專利名稱：通過旁路代謝途徑的耐受除草劑的植物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使植物耐受除草劑的新方法，具體地說是耐受HPPD-抑制性除草劑，還涉及可用于本方法的編碼酶的核酸序列、含有它們的表達(dá)盒以及含有至少一個這種表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物。
羥苯基丙酮酸過氧化物酶是催化對羥苯基丙酮酸(HPP)向尿黑酸轉(zhuǎn)化的酶。該反應(yīng)在有鐵離子(Fe2+)和氧氣存在的條件下發(fā)生(N.P.Crouch等，Tetrahedron，53，20，6993-7010，1997)。
另外，已知一些抑制這種酶的分子附著在酶上從而抑制HPP向尿黑酸轉(zhuǎn)化。由于在植物中對反應(yīng)的抑制導(dǎo)致受到處理的植物葉子發(fā)黃并使所述植物死亡，發(fā)現(xiàn)這些分子中有些可用作除草劑(K.E.Pallett等，1997，Pestic.Sci.5083-84)。這種將HPPD作為靶標(biāo)的除草劑，描述于本領(lǐng)域的文獻(xiàn)中，具體的是異噁唑(EP 418 175，EP 470 856，EP 487 352，EP 527 036，EP 560 482，EP 682 659，US 5424276)，特別是異噁唑草酮(isoxaflutole)，一種玉米的選擇性除草劑，二酮腈(EP486630，EP496631)，具體是2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1，3-二酮和2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-SO2CH3-4-2，3-Cl2苯基)丙烷-1，3-二酮和三酮(EP625505，EP625508，US5,506,195)，特別是硫康三酮(sulcotrione)或內(nèi)消旋三酮，或其它吡唑(pyrazolinates)。
證實(shí)HPPD實(shí)際上是二酮腈(DKNS)的靶標(biāo)和證實(shí)HPPD(至少在一定劑量下)是二酮腈的唯一靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室中、體外無菌條件下、通過在3種類型的培養(yǎng)基上使擬南芥(Arabidopsis)種子發(fā)芽進(jìn)行1、Murashige和Skoog培養(yǎng)基(T.Murashige和F.Skoog，1962，一種用于煙草組織培養(yǎng)的快速生長和生物測定的改良培養(yǎng)基Physiol.Plant.15，473-479)，發(fā)芽對照實(shí)驗(yàn)。
2、MS培養(yǎng)基加1ppm劑量的DKN3、MS培養(yǎng)基加相同劑量的DKN+濃度為5mM的尿黑酸非常清楚，在培養(yǎng)基1上，正常發(fā)芽，每一胚芽發(fā)育出兩個子葉，該子葉呈現(xiàn)清楚的綠色。然后繼續(xù)正常發(fā)育。在培養(yǎng)基2上，發(fā)芽了，但出現(xiàn)的胚芽是白色的，兩片子葉未著色。幾天后胚芽死亡。培養(yǎng)基3中，發(fā)芽正常出現(xiàn)，胚芽呈現(xiàn)清楚的綠色，植物發(fā)育，但很快培養(yǎng)基中尿黑酸的量減少，出現(xiàn)最初的發(fā)黃癥狀，植物生長停止，如在2號培養(yǎng)基中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)一樣它們以死亡告終。
這可以證實(shí)植物中HPPD明顯的是DKN的靶標(biāo)，而且是唯一的靶標(biāo)。這還顯示出尿黑酸從培養(yǎng)基轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞位點(diǎn)，在那里它對于細(xì)胞的正常機(jī)能和植物的存活是必須的。
目前可以使用三種策略使植物耐受除草劑，(1)用酶解毒除草劑，該酶將除草劑或其活性代謝物轉(zhuǎn)化為無毒的降解產(chǎn)物，如耐受溴苯腈的酶(EP242236，EP337899)(2)目標(biāo)酶轉(zhuǎn)變成為對除草劑不太敏感的功能酶或其活性代謝物，如對草甘膦耐受的酶(EP293356，S.R.Padgette等，J.Biol.Chem.266，33，1991)；或(3)敏感酶過量表達(dá)以在植物中產(chǎn)生大量的目標(biāo)酶，該酶足以滿足其作為殺蟲劑之目的酶動力學(xué)常數(shù)，從而即使在其抑制劑存在的情況下也能產(chǎn)生足量的功能酶。
有人描述了成功獲得耐受HPPD抑制因子的植物的第三種策略(WO96/38567)，它第一次被理解，敏感(未突變的)目標(biāo)酶的簡單過量表達(dá)的策略成功地用于賦予植物在農(nóng)學(xué)水平上耐受除草劑。在C-末端部分突變的HPPD的鑒定顯示對HPPD抑制因子耐受能力的改善，使采用第二種策略改進(jìn)植物的耐受能力成為可能(WO99/24585)。
