專利名稱：重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKaIT1的基因工程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，具體地說涉及設(shè)計基因DNA順序，DNA化學(xué)全合成和DNA重組等基因工程技術(shù)。
背景技術(shù)：
蝎屬節(jié)肢動物門、蛛形綱、蝎目，是已知最古老的陸生節(jié)肢動物，已有四億多年的生存史。全世界一共約有800種蝎子，其中對人體構(gòu)成危害的，即具有醫(yī)學(xué)意義的約有50種，它們幾乎都屬于鉗蝎科。中國有15種蝎子，其中以馬氏鉗蝎(亦稱東亞馬氏鉗蝎，Buthus Martensii Karsch，下簡稱BmK)分布最廣，它屬于鉗蝎科中的鉗蝎亞科，主要分布在河南、山東和遼寧一帶。馬氏鉗蝎毒的毒性較弱，對人無致命危險，在我國的傳統(tǒng)醫(yī)藥寶庫中也有重要的位置。本草綱目指出蝎“主治中風(fēng)半身不遂口眼歪斜語澀手足抽掣”。
蝎毒是由蝎尾的毒腺所分泌的成分較復(fù)雜的混合物，其主要毒性成分是分子量介于5000到10000道爾頓之間的蛋白類神經(jīng)毒素，其中絕大部分是一類選擇性地影響電壓敏感鈉離子通道的由60到70個氨基酸殘基組成的單鏈多肽。這些神經(jīng)毒素根據(jù)其作用對象可分為哺乳動物毒素、昆蟲毒素和甲殼動物毒素。1994年Gurevitz，M.根據(jù)一級結(jié)構(gòu)的同源性和毒性作用的選擇性，將鉗蝎亞科的蝎毒素分為以下幾類[參見文獻(xiàn)J.Toxicol.-Toxin Reviews(1994)13，65-100](1)α型哺乳動物毒素，與神經(jīng)、肌肉的鈉通道作用，使動作電位延長，去極化減緩，表現(xiàn)出抑制去極化；(2)β型哺乳動物毒素，表現(xiàn)出致極化，造成鈉離子的異常通透；(3)興奮型昆蟲毒素，表現(xiàn)出提高動作電位并減緩其滅活，使得動作神經(jīng)持續(xù)激活；(4)抑制型昆蟲毒素，引起緩慢的抑制性麻痹作用，通過增加休止鈉離子的通透性并抑制活性鈉離子的傳導(dǎo)，實現(xiàn)對鈉離子的阻遏；(5)α型昆蟲毒素，對昆蟲具有強(qiáng)的活性，而對哺乳動物則呈弱的毒性，具有與α型哺乳動物毒素相似的化學(xué)序列結(jié)構(gòu)，以及相似的抑制鈉通道失活化功能。電生理顯示此類毒素與大鼠腦突觸體鈉通道不發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，而與昆蟲鈉通道的結(jié)合不依賴膜電位。本發(fā)明中所涉及到的由工程菌表達(dá)的重組蝎毒rBmKαIT1即屬于此類α型昆蟲毒素。
正是由于蝎神經(jīng)毒素所具備的特異活性和高度選擇性，它們作為重要的工具已經(jīng)并正在被日益廣泛地應(yīng)用于神經(jīng)生物科學(xué)中涉及到相關(guān)靶離子通道蛋白成分的鑒定與純化，毒素與受體位點結(jié)合的特異性和敏感性，以及其受體調(diào)控胞內(nèi)遞質(zhì)釋放和信息傳輸?shù)姆肿訖C(jī)制等生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)理論研究。另一方面，它們作為未來的新型藥物也正顯示出十分誘人的潛力和前景。長鏈蝎毒素具有高的同源性，特別是八個半胱氨酸殘基在肽鏈氨基酸序列中的位置和構(gòu)成4對特定的二硫鍵，是蝎毒素的一個保守結(jié)構(gòu)因素。蝎毒素都具有共同的折疊方式，即由一個α螺旋和3個反平行的β折疊組成。因此蝎毒素也是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的極好模型。由于天然來源的蝎毒中含有結(jié)構(gòu)同源性很強(qiáng)的多種蝎毒多肽，因此從天然來源分離純化單一的蝎毒多肽基因有一定困難。1988年Carbonell等首次由Buthuseupeus蝎中昆蟲神經(jīng)毒素氨基酸序列推導(dǎo)并化學(xué)合成其基因序列，但僅在桿狀病毒載體中得到微弱表達(dá)[參見文獻(xiàn)Gene(1988)73，409-418]，自此人們廣泛試驗將各種屬的系列蝎毒素基因重組到大腸桿菌、酵母、桿狀病毒、植物等表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。在絕大多數(shù)的表達(dá)載體中只有無活性或含量非常少的活性蛋白可以表達(dá)并純化。這是由于蝎毒素所含有的4對二硫鍵能否正確重組所造成的。Zilberberg，N.等人在大腸桿菌內(nèi)以包涵體形式表達(dá)了LqhαIT蝎毒，并在體外復(fù)性獲得了活性蛋白[參見文獻(xiàn)Biochemistry(1996)35，10215-10222]。Tonny，M.J.等人采用了氧化型的大腸桿菌菌株表達(dá)β型的蝎毒CssII獲得成功[參見文獻(xiàn)Peptides(2000)21，767-772]。我國在蝎毒表達(dá)這一領(lǐng)域也展開了積極的研究。Shao，F(xiàn).等人在啤酒酵母中成功表達(dá)了BmK M1蝎毒[參見文獻(xiàn)ProteinExpression and Purification，(1999)17，358-365]。在大腸桿菌中表達(dá)有活性的東亞馬氏鉗蝎毒，尤其是α型昆蟲毒素目前尚無報道。1999年Wu，H.-M.等人報道了BmKαIT1的氨基酸序列[參見文獻(xiàn)Pure Appl.Chem.(1999)71，1157-1162]，2000年Zhu，S.-Y.等人報道了BmαTX12的cDNA及其推導(dǎo)的編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列[參見文獻(xiàn)Toxicon(2000)38，1653-1661]，該序列與BmKαIT1的氨基酸序列涉及的是同一個客觀實體。因此，我們綜合了兩者的合理部分作為設(shè)計重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的依據(jù)之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題就是用基因工程方法制備重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1及其突變體。
本發(fā)明提供了重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1基因，其DNA的核苷酸順序如下所示1 76C ATG GTT CGT GAT GCA TAT ATT GCC CAA AAC TAC AAT TGT GTA TAC CAT TGT GCT CGT GAT GCA TAT TGC AAC GAA151CTG TGC ACT AAG AAT GGT GCC AAG TCC GGA TCT TGC CCA TAC TTG GGT GAG CAC AAA TTC GCC TGC TAC TGC AAG206GAC CTG CCA GAT AAC GTT CCA ATC CGT GTC CCG GGT AAG TGC CAC TAA TAGGATC由這個合成基因衍生的突變體基因，可與上述的合成基因相對應(yīng)的密碼子有50％以上相同。
本發(fā)明的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的表達(dá)質(zhì)?？梢允琴|(zhì)粒pE2rBmKαIT(于2001年11月28日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏號為CGMCC No.0655)，結(jié)構(gòu)如下所示 該表達(dá)質(zhì)粒的宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌BL21(DE3)。
在大腸桿菌中表達(dá)有活性的重組東亞馬氏鉗蝎毒，尤其是α型昆蟲毒素目前尚無報道。本發(fā)明針對這一特點，在不排斥探索分離天然蝎毒多肽基因的同時，采用人工設(shè)計基因的戰(zhàn)術(shù)，從而保證了需要合成的蝎毒蛋白的結(jié)構(gòu)規(guī)定性和確定性。如前所述，本發(fā)明綜合了BmKαIT1的氨基酸序列與BmαTX12的cDNA及其推導(dǎo)的編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列兩者的合理部分以及在大腸桿菌中表達(dá)需要相應(yīng)的密碼子與之匹配，人工設(shè)計了編碼rBmKαIT1結(jié)構(gòu)基因序列，它與天然報道的cDNA的密碼子有51％不同。
本發(fā)明用基因工程方法制備重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1蛋白，在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)出除N-端增加一個Met殘基外與天然蝎毒具有相同氨基酸序列的多肽鏈，并在體外復(fù)性為有活性的蝎毒蛋白。其是通過設(shè)計并化學(xué)合成重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1結(jié)構(gòu)基因序列，即通過分步配對一次T4 DNA連接酶反應(yīng)的單鏈DNA合成法[參考文獻(xiàn)Chen，H.-B.et al.Nucl.Acids.Res.(1990)18，871-878]，將化學(xué)合成的寡核苷酸片段連接合成該基因并直接克隆入載體pET15b，得到表達(dá)質(zhì)粒pE2rBmKαIT1，并將此表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，目的蛋白以包涵體形式獲得高表達(dá)，接著通過體外復(fù)性使二硫鍵正確重組，高效液相色譜分離，從而獲得二硫鍵正確配對的有活性的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1蛋白。
本發(fā)明提供了一種能在大腸桿菌中表達(dá)并在體外復(fù)性獲得有活性的rBmKαIT1蛋白的基因工程制備方法，通過重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1結(jié)構(gòu)基因的設(shè)計，化學(xué)全合成、基因表達(dá)、表達(dá)產(chǎn)物的體外復(fù)性及分離純化和活性測定而確定得到重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1蛋白。具體過程例如1.重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1結(jié)構(gòu)基因的設(shè)計將成熟的東亞馬氏鉗蝎毒BmKαIT1肽鏈64個氨基酸殘基順序兩端分別配上起始碼和雙重終止碼后輸入計算機(jī)，運轉(zhuǎn)有關(guān)程序，按大腸桿菌高表達(dá)基因簡并密碼子的相對使用頻率數(shù)據(jù)[參見文獻(xiàn)Wada，K.，Nucl.Acids Res.(1992)20(supplement)，2111]，設(shè)計盡可能多的常用的單一的限制性內(nèi)切酶位點的要求和分子克隆需要安置兩端的限制性內(nèi)切酶NcoI和BamHI識別序列設(shè)計了含206個堿基的rBmKαIT1結(jié)構(gòu)基因，如圖1所示。在這個合成基因中，除了兩端的NcoI和BamHI外，我們還設(shè)置了9個常用的單一的限制性內(nèi)切酶位點，它們的分布情況見圖2，而相應(yīng)的BmKαIT1天然基因中只有2個這種位點。另外，對照BmKαIT1天然基因，在編碼區(qū)有許多堿基不一樣，這是為了改變34個密碼子(占67個密碼子的50.8％)使基因工程的rBmKαIT1更適應(yīng)于在大腸桿菌中表達(dá)。
2.重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1結(jié)構(gòu)基因的化學(xué)全合成本發(fā)明參照Chen，H.-B.等人的文獻(xiàn)方法[Nucl.Acids Res.(1990)18，871-878]加以改進(jìn)后完成了rBmKαIT1結(jié)構(gòu)基因的化學(xué)合成。用T4 DNA連接酶經(jīng)單鏈法催化連接化學(xué)合成的寡核苷酸片段成為單鏈DNA(ssDNA)大片段，然后用DNA重組技術(shù)將連接成的rBmKαIT1的單鏈大片段克隆進(jìn)質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，使之在宿主菌內(nèi)裝配成完整rBmKαIT1結(jié)構(gòu)基因雙鏈DNA，得到含此基因的克隆質(zhì)粒。圖3表示rBmKαIT1結(jié)構(gòu)基因的正股被劃分為A、B、C、D四個大片段以及連接和克隆所需的A’b、bc、cd和D’等負(fù)股短片段。圖4的瓊脂糖凝膠電泳分離結(jié)果顯示用DNA單鏈法合成了rBmKαIT1結(jié)構(gòu)基因的單鏈。將它們重組到載體pET15b中并轉(zhuǎn)化宿主菌得到含完整rBmKαIT1結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒pE2rBmKαIT1(CGMCC No.0655)，經(jīng)過DNA測序分析證明合成基因與設(shè)計的完全一致。
3.重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的表達(dá)質(zhì)粒pE2rBmKαIT1轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后取單菌落接種于LB培養(yǎng)基，經(jīng)預(yù)培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá)后，經(jīng)SDS變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析鑒定出現(xiàn)一條與預(yù)期分子量一致的表達(dá)產(chǎn)物(如圖8所示)。
4.重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的體外復(fù)性與分離純化和鑒定采用如圖7所示的純化步驟，超聲破碎表達(dá)后的菌體，依次用緩沖液洗滌沉淀，用變性溶液溶解后，再經(jīng)過透析、復(fù)性、濃縮，最后用高效液相色譜分離純化(圖10和11)。純化產(chǎn)物(圖9和11)依次用圓二色性光譜、毛細(xì)管電泳、1H核磁共振、電噴霧質(zhì)譜、電生理及昆蟲整體活性測定等技術(shù)鑒定，結(jié)果(見圖12～21)表明基因工程產(chǎn)生的重組rBmKαIT1具有與天然分離的BmKαIT1相同的完整α型抗昆蟲活性。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比。目前文獻(xiàn)報道的還沒有國產(chǎn)的東亞馬氏鉗蝎在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)并得到完整的二硫鍵正確配對的蝎毒多肽。通過大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)獲得重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1，比從天然分離純化而得具有費時少，方便可行，經(jīng)濟(jì)效益高的特點。通過普通的生物發(fā)酵即可制備高純度的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1。


