專利名稱：沙棘聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及非豆科固氮樹木聯(lián)合共生技術(shù)，具體地說是沙棘聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
氮素是組成蛋白質(zhì)的主要元素，是植物生長所必需的大量營養(yǎng)元素?？諝庵须m含有近80％的氮氣，但并不能被高等植物直接吸收利用，人工合成氮素化肥的能源耗費巨大，不合理的過量施用帶來的環(huán)境污染問題也日趨嚴(yán)重，人們逐漸認(rèn)識到農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)完全依賴化肥終非良策，因此生物固氮的研究倍受關(guān)注。在貧瘠的土壤中生物固氮的最經(jīng)常的限制因素是磷元素，這是因為磷元素在參與生物界的物質(zhì)循環(huán)中，只有在無機磷和有機磷之間的轉(zhuǎn)化，而不發(fā)生氧化還原反應(yīng)，而且磷元素在無人為活動參與的情況下總是單向流動的，生物體中的有機磷經(jīng)分解后形成不溶性無機磷酸鹽在土壤中沉積，在被河流帶入海洋，不參與陸地上的磷循環(huán)。而與植物共生的菌根真菌可以通過根外菌絲的形成，增加植物與土壤的接觸點，擴大吸收面積，縮短磷的擴散距離(文獻(xiàn)1Hattingh，M.J.，Gray，L.E.，Gerdemsnn，J.W.1973.Uptake andtranslocation of 32 P-labelled phosphate to onion roots byendomycorrhizal fungi，Soil Sci.5456～63；文獻(xiàn)2Nye P.H.，Tinker，P.B.1977.Solute movement in the soil-root system，OxfordBlackwellScientific Publications.；文獻(xiàn)3Rhode，L.H.and J.W.Gerdemann.1978.Translocation of calcium and phosphate by external hyphae ofVesicular-arbuscular mycorrhizae，Soil Sci.126125～126)，從而提高宿主對磷素的吸收，改善植物營養(yǎng)狀況，促進(jìn)植物生長(文獻(xiàn)4Raju，P.S.，Clark，R.B.，Ellis，J.R..et al，1990.Effects of species of VAMfungi on growth and mineral uptake of sorghum at differenttemperatures，Plant Soil.121165～170；文獻(xiàn)5Sieverding，E.T，1983.Influence of Soil moisture regime on VA-mycorrhiza.H.II.Effects ofsoil temperature and water regime on growth，nutrient uptake and waterutilization of Eupatorium odoratum L.Z.Acker and Pflanzenbau.15256～57)；菌根還可分泌生長素、抗生素及一些酶提高植物的抗逆性，使菌根植物在貧瘠土壤中生存。
植物與微生物的共生是自然界普遍存在的一種生物學(xué)現(xiàn)象，其中與人類關(guān)系密切的有高等植物與菌根真菌共生形成的菌根，豆科固氮植物與根瘤菌或非豆科固氮植物與弗蘭克氏放線菌共生形成的根瘤。近二十年來對于菌根和根瘤這樣兩位一體的共生體系的研究已取得顯著進(jìn)展，特別是從遺傳特性、形態(tài)解剖、生理生態(tài)等方面對共生關(guān)系的建立、優(yōu)化和機理都進(jìn)行了深入的研究，通過人工接種促進(jìn)共生體形成及應(yīng)用的技術(shù)也有較快發(fā)展，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)實踐中已顯示出菌根和根瘤的應(yīng)用潛力；但這方面多注重于植物與菌根真菌共生形成的菌根、固氮植物與根瘤菌或放線菌共生形成根瘤，進(jìn)而在貧脊的土地上應(yīng)用時，便不能最佳地形成植物與微生物間的營養(yǎng)共生環(huán)境，發(fā)揮固氮樹種優(yōu)良性狀，極大滿足它們各自生長的需求。