專利名稱：一類活性十二肽抗菌素的制作方法
技術領域：
肽類抗菌素在自然界已普遍存在，幾乎所有的動物、植物和微生物均能產(chǎn)生一種或多種抗菌肽。目前已報道過的有幾千種，例如從青蛙皮膚及哺乳動物中性粒細胞中分離出的多種抗菌肽。
十幾年來，盡管在肽類抗菌素的基礎研究上有明顯的進展，但在藥物開發(fā)上受到諸多局限。這些局限源于傳統(tǒng)的研究開發(fā)手段一是從生物體中直接分離提取抗菌多肽，但是由于這類天然抗菌多肽一般都有難以預測的副作用，很難直接作用于動物體內(nèi)；二是合成天然多肽的衍生物以提高其抗菌活性或減低副作用。但由于化學結(jié)構(gòu)修改的規(guī)律很難預料，此領域的研究迄今未見有滿意的成果；三是利用組合性方法合成大量多肽及建立多肽庫，然后再進行抗菌活性篩選。此法耗費巨大，周期很長，在實踐中很難尋找到合適的多肽抗菌素。鑒于以上三種主要因素的局限，阻礙了肽類抗菌素的發(fā)展。本發(fā)明采取先設計出肽類抗菌藥的序列結(jié)構(gòu)，再用人工合成法合成出具有抗菌活性的小分子肽，可用于抗細菌、霉菌、病毒感染的醫(yī)療、化妝品、食品、農(nóng)藥等相關領域。本發(fā)明所涉及的小分子肽還可用于對腫瘤的抑制、殺滅的醫(yī)療領域。
背景技術：
抗菌素是目前用于治療細菌和真菌感染的主要藥物。然而，病原菌對現(xiàn)有抗菌素的抗藥性急劇擴大，尤為嚴重的是病原菌對多種抗菌素的抗藥性的細菌數(shù)急劇擴大，這種情況嚴重的影響了人類感染性疾病的治療，威脅著人類的健康。2000年國家衛(wèi)生部、國家藥品監(jiān)督管理局聯(lián)合發(fā)布通知，在臨床使用抗菌藥時，應嚴格控制抗菌藥的使用范圍，防止濫用抗菌藥，其目的是防止病原菌對抗菌藥的耐藥性。由政府多部委聯(lián)合頒布政府令控制某類藥品的應用，這在我國是不多見的政例，可見病原菌的耐藥性問題已提到當務之急的緊迫的地位。世界各國都在采取各種措施防止抗菌素濫用，以此來控制細菌耐藥性。在采取各種措施防止抗菌素濫用的同時，研究新的抗菌藥是世界各國醫(yī)藥和科研人員的當務之急的研究課題，而活性肽類抗菌素(又稱小分子肽類抗菌素)是當今世界醫(yī)藥界最活躍、最有發(fā)展?jié)摿?、最有前途的抗菌素藥研究方向。本發(fā)明所涉及的一類活性十二肽抗菌藥屬于小分子肽類抗菌素。
發(fā)明的目的本發(fā)明目的在于開發(fā)小肽抗菌藥，并用于包括抗細菌、霉菌、病毒感染、污染的醫(yī)療、化妝品、食品、農(nóng)藥的領域。以及對腫瘤的抑制或殺滅的醫(yī)療領域。
發(fā)明簡述我們根據(jù)肽類抗菌素的作用原理和蛋白質(zhì)化學的立體構(gòu)效關系，選擇性的設計合成了由十二個氨基酸排列構(gòu)成的十二肽抗菌素，其特點如下1、所及的氨基酸序列均為創(chuàng)新設計，不同于已發(fā)表的自然及人工多肽序列。
2、目前的初步試驗已證實該類十二肽抗菌素對革蘭氏陽性及陰性細菌有較強的殺菌作用。
3、由于其抗菌機制不同于通用的抗菌素，理論上不易誘發(fā)細菌產(chǎn)生抗藥性，因而對解決病菌的抗藥性具有較大的應用潛力。
發(fā)明詳述本發(fā)明的參與者張建華利用現(xiàn)代計算機技術對肽類抗菌素設計的方法進行了研究，為快速有效地發(fā)展肽類抗生素提供了有效的方法，該方法已另外在國外申報發(fā)明專利。我們使用張建華的有關研究成果，根據(jù)肽類抗菌素的作用原理和蛋白質(zhì)化學的立體構(gòu)效關系，設計了具有十二肽結(jié)構(gòu)特點的氨基酸序列，其特點為構(gòu)成十二肽的氨基酸的組成可分為三個部分氨基端4個氨基酸，中央4個氨基酸和羧基端4個氨基酸其嚴格的一級結(jié)構(gòu)序列選擇使得這些氨基酸形成穩(wěn)固的α-螺旋和β-折角，作用于細胞的細胞膜上而破壞其結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮抗菌作用。