專利名稱：一種四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系的育種方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬作物育種領(lǐng)域，涉及一種四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系及相應(yīng)保持系的育種方法，專用于四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系的選育。
二、技術(shù)背景不結(jié)球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)俗稱小白菜、白菜、青菜，我國北方稱“油菜”，原產(chǎn)中國。是我國南方最大眾化的蔬菜，在蔬菜周年供應(yīng)中占有舉足輕重的地位。其天然種及各栽培種都是二倍體，即2n＝2x＝20?，F(xiàn)有技術(shù)中有本發(fā)明人在國內(nèi)外首次人工誘變四倍體不結(jié)球白菜“南農(nóng)矮腳黃”新品種(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1990，13(2)P.33～40)；1992年育成四倍體不結(jié)球白菜雜交種“熱優(yōu)2號”(發(fā)明專利ZL93110536.6)。該專利品種已應(yīng)用于生產(chǎn)。但是由于“熱優(yōu)2號”是由2個四倍體自交系配制的雜交種，生產(chǎn)種中有大量的自交種，使其F1代雜種率不能達到100％。利用雄性不育系生產(chǎn)F1代雜交種(即雜種優(yōu)勢最優(yōu)化的雜交制種手段)可使F1代雜種率達到100％。目前國內(nèi)外現(xiàn)有技術(shù)中還沒有四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系，使其四倍體不結(jié)球白菜雜種優(yōu)勢利用受到了極大的限制。
2、以四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系C0代突變株為母本分別與保持系C0代突變株成對側(cè)交，同時相應(yīng)的保持系突變株自交，分別得到四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育突變系C1代和相應(yīng)的保持突變系C1代；3、選擇雄性不育株率＞90％的四倍體雄性不育C1代突變系和相應(yīng)的C1代保持突變系，連續(xù)側(cè)交、馴化以恢復(fù)生活力和提高結(jié)實率、鑒定篩選雄性不育株率為100％的系統(tǒng)，直至C5代，同時相應(yīng)的保持突變系自交至C5代，獲得不育株率為100％雄性不育性穩(wěn)定的四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系及相應(yīng)的保持系，經(jīng)細胞學(xué)鑒定，其體細胞染色體數(shù)均為2n＝4x＝40；4、上述方法選育的四倍體胞質(zhì)雄性不育系及相應(yīng)的保持系，在植株營養(yǎng)器官(根、莖、葉)和生殖器官(花器、果實等)都表現(xiàn)出多倍體的巨大性，統(tǒng)計分析表明與二倍體雄性不育系和保持系相比，差異極顯著(p≤0.001)，四倍體雄性不育系雄蕊退化，即花絲極短或無，花藥小，為正?；ㄋ幍?/3～1/4，且不開裂，白色戟狀或三角形，其內(nèi)無花粉，四倍體保持系雄蕊正常，花粉染色體數(shù)n＝2x＝20；四倍體胞質(zhì)雄性不育系及保持系除雄性不育形狀差異外，其它經(jīng)濟形狀相同，為普通二月白春化型，株型直立束腰，株高24～28厘米，開展度22～26厘米，葉片黃綠色、近圓形，葉柄白色、扁平，單株重0.7～1.0千克。技術(shù)效果本發(fā)明所提供的一種四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系的育種方法所育成的四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點1、采用同時誘變雄性不育系和保持系的育種方法簡單、有效、快速。