本發(fā)明包括使植物對除草劑產(chǎn)生耐受的一種新方法，該方法使用新的或第四種除草劑耐受策略，這一新的策略包括新辟由所述除草劑抑制的旁路代謝途徑。該代謝旁路可總結(jié)如下 例如一種除草劑“H”具有抑制酶“E”的活力的活性，所述的酶“E”轉(zhuǎn)化底物“S”為產(chǎn)物“P”，所述產(chǎn)物“P”及其代謝物對植物的生存是必需的， 所述代謝旁路存在于植物表達(dá)中，該植物中至少具有一種新的異源酶“NE”對允許“S”向一種中間產(chǎn)物“I”轉(zhuǎn)化的“H”不敏感，然后其產(chǎn)物通過植物的自然生物合成途徑或者通過也對“H”不敏感的至少一種其它的異源酶“OE”的表達(dá)轉(zhuǎn)化為“P”， 代謝旁路還存在于允許“I”向“P”轉(zhuǎn)化的對“H”不敏感的至少一種其它的異源酶“OE”的表達(dá)中，“I”作為一種中間產(chǎn)物或者為植物自然生產(chǎn)或者通過允許“S”向“I”轉(zhuǎn)化的對“H”不敏感的至少一種新的異源酶“NE”的表達(dá)得到。
本發(fā)明更具體地涉及使植物對HPPD抑制因子耐受的一種新的方法，所述方法包括HPPD的代謝旁路。
至今在植物中沒有代謝旁路途徑的描述。
從文獻(xiàn)中已知HPP向尿黑酸的轉(zhuǎn)化可以通過用一種抑制HPP氧化酶活性的酶提取物首先進(jìn)行HPP向4-苯乙醇酸(4-HPA)的轉(zhuǎn)化，隨后通過抑制4-HPA 1-水解酶活性的酶提取物將4-HPA轉(zhuǎn)化成尿黑酸(WO99/34008)。


圖1描述了這種旁路途徑。
文獻(xiàn)研究揭示了構(gòu)建HPPD旁路途徑所需的酶活于七十年代在細(xì)菌粗提物上得以表征。因此在球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)(Blakley，1977)和食酸假單胞菌(Pseudomonas acidovorana)(Hareland等，1975)中分別鑒別到HPP氧化酶(HPPO，E.C.1.2.3.-)和4-HPA 1-水解酶(HPAH，E.C.1.14.13.18)的活性。從那以后，Suemori等只純化了HPAH(1996)，但是既沒有公開蛋白質(zhì)序列也沒有公開核酸序列。因此，需要鑒別編碼這些酶活的基因。
在旁路途徑中，通過4-HPA使HPP發(fā)生向HGA的轉(zhuǎn)化?，F(xiàn)在，4-HPA是一種在植物中很少鑒別到的化合物。它存在于落新婦(Astilbe chinensis)(Kindl，1969)，車前草(Plantago sp.)(Swiatek，1977)，蒲公英(Taraxacum officinale；Dey和Harborne，1977)，艾(Artemisia)(Swiatek等，1998)，連翹(Forsythiasuspensa)果實(shí)(Liu等，1998)，和最后存在于海洋藻類石莼(Ulva lactuca)(Flodin等，1999)中。幾乎沒有關(guān)于其來源的資料。它似乎可以來源于酪氨酸、莽草酸、或酪胺。也沒有關(guān)于它結(jié)果怎樣或在植物中的作用的資料。Kindl(1969)顯示了它經(jīng)3，4-二苯乙醇酸的降解，而Flocin等(1999)證實(shí)它通過4-羥基扁桃酸轉(zhuǎn)化為2，4，6-三溴苯酚，后者累積于綠藻石莼中。Gross(1975)提出4-PHA可能是一些高等植物中的生長調(diào)節(jié)因子，Abe等(1974)認(rèn)為它是藻類中的植物生長素類似物。
為了進(jìn)行HPPD的代謝旁路途徑，需要事先鑒別和分離編碼負(fù)責(zé)上述兩種活性的酶的基因和核酸序列。
發(fā)明中的定義“核酸序列”一個核苷酸或多核苷酸序列，它可以是DNA或RNA型，較佳的是DNA型，具體是雙鏈的。核酸序列可以是天然來源的，具體是基因組DNA或RNA，或者是合成的或半合成的序列，核酸包括選擇的核酸序列，該序列或者用于優(yōu)化作為宿主有機(jī)體功能的編碼序列的密碼子(在宿主中該核酸序列將被表達(dá))，或者用于引入或消除一個或多個限制位點(diǎn)。制備合成和半合成核酸序列的方法是本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員所熟知的。