圖1重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1合成基因與天然BmKαIT1基因及其編碼的氨基酸順序。
圖中說明第一行為東亞馬氏鉗蝎毒BmKαIT1天然基因的DNA核苷酸順序(只給出與設(shè)計順序不同的堿基)；第二行為重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1合成基因設(shè)計的DNA核苷酸順序；第三行為重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1蛋白的氨基酸順序。
圖2重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1合成基因中限制性核酸內(nèi)切酶位點分布圖。
圖3為合成重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1合成基因而劃分的寡核苷酸片段。
圖4瓊脂糖凝膠(3％)電泳分離鑒定重組的rBmKαIT1合成的寡核苷酸片段及其連接產(chǎn)物——合成基因的單鏈。
圖中說明泳道1DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，長度依次為65，75，214，396，517，1419bp；泳道2連接產(chǎn)物；泳道3片段B；泳道4片段C；泳道5片段D。
圖5重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1合成基因克隆及表達(dá)質(zhì)粒pE2rBmKαIT1的構(gòu)建程序圖。
圖6pE2rBmKoIT1的DNA順序測定結(jié)果圖，從圖中60位附近NcoI識別順序CCATGG開始到260位附近的HindIII識別順序GGATCC為止的測定結(jié)果與設(shè)計的DNA順序完全一致。
圖7基因表達(dá)的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1蛋白的變性、復(fù)性和分離純化流程圖。
圖8大腸桿菌BL21(DE3)中質(zhì)粒pE2rBmKαIT1誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分離圖。
圖中說明菌液樣品經(jīng)過離心后收集沉淀的菌體，菌體經(jīng)過常規(guī)操作裂解后離心取上清液上樣至10％凝膠進(jìn)行SDS-PAGE分離。泳道1BL21(DE3)含pE2rBmKαIT1生長至A600為0.6，未誘導(dǎo)時的全菌蛋白；
泳道2～4依次為IPTG誘導(dǎo)4小時后的全菌蛋白，菌體裂解上清液和菌體裂解后的沉淀；泳道5沉淀經(jīng)洗滌后的包涵體。
圖9純化后的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的SDS-PAGE。
圖中說明電泳條件與圖8相同。泳道1蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上至下依次為26.6，17.0，14.2，6.5和3.5kDa；泳道2HPLC純化后的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1；泳道3HPLC純化的天然BmKαIT1。
圖10天然BmKαIT1和初步純化的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的C18RP-HPLC洗脫曲線圖。
圖中說明梯度設(shè)置為0min(5％ B)，5min(30％ B)，35min(40％ B)，40min(100％ B)，45min(100％ B)，50min(5％ B)和55min(5％ B)。
圖11重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的最終純化的HPLC洗脫曲線。
圖中說明梯度設(shè)置為0min(22％ B)，40min(26％ B)和45min(40％ B)。
圖12天然BmKαIT1和重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的圓二色性譜圖。
圖中說明○指天然BmKαIT1的CD譜圖；□指重組的rBmKαIT1的CD譜圖。
圖13天然BmKαIT1和重組的rBmKαIT1的毛細(xì)管電泳行為曲線。
圖中說明左圖指天然BmKαIT1的毛細(xì)管電泳行為；右圖指重組的rBmKαIT1的毛細(xì)管電泳行為。
圖14重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的1H NMR譜。
圖15重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的電噴霧質(zhì)譜圖。
圖中說明譜圖右上角由質(zhì)譜儀標(biāo)出重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1分子量顯示為7310.63+1.07與計算值7310.5在合理的誤差范圍內(nèi)。
圖16重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的電生理性質(zhì)。
圖中說明在全細(xì)胞電壓片鉗實驗中重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1對大鼠背根神經(jīng)節(jié)鈉電流峰電流的影響。上圖為對照實驗，記錄了從背根神經(jīng)節(jié)的靜息電位-70mV開始，以每10mV遞增直至+30mV的脈沖刺激對鈉電流的影響；中圖顯示1μmol/L重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1使鈉電流的失活化減緩；下圖為10mV刺激鈉電流達(dá)到峰值時重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1對鈉電流失活化的影響。
圖17重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1對德國小蠊半數(shù)麻痹量(PU50)的測定。
圖中說明按圖中虛線計算而得，對德國小蠊的50％麻痹量(PU50)為15.6μg/kg，與已報道的天然BmKαIT1的PU50值24.16μg/kg在允許的誤差范圍內(nèi)。
圖18用表面等離子體共振(SurfacePlasmon Resonance，SPR)測定不同濃度的蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜懸浮液與重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1結(jié)合對共振單位(Resonance Unit，RU)的影響。
圖中說明從上至下依次代表濃度為36，18，12，9和6pmol/L的蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜懸浮液與固定在芯片表面的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1結(jié)合的RU隨時間變化的曲線。
圖19高濃度重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1對固定化的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的競爭抑制。
