專利名稱：小麥抗赤霉病種質(zhì)創(chuàng)制新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程育種領(lǐng)域，具體地說，涉及小麥抗赤霉病細(xì)胞工程育種新方法。本發(fā)明設(shè)計了雙層培養(yǎng)基、即愈傷組織培養(yǎng)基為上層和供菌體生長的馬鈴薯蔗糖下層培養(yǎng)基，對外植體進(jìn)行抗性和突變體的篩選，從而獲得抗赤霉病的小麥優(yōu)質(zhì)品種。
近年來，一些實驗結(jié)果表明，采用細(xì)胞培養(yǎng)篩選小麥抗赤霉病突變體可能是很有希望的。抗病突變體細(xì)胞選擇與植株水平選擇相比較，具有群體大、周期短、效率高的優(yōu)點，而且還可以解決缺乏抗源的病害、兼抗多種病害等難題。目前，用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抗病突變體篩選的實驗體系，主要包括活菌接種選擇體系、利用溫度敏感型病原接種選擇、原位篩選法、無選擇壓力法選擇和抗毒素篩選體系。在這些體系中，抗毒素細(xì)胞選擇體系較為成熟，只是在一些具體的技術(shù)參數(shù)上有待完善；另外，選擇體系的技術(shù)思路和原始材料的選擇尚有革新的空間。
中國科學(xué)院遺傳研究所長期從事小麥核質(zhì)雜種育種新技術(shù)研究，在創(chuàng)制和研究異源細(xì)胞質(zhì)小麥的遺傳變異過程中，采用田間植株麥穗單花定位注射接種法和室內(nèi)離體麥穗接種鑒定技術(shù)，發(fā)現(xiàn)偏凸山羊草和粗厚山羊草細(xì)胞質(zhì)能誘發(fā)并提高部分小麥的赤霉病抗性。如粗厚山羊草細(xì)胞質(zhì)鑒26小麥×歐柔的雜種子一代表現(xiàn)為抗病，病小穗率為5.60％、穗軸侵染率為1.06％；而其反交組合歐柔×粗厚山羊草細(xì)胞質(zhì)鑒26的子一代表現(xiàn)為中抗→中感，病小穗率為11.2％、穗軸侵染率為12.94％。偏凸山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥和節(jié)節(jié)麥細(xì)胞質(zhì)小麥也有類似的研究結(jié)果。中國科學(xué)院遺傳研究所是國內(nèi)較早開展細(xì)胞培養(yǎng)篩選小麥抗赤霉病突變體研究的單位之一，是“七五”、“八五”國家攻關(guān)相關(guān)項目和“八五”、“九五”中國科學(xué)院重大項目相關(guān)課題的主要承擔(dān)者之一。中國科學(xué)院遺傳研究所曾與黑龍江省合江地區(qū)農(nóng)科所合作，從偏凸山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥和粗厚山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥中選出抗或中抗赤霉病的新品系7個；之后，中國科學(xué)院遺傳研究所又選出抗或中抗赤霉病的新品系18個，并參加了相關(guān)不同地區(qū)的抗病性鑒定。這些研究結(jié)果為細(xì)胞培養(yǎng)篩選小麥抗赤霉病突變體研究奠定了材料和相關(guān)的技術(shù)方法基礎(chǔ)，也為從植株個體和群體水平鑒定抗赤霉病突變體材料奠定了必要的技術(shù)方法基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的是建立以偏凸山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥和粗厚山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥為材料、采用抗病原菌毒素細(xì)胞選擇技術(shù)，高效篩選小麥抗赤霉病突變體和育種材料的新方法。
用生物測定法鑒定供用毒素液的毒性強(qiáng)弱以小麥發(fā)芽種子在高壓滅菌毒素液和活菌毒素液中(設(shè)置無毒素液對照)胚根生長、胚芽生長的抑制率為參數(shù)，確定不同赤霉病菌株毒素的毒性強(qiáng)弱，確定及用于毒素篩選(誘導(dǎo)、分化、綠苗)的最佳菌種和毒素溶液。如發(fā)芽力正常的晉2148小麥品種的種子置于不同菌種的毒素液中發(fā)芽時，菌株M-10和SF-1的毒素液完全抑制了種子發(fā)芽和根生長；菌株76F17的毒素液雖然對種子發(fā)芽、生根也有抑制作用，但毒性明顯較弱，約有50％種子的芽和根可以不同程度的生長。
2、以甲基硫菌靈和多菌靈為抑菌劑。根據(jù)抑菌劑的毒性和既能有效抑制赤霉菌菌絲體生長、又不影響愈傷組織的誘導(dǎo)發(fā)生，45-55mg/L的多菌靈為首選。