根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)序列，還可合成相應的同分異構(gòu)體，如用D型氨基酸合成相應的多肽序列(反手鏈)，因機體內(nèi)沒有分解此類氨基酸的酶，則有可能提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性及胃腸道用藥的可能性。
根據(jù)本發(fā)明可以設計并合成具有上述抗菌活性結(jié)構(gòu)的十二肽抗菌素，并以此為原料可制備各種劑型的藥品、化妝品、消殺藥品、農(nóng)藥等相關產(chǎn)品，這些產(chǎn)品可用于細菌、霉菌、病毒感染、污染的醫(yī)療、化妝品、食品、農(nóng)藥的領域。還可用于對腫瘤的抑制或殺滅的醫(yī)療領域。
在本發(fā)明所設計的活性十二肽抗菌藥的氨基酸序列確定以后，可用化學合成法、生物發(fā)酵和半化學合成法(半合成法)、基因工程的手段得到。尤其應用基因工程的手段，將短肽序列相應的基因片斷插入到基因載體，制造出含有相應基因的基因工程菌，用發(fā)酵的方式大規(guī)模低成本地生產(chǎn)抗菌肽。此處需要申明的是肽類的發(fā)明主要是其氨基酸序列的發(fā)明，在確定其氨基酸序列以后，具體的生產(chǎn)可有多種途徑，現(xiàn)代的肽類合成技術可以方便的滿足已明確氨基酸序列的肽類化合物的合成。所以本發(fā)明僅限于具有上述結(jié)構(gòu)特點的十二肽化合物的氨基酸序列，以及以此氨基酸序列合成出的十二肽和它們的相關產(chǎn)品，不涉及具體的合成方法和具體的合成工藝。
下面的實施例用于進一步說明本發(fā)明，但不意味本發(fā)明僅限于此。
實施例11、依據(jù)本專利所描述的十二肽的結(jié)構(gòu)特點所設計的第一個十二肽抗菌藥的氨基酸序列為A用中文表達的氨基酸序列精氨酸-纈氨酸-精氨酸-精氨酸-丙氨酸-纈氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-纈氨酸-精氨酸-纈氨酸B用英文縮寫(國際符號)表達的氨基酸序列為Arg-Val-Arg-Arg-Ala-Val-Arg-Arg-Val-Val-Arg-Val本小肽取名為1號十二肽抗菌素。
C、抗菌活性試驗我們用肽合成儀按設計的氨基酸序列制備了1號十二肽抗菌素，并進行了體外抗菌試驗用以證明設計思想的正確性。為此我們在試驗中將Bactenecin這種公認具有較強抗菌作用的天然十二肽作為陽性對照。同時我們又設計并合成了兩種結(jié)構(gòu)上不具備上述抗菌活性特點的十二肽(分別取名為對照肽一號、對照肽二號)作為陰性對照。
為了全面評價1號十二肽的殺菌活性，我們初步選用了三種革蘭氏染色陽性細菌和三種革蘭氏陰性菌作為靶細菌(見表一)。其中包括了常見的醫(yī)學病原菌和植物病原菌。測定程序則按照抗菌素活性測定的標準方法。試驗簡述如下將待測1號十二肽溶于水中至每毫升含一毫克，取5微升滴于含有待測細菌的軟瓊脂肉湯平板上，培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱內(nèi)25攝氏度培養(yǎng)過夜，然后記錄抑菌圈大小。