“能選擇性雜交的序列”核酸序列與參考核酸序列在明顯大于背景噪聲的水平上雜交。背景噪聲可與其它存在的DNA序列的雜交聯(lián)合，特別是存在于cDNA文庫中的其它c(diǎn)DNA。能選擇性雜交的序列和上述根據(jù)本發(fā)明由序列ID定義的序列間的相互作用產(chǎn)生的信號水平通常10倍、較佳的100倍大于產(chǎn)生背景噪聲的其它DNA序列的相互作用的信號水平。相互作用的水平可以測定，例如通過用如32P的放射性元素標(biāo)記探針。通常通過使用非常嚴(yán)格的培養(yǎng)基條件(例如O.03M NaCl和O.03M檸檬酸鈉在約50℃-60℃)得到選擇性雜交。當(dāng)然可根據(jù)本領(lǐng)域通常的方法進(jìn)行雜交(具體是Sambrook等，1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊)。
“核酸序列的同系物”核酸序列與參考序列相比顯示出一個或多個序列修飾?？筛鶕?jù)突變常用技術(shù)得到這些修飾，或者通過選擇用于雜交制備所述序列的合成寡核苷酸得到。關(guān)于可產(chǎn)生相同氨基酸表達(dá)的核酸的多重結(jié)合，根據(jù)本發(fā)明的參考序列和相應(yīng)的同系物之間的差別可能是相當(dāng)大的。較佳的，同源的程度與參考序列相比將至少為60％，較佳的至少70％，更佳的至少80％，甚至更佳的至少90％。這些修飾通常和較佳地為中性，也就是說，對于一個編碼序列，它們不影響所編碼的蛋白質(zhì)或肽的初級序列。但是，可引入非沉默修飾、或突變，與參考序列相比這不影響核酸序列的功能。測定和鑒別核酸序列間同源性的方法是本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員熟知的。例如可使用PILEUP或BLAST程序(具體是Altschul等，1993，J.Mol.Evol.36290-300；Altschul等1990，J.Mol.Biol.215403-10)。
“片段”參考核酸或多肽序列的片段，其中一部分缺失但保存了所述參考序列的功能。
“異源物”與在天然有機(jī)體中具有相同功能的核酸序列不同的核酸序列。一個異源序列可包括在自然環(huán)境中原位修飾的核酸序列。它也可以是分離于其自然有機(jī)體然后再引入到同一有機(jī)體的核酸序列。它還可以是與另一個核酸序列異源的核酸序列，如序列與另一序列連接，這種連接不會自然發(fā)生。這是一個表達(dá)盒的具體例子，該表達(dá)盒包括通常不會自然連接的各種核酸序列。
“蛋白質(zhì)序列的異源序列”蛋白質(zhì)序列中的初級序列與參考蛋白質(zhì)的初級序列不同，但是它與參考序列執(zhí)行相同的功能。測定和鑒別多肽和蛋白質(zhì)間的同源性的方法也是本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員熟知的。例如可使用UWGCG成套試劑和BESTFITT程序計(jì)算同源性(Denerexu等，1984，Nucleic Acid res.12，387-395)。
“表達(dá)盒”在宿主有機(jī)體中包括表達(dá)編碼序列所需的各種功能元件的核酸序列。這些功能元件包括，在轉(zhuǎn)錄方向上的調(diào)節(jié)啟動子序列，也稱作啟動子，功能性連接于編碼序列和調(diào)節(jié)終止子序列，也稱作終止子或終止。表達(dá)盒還可包括在調(diào)節(jié)啟動子序列和編碼序列之間的調(diào)節(jié)元件如轉(zhuǎn)錄催化劑、或增強(qiáng)劑、和/或內(nèi)含子。
“宿主有機(jī)體”根據(jù)本發(fā)明這主要是指的普通植物細(xì)胞或植物。對于克隆載體，宿主有機(jī)體還可以是細(xì)菌、真菌或酵母。
“植物細(xì)胞”來自植物的細(xì)胞，它可以組成未分化的組織如愈傷組織，分化的組織如胚芽、植物的各部分、植物或種子。
“植物”能夠光合作用的分化的多細(xì)胞有機(jī)體，具體是單子葉植物或雙子葉植物，更具體的是可以或不可以用作動物或人的食物的農(nóng)作物，如水稻、玉米、小麥、大麥、甘蔗、油菜籽、大豆、甜菜根、土豆、煙草、棉花、苜蓿、菌絲、或觀賞植物如矮牽牛、或其它芭蕉屬植物、葡萄樹、樹莓、草莓、番茄、生菜植物等。
“調(diào)節(jié)啟動子序列”作為植物中的調(diào)節(jié)啟動子序列，可以使用在植物中自然表達(dá)的基因的任何調(diào)節(jié)啟動子序列，具體地說特別是在植物葉子中表達(dá)的啟動子，例如，來源于細(xì)菌、病毒或植物的“組成型”啟動子、或其它“光-依賴型”啟動子如植物核酮糖-二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)基因的啟動子、或者可使用的任何已知的適合的啟動子。在來源于植物的啟動子中，組蛋白啟動子的敘述描述于申請EP0507698，或者水稻肌動蛋白啟動子描述于(US 5641876)中。植物病毒基因的啟動子中，涉及了菜花花葉病毒(CAMV 19S或35S)或CsVMV(US…)的啟動子，或圈狀病毒(circovirus)啟動子(AU 689311)。還使用了對植物的具體區(qū)域或組織具有特異性的調(diào)節(jié)啟動子序列，更具體的是種子-特異性啟動子([22]R.Datla等，Biotechnology Ann.Rev.