圖中說明上一條曲線代表36pmol/L蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜懸浮液與固定在芯片表面的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的結(jié)合的RU隨時間變化的曲線；下一條曲線代表36pmol/L蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜懸浮液與30μmol/L重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1在25℃溫育1小時后與固定在芯片表面的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的結(jié)合的RU隨時間變化的曲線，此曲線表明高濃度重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1事先對蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜的結(jié)合完全抑制了固定在芯片表面的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1對蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜的結(jié)合，即不存在非特異性吸附。
圖20不同濃度的蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜懸浮液與天然BmKαIT1的結(jié)合對RU值的影響。
圖中說明從上至下依次代表濃度為36，18，12，9和6pmol/L的蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜懸浮液與固定在芯片表面的天然BmKαIT1的結(jié)合的RU隨時間變化的曲線。
圖21高濃度重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1對固定化的天然BmKαIT1的競爭抑制。
圖中說明上一條曲線代表36pmol/L蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜懸浮液與固定在芯片表面的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的結(jié)合的RU隨時間變化的曲線；下一條曲線代表36pmol/L蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜懸浮液與30μmol/L重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1在25℃溫育1小時后與固定在芯片表面的天然BmKαIT1的結(jié)合的RU隨時間變化的曲線，此曲線表明高濃度重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1事先對蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜的結(jié)合完全抑制了固定在芯片表面的天然BmKαIT1對蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜的結(jié)合。
圖22不同濃度的大鼠腦突觸體膜懸浮液與重組BmKαIT1的結(jié)合對RU值的影響。
圖中說明曲線A、B分別代表濃度為36和9pmol/L的蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜懸浮液與固定在芯片表面的重組rBmKαIT1的結(jié)合的RU隨時間變化的曲線。曲線C、D分別代表濃度為175和58.3pmol/L的大鼠腦突觸體膜懸浮液與固定在芯片表面的重組rBmKαIT1的結(jié)合的RU隨時間變化的曲線。此曲線表明重組rBmKαIT1對大鼠腦突觸體膜沒有結(jié)合。
圖23不同濃度的大鼠腦突觸體膜懸浮液與天然BmKαIT1的結(jié)合對RU值的影響。
圖中說明曲線A、B分別代表濃度為36和9pmol/L的蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜懸浮液與固定在芯片表面的天然BmKαIT1的結(jié)合的RU隨時間變化的曲線。曲線C、D分別代表濃度為175和58.3pmol/L的大鼠腦突觸體膜懸浮液與固定在芯片表面的天然BmKαIT1的結(jié)合的RU隨時間變化的曲線。此曲線表明天然BmKαIT1對大鼠腦突觸體膜沒有結(jié)合。
圖24PCR突變的設(shè)計流程。
具體實施例方式
以下實施例有助于理解本發(fā)明，但不限于本發(fā)明的內(nèi)容材料與方法四種全保護(hù)的亞磷酰胺核苷單體和四種全保護(hù)的脫氧核苷CPG(ControlledPore Glass，500A或1000A)衍生物購自ABI公司(Applied Biosystem Inc.)。
ATP，牛血清白蛋白(BSA)，丙烯酰胺，溶菌酶，對甲基苯磺酰氟(PMSF)，胃酶抑素(pepstatin)A，碘乙酰胺，1，10-菲咯啉，Triton X-100，蛋白低分子量標(biāo)準(zhǔn)和考馬斯亮蘭G-250均購自Sigma公司。
T4 DNA連接酶購自華美生物工程公司(SABC)。
N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺，溴化乙錠(EthidiumBromide，EB)來自Aldrich公司；蘇式-1，4-二巰基-2，3-丁二醇(DTT)購自BDH公司；N，N，N′，N′-四甲基乙二胺(TEMED)購自E.Merck公司；Sep-pak C18反相柱購自Waters公司；低熔點瓊脂糖凝膠(LMP Agarose)購自Gibco BRL公司；pET15b質(zhì)粒和菌種BL21(DE3)購自Novagen公司；胰蛋白胨(Tryptone)和酵母抽取物(Yeast Extract)購自O(shè)xiod公司；鹽酸胍和三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自Amresco公司；Bradford蛋白定量用儲存液購自Bio-rad公司；5，5′-二巰基雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)購自Acros公司；CsCl和十二烷基硫酸鈉(SDS)購自Boehringer Mannheim公司；Macrosep(MWCO 3k)購自Pall-Gelman公司；C18 RP-HPLC柱(300，10×250和4.6×250mm)及其預(yù)柱Security Guard購自Phenomenex公司；CM5芯片及N-乙基-N-(二甲氨基丙基)-羰二亞胺(EDC)和N-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)購自瑞典BIACore公司；氨芐青霉素鈉(Amp)購自上海第四制藥股份有限公司；其他無機(jī)鹽和常用化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純試劑。
本發(fā)明中所涉及的基因合成用的寡核苷酸片段由本實驗室按固相亞磷酰胺三酯法在DNA合成儀(381A型，美國ABI公司)上合成。合成產(chǎn)物經(jīng)濃氨水60℃放置過夜，使之從固相上脫落并切除保護(hù)基團(tuán)，初產(chǎn)物濃縮后溶于水，用尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離，含純產(chǎn)物的凝膠帶經(jīng)碳酸氫三乙胺(1mol/L)浸出后，用Sep-pak C-18反相柱按文獻(xiàn)方法[參考文獻(xiàn)Lo，K.-M.，et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，2285-2289]脫鹽后得到純的寡核苷酸片段純的寡核苷酸片段B，C和D用T4多核苷酸磷酸化激酶和ATP按常規(guī)方法進(jìn)行5’磷酸化。