如果按常規(guī)選育二倍體胞質(zhì)雄性不育系的方法，需要通過遠緣雜交導(dǎo)入不育源，再通過回交、側(cè)交篩選保持系，一般需要6～7代。四倍體染色體比二倍體多一倍，在遠緣雜交、回交、側(cè)交過程中基因分離極其復(fù)雜，要想獲得純合基因的雄性不育系和保持系相當(dāng)困難。故今未見成功報道。本發(fā)明克服了上述困難，獲得成功。該項研究曾被列入江蘇省“九五”農(nóng)業(yè)科技重大項目(BG99501-3)資助。
2、四倍體胞質(zhì)雄性不育系及相應(yīng)的保持系比其二倍體在植株營養(yǎng)器官(根、莖、葉)和生殖器官(花器、果實等)都表現(xiàn)出多倍體的巨大性，統(tǒng)計分析表明差異極顯著(p≤0.001)。四倍體胞質(zhì)雄性不育系及相應(yīng)的保持系株型直立束腰，株高24～28厘米，開展度22～26厘米，葉片黃綠色、近圓形，葉柄白色、扁平，單株重0.7～1.0千克。
3、四倍體胞質(zhì)雄性不育系其雄性不育性徹底，不受環(huán)境條件影響，不育株率達100％。該不育系只能與四倍體不結(jié)球白菜父本系配制四倍體F1代雜交種。由于其不與二倍體不結(jié)球白菜雜交，在生產(chǎn)上容易尋找隔離區(qū)，可降低生產(chǎn)成本。
4、利用四倍體胞質(zhì)雄性不育系所配制的F1代雜交種具有明顯的倍性優(yōu)勢和雜種優(yōu)勢。四倍體豐產(chǎn)、抗病、優(yōu)質(zhì)不結(jié)球白菜雜交新品種選育已被列入江蘇省“十五”農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目(BE2001321-2)。四倍體雜交種抗逆性、適應(yīng)性、豐產(chǎn)性都顯著優(yōu)于二倍體雄性不育系所配制的F1代雜交種。如四倍體雜交種比二倍體雜交種增產(chǎn)達27％～30％。
1.2選育過程(見附


圖1)1.2.1染色體倍性操作方法 1998年10月3日播種二倍體雄性不育系和保持系，在子葉期采用0.1％、0.15％和0.25％秋水仙素對其莖尖生長點分生細胞染色體進行加倍。處理時間10月11日～22日每天上午8時，下午3時，連續(xù)3天處理共6次，處理溫度為22～24℃/16～18℃。每份材料處理400株，共計7200株，每份材料設(shè)對照20株。
1.2.2四倍體間接鑒定方法1、營養(yǎng)器官鑒定參照劉惠吉[1]的方法。總變異率＝變異株數(shù)/總株數(shù)。誘變C0代，單株選擇第2～5片真葉，葉片變圓、變厚，顏色變深，株型開展正?；蜉p微畸形的變異株，于11月8日定植，株行距18cm×20cm。
2、氣孔鑒定定植后，當(dāng)植株8～10片葉完全伸展時取功能葉(以二倍體植株為對照)，用鑷子迅速撕下下表皮，在99％乙醇中固定2～3秒鐘，平鋪于栽玻片上，加一滴1％KI溶液，蓋上蓋玻片，在OLYPA顯微鏡下進行鏡檢用測微尺測量氣孔密度(30個視野)；氣孔器長和寬(樣本數(shù)N＝30)；單個保衛(wèi)細胞葉綠體數(shù)量(N＝30)。并進行T測驗比較二倍體與四倍體的差異。
3、花粉鑒定1999年3月開花期，取套袋隔離開放花朵散粉花藥的成熟花粉，涂散在栽玻片上，直接鏡檢。觀察花粉形狀，測量花粉長和寬(N＝30)，并進行T測驗比較二倍體與四倍體的差異。
4、花器及果實鑒定 用解剖鏡測微尺或直接測量花蕾、花瓣、花藥、花絲、子房、蜜腺、果實大小，樣本數(shù)N＝30。
1.2.3四倍體直接鑒定方法1、花粉母細胞減數(shù)分裂染色體數(shù)目鑒定(見附圖2) 上午8～11時取四倍體保持系花期主枝或一級分枝未開放的花序，立即放入Carnoy固定液(3份95％乙醇1份冰醋酸)中固定24h，轉(zhuǎn)入70％乙醇中保存。選0.8～1.6mm花蕾，撥出花藥，置于1N鹽酸中，60℃水浴酸解3～5min。用醋酸洋紅染色2～4min后敲片、壓片，鏡檢。
2、根尖染色體數(shù)目鑒定(見附圖3)參考楊漢民[3]去壁低滲法制備四倍體雄性不育系根尖染色體標(biāo)本。