表一所用靶細菌標準拉丁名 中文革蘭氏染色 致病特點Bacillus megaterium 巨型芽胞桿菌 陽性 人體致病菌Staphylococcus aureus金黃色葡萄球菌 陽性 人體致病菌Claribacter michiganensis 陽性 植物病原菌Escherichia coli 大腸桿菌 陰性 人體Pseudomonas aeruginosa 綠膿桿菌 陰性 人體Burkholderia cepacia陰性 人體及植物在選用的菌種中，Staphylococcus aureus金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是用于測定抗菌素活性的標準菌，而Pseudomonasaeruginosa綠膿桿菌和Burkholderia cepacia則是對抗菌素有抗性的菌種。結(jié)果表明十二肽一號對所測六種細菌均顯示了殺菌活性，其中對Bacillus Megaterium巨型芽胞桿菌和Claribacter michiganensis的活性最強。天然抗菌肽Bacterecin只對其中五種有效而對Burkholderia cepacia無效。所用的兩個陰性對照十二肽只對Pseudomonas aeruginosa綠膿桿菌有很弱的活性(見


圖1)。
圖1一號十二肽、Bactenecin及對照肽對巨型芽孢桿菌的抗菌作用為比較十二肽一號和Bacterecin對Bacillus Megaterium巨型芽胞桿菌的抗菌活性，我們將兩者系列稀釋至同樣的梯度濃度(1000ng/μl-60.3ng/μl)，然后測定其在軟瓊脂平板上對Bacillus Megaterium巨型芽胞桿菌的抗菌活性。以產(chǎn)生半透明抑菌圈的前一個濃度為最低有效濃度，1號十二肽為250ng/l，Bactenecin為500ng/μl。(見圖2)圖2一號十二肽和Bactenecin及對巨型芽孢桿菌(B.megaterium)的抗菌效價測定。濃度范圍為1000ng/μl至60.3ng/μl為精確測定1號十二肽的最低有效濃度，我們按照常規(guī)測定抗菌素最低有效濃度的方法，用96孔組織培養(yǎng)板法。于每排第一孔中加入90μl營養(yǎng)肉湯和10μl的待測抗菌肽母液(1μg/μl)，然后以1∶2的比例系列稀釋。最后每孔加入50μl營養(yǎng)肉湯(含50000個菌落形成單位)。然后振蕩培養(yǎng)22-24小時。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)溫度為37攝氏度，其他細菌為25度。由于Claribacter michiganensis生長較慢，其培養(yǎng)時間為48小時。每個試驗重復3次以上。細菌生長測定采用培養(yǎng)平板檢測儀測定在波長600納米的吸收值，以確定待測物的最低殺菌濃度(見上表2)。如上表2所示，1號十二肽對所測靶細菌均有效，是一廣譜殺菌劑，對革蘭氏陽性菌的效果最好。雖然對有的細菌，1號十二肽的最低有效濃度稍高于Bactenecin，但仍類似于市售常用抗菌素的最低有效濃度。(見表二)表二1號十二肽及其對照物的最低有效濃度(μg/ml)菌株 十二肽一號 對照1 對照2 BactenecinBacillus megaterium 3.13- -0.2巨型芽胞桿菌KMStaphylococcus aureus金黃色葡萄球菌ATCC2593 50 - -12.5Claribacter michiganensis13-3 12.5- -＜0.2Escherichia coli大腸桿菌ATCC2592250 - -50Pseudomonas aeruginosa ＞50＞50＞50 ＞50綠膿桿菌A01Burkhoderia cepacia72-208＞50- --注-表示無抑菌作用。
限制天然肽類抗菌素應用的一個重要因素是其往往具有溶血活性以及與血清發(fā)生反應，從而限制了其在人體及動物體的應用。如Bactenecin就具有明顯的溶血和血清凝集反應。為了測定1號十二肽是否也有同樣缺陷，我們做了如下試驗試驗1是直接用十二肽一號的母液(1μg/μl)，按標準血漿瓊脂平板法測定其溶血活性。結(jié)果表明在如此高的濃度下，培養(yǎng)6小時仍無溶血現(xiàn)象出現(xiàn)。