(1997)3，269-296)，特別是蕪青蛋白(napin)(EP255378)、菜豆蛋白、麥谷蛋白、半日花蛋白(heliantinin)(WO 92/17580)、白蛋白(WO 98/45460)、油質(zhì)蛋白(WO 98/45461)、ATS1或ATS3(PCT/US98/06978，提交于1998年10月20日，本文引入用作參考)的啟動子。還使用了可誘導(dǎo)的啟動子，這些啟動子方便地選自苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)啟動子、HMG-CoA還原酶(HMG)啟動子、幾丁質(zhì)酶啟動子、葡聚糖酶啟動子、蛋白質(zhì)酶抑制因子(PI)啟動子，PR1家族基因啟動子、胭脂氨酸合成酶(nos)或vspB基因(US569349，表3)啟動子、HMG2啟動子(US5670349)、蘋果β-半乳糖苷酶(ABG1)啟動子或蘋果氨基環(huán)丙烷羧化物合成酶(ACC合成酶)啟動子(WO98/45445)。
“轉(zhuǎn)錄激活劑(增強(qiáng)子)”敘述了例如煙草花葉病毒(TMV)的增強(qiáng)子，描述于申請WO87/07644中，或Carrington和Freed描述的煙草蝕刻病毒(TEV)的增強(qiáng)子。
“內(nèi)含子”未翻譯的核酸序列。將敘述如描述于專利申請WO97/04114中的用于在雙子葉植物中表達(dá)的擬南芥組蛋白基因的內(nèi)含子1，描述于專利申請WO99/34005中的水稻肌動蛋白第一內(nèi)含子，或在單子葉植物中用于表達(dá)玉米adh1內(nèi)含子。
“編碼序列”翻譯的核酸序列。它包括編碼感興趣的蛋白質(zhì)或多肽的序列，任選地融合于5’或3’位點(diǎn)，具有編碼信號肽或用于定向特異細(xì)胞區(qū)室的肽。
“信號肽或定向肽”肽在其N-或C-末端部分與感興趣的蛋白質(zhì)或肽融合，為用于感興趣的蛋白質(zhì)或肽定向到具體的細(xì)胞區(qū)室的細(xì)胞機(jī)制識別。具體地說它們是用于指引感興趣的蛋白質(zhì)或肽進(jìn)入葉綠體的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，或進(jìn)入各個細(xì)胞區(qū)室的信號肽，例如液泡、線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等。具體描述于評論《植物分子生物學(xué)》(Plant moleular Biology)第38期的這種蛋白質(zhì)序列的作用主要是轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)進(jìn)入植物細(xì)胞的各個區(qū)室(《分選蛋白質(zhì)進(jìn)入植物細(xì)胞的液泡》Soring of proteins to vacuoles in plant cells，127-144頁；核膜孔復(fù)合體，145-162頁；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入和穿過葉綠體包膜，91-207頁；葉綠體中用于類囊體蛋白質(zhì)的導(dǎo)向的多種途徑，209-221頁；植物中線粒體蛋白質(zhì)的輸入，311-338頁)。
“葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽”葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽是由核酸序列編碼的，核酸序列的5’位置編碼感興趣的蛋白質(zhì)或肽，以允許感興趣的融合蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽/蛋白質(zhì)(肽)的表達(dá)。轉(zhuǎn)運(yùn)肽能夠指引感興趣的蛋白質(zhì)或肽進(jìn)入細(xì)胞器，更具體的是葉綠體，當(dāng)融合蛋白穿過細(xì)胞器膜時，它在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和感興趣的蛋白或肽間被酶切。轉(zhuǎn)運(yùn)肽可以是單獨(dú)的，如EPSPS轉(zhuǎn)運(yùn)肽(US5,188,642)或者來自植物的核酮糖-二羧化酶/加氧酶小亞基(RuBisCO ssu)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，任選地包括成熟RuBisCO ssu的N-末端部分的一些氨基酸(EP 189707)，或者包括與位于色素體上的成熟蛋白質(zhì)N-末端序列的部分融合的第一種植物的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的一個多轉(zhuǎn)運(yùn)肽，與第二種植物轉(zhuǎn)運(yùn)肽融合(如專利EP 508 909所描述)，更具體的是，優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽包括一種向日葵RuBisCO ssu的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，該肽與玉米RuBisCO ssu的N-末端的22個氨基酸融合，與玉米RuBisCO ssu轉(zhuǎn)運(yùn)肽融合及其編碼序列在專利EP 508 909中描述。