由于Frankia具有對宿主的侵染范圍寬，固氮活性比較強和對氧氣不敏感等特性，在生物固氮研究中對Frankia菌的研究將更為重要；Frankia-非豆科樹木共生固氮體系是自然界中重要的固氮生物資源，具有與Rhizobium-豆科植物相似的固氮能力，在自然界能量循環(huán)和生態(tài)平衡中起重要作用，但同具有固氮能力的木本豆科植物相比，非豆科樹木共生固氮體系具有兩大特點，一抗逆性強，耐干旱、耐鹽堿，抗高寒、瘠薄，能在一般豆科植物不能生長的惡劣環(huán)境下正常生長結(jié)瘤固氮，常用作三北干旱地區(qū)造林先鋒植物；二樹木分布廣，具有廣譜的自然寄主范圍。而且非豆科固氮植物幾乎全部為木本雙子葉，這些樹種有很強的抗逆性，分布廣、適應(yīng)性強，因而在營林生產(chǎn)中應(yīng)用這類植物的生物潛力是相當(dāng)大的，非豆科樹木共生固氮體系抗逆性強，且分布廣，資源豐富，因此開展Frankia-非豆科樹木聯(lián)合共生體系的理論與應(yīng)用研究，不僅對豐富和發(fā)展聯(lián)合共生理論具有重要意義，而且在加速樹木生長，解決農(nóng)村資源短缺，減少水土流失，改良土壤和改善生態(tài)環(huán)境等方面將產(chǎn)生重大的經(jīng)濟和生態(tài)環(huán)境效益。
非豆科固氮樹種-沙棘是三北地區(qū)重要墾荒先鋒樹種，其果實富含維生素，具有重要的經(jīng)濟開發(fā)價值。很早以前許多學(xué)者就認(rèn)識到高等植物、根瘤、菌根同時存在的聯(lián)合共生現(xiàn)象，固氮植物菌根的存在就是這種聯(lián)合共生現(xiàn)象的具體表現(xiàn)；已有研究表明聯(lián)合共生體中菌根菌與共生固氮菌之間存在著相互促進(jìn)作用，尤其是菌根菌對固氮菌的固氮作用具有明顯的增效作用，菌根的存在促進(jìn)了宿主植物的生長，改善了植物根際的微生態(tài)環(huán)境；但是這類研究基本上是限于VA菌之間或外生菌之間，并且多停留在現(xiàn)象的描述上，并未在純培養(yǎng)條件下進(jìn)行，就將其歸功于雙接種的增效作用，這種盲目性的結(jié)論必然導(dǎo)致不能更好地利用固氮植物資源和菌根技術(shù)，發(fā)揮固氮植物與微生物共生的優(yōu)勢作用和效果不夠理想，及對脆弱地帶的生態(tài)恢復(fù)效果必然受到影響；并且不同的固氮樹種需要適宜的不同的菌根菌、不同的固氮菌，它們不同的組合其增效作用明顯不同，那么選擇出不同樹木適宜的不同菌根菌與共生固氮菌顯得尤為重要；因為共生是一種雙向選擇過程，它們需要彼此相互適應(yīng)，如果彼此間不能相互協(xié)調(diào)，反而會抑制植物生長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種相互協(xié)調(diào)的適宜的VA菌根真菌、共生固氮菌與沙棘聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為將菌根菌、固氮菌與非豆科共生固氮植物沙棘相結(jié)合，以共生固氮為核心，發(fā)揮多學(xué)科配套優(yōu)勢，特別是對逆境條件下的沙棘與微生物共生生態(tài)的過程、生態(tài)功能和對環(huán)境的適應(yīng)及作用進(jìn)行研究，將純培養(yǎng)條件下的觀察測試與放大規(guī)模的田間模擬相結(jié)合，從微觀到宏觀角度揭示共生體系的基本規(guī)律及其相互關(guān)系，同時與沙棘選取相應(yīng)的菌種進(jìn)行混合接種，進(jìn)一步增強宿主植物沙棘與微生物間的親合力；本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為以沙棘為宿主植物的VA菌根真菌聚叢球囊霉(G.aggregatum)與沙棘為宿主植物的弗蘭克氏放線菌共同接種于沙棘形成沙棘聯(lián)合共生體。
