專利名稱：利用基因工程技術(shù)培育“雙肌”克隆豬的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬育種的新方法，特別涉及一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育瘦肉率增加、快速增長、飼料轉(zhuǎn)化率提高的“雙肌”克隆豬的方法。
背景技術(shù)：
豬肉是我國人民最喜愛的肉食，除一些少數(shù)民族和生活在牧區(qū)的漢族人口外，大多數(shù)人日常食用的主要肉類是豬肉。隨著人民生活的日益提高，人們對瘦肉的需求增加。就畜牧業(yè)來講，獲得高瘦肉率、快速增長、飼料轉(zhuǎn)化率提高的豬的新品種，成為多年來育種工作者孜孜以求的目標(biāo)。我國是傳統(tǒng)的養(yǎng)豬大國，是世界上養(yǎng)豬最多的國家。培育品質(zhì)優(yōu)良的豬的品種，必將對我國國民經(jīng)濟產(chǎn)生巨大而深遠的影響。
1982年，Palmiter等將大鼠的生長激素基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，獲得“超級小鼠”。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行豬的育種成為包括我國在內(nèi)的眾多國家的研究課題。經(jīng)過20年的努力，在我國，經(jīng)顯微注射方法生產(chǎn)了數(shù)百頭原代轉(zhuǎn)基因豬及其后代。盡管一部分轉(zhuǎn)生長激素基因豬獲得了良好的表型，但有的性狀不能穩(wěn)定遺傳，有的由于轉(zhuǎn)基因多拷貝隨機整合破壞某些內(nèi)源基因或轉(zhuǎn)基因異位表達而導(dǎo)致產(chǎn)生各種畸變。更為重要的是，直至目前，尚未獲得純合的轉(zhuǎn)基因家系，給豬的基因工程育種工作的前景蒙上了一層陰影。
肌肉生長抑制素基因[myostatin(GDF8；MSTN)]剔除型小鼠比野生型小鼠的肌肉明顯肥大、增生，體重增加30％，脂肪蓄積受到抑制，成為“超級小鼠”[McPherron AC，Lawler AM，Lee SJ.Regulation of skeletal muscle mass inmice by a new TGF-beta superfamily member.Nature.1997，38783-90；McPherron AC，Lee SJ.Suppression of body fat accumulation in myostatin-deficient mice.J Clin Invest.2002，109(5)595-601.]。經(jīng)過長期遺傳選育的比利時藍牛與其他品種相比，具有更為強壯的骨骼肌，可能是由于肌肉生長抑制素基因突變的結(jié)果[McPherron AC，Lee SJ.Double muscling in cattle due tomutations in the myostatin gene.Proc Natl Acad Sci USA.1997，94(23)12457-12461.]。因此，肌肉生長抑制素是肌肉生長的一種負調(diào)控因子。
基因打靶技術(shù)是利用外源DNA與細胞基因組DNA同源序列發(fā)生同源重組對細胞基因組進行定點修飾的技術(shù)[Capecchi MR.Altering the genome byhomologous recombination.Science.1989，244(4910)1288～1292.]。利用基因打靶技術(shù)可以實現(xiàn)外源基因的單拷貝定點整合，從而剔除細胞的內(nèi)源基因。