試驗2是將1號十二肽直接與兔血清混合，使最終濃度為100μg/ml及1000μg/ml。結(jié)果表明兔血清與1號十二肽無任何反應。而Bactenecin在同樣條件下則與兔血清產(chǎn)生明顯的沉淀反應。
綜合以上結(jié)果，我們認為1號十二肽受血清影響較小，因而將在活體有較大的應用潛力。
實施例2依據(jù)本專利所描述的十二肽的結(jié)構(gòu)特點所設計的第二個十二肽抗菌藥的氨基酸序列為A用中文表達的氨基酸序列精氨酸-纈氨酸-精氨酸-精氨酸-丙氨酸-纈氨酸-精氨酸-纈氨酸-纈氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸B用英文縮寫(國際符號)表達的氨基酸序列為Arg-Val-Arg-Arg-Ala-Val-Arg-Val-Val-Arg-Arg-Val本小肽抗菌素取名為2號十二肽抗菌素。
實施例3依據(jù)本專利所描述的十二肽的結(jié)構(gòu)特點所設計的第三個十二肽抗菌藥的氨基酸序列為A用中文表達的氨基酸序列纈氨酸-精氨酸-纈氨酸-纈氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-精氨酸B用英文縮寫(國際符號)表達的氨基酸序列為Val-Arg-Val-Val-Arg-Arg-Val-Ala-Arg-Arg-Val-Arg本小肽抗菌素取名為3號十二肽抗菌素。
實施例4依據(jù)本專利所描述的十二肽的結(jié)構(gòu)特點所設計的第四個十二肽抗菌藥的氨基酸序列為A用中文表達的氨基酸序列精氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-纈氨酸-纈氨酸-纈氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-精氨酸B用英文縮寫(國際符號)表達的氨基酸序列為Arg-Arg-Arg-Val-Val-Val-Val-Ala-Arg-Arg-Val-Arg本小肽抗菌素取名為4號十二肽抗菌素。
實施例5依據(jù)本專利所描述的十二肽的結(jié)構(gòu)特點所設計的第五個十二肽抗菌藥的氨基酸序列為A用中文表達的氨基酸序列纈氨酸-纈氨酸-纈氨酸-精氨酸-丙氨酸-纈氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-纈氨酸-精氨酸-纈氨酸B用英文縮寫(國際符號)表達的氨基酸序列為Val-Val-Val-Arg-Ala-Val-Arg-Arg-Val-Val-Arg-Val本小肽抗菌素取名為5號十二肽抗菌素。
權(quán)利要求
1.具有十二肽結(jié)構(gòu)特點的氨基酸序列，其特點為構(gòu)成十二肽的氨基酸的組成可分為三個部分氨基端4個氨基酸，中央4個氨基酸和羧基端4個氨基酸，其嚴格的一級結(jié)構(gòu)序列選擇使得這些氨基酸形成穩(wěn)固的α-螺旋和β-折角，作用于細胞的細胞膜上而破壞其結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮抗菌作用。具有其特點的肽鏈的一級序列，及其衍生序列，如反向序列，反手鏈等和其相應的DNA序列，以及應用以上序列研究開發(fā)的具有抗菌活性結(jié)構(gòu)的十二肽抗菌素，并以此為原料制備的各種劑型的藥品、化妝品、消殺藥品、農(nóng)藥等相關產(chǎn)品，這些產(chǎn)品可用于細菌、霉菌、病毒感染、污染的醫(yī)療、化妝品、食品、農(nóng)藥的領域，還可用于對腫瘤的抑制或殺滅的醫(yī)療領域。