其具體操作過程如下(1)共生菌種的選取在沙棘分布的干旱、半干旱地區(qū)，隨機選取至少3處不同地塊的樹齡在5年以上的沙棘根系樣品進(jìn)行形態(tài)解剖學(xué)觀察，確定其VA菌根菌的感染情況；依據(jù)菌根感染強度和固氮結(jié)瘤量，確定共生菌與沙棘的親合力，選定沙棘根際中的發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型和較優(yōu)的菌株，并在每一不同地塊多點取樣，于其根際中分離出VA菌根菌、弗蘭克氏放線固氮菌，分別出心裁進(jìn)行菌種擴繁培養(yǎng)；在純培養(yǎng)條件下，將分離培養(yǎng)好的菌種單接和組合搭配接種，以回接試驗確定其共生體形成效應(yīng)，進(jìn)一步對上述發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型進(jìn)行驗證，確定優(yōu)勢菌種和優(yōu)勢菌種組合；(2)共生體構(gòu)建用上述所選優(yōu)勢菌種組合對沙棘樹種進(jìn)行混合接種，構(gòu)建成聯(lián)合共生體。
其中所述弗蘭克氏放線固氮菌的優(yōu)良菌株的選取及確認(rèn)過程為(1)優(yōu)良菌株的初篩選擇不同宿主來源和同一宿主不同位點的菌株，在純培養(yǎng)中，在較為適宜的沙棘幼苗生長發(fā)育的相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行自生固氮活性的誘導(dǎo)培養(yǎng)，過一階段后(至少在一個月后)，進(jìn)行乙炔還原活性測定，活性高者為自生固氮活性強的菌株；(2)優(yōu)良菌株的確認(rèn)將自生固氮活性強的菌株與宿主植物進(jìn)行回接試驗，驗證菌株對宿主植物的感染結(jié)瘤量，同時測定其根瘤的固氮活性，以此確認(rèn)上述初篩菌株的優(yōu)劣。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明接種VA菌根菌及分離于沙棘根際中的固氮菌形成的聯(lián)合共生體效果優(yōu)于雙接種和單接種，以此為理論依據(jù)去應(yīng)用于造林生產(chǎn)實踐，會能發(fā)揮它們之間的促生優(yōu)勢；從而提高沙棘的抗逆性，而且在其感染VA菌后可極大地提高宿主的抗旱性、抗鹽堿性、抗重金屬毒害及抗極端PH值等能力。
2.本發(fā)明接種VA菌根菌及分離于沙棘根際中的固氮菌形成的聯(lián)合共生體增強宿主植物沙棘的適應(yīng)性，能夠較好地應(yīng)用于今后的造林引種、育苗及經(jīng)濟林等生產(chǎn)實踐中，尤其是逆境條件下的造林與復(fù)墾；同時在促進(jìn)沙棘生長，沙棘病蟲害的防治等方面都有很好的應(yīng)用前景；能更好地恢復(fù)和重建農(nóng)林生態(tài)系統(tǒng)而發(fā)揮共生優(yōu)勢。
3.本發(fā)明聯(lián)合共生體的構(gòu)建豐富和發(fā)展了聯(lián)合共生理論，在森林生態(tài)系統(tǒng)中有較大的應(yīng)用潛力，在加速沙棘樹木生長，解決農(nóng)村資源短缺，減少水土流失，改良土壤和改善生態(tài)環(huán)境等方面將產(chǎn)生重大的經(jīng)濟和生態(tài)環(huán)境效益；在營林生產(chǎn)中應(yīng)用這類植物有巨大的生物潛力。
4.本發(fā)明通過純培養(yǎng)驗證了固氮樹種沙棘優(yōu)良性狀的發(fā)揮優(yōu)劣與其同時受菌根侵染和結(jié)瘤有關(guān)，以聯(lián)合共生生態(tài)效應(yīng)為主干，創(chuàng)建出沙棘聯(lián)合共生體優(yōu)化組合的應(yīng)用技術(shù)；為生物適應(yīng)貧瘠環(huán)境提供有效途徑，增加其對不良環(huán)境的適應(yīng)能力；為沙棘聯(lián)合共生體接種技術(shù)在造林生產(chǎn)實踐尤其是在逆境條件下的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。
具體實施例方式
實施例本實施例圍繞北方干旱和半干旱地區(qū)逆境條件下固氮樹種沙棘，以下實驗過程中部分方法參照《菌根研究及應(yīng)用》(中國林業(yè)出版社，1997年第一版)一書。