1.2.4四倍體雄性不育系選育方法1、連續(xù)測交和自交1999年3月～4月對已鑒定的四倍體雄性不育變異株C0代為母本，四倍體保持系變異株C0代為父本作成對人工測交，相應(yīng)父本自交。1999年10月(人工加代)、2000年4月、2001年3月和2002年3月選擇不育性高、結(jié)實稔性高和經(jīng)濟性狀優(yōu)良的系統(tǒng)連續(xù)測交和自交。獲得C5代四倍體雄性不育系及相應(yīng)的保持系。
2、結(jié)實稔性和雄性不育性測定從測交第一代開始測定雄性不育系及保持系結(jié)實稔性(用親和指數(shù)表示)，花期親和指數(shù)＝花期雜交30朵花所結(jié)種子數(shù)/角果數(shù)(樣本數(shù)N＝10)；蕾期親和指數(shù)＝蕾期雜交30朵花所結(jié)種子數(shù)/角果數(shù)；(樣本數(shù)N＝10)。雄性不育不育株率及不育度測定參照柯桂蘭[4]方法。
1.2.5四倍體F1雜交種組合品比試驗2001年3月利用四倍體雄性不育系配制F1雜交組合01P-43(4X CMS×4X亮白葉)、01P-25(4X CMS×4X五月蔓)及01P-44(2X CMS×2X亮白葉)、01P-27(2X CMS×2X五月蔓)。2001年9～2002年4月進行品比試驗，采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，4次重復(fù)，每小區(qū)70株，株行距20cm×20cm。試驗結(jié)果進行方差分析。2結(jié)果與分析2.1秋水仙素誘變效果采用三種濃度秋水仙素對三對雄性不育系及保持系進行染色體加倍，試驗結(jié)果(見表1)表明1、本試驗共計獲得四倍體雄性不育變異株108株，總四倍體變異率為3.0％；四倍體雄性不育保持系變異株142株，總四倍體變異率為3.9％。
2、0.15％秋水仙素的誘變效果優(yōu)于0.1％或0.25％秋水仙素的誘變效果。從表1可見，隨著秋水仙素濃度的增加，總變異率亦隨之增加，但四倍體變異率并不相應(yīng)地增加。0.1％、0.15％和0.25％秋水仙素的總變異率分別為36～47.5％、50.8～65.5％和74.5～88.3％；而四倍體變異率分別為1.5～3.5％、3.0～6.5％和2.25～4.75％。提高秋水仙素濃度可提高總變異率，但會出現(xiàn)大量畸形突變體，降低有效四倍體變異率。在本試驗的條件下，采用0.15％秋水仙素可獲得較高的四倍體加倍效果。
表1秋水仙素誘變效果比較0.1％秋水仙素 0.15％秋水仙素 0.25％秋水仙素處 變 四 總 四處 變 四 總四處 變 四 總四倍倍 倍倍 倍倍變 變變理 異 體理 異 體理 異 體材料體體體異 變 異變 異變株 株 變 株 株 變 株 株 變異異異率 率率異率 異異數(shù) 數(shù)(％) 數(shù) 數(shù) (％) 率數(shù) 數(shù) (％) 率株(％)株(％)株(％)98PA*-51 400 144 636.0 1.50 400 203 12 50.8 3.00 400 298 9 74.5 2.2598PA-75 400 170 10 42.5 2.50 400 235 19 58.8 4.75 400 306 13 76.5 3.2598PA-77 400 159 939.8 2.25 400 228 16 57.0 4.00 400 315 14 78.8 3.50合計Total 1200 473 25 39.4 2 08 1200 666 47 55.5 3.92 1200 919 36 76.6 3.0098PB*-52 400 161 840.3 1.75 400 218 14 54.5 3.25 400 320 10 80.0 2.5098PB-76 400 178 14 44.5 3.50 400 262 26 65.5 6.50 400 353 19 88.3 4.7598PB-78 400 190 13 47.5 3.25 400 251 21 62.8 5.25 400 325 17 81.3 4.25合計Total 1200 529 35 44.1 2.92 1200 731 61 60.9 5.08 1200 998 46 83.2 3.83注A*——雄性不育系B*——雄性不育保持系3、雄性不育系的誘變率低于其相應(yīng)的保持系的誘變率，100％不育度雄性不育系的誘變率低于95％不育度雄性不育系的誘變率。