2.為描述本發(fā)明而舉例的5個活性十二肽抗菌素實例的肽鏈的一級序列第一個十二肽抗菌藥的肽鏈的一級序列為A用中文表達的氨基酸序列精氨酸-纈氨酸-精氨酸-精氨酸-丙氨酸-纈氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-纈氨酸-精氨酸-纈氨酸B用英文縮寫(國際符號)表達的氨基酸序列為Arg-Val-Arg-Arg-Ala-Val-Arg-Arg-Val-Val-Arg-Val第二個十二肽抗菌藥的肽鏈的一級序列為A用中文表達的氨基酸序列精氨酸-纈氨酸-精氨酸-精氨酸-丙氨酸-纈氨酸-精氨酸-纈氨酸-纈氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸B用英文縮寫(國際符號)表達的氨基酸序列為Arg-Val-Arg-Arg-Ala-Val-Arg-Val-Val-Arg-Arg-Val第三個十二肽抗菌藥的肽鏈的一級序列為A用中文表達的氨基酸序列纈氨酸-精氨酸-纈氨酸-纈氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-精氨酸B用英文縮寫(國際符號)表達的氨基酸序列為Val-Arg-Val-Val-Arg-Arg-Val-Ala-Arg-Arg-Val-Arg第四個十二肽抗菌藥的肽鏈的一級序列為A用中文表達的氨基酸序列精氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-纈氨酸-纈氨酸-纈氨酸-丙氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-精氨酸B用英文縮寫(國際符號)表達的氨基酸序列為Arg-Arg-Arg-Val-Val-Val-Val-Ala-Arg-Arg-Val-Arg第五個十二肽抗菌藥的肽鏈的一級序列為A用中文表達的氨基酸序列纈氨酸-纈氨酸-纈氨酸-精氨酸-丙氨酸-纈氨酸-精氨酸-精氨酸-纈氨酸-纈氨酸-精氨酸-纈氨酸B用英文縮寫(國際符號)表達的氨基酸序列為Val-Val-Val-Arg-Ala-Val-Arg-Arg-Val-Val-Arg-Val及其它們的衍生序列，如反向序列，反手鏈等和其相應的DNA序列，以及應用以上序列研究開發(fā)的具有抗菌活性結(jié)構(gòu)的十二肽抗菌素，并以此為原料制備的各種劑型的藥品、化妝品、消殺藥品、農(nóng)藥等相關產(chǎn)品，這些產(chǎn)品可用于細菌、霉菌、病毒感染、污染的醫(yī)療、化妝品、食品、農(nóng)藥的領域，還可用于對腫瘤的抑制或殺滅的醫(yī)療領域。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有十二膚結(jié)構(gòu)特點的氨基酸序列，其特點為構(gòu)成十二肽的氨基酸的組成可分為三個部分氨基端4個氨基酸，中央4個氨基酸和羧基端4個氨基酸，其嚴格的一級結(jié)構(gòu)序列選擇使得這些氨基酸形成穩(wěn)固的α－螺旋和β－折角，作用于細胞的細胞膜上而破壞其結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮抗菌作用。根據(jù)其一級結(jié)構(gòu)序列，還可合成相應的同分異構(gòu)體，如用D型氨基酸合成相應的多肽序列(反手鏈)，因機體內(nèi)沒有分解此類氨基酸的酶，則有可能提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性及胃腸道用藥的可能性。
文檔編號A61P31/00GK1446821SQ0211625
公開日2003年10月8日 申請日期2002年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月26日
發(fā)明者高華, 張建華, 傅亞敏 申請人:高華, 張建華, 傅亞敏