1.共生菌種的選取(1)在選定固氮樹種沙棘分布的干旱、半干旱地區(qū)，隨機選取4處不同地塊的樹齡在5年以上的沙棘根系樣品進(jìn)行形態(tài)解剖學(xué)觀察確定其VA菌根菌的感染情況；依據(jù)菌根感染強度和固氮結(jié)瘤量，確定共生菌與沙棘的親合力，選定沙棘根際中的發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型和較優(yōu)的菌株，并在每一不同地塊多點取樣，于其根際中分離出VA菌根菌，弗蘭克氏放線固氮菌，分別進(jìn)行菌種擴繁培養(yǎng)；供試菌株內(nèi)生菌根真菌VAR為摩西球囊霉(Glomus mosseae)分離于刺槐林下；VAH為聚叢球囊霉(G.aggregatum)分離于沙棘林下。內(nèi)生菌根菌以孢子形式分離于林下根際土壤中(土深約10～30厘米)，以三葉草為宿主植物進(jìn)行菌種擴繁備用。
弗蘭克氏放線菌HR16，HR18，HR32，HR37分離于不同地塊的不同點位沙棘林下(見表1)。
表1

在純培養(yǎng)條件下，將分離培養(yǎng)好的菌種單接和組合搭配接種，以回接試驗確定其共生體形成效應(yīng)，進(jìn)一步對上述發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型進(jìn)行驗證，確定優(yōu)勢菌種和優(yōu)勢菌種組合；其中所述弗蘭克氏放線固氮菌的優(yōu)良菌株的選取及確認(rèn)過程為
首先進(jìn)行優(yōu)良菌株的初篩選擇不同宿主來源和同一宿主不同位點的菌株，在純培養(yǎng)中，在較為適宜的相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行自生固氮活性的誘導(dǎo)培養(yǎng)，過一階段后，進(jìn)行乙炔還原活性測定，活性高者為自生固氮活性強的菌株；然后進(jìn)行優(yōu)良菌株的確認(rèn)將自生固氮活性強的菌株與宿主植物進(jìn)行回接試驗，驗證菌株對宿主植物的感染結(jié)瘤量，同時測定其根瘤的固氮活性，以此確認(rèn)上述初篩菌株的優(yōu)劣。
試驗方法A.沙棘種子的處理用自來水浸泡一小時，在震蕩器上用中性的消毒液吐溫2～3滴加到500毫升水中，漂洗90分鐘；用自來水沖洗90分鐘；再用30％的雙氧水滅菌30分鐘，后用無菌水反復(fù)沖洗幾次；在無菌室將上述處理過的種子2～3粒置放在盛有瓊脂培養(yǎng)基的指形管中，置于恒溫箱(25℃)內(nèi)待無菌苗長出二片葉后進(jìn)行移植。
B.基質(zhì)配置及用量培養(yǎng)基質(zhì)為珍珠巖、泥碳分別過2mm篩，珍珠巖取篩上大粒，泥碳取下面粒性均一的碎屑，珍珠巖泥碳按7∶1的質(zhì)量比用M.M.N營養(yǎng)液拌料，所用M.M.N營養(yǎng)液為總質(zhì)量1.2倍，將上述拌好的基質(zhì)用塑料布蒙12小時，待水分充分滲透后，將基質(zhì)按2/3高度裝入500毫升三角瓶，輕輕壓實，瓶壁擦干凈，高壓蒸氣滅菌1.5小時。
C.菌種用量及接種過程弗蘭克氏菌懸液在勻漿器中勻碎離心(1000r/m，5-10min)，離心后的菌體按每100株苗接種離心后菌體1毫升的量接種；VA菌根菌真菌每瓶50個孢子，首先在基質(zhì)中接入VA菌孢子，然后在每瓶栽入5棵無菌苗，一周后在接入弗蘭克氏放線菌，每種搭配重復(fù)三次，瓶口蓋上口徑5厘米的塑料小杯，自然光照為主，輔以人工光照(105000LUX)，室溫條件下培養(yǎng)5個月，每2～3天澆20-30毫升無菌水每瓶，在小苗長至瓶口時打開杯蓋。
接種處理單接HR37，單接HR32，單接HR18，單接HR16，單接VAR，單接VAH；雙接VAR+VAH；不加接種物為CK；每種處理重復(fù)3次。
D.培養(yǎng)6個月后對沙棘小苗進(jìn)行測試苗高、地徑、生物量(植株干重)、菌根侵染率、結(jié)瘤干量、固氮活性。其中菌根侵染率采用壓片染色法計數(shù)統(tǒng)計，用形態(tài)解剖學(xué)法對根部菌根特征進(jìn)行觀察。固氮活性的測定采用國際通用的乙炔還原法，于實驗室在100型氣相層析儀上檢測乙炔含量。
(2)結(jié)論沙棘聯(lián)合共生的確認(rèn)(在純培養(yǎng)條件下，較單純的根際環(huán)境，這種確認(rèn)是確鑿可信的)A.VA菌根真菌侵染的確認(rèn)通過壓片染色法，根據(jù)根樣鮮嫩的特點加熱處理時間適當(dāng)縮短來進(jìn)行VA菌根真菌感染的觀測在感染VA菌根菌的沙棘根系皮層組織細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)泡囊及胞內(nèi)菌絲，泡囊在皮層薄壁細(xì)胞內(nèi)或在細(xì)胞間由菌絲體頂端膨大形成，其形態(tài)為橢圓形或長橢圓形，在根系表面也觀察到了VA菌根菌根外菌絲的結(jié)構(gòu)，同時在根際培養(yǎng)基質(zhì)中篩出了VA菌根真菌孢子。通過鏡檢觀察根系侵染結(jié)果，充分確認(rèn)了沙棘能形成菌根。