“信號肽”這些肽序列具體描述于《植物分子生物學(xué)》評論第38期(1998)，主要用于轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)進(jìn)入植物細(xì)胞的各個區(qū)室(《分選蛋白質(zhì)進(jìn)入植物細(xì)胞的液泡》Soring of proteins to vacuoles in plant cells，127-144頁；核膜孔復(fù)合體，145-162頁；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入和穿過葉綠體包膜，91-207頁；葉綠體中用于類囊體蛋白質(zhì)的導(dǎo)向的多種途徑，209-221頁；植物中線粒體蛋白質(zhì)的輸入，311-338頁)。用于定向進(jìn)入液泡的肽廣泛描述于文獻(xiàn)中(J.M.Neuhaus和J.C.Rogers分選蛋白質(zhì)進(jìn)入植物細(xì)胞的液泡，植物分子生物學(xué)38127-144，1998)。較佳的，液泡中的肽是與感興趣的蛋白質(zhì)或肽的C-末端部分融合的蛋白質(zhì)的液泡肽(J.M.Ferullo等描述，植物分子生物學(xué)，33625-633，1997)。
“調(diào)節(jié)終止子序列”還包括聚腺苷酸化序列，這是指在植物細(xì)胞或植物中具有功能的普通的任何序列，或者起源于細(xì)菌的，如根癌農(nóng)桿菌終止子，病毒起源的如CaMV 35S終止子，或其它植物起源的，如專利申請EP 0 633 317中描述的組蛋白終止子。
“載體”用于宿主有機(jī)體轉(zhuǎn)化的、含有至少一個表達(dá)盒的克隆和/或表達(dá)載體。該載體包括，除表達(dá)盒外，至少一個復(fù)制起點(diǎn)。載體可包括質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或病毒，通過引入表達(dá)盒轉(zhuǎn)化。這種轉(zhuǎn)化載體作為宿主有機(jī)體轉(zhuǎn)化的一個功能，是本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員熟知的并廣泛描述于文獻(xiàn)中。對于植物細(xì)胞或植物的轉(zhuǎn)化具體的將是病毒，該病毒可用于轉(zhuǎn)化發(fā)育了的植物并且它還含有其自身的復(fù)制和表達(dá)元件。
優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物的載體是質(zhì)粒。
HPP氧化酶本發(fā)明的第一個主題是關(guān)于編碼HPP氧化酶的核酸序列，以及相應(yīng)的多肽。優(yōu)選地，HPP氧化酶對HPPD抑制因子不敏感，具體對于異噁唑如異唑草酮和它們的二酮腈，具體如上所述。HPP氧化酶具體的是一種來自細(xì)菌的HPP氧化酶，例如來自節(jié)桿菌屬，具體是球形節(jié)桿菌。HPP氧化酶優(yōu)選的是一種蛋白質(zhì)，其初級氨基酸序列是由標(biāo)識為No.2(SEQ ID No.2)的序列以及與之同源的序列及其片段表示的。
與SEQ ID No.2同源的HPP氧化酶的蛋白質(zhì)序列具體是由與之同源的序列及其片段SEQ ID No.4和6表示的。
由SEQ ID No.4表示的HPP氧化酶對應(yīng)于SEQ ID No.2的HPP氧化酶，其中甘氨酸被丙氨酸所取代。
本發(fā)明還涉及如上所述的編碼HPP氧化酶的核酸序列。
較佳地，編碼HPP氧化酶的序列是DNA序列，特別是基因組DNA或cDNA，具體的是異源或分離的序列。
根據(jù)本發(fā)明編碼HPP氧化酶的序列具體選自由SEQ ID No.1，2，3，5或15表示的DNA序列的編碼序列及與之同源的序列、片段以及可選擇的與SEQ ID 1，3，5或15雜交的序列。
SEQ ID No.5的編碼序列具有SEQ ID No.1在463、602和1511位置的3個突變，這些突變是沉默的，即它不引入相應(yīng)多肽的改變。
4-HPA 1-羥化酶本發(fā)明的第二個主題是4-HPA 1-羥化酶表達(dá)所需的方法。與從關(guān)于一些蛋白提取物的活性的文獻(xiàn)所預(yù)期的相反，注意到4-HPA 1-羥化酶在細(xì)菌(具體的是假單胞菌)中的活性來自兩種酶活性的總和，以下稱作HPAH和HPAC。