3、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2mg/L 2，4-D。培養(yǎng)基中添加毒素液的體積比例為25％、30％、50％、70％，分化培養(yǎng)基和壯苗培養(yǎng)基中都補(bǔ)加毒素液。雙層培養(yǎng)基的下層培養(yǎng)基為馬鈴薯、蔗糖培養(yǎng)基，在無菌條件下接種赤霉病菌絲體，25℃恒溫培養(yǎng)24-72小時；上層培養(yǎng)基為MS+2mg/L 2，4-D+抑菌劑，加入時的溫度為45℃。配置好后放入4℃冰箱保存，72小時后用于實驗，包括用于赤霉病菌株培養(yǎng)和用于愈傷組織的誘導(dǎo)、分化的培養(yǎng)基外植體接種。
4、選擇幼穗、幼胚為接種的外植體。所取幼穗長5-10mm，在室內(nèi)剝?nèi)ダ先~、僅留一片心葉，用70％酒精消毒1分鐘、01％升汞消毒5分鐘，將幼穗切成3mm長小段接種于(上層)培養(yǎng)基。幼胚取自幼嫩種子，用70％酒精消毒1分鐘、01％升汞消毒8分鐘，剝出幼胚、盾片朝上接種于(上層)培養(yǎng)基。鑒于幼穗對毒素較敏感，更適合于作離體抗性鑒定和篩選的培養(yǎng)材料。
5、根據(jù)赤霉菌毒素對愈傷組織誘導(dǎo)、生長、存活、分化的抑制作用參數(shù)，抗性的最佳鑒定時間和突變體的最佳篩選期確定在外植體接種7-14天以后。
6、根據(jù)赤霉菌毒素對植株分化的影響(以毒素培養(yǎng)基上愈傷組織分化率和綠苗率為參數(shù))，確定30％-50％的毒素濃度為適宜的篩選濃度。
7、細(xì)胞水平抗性鑒定(毒素培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率、分化率)與植株水平鑒定(麥穗單花定位注射接種鑒定--離體室內(nèi)接種鑒定、田間植株接種鑒定)的關(guān)系分析。結(jié)論為細(xì)胞水平抗毒素能力較強(qiáng)的材料，植株水平抗病性也較強(qiáng)。如在70％濃度的毒素培養(yǎng)基上愈傷組織的相對誘導(dǎo)率(與不含毒素培養(yǎng)基)，晉2148為53.6％、VDKP2282為92.9％；植株抗性鑒定，晉2148表現(xiàn)感病、VDKP2282表現(xiàn)為中抗水平。
8、用于植株抗赤霉病鑒定的離體麥穗單花定位注射接種技術(shù)在抽穗到始花期階段，自劍葉節(jié)下斷剪取麥穗，放入特制的接種箱內(nèi)，接種禾谷鐮刀菌株M-10、SF-1所培養(yǎng)的分生孢子液。用滴管將分生孢子液滴入麥穗中部經(jīng)剪穎、標(biāo)記的一朵小花內(nèi)，置于25℃和高濕條件下。接種8-10天后比較病穗率和反應(yīng)級。
田間植株麥穗接種鑒定技術(shù)在抽穗到始花期階段，選取抽穗期一致的穗子，以上述離體單花定位注射方法接種，套袋噴水保濕，15天后調(diào)查病害發(fā)生情況，以病小穗率和穗軸浸染率進(jìn)行評價。
發(fā)病區(qū)田間抗病鑒定根據(jù)供試材料的生態(tài)特點，參加黑龍江省佳木斯地區(qū)、湖北省襄樊地區(qū)、江蘇省南京地區(qū)等地的小麥赤霉病抗病鑒定圃統(tǒng)一試驗，采用一般通用的田間鑒定方法。本發(fā)明的優(yōu)點就篩選或選擇效率而言具有群體大、周期短、效率高的優(yōu)點；而且還可以解決缺乏抗源的病害、兼抗多種病害等難題。
在組織培養(yǎng)與篩選技術(shù)上方面中國科學(xué)院遺傳研究所建立了赤霉病菌株選擇、毒素篩選與鑒定、用于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體選擇、基于最佳選擇的培養(yǎng)時間界定和綠苗分化等完整的技術(shù)方法體系。近年來，又探索出一種更為有效的篩選鑒定技術(shù)，即雙層培養(yǎng)與活菌毒素篩選相結(jié)合的方法，活菌毒素篩選與滅菌提取毒素篩選相比，其有效性更接近于自然浸染狀態(tài)，只是這種方法要選擇好抑菌劑并控制好其濃度(達(dá)到真菌生長與選擇壓力的協(xié)調(diào))。
在材料選擇上核質(zhì)雜種小麥與一般的小麥材料不同，一部分核質(zhì)組合的赤霉病抗性具有細(xì)胞質(zhì)正效應(yīng)；核質(zhì)雜種材料的誘變頻率比常規(guī)品種高。部分核質(zhì)雜種小麥不但幼穗愈傷組織細(xì)胞抗赤霉病能力明顯超過常規(guī)小麥品種(系)，而且在毒素培養(yǎng)基上愈傷組織的誘導(dǎo)率、分化率和綠苗率也明顯提高，有利于篩選并獲得抗赤霉病突變體植株。
植株的抗病性鑒定技術(shù)試驗條件易于控制，簡易方便，結(jié)果較穩(wěn)定能較好地鑒別材料的抗病性。
實施例材料偏凸山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥VDKP系統(tǒng)技術(shù)抗赤霉菌毒素細(xì)胞篩選小麥抗赤霉病新種質(zhì)265-1-9用于抗性細(xì)胞突變體篩選與鑒定的毒素來源于三個菌種M-10、SF-1、76F17。用于接種誘導(dǎo)愈傷組織的外植體為幼穗，幼穗先置于含或不含毒素的培養(yǎng)基(MS+2mg/L 2，4-D)上誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生，存活下來的愈傷組織連續(xù)移植到毒素濃度逐次提高的培養(yǎng)基上，進(jìn)行繼代多次細(xì)胞篩選，培養(yǎng)基中添加粗毒素的比例按體積計算分別為25％、30％、50％、70％；分化培養(yǎng)基和壯苗培養(yǎng)基中都補(bǔ)加毒素液。