同時接種弗蘭克氏放線菌的沙棘能夠結(jié)瘤，證明了沙棘能夠與弗蘭克氏放線菌形成共生體進(jìn)行結(jié)瘤固氮作用。
B.菌根真菌對于沙棘生長的增效作用菌根作為一種高等植物和真菌之間互利共生的活體營養(yǎng)現(xiàn)象，是真菌和植物長期協(xié)同進(jìn)化的結(jié)果，菌根為共生雙方提供了更廣闊的生存和發(fā)展的可能性，實驗結(jié)果證實了接種菌根真菌對宿主植物的生長有明顯的促進(jìn)作用，同時接種不同的VA菌對宿主植物生長有改善作用是有差別的；如表2所示。
表2

菌根對宿主植物沙棘的生長有促進(jìn)作用，不同來源的菌根真菌對沙刺的促進(jìn)作用是不同的；其中接種VAH對宿主植物的植株表現(xiàn)較好的生長狀況；而接種VAR促進(jìn)作用雖有，但體現(xiàn)不十分明顯；混合接種與對照比也有增長，但不如單接VAH好?？梢妼ι臣瑏碚f，VAH是相對較好的共生植株，從菌根的生長狀況可以明顯看出，這說明宿主植物良好的生長狀況是由于菌根侵染所形成的。接種VAH好的原因也許是VAH分離于沙棘林下，經(jīng)過長期限的協(xié)同進(jìn)化，菌根菌與宿主植物之間彼此適應(yīng)，相互獲益，而VAR來自刺激槐林下，在人工構(gòu)建成中雖能形成共生體，并有一定的促進(jìn)作用，但共生體是長期進(jìn)化的結(jié)果，人工建立共生體恐怕不符進(jìn)化規(guī)律，因而增效不明顯；當(dāng)兩種內(nèi)生菌根混合時，由于兩種菌之間存在著競爭，因而限制了其作用的發(fā)揮。這說明了菌根真菌侵染宿主植物存在著一定的專一性，土著共生菌種的選擇對于聯(lián)合共生體的建立具有重要的意義。
表3


C.弗蘭克氏放線菌對沙棘生長的作用，如表3所示。
弗蘭克氏放線菌對沙棘的生長具有促進(jìn)作用，沙棘可與弗蘭克氏菌形成共生體，具有很強的固氮能力，滿足植物生長氮素的需求，促進(jìn)植物的生長，實驗結(jié)果證實了這點，同時也可以看出，不同來源的弗蘭克氏菌對沙棘的生長的促進(jìn)作用是不同的，這也說明了非豆科固氮樹木沙棘與弗蘭克氏放線菌聯(lián)合共生體的建立很有必要進(jìn)行優(yōu)良菌株的篩選。接種HR16、HR37兩株為較好的共生菌株，HR18、HR32也有一定的促生作用，但相對于上兩株效果稍差一些；這充分證明了宿主植物沙棘良好的生長狀況與弗蘭克氏放線菌的作用是緊密相關(guān)的。
通過人工純培養(yǎng)實驗，對沙棘根部形態(tài)特性解剖學(xué)觀察證實，非豆科固氮樹木沙棘能夠被VA菌根侵染形成VA菌根，同時也能被弗蘭克氏放線菌侵染形成根瘤。
2.沙棘聯(lián)合共生體的構(gòu)建用上述所選優(yōu)勢菌種組合對沙棘樹種進(jìn)行混合接種，構(gòu)建成聯(lián)合共生體，優(yōu)勢菌種組合為VA菌根菌及分離于固氮樹種根際中的固氮菌。
人工構(gòu)建盆栽實驗盆栽是半開放的，相對于純培養(yǎng)條件來說，接近自然條件，因此它是純培養(yǎng)的進(jìn)一步擴展，能為大面積的應(yīng)用聯(lián)合共生技術(shù)進(jìn)行植樹造林提供基礎(chǔ)，并形成一套可行的人工接種方法。
(1)材料與方法A.供試土壤來自樹木園林內(nèi)40厘米以下的生土，過篩，在陽光下曬二天，加干燥滅菌的河沙，沙土比為2∶1，混勻后裝入直徑為20厘米的泥盆中，每盆加過磷酸鈣5克，每盆裝2.5公斤；土壤理化性質(zhì)如表4所示。
表4

B.實驗處理(1)不加接種物(對照)；(2)接種弗蘭克氏放線菌HR16；(3)接種菌根真菌一VAR，二VAH；(4)同時接種VAR和HR16；每種處理重復(fù)5次，每盆保證有5棵苗。
接種物來源和菌劑用量弗蘭克氏放線菌HR16分離于沙棘根瘤；VA菌根接種物是通過白車軸草擴繁后獲得含有孢子和細(xì)根碎片(侵染率為48％)的菌根菌劑，其中VAR為摩西球囊霉(Glomus mosseae)分離于刺槐林下、VAH為聚叢球囊霉(G.aggregatum)分離于沙棘林下每盆接種50克，均勻散布于盆中。放線菌在勻漿器中勻碎離心(1000轉(zhuǎn)/每分鐘，5-10分鐘)，離心后的菌體按1毫升/100棵苗的量接種。