HPAHHPAH允許HPA轉(zhuǎn)化為中間代謝產(chǎn)物，下文稱作代謝物Z，其結(jié)構(gòu)尚未確定。可以觀察到HPAH使HPA的芳環(huán)羥化，代謝物Z穩(wěn)定為酮的形式，酶活性的假設(shè)描述于圖2中。
因此本發(fā)明的第二個主題涉及編碼HPAH和相應(yīng)多肽的序列核酸。較佳的，HPAH對HPPD抑制因子不敏感，具體對異噁唑如異噁唑草酮及其二酮腈，特別是上面描述的。HPAH具體是來源于細(xì)菌的HPAH，例如來自假單胞菌，特別是來自食酸假單胞菌。HPAH較佳地是一種蛋白質(zhì)，其初級氨基酸序列是由序列標(biāo)識為No.8和18(SEQ ID No.8和SEQ ID No.18)的序列及與之同源的序列及其片段表示的。
本發(fā)明還涉及如上述定義的編碼HPAH的核酸序列。
較佳地，編碼HPAH的序列是DNA序列，特別是基因組DNA或cDNA，具體的是同源的或分離的序列。
根據(jù)本發(fā)明，編碼HPAH的序列具體選自由SEQ ID No.7或17表示的序列的編碼區(qū)域及與之同源的序列和其片段，及可選擇地與SEQ ID No.7或17雜交的序列。
HPACHPAC是使代謝物Z向尿黑酸轉(zhuǎn)化的第二種酶。
因此本發(fā)明的第三個主題涉及編碼HPAC和相應(yīng)多肽的核酸序列。較佳地，HPAC對HPPD抑制因子，特別是對異噁唑如異噁唑草酮及其二酮腈，尤其是上文所述的不敏感。HPAH具體是來源于細(xì)菌的HPAC，例如來自假單胞菌，具體是來自食酸假單胞菌。HPAH較佳地是一種蛋白質(zhì)，其初級氨基酸序列是由序列標(biāo)識為No.10(SEQID No.10)的序列及與之同源的序列及其片段表示的。
與SEQ ID No.10同源的HPAC的蛋白質(zhì)序列，具體是由SEQ ID No.12，14和20，其同源序列和其片段表示的。
本發(fā)明還涉及如上述定義的編碼HPAC的核酸序列。
較佳地，編碼HPAC的序列是DNA序列，特別是基因組DNA或cDNA，特別是同源的或分離的序列。
根據(jù)本發(fā)明，編碼HPAC的序列具體選自SEQ ID No.9、11、13或19表示的序列的編碼區(qū)域及與之同源的序列和其片段，及可選擇地與SEQ ID No.7或17雜交的序列。
表達(dá)盒本發(fā)明還涉及表達(dá)盒，其編碼序列包括選自編碼如上所述的HGA氧化酶、HGAH或HGAC的核酸序列的核酸序列。
該編碼序列還可包括，在5’或3’位點(diǎn)，編碼信號肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列。較佳地，編碼序列包括，編碼HGA氧化酶、HGAH或HGAC的序列的5’位置，和編碼用于葉綠體定向的轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列，具體是多轉(zhuǎn)運(yùn)肽，更具體的是優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
因此本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)運(yùn)肽/HGA氧化酶，轉(zhuǎn)運(yùn)肽/HGAH或轉(zhuǎn)運(yùn)肽/HGAC融合蛋白，上面描述的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，具體是專利申請EP 508 909中描述的優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。
較佳的，調(diào)節(jié)啟動子序列選自允許編碼序列的組成型表達(dá)的調(diào)節(jié)啟動子序列。這些具體是CaMV35S、CsVMV、水稻肌動蛋白或組蛋白啟動子的序列。
根據(jù)本發(fā)明它還可以選擇在與產(chǎn)生旁路代謝的基因表達(dá)水平接近的表達(dá)水平上表達(dá)編碼序列。根據(jù)本發(fā)明在表達(dá)盒中可使用選自植物HPPD的調(diào)節(jié)啟動子序列的調(diào)節(jié)啟動子序列。
對于在同一植物中HPP氧化酶、HGAH、HGAC三種酶的表達(dá)，可以選擇相應(yīng)編碼序列的表達(dá)盒，根據(jù)它們的長度和/或它們在植物各個功能器官中位置，不同的調(diào)節(jié)啟動子序列顯示出不同的表達(dá)特點(diǎn)。
可以選擇允許的表達(dá)梯度為HGAC＞HGAH＞HPP氧化酶(或反之亦然)的調(diào)節(jié)啟動子序列。