利用體細胞核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物[Wilmut I，Schnieke AE，McWhir J，et al.Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells.Nature.1997，385(6619)810～813]，開辟了轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的新領(lǐng)域。隨著多種克隆動物的誕生，這一技術(shù)顯示出眾多優(yōu)越性，并逐步替代顯微注射法。從普通的豬體細胞[Polejaeva IA，Chen SH，Vaught TD，et al.Cloned pigs produced by nucleartransfer from adult somatic cells.Nature.2000，407(6800)86-90.]到遺傳修飾過的豬體細胞[Lai L，Kolber-Simonds D，Park KW，et al.Production of alpha-1，3-galactosyltransferase knockout pigs by nuclear transfer cloning.Science.2002，295(5557)1089-92；Dai Y，Vaught TD，Boone J，et al.Targeted disruption of thealphal，3-galactosyltransferase gene in cloned pigs.Nat Biotechnol.2002，20(3)251-5.]通過核移植技術(shù)都能產(chǎn)生仔豬，為豬的基因工程育種工作增添了新的活力。

發(fā)明內(nèi)容
為提供一種培育瘦肉率增加、快速增長、飼料轉(zhuǎn)化率提高的新的豬品種的方法，本發(fā)明的發(fā)明人采取了以下技術(shù)方案。
本發(fā)明的發(fā)明人首先從構(gòu)建的豬的基因組文庫中克隆出豬肌肉生長抑制素的基因組序列，構(gòu)建基因剔除打靶載體，其中包括豬肌肉生長抑制素的基因5’端序列、抗生素抗性基因pCMV-neo序列、豬肌肉生長抑制素的基因3’端序列和pSV40-tk基因序列。分離豬胚胎成纖維細胞，進行體外培養(yǎng)，然后用電穿孔法或者其他轉(zhuǎn)染方法將線性化的基因打靶載體導(dǎo)入豬胚胎成纖維細胞中，用抗生素G418和Ganc進行篩選。挑取的克隆以豬肌肉生長抑制素的基因序列作探針進行Southern印跡試驗，確證同源重組事件的發(fā)生。在完成體細胞打靶后，取出豬的卵母細胞，體外活化，然后去掉活化的卵母細胞的核，然后，將抗生素抗性基因已插入豬肌肉生長抑制素的基因組序列中的豬成纖維細胞的核移植到去核豬卵中。體外培養(yǎng)觀察，選擇成活的移核卵胚移植到代孕豬的輸卵管。用Southern印跡方法對出生的小豬進行DNA檢測；對出生的仔豬稱重，測定出生仔豬的增重情況；測定肌肉的數(shù)量、直徑；測定脂肪含量等。通過基因剔除豬進行交配，獲得純合家系。
本發(fā)明涉及利用基因打靶技術(shù)剔除豬體細胞中肌肉生長抑制素基因，然后通過中靶體細胞核移植法，培育一種瘦肉率增加、快速增長、飼料轉(zhuǎn)化率提高的“雙肌”克隆豬的方法。這種育種方法通過同源重組，實現(xiàn)了基因的定點整合，可以克服普通顯微注射轉(zhuǎn)基因的位點效應(yīng)而導(dǎo)致的流產(chǎn)、生理障礙等。同時，可以使豬的性狀穩(wěn)定遺傳，最終獲得純和家系，達到真正培育豬的良種的目的。
本發(fā)明將為牛、羊等其他家畜品種的基因育種工作提供有意義的理論和實踐指導(dǎo)。
本發(fā)明所指的豬包括大白豬、杜洛克、漢普夏、皮特蘭、二花臉、長白豬、約克夏、東北民豬、湖北白豬等品種及我國其他地方豬的品種。


圖1為基因打靶載體及基因鑒定引物的位置示意2為顯微操作核移植和胚胎的體外培養(yǎng)具體實施方式
材料和方法1、試劑與培養(yǎng)基所有試劑購自Sigma-Aldrich公司；所用內(nèi)切酶、分子生物學(xué)方面的試劑購于Promega公司；培養(yǎng)基購自Gibco公司。