C.沙棘種子處理用氯化汞消毒滅菌，在28℃的恒溫箱中催芽；挑選萌芽整齊生長良好的種子播種；先將內(nèi)生菌根真菌接種于盆中，播入種子；小苗長出一星期，接種放線菌，盆栽前兩個星期置于溫室中，之后放于室外，6個月后進(jìn)行各項指標(biāo)測試。
D.生長指標(biāo)和生理指標(biāo)的測定6個月后進(jìn)行各項指標(biāo)測試，包括株高、地徑、鮮重、主根長、側(cè)根數(shù)、結(jié)瘤量、固氮活性、葉綠素含量、凈光和效率；其中葉綠素含量采用ANON法進(jìn)行測量；凈光和效率采用CL-301P光合測定儀進(jìn)行測定；菌根侵染率采用壓片染色法進(jìn)行計數(shù)統(tǒng)計；菌根及根瘤分別采用壓片和切片法進(jìn)行形態(tài)解剖觀察；固氮活性采用乙炔還原法進(jìn)行測試。
(2)結(jié)論A.聯(lián)合共生的確認(rèn)菌根侵染的沙棘根系表現(xiàn)出根毛的退化，小根的分叉、變粗，外形多成瘤狀、塊根狀；纏繞于根外的菌絲體，疏松，不形成明顯的菌絲套，菌絲可穿過根部表皮細(xì)胞內(nèi)，有的還可以進(jìn)入到內(nèi)皮層細(xì)胞內(nèi)，壓片染色后在細(xì)胞內(nèi)的菌絲體較肥大，有的斷裂成小段，有的形成泡囊狀和樹叢狀，或盤旋成扭結(jié)狀，證實沙棘確能形成內(nèi)生菌根；同時也可看到根瘤，證明沙棘能被侵染結(jié)瘤。
表5

B.菌根菌對沙棘生長的促進(jìn)作用如表5所示。
從以上結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，接種VA菌根菌明顯促進(jìn)了沙棘的生長，接種VAR與VAH比對照組都好，并且菌根的發(fā)育狀況更好，其中VAH表現(xiàn)效果最佳，這充分證明了宿主植物沙棘的良好生長狀況是由于菌根侵染帶來的，即VA菌根對于非豆科固氮樹木沙棘的生物量的提高起了關(guān)鍵性的作用；從接種VAR和VAH植株生長狀況不同說明不同的菌根真菌對宿主植物的促生作用是不同的，這也從一定程度上說明了菌根真菌對宿主植物具有選擇性，從而可以肯定土著菌種的選擇對聯(lián)合共生體的建立起關(guān)鍵性的作用。從沙棘的葉綠素含量和凈光和效率兩項生理指標(biāo)可以看出菌根的形成增強了沙棘對營養(yǎng)元素的吸收，激素水平的變化，從而使葉綠素合成加快，另一方面菌根的形成促使葉綠素降解減緩；在一定條件下，葉綠素的含量和二氧化碳的吸收之間表現(xiàn)出很強的相關(guān)性，即在一定范圍內(nèi)葉綠素含量高，光和效率就高，而光合作用的提高對于促進(jìn)沙棘的生長，延緩葉片的脫落，提高其抗逆性舉足輕重，這也是從植物生理的角度驗證了菌根真菌的促生作用。
C.弗蘭克氏菌對沙棘生長的促進(jìn)作用如表5所示。
接種菌種的植株的各項指標(biāo)都較好，說明其對宿主植物沙棘來說是一種較合適的共生菌種，能夠改善植物的氮素營養(yǎng)從而促進(jìn)植物的生長。這說明弗蘭克氏放線菌可以提高樹木的生理功能，增強其對逆境的適應(yīng)性。
D.VA菌根對弗蘭克氏菌結(jié)瘤固氮的影響如表5所示。
內(nèi)生菌根真菌能幫助植物從土壤中獲得礦物營養(yǎng)(尤其是那些難溶性營養(yǎng)成分)、增加水分的吸收和植物對土壤脅迫條件的耐受性以及植物激素的產(chǎn)生，并且改變植物體內(nèi)C素的分布類型。隨之而發(fā)生的是植物細(xì)胞尤其是根細(xì)胞膜透性、根系分泌物和滲出物數(shù)量和質(zhì)量的改變，并且最終影響植物根際微生物的類型和種群數(shù)量，并且表現(xiàn)出很強的選擇性，這就是菌根根際效應(yīng)，本實驗以沙棘為對象進(jìn)行定量分析，證明菌根菌對于植株的結(jié)瘤固氮能力的促進(jìn)作用，同時也顯示出不同的菌根真菌對弗蘭克氏放線菌的結(jié)瘤固氮能力的促進(jìn)作用是不同的。
從實驗結(jié)果可以看出，接種弗蘭克氏放線菌和菌根菌的植株其結(jié)瘤量和固氮活性要好于只接弗蘭克氏放線菌的植株，而它們都比對照組高，其中接種VAH和HR16的結(jié)瘤固氮能力最高；可以看出不同的接菌條件下固氮能力與菌根的發(fā)育狀況存在正相關(guān)性，說明由于VA菌根菌的存在的作用才導(dǎo)致宿主植物沙棘的結(jié)瘤固氮能力提高，即菌根對于放線菌的結(jié)瘤固氮能力具有促進(jìn)作用，但不同菌根其促進(jìn)作用不同，VAH是相對較好的共生菌株，原因可能是其與沙棘長期共生協(xié)同進(jìn)化，能體現(xiàn)出較好的共生效益，而VAR只是人為的設(shè)置與沙棘共生，雖能形成共生體，但若想達(dá)到完全的協(xié)調(diào)一致，還需進(jìn)化，從而再次說明選育共生株最好選擇伴生的土著菌種，這樣才有可能發(fā)揮最佳的共生生態(tài)效益。