由表1可見，0.1％、0.2％和0.3％秋水仙素的總變異率和四倍體變異率，雄性不育系分別為39.4％，2.08％、55.5％，3.92％和76.6％，3.0％；保持系分別為44.1％，2.92％、60.9％，5.08％和83.3％，3.83％。雄性不育系比保持系總變異率和四倍體變異率分別平均下降10％和31％；100％不育度雄性不育系98PA-51平均總變異率和四倍體變異率為53.8％和2.25％，95％不育度雄性不育系98PA-75和98PA-77的平均總變異率和四倍體變異率為58.92％和3.38％，前者比后者分別下降9..5％和50％。保持系98PA-52平均總變異率和四倍體變異率比98PA-76和98PA-78下降11.3％和71.5％。由此表明不同基因型的雄性不育系及保持系對秋水仙素誘導(dǎo)反應(yīng)不同。2.2四倍體雄性不育系及保持系的氣孔特征四倍體(4X)雄性不育系及保持系的氣孔器與二倍體(2X)比較(見表2)表現(xiàn)出明顯的巨大性及低密度，t測驗差異極顯著。4X雄性不育系比2X，氣孔器長度增加33.64％，寬度增加34.44％。4X保持系比2X長度增加31.35％，寬度增加36.19％；氣孔密度4X雄性不育系及保持系分別比2X減少90.83％和92.17％；氣孔器單個保衛(wèi)細胞含葉綠體數(shù)目4X雄性不育系及保持系分別比2X增加31.56％和34.48％。2.3四倍體保持系的花粉特征4X保持系成熟花粉多數(shù)為廣橢圓形，長短軸之比為1.98，少數(shù)花粉呈鈍角磚形(占20％～30％)，三角形、不規(guī)則畸形花粉約占5％～10％，而2X為扁橢圓形，長短軸之比為2.13；4X比2X，花粉長度增加27..14％(見表3)，寬度增加26.38％，差異極顯著。試驗表明，花粉的形狀和大小可作為四倍體鑒定的可靠指標(biāo)。
表2二倍體與四倍體葉下表皮氣孔比較不育系4X比2X增保持系4X比2X增t測驗 t測驗4X 2X加％4X2X 加％長 3035±2.26 22.71±1.91 33.64 18.76**32.05±2.68 24.40±1.89 3135 17.62**氣孔器(μ)寬 22.21±1.59 16.52±1.19 34.44 19.73**24.12±1.79 17.71±1.91 36.19 20.94**氣孔密度(Num./mm2) 120±7.13 229±5.67-90.83 32.12**115±6.30221±4.17-92.17 34..36葉綠體數(shù)目/保衛(wèi)細胞12.38±0.91 9.41±0.85 31.56 3.77**12.91±0.89 9.60±0.78 34.48 3.85***0.05差異顯著水平，t0.05＝1.98；**0.01差異極顯著水平，t0.01＝2.62；樣本數(shù)N＝30。2.4四倍體雄性不育系及保持系的花器特征(見附圖4)四倍體花器官各部分都呈現(xiàn)巨大性，t測驗差異顯著(見表3)?；ɡ俜蚀?，花瓣大而近圓，顏色變深。
1、4X雄性不育系及保持系花瓣長和寬比其二倍體分別增加13.75％、37.02％和17％、55.18％，形狀由廣扇形變?yōu)榻鼒A形，黃色加深。4X保持系的花瓣比4X雄性不育系花瓣大，長和寬分別大19.3％和45.9％。
2、4X雄性不育系花藥白色，三角形或戟形，藥內(nèi)無花粉。其長和寬分別比二倍體增加15.52％和24.09％，分別比4X保持系減少62.2％和49.5％，4X保持系的花藥長和寬比2X分別增加17.68％和22.22％。；4X雄性不育系花絲長和寬分別比二倍體增加11.52％和19.44％，分別比4X保持系減少202.3％和39.5％。4X保持系的花絲長和寬比2X分別增加14.8％和26.36％。
3、4X雄性不育系和保持系子房差異不大，其長和寬比其二倍體分別增加9.9％、27.19％和9.34％、28.97％；4X雄性不育系和保持系花柱長比其二倍體分別增加49.26％和69.79％。