以VDKP2282和VDKP2301為材料(偏凸山羊草細(xì)胞質(zhì)小麥新品系)、以抗病品種蘇麥3號為對照，依據(jù)幼穗在30％赤霉菌毒素培養(yǎng)基(MS+2mg/L 2，4-D+毒素)上的愈傷組織誘導(dǎo)率和存活率參數(shù)，并經(jīng)兩次重復(fù)細(xì)胞抗赤霉菌毒素篩選和抗病性鑒定，獲得小麥抗赤霉病突變新株系265和VDKP2301-1。抗性鑒定結(jié)果為株系265的抗赤霉病反應(yīng)級為1.8，略高于VDKP2282(反應(yīng)級為2.01)。
以抗赤霉病新株系265和VDKP2301-1為材料、以抗病品種蘇麥3號和感病品種歐柔為對照，設(shè)計毒素濃度梯度為30％→50％→70％的抗病突變體的篩選和鑒定培養(yǎng)基，通過幼穗愈傷組織的誘導(dǎo)、突變、分化和綠苗，得到一批抗病性很強(qiáng)的突變體，其中來源于新株系265的突變系265-1在田間鑒定試驗中表現(xiàn)最為突出。
在溫室中，從突變系265-1的群體中鑒定并選擇出高抗單株265-1-9；繼而進(jìn)行大田的重復(fù)鑒定，得到了相同的結(jié)果接種病菌孢子后，只有接種的小穗上長出少量菌絲，不擴(kuò)展到穗軸和上下部臨近的小穗上；并且，株系內(nèi)各單株間的抗性表現(xiàn)一致。
以抗病品種蘇麥3號和感病品種歐柔為對照，采用離體麥穗單花定位注射接種技術(shù)3次重復(fù)鑒定抗病突變系265-1-9的抗性強(qiáng)弱與等級，結(jié)果見下表，突變系265-1-9的抗赤霉病能力明顯超過VDKP2282和抗病對照品種蘇麥3號。

權(quán)利要求
1.一種小麥抗赤霉病細(xì)胞工程育種的方法，該方法的具體步驟如下a.選擇禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)或其毒素液作為細(xì)胞篩選劑；b.以甲基硫菌靈，多菌靈為抑菌劑；c.由愈傷組織細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，MS+2mg/L 2，4-D和馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基組成的雙層培養(yǎng)基；d.將幼穗或幼胚作為外植體接種于雙層培養(yǎng)基上，進(jìn)行抗性和突變體篩選。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的細(xì)胞篩選劑包括M-10，SF-1，76F17和病原菌的毒素液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的抑菌劑首選45-55mg/L的多菌靈。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的愈傷組織細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含有病原菌毒素液的MS+2mg/L2，4-D的培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的病原體毒素液的濃度范圍為30％至50％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的雙層培養(yǎng)基，上層為含有毒素液、抑菌劑的愈傷組織細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基，下層為M-10，SF-1或76F17菌體生長時所需要的馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，外植體接種于雙層培養(yǎng)基7至14天后進(jìn)行抗體和突變體的篩選。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物細(xì)胞工程育種領(lǐng)域，具體地說，涉及小麥抗赤霉病細(xì)胞工程育種新方法。本發(fā)明設(shè)計了雙層培養(yǎng)基、即愈傷組織培養(yǎng)基為上層和供菌體生長的馬鈴薯蔗糖下層培養(yǎng)基，對外植體進(jìn)行抗性和突變體的篩選，從而獲得抗赤霉病的小麥優(yōu)質(zhì)品種。
文檔編號A01H1/04GK1446455SQ0210788
公開日2003年10月8日 申請日期2002年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月26日
發(fā)明者劉春光, 侯寧, 劉根齊, 吳郁文, 張翠蘭, 張炎 申請人:中國科學(xué)院遺傳研究所