2、基因克隆與鑒定從豬基因組文庫用常規(guī)方法篩選出豬肌肉生長抑制素基因全長序列，進行序列分析[Stratil A，Kopecny M.Genomic organization，sequence and polymorphism of the porcine myostatin(GDF8；MSTN)gene.AnimGenet，30(6)468-70.]。
3、豬肌肉生長抑制素基因打靶載體的構(gòu)建。利用合適的酶切位點用常規(guī)分子克隆方法構(gòu)建用于打靶的載體。酶切確證成功后，將載體線性化，定量后備用。
4、從性成熟或性成熟前的母豬獲取成熟的卵母細胞對性成熟后的母豬，在懷孕21-40天時，肌肉注射0.2mg前列腺素F2(a)類似物，(+)-Cloprostenol，24小時后再注射0.2mg(+)-Cloprostenol和1500IU eCG，誘導(dǎo)流產(chǎn)。在注射eCG猴2小時后，注射500IU hCG誘導(dǎo)超排卵。對性成熟前母豬，在注射1500IU eCG后72小時，再注射500IU hCG。在注射hCG后45小時屠宰母豬，用無Ca、無Mg的Dulbecco磷酸緩沖鹽水，補充有01％BSA。獲得的卵母細胞置于38.5℃的5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。從屠宰場取到的卵巢獲取卵母細胞從屠宰場取到的卵巢，用0.9％鹽水浸洗兩次，放入DPBS(含100μl/ml青霉素和100μl/ml硫酸連霉素)溶液內(nèi)，用25-30℃的冷藏箱運回實驗室。卵巢收集到卵泡吸出的時間控制在2-5h。預(yù)先在39℃、CO2培養(yǎng)箱平衡卵丘卵母細胞復(fù)合體(COC)成熟培養(yǎng)基備用。選擇卵巢表面直徑3-6mm的中等卵泡，用18G針頭的10ml注射器吸出COC，放入COC成熟培養(yǎng)基，挑選出至少被兩層卵丘細胞包裹的卵母細胞，洗三次，然后將50-60枚COC轉(zhuǎn)移到4孔板里用石蠟油覆蓋500μl COC成熟培養(yǎng)基內(nèi)。在39℃、CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)22h后，卵母細胞用無激素的NCSU23培養(yǎng)基洗三次，再加500μl不含激素的NCSU 23培養(yǎng)基在39℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)22h。
5、豬胚胎成纖維細胞制備取受精后30-35天的豬胚胎，將胚胎組織剪成小塊，用含0.25％胰酶和1mM EDTA的PBS在4℃培養(yǎng)3小時，分散細胞。然后用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(GIBCO)洗一次。用10％FBS的DMEM高密度地培養(yǎng)胚胎成纖維細胞。每次傳代一傳二，傳到2-6代用于轉(zhuǎn)染。核供體細胞培養(yǎng)到長滿，不補充培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16天。培養(yǎng)3天時，用增殖細胞核抗原(PCNA)檢測仍為陽性，10天后檢測為陰性，繼續(xù)培養(yǎng)6天，細胞進入G0期。用Giemsa染色確定每一細胞的正常核型。
6、電擊轉(zhuǎn)染按常規(guī)復(fù)蘇胚胎成纖維細胞，培養(yǎng)3天。用0.25％胰酶消化細胞，用10％FCS的DMEM培養(yǎng)基洗一次，用Hepes緩沖鹽水懸浮細胞，計數(shù)細胞，取2×107細胞，1000RPM離心，去上清。用0.8ml含有0.5pmol/ml載體DNA的Hepes緩沖鹽水懸浮細胞。轉(zhuǎn)移細胞懸浮液到電擊池。電擊條件260V、960μFD。電擊后的細胞，用無選擇劑的10％FCS DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)在使用膠原蛋白包被的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿。培養(yǎng)兩天后，消化細胞，計數(shù)，懸浮在含20％FCS和100μg/ml G418的Hams營養(yǎng)混合物，以2×104細胞/孔的濃度培養(yǎng)在膠原蛋白包被96孔板。(正常成纖維細胞在50-75的G418培養(yǎng)5-7天被殺死。)培養(yǎng)14天后，一傳三復(fù)制。一塊用于提取DNA；一塊用于保存。保存方法用0.25％胰酶消化，凍存在20μl凍存液內(nèi)，細胞數(shù)大約為1000-2000。