4、4X雄性不育系蜜腺4個正常，其直徑比二倍體增加58.14％，但比4X保持系小16％。4X保持系的蜜腺直徑比2X增加43.64％。2.5四倍體雄性不育系及保持系的果實特征四倍體的果實仍為長角果，但由于花柱膨大，在角果上端形成特有的“喙”。而二倍體的“喙”短少，隨著果實成熟而枯萎。4X雄性不育系和保持系“喙”長比其二倍體分別增加133.8％和156.06％。(見表3)2.6四倍體花粉母細胞減數(shù)分裂及根尖有絲分裂染色體數(shù)目鑒定四倍體保持系花粉母細胞減數(shù)分裂試驗結(jié)果表明減數(shù)分裂中期II排列在赤道板上的染色體數(shù)目為n＝2x＝20，而二倍體則為n＝x＝10。證明該保持系為四倍體，2n＝4x＝40。四倍體雄性不育系根尖有絲分裂試驗結(jié)果表明有絲分裂中期排列在赤道板上的染色體數(shù)目為2n＝4x＝40，而二倍體則為2n＝2x＝20。證明該不育系為四倍體。
表3二倍體與四倍體花器及果實特征比較4X比4X比保持系不育系2X2X增t測驗 t測驗4X 2X增加4X 2X 加％ ％花粉粒 長 - - --49.19±1.8638.69±1.6527.1429.82**(μ)寬 - - --24.78±0.8718.17±0.9436.3825.54**花蕾長 6.26±0.755.98±0.48 4.68 2.42*6.45±0.84 6.15±0.49 4.88 2.51*(mm)寬 3.38±0.822.78±0.27 21.586.02**3.57±0.93 3.04±0.37 17.434.19**花瓣長 8.77±0.827.71±1.07 13.755.84**10.46±0.658.94±0.61 17.004.44**(mm)寬 7.07±1.045.16±0.63 37.024.82**10.32±0.776.65±0.48 55.188.27**花藥長 2.01±0.181.74±0.11 15.523.62**3.26±0.32 2.77±0.19 17.684.23**(mm)寬 1.03±0.130.83±0.07 24.096.12**1.54±0.17 1.26±0.14 22.225.18**花 絲 長 2.13±0.571.91±0.21 11.525.47**6.44±0.55 5.61±0.29 14.808.88**(mm)寬 0.86±0.240.72±0.06 19.445.91**1.20±0.13 0.88±0.06 36.3617.81**子房長 5.58±0.285.08±0.31 9.90 2.61*5.97±0.18 5.46±0.22 9.34 2.59*(mm)寬 1.45±0.121.14±0.09 27.196.94**1.38±0.17 1.07±0.11 28.977.04**花柱長 3.03±0.432.03±0.13 49.267.13**3.26±0.21 1.92±0.18 6979 10.94**蜜腺直徑(mm)0.68±0.070.43±0.05 58.149.79**0.79±010 0.55±0.07 43.645.05**長 55.75±4.25 49.59±3.07 12.424.95**56.27±4.1248.63±2.7415.715.04**果實寬 6.55±0.274.20±0.21 55.9516.9**6.74±0.32 4.18±0.19 61.2417.10**(mm)喙14.15±1.49 6.05±0.42 133.8 23.8**15.21±1.525.94±0.53 156.0624.45**長*0.05差異顯著水平，t0.05＝1.98；**0.01差異極顯著水平，t0.01＝2.62樣本數(shù)N＝30。2.7四倍體雄性不育性和結(jié)實稔性四倍體雄性不育系及保持系經(jīng)5代馴化選育，試驗結(jié)果表明(見表4)1、四倍體雄性不育系雄性不育性穩(wěn)定，不育株率為100％。其中98PTA-51系統(tǒng)不育度仍為100％，98PTA-75和98PTA-77系統(tǒng)不育度在中小株采種時為100％，大中株采種時，在春季初花期為96％，盛花期后為100％。這2個系統(tǒng)對春季低溫輕度敏感。