對于HPP氧化酶、HGAH和HGAC的表達(dá)，調(diào)節(jié)啟動子序列較佳地選自植物HPPD、組蛋白H3或H4的啟動子，特別是選自假單胞菌或玉米的啟動子，具體是專利申請EP507 698中描述的，以及植物RuBisCO SSU的啟動子，具體選自如專利申請WO 99/25842描述的向日葵或玉米，CaMV 35S啟動子或CsVMV啟動子以及它們的組合，具體是組蛋白/35S混合啟動子(如專利申請EP 507 698的實(shí)施例中所描述的)。對于單子葉植物中的表達(dá)，這些調(diào)節(jié)啟動子序列較佳地與水稻肌動蛋白的第一內(nèi)含子結(jié)合。
根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施例，編碼HPP氧化酶的表達(dá)盒包括組蛋白啟動子、編碼HPP氧化酶的序列和組蛋白終止子(
圖12；SEQ ID No.15)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施例，編碼HPAH的表達(dá)盒包括CaMV 35S啟動子、編碼HPAH的序列和NOS終止子(
圖11；SEQ ID No.17)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施例，編碼HPAC的表達(dá)盒包括CsVMV啟動子、編碼HPAC的序列和NOS終止子(
圖10；SEQ ID No.19)。
載體本發(fā)明還涉及克隆和/或表達(dá)載體，該載體含有至少一個本發(fā)明的表達(dá)盒。
根據(jù)本發(fā)明的第一個實(shí)施例，載體包括根據(jù)本發(fā)明的僅一個表達(dá)盒，該表達(dá)盒選自含有如上述定義的HPP氧化酶、HGAH、或HGAC的編碼序列的表達(dá)盒。
根據(jù)本發(fā)明的第二個實(shí)施例，載體包括根據(jù)本發(fā)明的兩個表達(dá)盒，該表達(dá)盒選自含有如上述定義的HPP氧化酶、HGAH、或HGAC的編碼序列的表達(dá)盒，在同一載體中成對結(jié)合HPP氧化酶和HGAH，HPP氧化酶和HGAC，HGAH和HGAC。
含有編碼HPAH的表達(dá)盒和編碼另一個HPAC的表達(dá)盒的載體可以是上述兩個表達(dá)盒的組合(SEQ ID No.17和19)。
圖13和SEQ ID No.21中描述了這種表達(dá)盒。
根據(jù)本發(fā)明第三個實(shí)施例，載體含有根據(jù)本發(fā)明的三個表達(dá)盒，第一個表達(dá)盒用于HPP氧化酶，第二個表達(dá)盒用于HGAH以及第三個表達(dá)盒用于HGAC。這種表達(dá)盒可以包括上述三種表達(dá)盒的組合(SEQ ID No.15，17和19)。在
圖14和SEQID No.22中描述了這種載體。
根據(jù)本發(fā)明，如上所述的載體還可包括其它感興趣的蛋白質(zhì)或肽的表達(dá)盒。
當(dāng)載體包含幾個表達(dá)盒時，這些表達(dá)盒可以相互成對地具有各種取向，共線性的、趨異的或趨同的。
其它感興趣的蛋白質(zhì)或肽的表達(dá)盒包括編碼不同于上述HPP氧化酶、HGAH和HGAC的感興趣的蛋白質(zhì)或肽的核酸序列。
可具有編碼選擇性標(biāo)記的基因序列，如基因賦予轉(zhuǎn)化植物以新的農(nóng)學(xué)特性，或者基因改良了轉(zhuǎn)化植物的農(nóng)學(xué)特性。
選擇性標(biāo)記在編碼選擇性標(biāo)記的基因中，將涉及抗抗生素的基因，耐受除草劑的基因(雙丙氨酰膦、草甘膦或異噁唑)，編碼易于識別的報道酶如GUS酶的基因，編碼在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中調(diào)節(jié)色素生產(chǎn)的色素或酶的基因。這種選擇性標(biāo)記基因具體描述于專利申請EP 242 236，EP 242 246，GB 2 197 653，WO 91/02071，WO 95/06128，WO 96/38567或WO 97/04103。
感興趣的基因在賦予轉(zhuǎn)化的植物新的農(nóng)學(xué)特性的基因中，涉及某些耐受除草劑的基因，某些耐受昆蟲的基因，某些耐受疾病的基因等。這些基因具體描述于專利申請WO91/02071和WO/06128。
除草劑耐受性本發(fā)明具體適用于賦予轉(zhuǎn)化的單子葉植物和植物細(xì)胞對一些除草劑的耐受性的基因的表達(dá)。在賦予對某些除草劑耐受性的基因中，將涉及對雙丙氨酰膦耐受的Bar基因，該基因編碼適合的EPSPS，該EPSPS賦予對以EPSPS為靶標(biāo)的除草劑的抗性，如草甘膦及其鹽(US 4,535,060，US 4,769,061，US 5,094,945，US4,940,835，US 5,188,642，US 4,971,908，US 5,145,783，US 5,310,667，US5,312,910，US 5,627,061，US 5,633,435，F(xiàn)R 2 736 926)，該基因編碼甘草膦氧化還原酶(US 5,463,175)，或者編碼HPPD的基因以HPPD為靶標(biāo)賦予對除草劑的耐受性，例如異噁唑，具體是異噁唑草酮(FR 95 06800，F(xiàn)R 95 13570)，二酮腈(EP496 630，EP 496 631)或三酮，具體是硫康三酮(EP 625 505，EP 625 508，US5,506,195)。這些編碼HPPD的基因以HPPD為靶標(biāo)賦予對除草劑的耐受性描述于專利申請WO 96/38567中。