E.弗蘭克氏對菌根的作用如表5所示。
VA菌根真菌從孢子的萌發(fā)到菌絲在皮層細(xì)胞內(nèi)形成叢枝和泡囊的整個發(fā)育過程中，因其與弗蘭克氏菌生活在同一根際微生態(tài)系統(tǒng)中，必然會受到弗蘭克氏菌的影響；弗蘭克氏菌除了能通過改善宿主植物的生長狀況來間接的影響菌根外，還可通過分泌物來改變根際環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)根系的發(fā)育。
接種弗蘭克氏放線菌對植株菌根的發(fā)育狀況有一定的影響，同時接種放線菌和菌根真菌的植株發(fā)育狀況要明顯好于只接菌根真菌的植株，接種放線菌明顯地促進(jìn)了菌根菌的發(fā)育狀況，在菌根菌的發(fā)育狀況和結(jié)瘤固氮能力之間體現(xiàn)一定的正相關(guān)性，由此可知，放線菌對菌根菌的發(fā)育有著促進(jìn)作用，并且因菌種的不同促進(jìn)作用也不同，針對沙棘來說，對放線菌HR16的結(jié)瘤固氮能力促進(jìn)效果較好的是VAH這種菌根真菌。
F.VA菌與弗蘭克氏菌的協(xié)同作用如表5所示。
VA菌根和根瘤能夠同時存在于沙棘上，說明它們形成的聯(lián)合共生體是自然選擇狀態(tài)下的最優(yōu)生存方式，那么它們間必然存在著協(xié)同作用。結(jié)果表明，接種VAH和HR16的植株明顯的體現(xiàn)了較好的聯(lián)合共生生態(tài)效益，它們間協(xié)同進(jìn)化，彼此協(xié)調(diào)，功能互補，在促進(jìn)沙棘生物量的提高，生理功能的增強以及抗逆性提高方面都好于其它菌種；因此，從上述分析可知，聯(lián)合共生優(yōu)勢是建立在菌種合理搭配的基礎(chǔ)上的，最佳的菌種選擇應(yīng)是宿主植物的土著菌種，這與最佳結(jié)瘤固氮，最佳菌根發(fā)育狀況的菌種組合是一致的。
從上表可看出，雙接種菌根菌和放線菌不但促進(jìn)了菌根的發(fā)育狀況，也提高了放線菌的結(jié)瘤固氮能力，這種彼此促進(jìn)的良好效應(yīng)，必然導(dǎo)致聯(lián)合共生優(yōu)勢的產(chǎn)生。
從實驗中我們可以明顯的發(fā)現(xiàn)放線菌的結(jié)瘤固氮能力與菌根菌的發(fā)育狀況之間的相互增效作用；對植物生長起重要作用的因素除水份以外，氮、磷營養(yǎng)的供應(yīng)是最重要的，放線菌能夠固定大氣中的氮素，滿足植物生長對氮素的需求，而菌根促進(jìn)宿主植物吸磷素是一個普遍現(xiàn)象，菌根菌通過根外菌絲的形成直接吸收養(yǎng)份并運輸給宿主植物，同時固氮菌和菌根菌都具有生防的功能是聯(lián)合共生體促進(jìn)宿主植物生長的另一個原因，菌根的侵染改變了根系的形態(tài)以及生理生化性狀，限制了病菌的侵染，放線菌能夠通過分泌一些抗生素來達(dá)到生防的目的；關(guān)于二者之間協(xié)同作用的一個問題是既然放線菌可以產(chǎn)生抗生素，而菌根真菌也能分泌抑制性物質(zhì)，它們間必然會帶來一定的副效應(yīng)，因而促進(jìn)作用和副效應(yīng)之間的平衡問題是成為聯(lián)合共生體共生效益能否發(fā)揮的關(guān)鍵，從實驗結(jié)果也證實了此點，VAR與HR16的接菌組合不如VAH和HR16的接菌組合效果好，所以在于副效應(yīng)在整體的協(xié)同作用中占了較大的比例。
本實施例所用各類菌株都為非特異性的菌株體，而各菌株體所在的菌種于自然界普遍存在，分布較廣，各菌種在微生物學(xué)雜志、生態(tài)學(xué)報、土壤學(xué)報、林業(yè)科學(xué)研究、應(yīng)用生態(tài)學(xué)報上1989～2000年間發(fā)表的論文中均有提及和利用，摩西球囊霉分離于刺槐林下，聚叢球囊霉分離于沙棘林下，都于1998年分離得到，依據(jù)N.C.SCHEWCK andYVONNE PEREZ 1988.1Mannual for the identification of VA mycorrizalfungi(second edition published)進(jìn)行分類鑒定；沙棘林下的弗蘭克氏放線菌分離于1982年，此后，先后在微生物學(xué)報、微生物學(xué)雜志、應(yīng)用生態(tài)學(xué)報上1984～1994年間發(fā)表的論文中均有提及和利用。