7、中靶細胞的鑒定選用打靶載體同源臂外側(cè)的一段豬肌肉生長抑制素基因作為探針，用組織DNA提取試劑盒，提取細胞克隆的DNA，用EcoR V、Hind III、Sal I等幾種不同的內(nèi)切酶酶切電泳后，進行Southern印跡，鑒定發(fā)生同源重組的細胞，陽性的細胞克隆用作核移植的核供體。
8、COC的顯微操作和核移植將COC從NCSU-23培養(yǎng)基移到0.3mg/ml透明質(zhì)酸酶溶液，用巴斯德管打掉卵丘細胞。成熟卵母細胞放入5μg/mlBisbenzimide(Hoechst 33258)溶液30min，然后轉(zhuǎn)移到含4mg/ml BSA和7.5μg/ml Cytochalase B的TL-Hepes溶液中。用25-30μm的玻璃管吸掉第1極體和M II板以及周圍的少量胞漿，完成去核。在紫外光下觀察玻璃管內(nèi)的核體，確定是否成功地去掉胞核。去核的的卵母細胞轉(zhuǎn)移到含4mg/ml BSA和01mg/ml半胱氨酸的NCSU 23培養(yǎng)基，在39℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h。然后移到加有300μl TL-Hepes+4mg/ml BSA的顯微注射池，放到顯微鏡的載物臺上。預(yù)先制備好鋒利斜面口徑10μm的注射玻璃管。每次注射后，用含15％Polyvinylpyrrolidone(分子量40,000)NCSU23洗注射管。刺破成纖維細胞，輕輕吸入可見的胞漿，去掉胞漿。然后將胞核和殘存細胞碎片，通過去核的同一裂口注射到去核卵母細胞胞漿中，盡可能少地將培養(yǎng)基注射到卵母細胞胞漿中。
9、移植核的活化將顯微注射的卵細胞移到含4mg/ml BSA和0.1mg/ml半胱氨酸NCSU-23培養(yǎng)基，在39℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min。用不同濃度的Thimerosal在不同時間活化卵母細胞，然后在DTT中培養(yǎng)?；罨穆涯讣毎皶r地轉(zhuǎn)移到NCSU-23培養(yǎng)基，在39℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
10、代孕豬的制備給孕20-30天豬，注射0.2mg的cloprostenol，24小時后注射0.2mg的cloprostenol和1000IU eCG誘導(dǎo)流產(chǎn)。在注射eCG 72小時后，注射500IU hCG誘導(dǎo)發(fā)情。在注射hCG 24小時后，進行人工受精，產(chǎn)生輔助胚胎。沖洗準(zhǔn)備用于移植的一側(cè)輸卵管，在激活后20或40小時，注射hCG 48或68小時轉(zhuǎn)移克隆胚胎。
11、出生仔豬的Southern印跡方法鑒定留取出生時小豬的胎血或取新生豬的耳朵組織，用組織DNA提取試劑盒，提取DNA。鑒定方法同材料和方法的第7步。
12、生理生化檢查對基因剔除的小豬，進行生理生化檢查，判斷其健康情況。
13、純合家系的獲得。通過基因剔除豬進行交配，獲得純合家系。
結(jié)果1、基因打靶載體的構(gòu)建從豬基因文庫中獲取豬的肌肉生長抑制素基因的全部編碼及5’端和3’端側(cè)翼序列。按附圖1構(gòu)建基因打靶載體。在這一載體中的肌肉生長抑制素基因5’端序列長度為2kb、肌肉生長抑制素基因3’端序列6kb?？剐曰驗閜CMV調(diào)控的neor，位于肌肉生長抑制素基因的第三外顯子編碼區(qū)。在肌肉生長抑制素基因3’端后連接有tk基因。在轉(zhuǎn)染前線性化載體。