DNA核苷酸順序分析由上?；瞪锛夹g(shù)公司在ABI 3700自動測序儀上進(jìn)行。
8mol/L尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、SDS變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、低熔點瓊脂糖凝膠電泳分離純化DNA片段、寡核苷酸片段的5’磷酸化和質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞按常規(guī)方法進(jìn)行[參考文獻(xiàn)Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2ndEd)Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York]。
蛋白定量用Bradford試劑按文獻(xiàn)方法[Bradford，M.，Anal.Biochem.(1976)72，248]以BSA標(biāo)準(zhǔn)水溶液(1mg/ml的A280＝0.661)作A595對BSA濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后在相同條件下測蛋白樣品的A595，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定相應(yīng)的蛋白樣品濃度。
游離巰基定量用Ellman試劑按文獻(xiàn)方法進(jìn)行[Ellman，G.L.，Arch.Biochem.Biophysics(1959)82，70-77]。
HPLC是在Waters 510(Waters公司)上進(jìn)行的。檢測器為Waters 484型。C18 RP-HPLC柱(300，10×250和4.6×250mm)及其預(yù)柱的流動相為A液0.1％(v/v)TFA/H2O；B液0.1％(v/v)TFA/乙腈。流速為3ml/min。紫外檢測A280。
遠(yuǎn)紫外CD光譜是在JASCO J-715(美國)旋光分光計上進(jìn)行的。實驗條件比色杯光程長度為0.1cm，掃描范圍190-250nm，掃描速度10nm/min，時間常數(shù)0.25秒，溫度25℃。數(shù)據(jù)經(jīng)過進(jìn)一步處理，減小噪音，基線平滑，信號平均，最后得到平均殘基摩爾消光系數(shù)[θ](圖8c所示)。
毛細(xì)管電泳是在Waters Quanta 4000E毛細(xì)管電泳系統(tǒng)(美國WATERS公司)上進(jìn)行的。電泳條件流動相為50mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 2.5)，電壓25kV，溫度為30℃，時間為10min，毛細(xì)管為30cm長，直徑75μm。樣品進(jìn)樣時間為30秒，紫外檢測A214。
1H NMR是在Varian Inova-600譜儀上采集，在Sun工作站上用VNMR軟件進(jìn)行譜圖處理。數(shù)據(jù)在300K采集，用預(yù)飽和技術(shù)壓水峰?；瘜W(xué)位移根據(jù)水峰定標(biāo)。樣品溶于H2O/D2O(9∶1)，并用HCi或NaOH調(diào)節(jié)至pH 4.9，樣品終濃度0.66mmol/L。
重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的電噴霧質(zhì)譜是在QUATTRO LC(英國Macromass質(zhì)譜公司)上測定。
電生理實驗采用從成年大鼠的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)中分離的神經(jīng)元細(xì)胞[參考文獻(xiàn)Song，et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.(1997)282，707-714]。全細(xì)胞記錄采用小直徑DRG神經(jīng)元(10-25μm)。膜電流通過玻璃毛細(xì)管吸管(2-5MΩ)連接到EPC-9擴(kuò)增器，通過Pulse/Pulsefit software(德國HEKA elektronik)處理。吸管溶液由120mmol/L CsCl，20mmol/L氯化三乙基銨(TEACl)，5mmol/L Na2ATP，10mmol/L乙二醇雙乙胺醚-N，N′-四乙酸(EGTA)，10mmol/L HEPES，2.5mmol/LMgCl2和0.4mmol/L Na2GTP組成。溶液用CsOH調(diào)節(jié)至pH 7.3。外液組成為140mmol/L NaCl，5mmol/L KCl，2.5mmol/L CaCl2，1mmol/L MgCl2，10mmol/LHEPES和10mmol/L D-glucose。外液用NaOH調(diào)節(jié)至pH 7.3-7.4。Ag-AgCl鹽橋作為參比電極。峰電流根據(jù)它們和對照的相對強(qiáng)度被挑選出來。
抗昆蟲生物活性測定采用的昆蟲為德國小蠊(Blattella germanica，55±3mg)。將蛋白按不同濃度溶于測活緩沖液中，測活緩沖液組成為0.9％ NaCl和1％ BSA，腹腔注射0.6μl，并用石蠟封口，5分鐘后觀察麻痹癥狀，翅膀張開，后腿伸直，仰面躺下至少30分鐘，每測定一個數(shù)據(jù)用8個昆蟲。
大鼠腦突觸體膜按照文獻(xiàn)方法制備[參考文獻(xiàn)Dodd，P.R.et al.Brain Res.(1981)226，107-118]和蟑螂(Periplaneta americana)腹神經(jīng)節(jié)突觸體膜按照文獻(xiàn)方法制備[參考文獻(xiàn)Lima，M.E.D.et al，Insect Biochem.(1989)19，413-422]。突觸體膜懸浮于運行緩沖液[運行緩沖液含有140mmol/L氯化膽堿，1.8mmol/L CaCl2，5.4mmol/L KCl，0.8mmol/L MgSO4，10mmol/L D-葡萄糖和25mmol/L(pH 7.4)Hepes-Tris]。并加入蛋白酶抑制劑混合物至各組分終濃度為對甲苯磺酰氟(PMSF)50μg/ml，1μmol/L胃酶抑素A，1mmol/L碘乙酰胺和1mmol/L 1，10-菲咯啉。突觸體膜懸浮液的濃度用Bradford蛋白定量法定量。
SPR實驗是在BIACore 3000(瑞典BIACore公司)上進(jìn)行的。芯片采用CM5型。芯片表面的羧甲基葡聚糖先用35μl 1∶1(v/v)的400mmol/L N-乙基-N-(二甲氨基丙基)-羰二亞胺(EDC)和100mmol/L N-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)活化。重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1溶于固定緩沖液(此緩沖液組成為10mmol/L NaOAc，pH 6)中，終濃度0.2mg/ml，此蛋白溶液流經(jīng)芯片并將重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1或天然的BmKαIT1固定在芯片表面，至RU值到達(dá)750左右，停止進(jìn)樣。未反應(yīng)的N-羥基-琥珀酰亞胺酯用35μl封閉試劑(1mol/L鹽酸乙醇胺，pH 8.0)封閉。整個固定過程流速為5μl/min。配體與受體相互作用是通過檢測不同濃度的突觸體膜懸浮液結(jié)合于芯片表面的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1所造成的RU值的變化及其動力學(xué)過程。緩沖液為上述所提到的運行緩沖液。流速20μl/min，共流過60μl，溫度25℃。競爭實驗則先將蟑螂腹神經(jīng)節(jié)突觸體膜懸浮液與重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1混和于25℃放置1小時或大鼠腦突觸體膜懸浮液與重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1混和于37℃放置30分鐘再與芯片結(jié)合。