2、四倍體雄性不育系及保持系結(jié)實稔低。誘變材料測交及自交第一代，平均單角果結(jié)籽數(shù)小于1，即4X雄性不育系最高的蕾期親和指數(shù)為0.56～0.72，保持系為0.67～0.81。試驗測定的實際范圍為0.08～0.81。隨著馴化代數(shù)增加單親和指數(shù)逐漸提高。測交及自交第五代，4X雄性不育系最高的蕾期和花期親和指數(shù)分別上升至8.24～10.37和5.32～7.26，保持系為7.56～8.42和5.09～5.18；由表4又見，98PTA-51系統(tǒng)不育系的親和指數(shù)比98PTA-77系統(tǒng)低。保持系的親和指數(shù)在前三代高于不育系，而在后兩代低于不育系。
表4四倍體雄性不育性及結(jié)實稔性年/月材料蕾期親和指數(shù) 花期親和指數(shù) 年/月不育株率(％) 不育度(％)1999/03 98PTA-51-1 0.56 -1999/10 10010098PTA-75-7 0.72 -10010098PTA-77-3 0.64 -- -98PTB-52-1 0.67 -0 098PTB-76-1 0.81 -0 098PTB-78-4 0.70 -- -1999/11 98PTA-51-1-2 1.28 -2000/04 10010098PTA-75-7-5 1.76 -10010098PTB-52-1-8 2.04 -0 098PTB-76-1-3 2.35 -0 02000/04 98PTA-51-1-2-5 3.84 1.07 2001/03 10010098PTA-75-7-5-3 4.53 1.88 1009698PTB-52-1-8-2 4.05 1.79 0 098PTB-76-1-3-125.95 2.12 0 02001/03 98PTA-51-1-2-5-10 5.12 2.41 2002/03 10010098PTA-75-7-5-3-9 6.21 2.57 1009698PTB-52-1-8-2-7 4.89 2.32 0 098PTB-76-1-3-12-6 6.02 3.15 0 02002/03 98PTA-51-1-2-5-10-68.24 5.32 - - -98PTA-75-7-5-3-9-1610.37 7.26 - -98PTB-52-1-2-5-10-87.56 5.18 - -98PTB-76-1-3-12-6-18.42 5.09 - -2.8四倍體雄性不育系及保持系農(nóng)藝形狀四倍體雄性不育系及保持系農(nóng)藝學(xué)形狀除雄性不育形狀外，其它形狀相同為普通二月白春化型，株型直立，束腰，株高24～28厘米，開展度22～26厘米，葉片黃綠色、近圓形，葉柄白色、扁平，單株重0.7～1.0千克。(見附圖5)2.9四倍體F1雜交種組合品比試驗表5四倍體與二倍體F1雜交組合比較單位Uniteg cm小區(qū)產(chǎn)材料株高 開展度 葉形 葉片重 十葉厚 葉柄重 葉柄厚 單株重量(kg)近圓01P-43 30.0*29.8*262.8**0.68**467.0**0.60**729.8**51.61**卵圓01P-44 27.8 27.8 208.30.49 372.30.45580.6 40.80近圓01P-25 25.5*25.3*223.5**0.72**419.5**0.62**643.0**44.12**卵圓01P-27 23.5 24.5 183.5 0.60 326.80.50510.3 33.87*0.05差異顯著水平；**0.01差異極顯著水平。利用四倍體和二倍體雄性不育系配制F1雜交種組合品比試驗(見表5)表明四倍體0雜交種具有明顯的雜種優(yōu)勢和倍性優(yōu)勢，植株高大，葉形變圓變大，厚度增加，單株重增加。二、四倍體雜交種各子性狀差異顯著至極顯著。葉片厚度四倍體比二倍體分別增加20％和38.8％；葉柄厚度分別增加24％和33.3％；小區(qū)產(chǎn)量01P-43比01P-44增加26.5％，01P-25比01P-27增加30.3％。
權(quán)利要求