2、細胞轉(zhuǎn)染與鑒定復(fù)蘇胚胎成纖維細胞，培養(yǎng)3天后用于基因打靶。打靶后的細胞培養(yǎng)在10％FCS DMEM培養(yǎng)基中48h，然后，換成含G418和FIAUHams營養(yǎng)混合物培養(yǎng)基。培養(yǎng)14天后，一傳三復(fù)制。
細胞克隆進行Southern blot試驗，分別用EcoR V、Hind III、Sal I酶切細胞DNA，用附圖1標(biāo)示部位的序列作探針，其顯影片段與理論推測一致的細胞為基因打靶陽性細胞，將其擴增，凍存?zhèn)溆谩?br> 3、核移植和胚胎的體外培養(yǎng)將基因打靶陽性細胞培養(yǎng)至80％的覆蓋率，調(diào)整大多數(shù)細胞到G0期后用于核移植其過程見圖2。將核移植的卵細胞轉(zhuǎn)移到含4mg/ml BSA和0.1mg/ml半胱氨酸NCSU 23培養(yǎng)基，在39℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)30min，再按材料和方法中敘述方法進行活化處理。活化的卵母細胞及時地轉(zhuǎn)移到NCSU23培養(yǎng)基，在39℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24-48h，胚胎可發(fā)育到4-16細胞。代孕母豬為杜羅克豬，在核移植的前三天開始給代孕母豬注射eCG，72h后注射hCG，發(fā)情后，進行人工受精，20h后選擇24-48h、發(fā)育良好的胚胎用于輸卵管的植入。
4、新生小豬的鑒定由于胚胎成纖維細胞來自大白豬(約克夏種)，毛色為白色，代孕豬毛色為紅色。出生小豬從顏色可初步分出克隆豬和野生型小豬。抽取克隆小豬的血液或取耳朵組織，提取DNA，進行3種內(nèi)切的Southern blot試驗，用鑒定細胞(見附圖1)相同的探針雜交。
5、生理生化檢查及分析對基因剔除的小豬，進行生理(仔豬出生重、斷奶時體重、出欄重、不同月齡重等；測定肌肉的數(shù)量、直徑等，脂肪含量)及生化檢查，判斷其健康情況，可分析野生型和基因打靶克隆豬的差別。
6、純合家系的獲得。通過基因剔除豬進行交配，分析其后代，最終獲得純合家系。
權(quán)利要求
1.利用基因工程技術(shù)培育“雙肌”豬的方法，其特征在于包括利用基因打靶技術(shù)重組豬肌肉生長抑制素基因和利用體細胞核移植技術(shù)生產(chǎn)移核卵胚等步驟。
2.權(quán)利要求1的培育“雙肌”豬的方法，其特征在于包括以下步驟(a)克隆豬肌肉生長抑制素基因；(b)構(gòu)建肌肉生長抑制素基因打靶載體；(c)將打靶載體導(dǎo)入豬胚胎成纖維細胞中，并抗生素G418和Ganc進行篩選；(d)將抗生素抗性基因已插入豬肌肉生長抑制素的基因組序列中的豬成纖維細胞的核移植到去核豬卵中；(e)選擇成活的移核卵胚移植到代孕豬的輸卵管；(f)出生仔豬的生物學(xué)鑒定。
3.權(quán)利要求1或2的培育“雙肌”豬的方法，其特征在于所說的豬為大白豬、杜洛克、漢普夏、皮特蘭、二花臉、長白豬、約克夏、東北民豬或湖北白豬。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用基因剔除和體細胞核移植法培育克隆豬的方法。該方法通過同源重組破壞豬體細胞的肌肉生長抑制素基因，體外篩選中靶細胞后，通過核移植技術(shù)最終獲得基因打靶的克隆豬。本發(fā)明涉及嶄新的豬育種方法具有能使優(yōu)良性狀穩(wěn)定遺傳，最終獲得純合家系的優(yōu)點。
文檔編號A01K67/027GK1489899SQ0214626
公開日2004年4月21日 申請日期2002年10月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月18日
發(fā)明者林福玉, 鄧?yán)^先, 黃培堂 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工