實施例1重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1基因的設(shè)計、全合成與克隆A、編碼重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1結(jié)構(gòu)基因的設(shè)計將重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的氨基酸順序輸入計算機(jī)后，運行DNAStar軟件，按照(1)大腸桿菌高表達(dá)基因密碼子使用頻率，(2)均勻安置單一的限制性內(nèi)切酶于重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1合成基因中，(3)合成基因片段分段和消除片段自身配對等三項要求人工選定每個氨基酸的密碼子而確定重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1結(jié)構(gòu)基因的DNA順序，如圖1所示。
B、寡核苷酸片段的制備寡核苷酸片段在DNA合成儀(ABI 381A型)上用固相亞磷酰胺三酯法合成。每個片段被單獨合成后，經(jīng)濃氨水60℃放置過夜，使之從固相上脫落并切除保護(hù)基團(tuán)，初產(chǎn)物濃縮后溶于水，用尿素變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離，含純產(chǎn)物的凝膠帶經(jīng)1mol/L碳酸氫三乙胺浸出后，用Sep-pak C-18反相柱按文獻(xiàn)方法[Lo，K.-M.，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1984)81，2285-2289]脫鹽后得到純的寡核苷酸片段。
純的寡核苷酸片段B，C和D用T4多核苷酸磷酸化激酶和ATP按常規(guī)方法進(jìn)行5’磷酸化。
C、重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1合成基因各片段的連接及連接產(chǎn)物的克隆寡核苷酸片段配對并連接合成完整的單鏈DNA正股各片段各取1nmol，負(fù)股各片段各取1.2nmol，按如下三組分別配對A+B+A′b，C+bc+cd和D+D′。90℃保溫3分鐘，然后自然冷卻至16℃，將三組溶液合并總體積為34μl，加入2單位T4 DNA連接酶，4℃連接過夜。
連接產(chǎn)物的克隆連接產(chǎn)物經(jīng)過3％低融點瓊脂糖凝膠電泳分離純化與pET15b的NcoI/BamHI雙酶切線性片段按9∶1比例一起連接，直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，酶切鑒定正確的菌落，經(jīng)進(jìn)一步順序分析鑒定證實(圖6)，得到了相應(yīng)的如圖5所示的克隆及表達(dá)質(zhì)粒pE2rBmKαIT1。
實施例2基因表達(dá)質(zhì)粒pE2rBmKαIT1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。取單菌落接入5ml LB培養(yǎng)基，此培養(yǎng)基中含有Amp(100μg/ml)，在37℃條件下振蕩過夜。然后在100ml上述培養(yǎng)基中，按1∶100接種，37℃培養(yǎng)至A600為0.6，再在1L的上述培養(yǎng)基中按1∶100接種，37℃培養(yǎng)至A600為0.6，加入IPTG至終濃度0.4mmol/L，繼續(xù)誘導(dǎo)4～6小時，表達(dá)產(chǎn)物用10％的Tris-Tricine SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖8所示。
實施例3表達(dá)產(chǎn)物的體外復(fù)性及分離純化A、包涵體的制備在4℃條件下，離心(5,500g)收集經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后的大腸桿菌菌體，菌體重懸于20ml緩沖液A中(緩沖液A由50mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)，2.5mmol/L EDTA，20mmol/L β-巰基乙醇組成)，加入溶菌酶和PMSF分別至終濃度為0.2mg/ml和1mmol/L，冰浴放置1小時后，超聲破菌10分鐘(～150W，超聲30秒，間歇30秒)，15,000g離心20分鐘，收集沉淀。沉淀依次用3×20ml緩沖液A(加入1％(v/v)Triton X-100)和20ml緩沖液A(內(nèi)含2mol/L鹽酸胍)洗滌。每次洗滌前先用緩沖液重懸沉淀，并在室溫下攪拌30分鐘，然后離心收集沉淀。這樣制備得到的即為較純的包涵體。
B、包涵體的溶解及體外復(fù)性將從1L培養(yǎng)基中得到的包涵體100mg，加入5ml變性緩沖液(變性緩沖液含有50mmol/L Tris-Cl(pH 7.5)，6mol/L鹽酸胍，0.2mol/L DTT)，4℃放置過夜，離心(15,000g)收集上清。上清以1∶50比例對透析緩沖液4℃透析過夜(透析緩沖液含有50mmol/L Tris(pH 7.5)，4mol/L鹽酸胍)后，離心收集透析上清液。透析上清液用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度定量，然后迅速用復(fù)性緩沖液稀釋此蛋白至終濃度為0.1mg/ml(復(fù)性緩沖液含有50mmol/LTris-Cl(pH 7.5)，50mmol/L KCl)。然后4℃放置此復(fù)性溶液并用Ellman反應(yīng)跟蹤游離巰基直至呈陰性反應(yīng)。
C、表達(dá)產(chǎn)物的分離純化將上述復(fù)性溶液用離心超濾裝置濃縮至3ml，上樣至C18 RP-HPLC柱，梯度洗脫。流動相為A液0.1％(v/v)三氟乙酸(TFA)/H2O；B液0.1％(v/v)TFA/乙腈。流速為3ml/min。紫外檢測A280。初步分離純化時梯度為0min(5％ B)，5min(30％ B)，35min(40％ B)，40min(100％ B)，45min(100％ B)，50min(5％ B)，55min(5％ B)。如圖10所示重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1的HPLC洗脫行為一致。最終純化的梯度為0min(22％ B)，40min(26％ B)，45min(40％ B)。如圖9和圖11所示最終純化的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的純度已達(dá)95％以上。
實施例4表達(dá)產(chǎn)物的純度及活性測定A、SDS-PAGE通過10％ Tris-Tricine SDS-PAGE進(jìn)行純度檢測，圖9顯示重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1不僅和天然的BmKαIT1電泳行為相同，蛋白條帶大小顯示同預(yù)期分子量一致，而且純度也達(dá)到95％以上。