權(quán)利要求
1.沙棘聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于以沙棘為宿主植物的VA菌根真菌聚叢球囊霉與沙棘為宿主植物的弗蘭克氏放線菌共同接種于沙棘形成沙棘聯(lián)合共生體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述沙棘聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于其中所述弗蘭克氏放線菌為HR16。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述沙棘聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于具體操作過程如下(1)共生菌種的選取在沙棘分布的干旱、半干旱地區(qū)，隨機選取至少3處不同地塊的樹齡在5年以上的沙棘根系樣品進(jìn)行形態(tài)解剖學(xué)觀察，確定其VA菌根菌的感染情況；依據(jù)菌根感染強度和固氮結(jié)瘤量，確定共生菌與沙棘的親合力，選定沙棘根際中的發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型和較優(yōu)的菌株，并在每一不同地塊多點取樣，于其根際中分離出VA菌根菌、弗蘭克氏放線固氮菌，分別進(jìn)行菌種擴繁培養(yǎng)；在純培養(yǎng)條件下，將分離培養(yǎng)好的菌種單接和組合搭配接種，以回接試驗確定其共生體形成效應(yīng)，進(jìn)一步對上述發(fā)育狀態(tài)較優(yōu)的菌種類型進(jìn)行驗證，確定優(yōu)勢菌種和優(yōu)勢菌種組合；(2)共生體構(gòu)建用上述所選優(yōu)勢菌種組合對沙棘樹種進(jìn)行混合接種，構(gòu)建成聯(lián)合共生體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述沙棘聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，其特征在于其中所述弗蘭克氏放線固氮菌的優(yōu)良菌株的選取及確認(rèn)過程為(1)優(yōu)良菌株的初篩選擇不同宿主來源和同一宿主不同位點的菌株，在純培養(yǎng)中，在較為適宜的沙棘幼苗生長發(fā)育的相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行自生固氮活性的誘導(dǎo)培養(yǎng)，過一階段后，進(jìn)行乙炔還原活性測定，活性高者為自生固氮活性強的菌株；(2)優(yōu)良菌株的確認(rèn)將自生固氮活性強的菌株與宿主植物進(jìn)行回接試驗，驗證菌株對宿主植物的感染結(jié)瘤量，同時測定其根瘤的固氮活性，以此確認(rèn)上述初篩菌株的優(yōu)劣。
全文摘要
本發(fā)明涉及非豆科固氮樹木聯(lián)合共生技術(shù)，具體地說是沙棘聯(lián)合共生體的構(gòu)建方法，以沙棘為宿主植物的VA菌根真菌聚叢球囊霉(G.aggregatum)與沙棘為宿主植物的弗蘭克氏放線菌共同接種于沙棘形成沙棘聯(lián)合共生體。本發(fā)明接種VA菌根菌及分離于沙棘根際中的固氮菌形成的聯(lián)合共生體提高沙棘的抗逆性，增強宿主植物沙棘的適應(yīng)性，能夠較好地應(yīng)用于今后的造林引種、育苗及經(jīng)濟林等生產(chǎn)實踐中，尤其是逆境條件下的造林與復(fù)墾；同時在促進(jìn)沙棘生長，沙棘病蟲害的防治等方面都有很好的應(yīng)用前景；豐富和發(fā)展了聯(lián)合共生理論。
文檔編號A01H1/00GK1465226SQ0213242
公開日2004年1月7日 申請日期2002年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月21日
發(fā)明者何興元, 張成剛, 田春杰, 韓桂云 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所