1.一種四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系的育種方法，其特征在于1)誘變四倍體用的秋水仙素溶液濃度為0.1％(g/ml，下文同)、0.15％和0.25％，在子葉期處理二倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系及相應(yīng)的保持系(2n＝2x＝20)的莖尖生長點分生細胞，連續(xù)處理3天，每天2次，處理溫度為晝22～24C/夜16～18℃，篩選出第一代四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系及相應(yīng)的保持系突變株C0代，與未處理對照相比，C0代特征為植株生長緩慢，葉片近圓形且厚、顏色深黃綠色，葉片下表皮氣孔保衛(wèi)細胞大，氣孔密度小，花器官大，花瓣圓，顏色深黃，不育系與保持系區(qū)別在于前者表現(xiàn)雄性不育，后者雄性可育；2)以四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系C0代突變株為母本分別與保持系C0代突變株成對側(cè)交，同時相應(yīng)的保持系突變株自交，分別得到四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育突變系C1代和相應(yīng)的保持突變系C1代；3)選擇雄性不育株率＞90％的四倍體雄性不育C1代突變系和相應(yīng)的C1代保持突變系，連續(xù)側(cè)交、馴化以恢復(fù)生活力和提高結(jié)實率、鑒定篩選雄性不育株率為100％的系統(tǒng)，直至C5代，同時相應(yīng)的保持突變系自交至C5代，獲得不育株率為100％雄性不育性穩(wěn)定的四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系及相應(yīng)的保持系，經(jīng)細胞學(xué)鑒定，其體細胞染色體數(shù)均為2n＝4x＝40；4)上述方法選育的四倍體胞質(zhì)雄性不育系及相應(yīng)的保持系，在植株營養(yǎng)器官(根、莖、葉)和生殖器官(花器、果實等)都表現(xiàn)出多倍體的巨大性，與二倍體雄性不育系和保持系相比，經(jīng)統(tǒng)計分析，差異極顯著(p≤0.001)，四倍體雄性不育系雄蕊退化，即花絲極短或無，花藥小，為正常花藥的1/3～1/4，且不開裂，白色戟狀或三角形，其內(nèi)無花粉，四倍體保持系雄蕊正常，花粉染色體數(shù)n＝2x＝20；四倍體胞質(zhì)雄性不育系及保持系除雄性不育形狀差異外，其它經(jīng)濟形狀相同，為普通二月白春化型，株型直立束腰，株高24～28厘米，開展度22～26厘米，葉片黃綠色、近圓形，葉柄白色、扁平，單株重0.7～1.0千克。
全文摘要
本發(fā)明為一種四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系的育種方法，用0.1％(g/ml，下文同)、0.15％和0.25％秋水仙素處理二倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系及相應(yīng)的保持系，以四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系突變株為母本與相應(yīng)的保持系突變株連續(xù)側(cè)交5代，同時相應(yīng)的保持系突變株自交，經(jīng)選育馴化獲得雄性不育性穩(wěn)定的四倍體不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育系及相應(yīng)的保持系。該雄性不育系不育株率為100％，株型直立、束腰、白梗、黃綠色近圓葉、單株重0.7～1.0千克，體細胞染色體數(shù)2n＝4x＝40。該系統(tǒng)是生產(chǎn)四倍體雜交種最優(yōu)化的制種手段。
文檔編號A01H3/04GK1443442SQ0311328
公開日2003年9月24日 申請日期2003年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月25日
發(fā)明者張蜀寧, 劉惠吉, 李式軍 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)