B、圓二色性光譜(CD)重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1均溶于20mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)。圖12顯示了重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1具有相同的圓二色性行為，說明了重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1具有與天然的BmKαIT1相同的α螺旋、β折疊等二級結(jié)構(gòu)。
C、毛細(xì)管電泳(CE)重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1均溶于50mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 2.5)，樣品終濃度為0.1mg/ml。從圖13上可以看出重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1和天然的BmKαIT1具有相同的出峰時間，都是8.25分鐘，說明它們蛋白的表面性質(zhì)相同。
D、1HNMR譜()1HNMR譜(圖14)顯示峰形分散得很好，表明了重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1具有良好的空間三級結(jié)構(gòu)，即二硫鍵是正確裝配的而不是無序的。
E、質(zhì)譜重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的分子離子峰顯示為7310.63±1.07(圖15)，與計算的分子量7310.5一致。
F、電生理圖16顯示了在1μmol/L濃度下重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαITl對大鼠背根神經(jīng)節(jié)的鈉離子通道有明顯的減緩失活化的影響，說明了重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1具有α型蝎毒素的典型電生理性質(zhì)。
G、抗昆蟲生物活性測定重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1溶于測活緩沖液中，樣品終濃度分別為1，1.5，2和2.5ng/μl，每只小蠊注射0.6μl，每個濃度注射8只，共做3組獨立實驗。根據(jù)麻痹百分?jǐn)?shù)對濃度作圖，測活結(jié)果如圖17所示，可得到重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1對德國小蠊的50％麻痹量(PU50)為15.6μg/kg，與已報道的天然BmKαIT1的PU50值24.16μg/kg在允許的誤差范圍內(nèi)。說明重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1已具有天然BmKαIT1相同的抗昆蟲活性。
H、重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1和天然BmKαIT1與昆蟲鈉離子通道的結(jié)合測試CM5芯片經(jīng)NHS和EDC活化后分別與0.2mg/ml的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1和天然BmKαIT1進(jìn)行偶聯(lián)，然后用乙醇胺封閉。其最終偶聯(lián)上芯片的RU值分別為768和737，具有相同的偶聯(lián)水平。蟑螂腹神經(jīng)節(jié)突觸體膜懸浮液經(jīng)Bradford蛋白濃度定量，其濃度為0.45mg/ml(≈0.9nmol/L鈉離子通道)。按比例稀釋得到一系列濃度的蟑螂腹神經(jīng)節(jié)懸浮液，鈉離子通道的濃度，分別為36，18，12，9，6pmol/L。按濃度由低到高的次序依次進(jìn)樣，可得到不同濃度的鈉離子通道與芯片表面的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1(如圖18所示)和天然BmKαIT1(如圖20所示)結(jié)合所引起的RU值的變化。通過BIAevaluation3.1軟件按1∶1的Langmuir模式進(jìn)行動力學(xué)擬和，可得到重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1與昆蟲鈉離子通道的解離平衡常數(shù)為1.3×10-9mol/L，天然BmKαIT1與昆蟲鈉離子通道的解離平衡常數(shù)為1.3×10-8mol/L。芯片表面的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1和天然BmKαIT1對蟑螂腹神經(jīng)節(jié)突觸體膜懸浮液的非特異性吸附是由高濃度的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1(30μmol/L)與蟑螂腹神經(jīng)節(jié)突觸體膜懸浮液(36pmol/L)先在25℃溫育1小時后，再進(jìn)樣測定而得。從圖19和圖21表明高濃度重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1事先對蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜的結(jié)合可以完全抑制了固定在芯片表面的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1或天然BmKαIT1對蟑螂腹神經(jīng)突觸體膜的結(jié)合，即說明不存在非特異性吸附。
I、重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1和天然BmKαIT1與哺乳動物鈉離子通道的結(jié)合測試大鼠腦突觸體膜懸浮液經(jīng)Bradford蛋白濃度定量，其濃度為0.35mg/ml。按比例稀釋得到一系列鈉離子通道濃度的大鼠腦突觸體膜懸浮液，分別為350，175，116.7，87.5，70，58.3pmol/L。按濃度由低到高的次序依次進(jìn)樣，可得到不同濃度的鈉離子通道與芯片表面的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1和天然BmKαIT1結(jié)合所引起的RU值的變化。通過比較重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1和天然BmKαIT1與蟑螂腹神經(jīng)節(jié)突觸體膜和大鼠腦突觸體膜(如圖22和23所示)，可以看出不論重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1還是天然BmKαIT1，其對大鼠腦突觸體膜的結(jié)合遠(yuǎn)低于蟑螂腹神經(jīng)節(jié)突觸體膜，在175pmol/L的受體濃度下其RU值均低于20RU，說明對大鼠腦突觸體膜沒有結(jié)合。
綜合上述實驗結(jié)果，重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1對大鼠背根神經(jīng)節(jié)的鈉離子通道有明顯的減緩失活化的影響，與蟑螂腹神經(jīng)節(jié)突觸體膜有明顯的結(jié)合，但與大鼠腦突觸體膜沒有結(jié)合，說明了它具有α型抗昆蟲毒素的特征。
實施例5人工基因突變的例子，rBmKαIT1第30位的天冬酰胺(Asn)突變成天冬氨酸(Asp)，即N30D突變體的構(gòu)建。
A、PCR突變引物的設(shè)計PCR突變方法參照《現(xiàn)代基因操作技術(shù)》，胡福泉主編，人民軍醫(yī)出版社，第31章用Megaprimer PCR進(jìn)行基因突變和基因融合。
PCR突變的設(shè)計流程參見附圖24。上游引物A 5’GCGATGGCCATGGTTCGTGA 3’(內(nèi)含NcoI位點)突變引物M 5’(即附圖24中含突變堿基的下游引物)CTTGGCACCATCCTTAGTGCACAGTTCGTTG 3’下游引物B 5’GAGTGCGGCCGCAAGCTTGCATGCC 3’(含有BamH I和HindIII位點)B、質(zhì)粒pE2BmKαIT1-N30D的構(gòu)建PCR1以pE2BmKαIT1為模板，加入上游引物A和突變引物M，進(jìn)行第一輪PCR，PCR條件與普通PCR相同。PCR產(chǎn)物經(jīng)Agarose膠回收分離純化，得到108bp的片段，作為下一步PCR的大引物Megaprimer。
PCR2加入下游引物B，上游引物則采用上一步PCR的產(chǎn)物Megaprimer。100μl PCR反應(yīng)體積中有模板DNA(與PCR1中相同的pE2BmKαIT1)400ng，下游引物B 25pmol，Megaprimer 18pmol以及一般性PCR反應(yīng)物。退火溫度60℃，擴(kuò)增30個循環(huán)。取5μl反應(yīng)液經(jīng)Agarose低熔點膠分離(電泳緩沖液采用修改過的TAE緩沖液，EDTA濃度為0.1mM)，切下含所需大小片段的膠(257bp)放入Ultrafree-DA(Millipore Co.)離心10分鐘，得到20μl DNA提取液。取5μl溶液即作為下一步PCR反應(yīng)的模板。
PCR3100μl反應(yīng)體積中含模板5μl(約25ng)，上游引物A 100pmol，下游引物B 100pmol以及一般性PCR反應(yīng)物，擴(kuò)增30個循環(huán)。
PCR產(chǎn)物經(jīng)Agarose膠回收分離純化后，用Nco I/BamH I進(jìn)行酶切與pET15b的NcoI/BamH I酶切的線性質(zhì)粒連接，構(gòu)建了pE2BmKαIT1-N30D質(zhì)粒。
C、rBmKαIT1-N30D的分離純化及活性測定質(zhì)粒pE2BmKαIT1-N30D轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。細(xì)菌培養(yǎng)及后處理分離純化操作參見實施例2、3。但是在HPLC分離時沒有出現(xiàn)單峰，粗產(chǎn)物測定CD時主要顯示“無規(guī)卷曲”，1HNMR譜也顯示“無規(guī)卷曲”，抗昆蟲生物活性測定PU50表明其活性約為天然的4％左右。通過以上實驗說明30位殘基由Asn突變?yōu)锳sp以后，在我們的復(fù)性條件下不能得到正確折疊的產(chǎn)物，這說明30位殘基為Asn對于該蝎毒蛋白形成正確的折疊是非常重要的。
權(quán)利要求
1.一種重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1基因，其特征在于該基因的DNA核苷酸順序如下所示1 76C ATG GTT CGT GAT GCA TAT ATT GCC CAA AAC TAC AAT TGT GTA TAC CAT TGT GCT CGT GAT GCA TAT TGC AAC GAA151CTG TGC ACT AAG AAT GGT GCC AAG TCC GGA TCT TGC CCA TAC TTG GGT GAG CAC AAA TTC GCC TGC TAC TGC AAG206GAC CTG CCA GAT AAC GTT CCA ATC CGT GTC CCG GGT AA6 TGC CAC TAA TAGGATC
2.如權(quán)利要求1所述的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1基因，其特征在于由這個合成基因衍生的突變體基因，與權(quán)利要求1所述的合成基因相對應(yīng)的密碼子有50％以上相同。
3.如權(quán)利要求1所述的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1基因，其特征在于重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的表達(dá)質(zhì)粒是質(zhì)粒pE2rBmKαIT1(CGMCC No.0655)，結(jié)構(gòu)如下所示
4.如權(quán)利要求1所述的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1基因，其特征在于所述的表達(dá)質(zhì)粒的宿主細(xì)胞是大腸桿菌BL21(DE3)。
5.如權(quán)利要求1或2所述的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1基因的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于產(chǎn)生重組東亞馬氏鉗蝎毒蛋白rBmKαIT1及其突變體，包括將合成基因克隆入表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建成表達(dá)質(zhì)粒pE2rBmKαIT1，然后在大腸桿菌中表達(dá)，通過體外復(fù)性和分離純化獲得重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的方法。
6.如權(quán)利要求5所述的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1基因的應(yīng)用，其特征在于所述的表達(dá)質(zhì)粒載體是pET15b。
7.如權(quán)利要求3所述的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的應(yīng)用，其特征在于所述的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)體外復(fù)性并分離純化，獲得有活性的重組東亞馬氏鉗蝎毒蛋白，其所含有的四對二硫鍵具有正確的共價鍵連接。
8.如權(quán)利要求1所述的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的應(yīng)用，其特征在于具有完整α型抗昆蟲活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程制備的重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1。本發(fā)明通過設(shè)計和化學(xué)全合成獲得了編碼重組東亞馬氏鉗蝎毒rBmKαIT1的基因后使之克隆入質(zhì)粒,它在大腸桿菌中獲得高表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式出現(xiàn)并占菌體總蛋白的15%左右。經(jīng)過變性、復(fù)性、高效液相色譜分離純化后可獲得純度達(dá)95%以上的活性rBmKαIT1。全蝎是我國傳統(tǒng)的名貴中藥,其有效成分正是蝎毒,具有極高的應(yīng)用開發(fā)價值,但從蝎尾腺采集費時而且量少。因此本基因工程所得的重組東亞馬氏鉗蝎神經(jīng)毒rBmKαIT1具有誘人的應(yīng)用前景和潛力。
文檔編號A01N63/00GK1373219SQ0211058
公開日2002年10月9日 申請日期2002年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月18日
發(fā)明者陳海寶, 黃昊 申請人:中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所