在編碼以EPSPS為靶標(biāo)賦予對除草劑抗性的適合的EPSPS的基因中，將更具體地涉及編碼植物EPSPS的基因，具體來自玉米，顯示102和106兩個突變，描述于專利申請F(tuán)R 2 736 926，下文稱作EPSPS雙重突變型，或者編碼分離自土壤桿菌的EPSPS的基因，由美國專利5,633,435的序列ID 2和ID 3描述，下文稱作CP4。
在編碼以HPPD為靶標(biāo)賦予對除草劑耐受性的HPPD基因中，將更具體的涉及來自假單胞菌和來自擬南芥的HPPD，描述于專利申請WO 96/38567中。
在編碼EPSPS或HPPD的基因情況下，更具體是的編碼上述基因的情況下，編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列較佳地位于編碼這些酶的序列之前，具體地說在美國專利5,510,471或5,633,448中編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽被稱作“優(yōu)化轉(zhuǎn)運(yùn)肽”。
對昆蟲的抗性在賦予新的抗昆蟲特性的感興趣的蛋白質(zhì)中，將更具體地涉及Bt蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)廣泛描述于文獻(xiàn)中，并是本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員熟知的。還將涉及提取于細(xì)菌如光桿狀菌的蛋白質(zhì)(WO 97/17432和WO 98/08932)。
對疾病的抗性在賦予新的抗疾病特性的感興趣的蛋白質(zhì)或肽中，將具體涉及幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、草酸氧化酶，所有這些蛋白質(zhì)及其編碼序列廣泛描述于文獻(xiàn)中，或者其它抗細(xì)菌和/或抗真菌的肽，具體是少于100個氨基酸的富含半胱氨酸的肽，如植物硫堇或防衛(wèi)素，更具體的是在半胱氨酸和具有基本氨基酸的區(qū)域之間包括一個或多個二硫鍵的所有起源的溶解肽，具體如下溶解肽雄蝎素(androctonin)(WO97/30082和PCT/FR98/01814，提交于1998年8月18日)或嗜露霉素(drosomycin)(PCT/FR98/01462，提交于1998年6月8日)。
根據(jù)本發(fā)明一個具體的實(shí)施例，感興趣的蛋白質(zhì)或多肽選自真菌引起的肽，具體是誘導(dǎo)素(elicitin)(Kamoun等，1993；Panabieres等，1995)。
質(zhì)量的改變還將涉及修飾改變的植物的組成的基因，具體的是一些必需脂肪酸的含量和質(zhì)量(EP 666918)或蛋白質(zhì)的含量和質(zhì)量，具體是存在于所述植物的葉和/或種子中。還將具體涉及編碼富含含硫氨基酸的蛋白質(zhì)的基因(A.A.Korit等，Eur.J.Biochem.(1991)195，329-334；WO 98/20133；WO 97/41239；WO 95/31554；WO 94/20828；WO 92/14822)。這些富含含硫氨基酸的蛋白質(zhì)還具有捕捉和儲藏過量半胱氨酸和/或甲硫氨酸的功能，這可以避免由于誘捕它們造成的含硫氨基酸的過量生產(chǎn)可能產(chǎn)生的毒性問題。還將涉及編碼富含含硫氨基酸的肽的基因，更具體的是半胱氨酸，所述的肽還具有抗細(xì)菌和/或抗真菌的活性。還將更具體地涉及植物防衛(wèi)素，以及任何起源的溶解肽雄蝎素(WO 97/30082和PCT/FR98/01814，提交于1998年8月18日)或嗜露霉素(PCT/FR98/01462，提交于1998年6月6日)。
植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞和含有上述HPP氧化酶、HGAH或HGAC的至少一種表達(dá)盒的植物。
根據(jù)本發(fā)明的第一個實(shí)施例，植物細(xì)胞或植物僅含有根據(jù)本發(fā)明的一個表達(dá)盒，該表達(dá)盒選自含有上述HPP氧化酶、HGAH或HGAC的編碼序列的表達(dá)盒。
根據(jù)本發(fā)明的第二個實(shí)施例，植物細(xì)胞或植物含有根據(jù)本發(fā)明的兩個表達(dá)盒，該表達(dá)盒選自含有上述HPP氧化酶、HGAH或HGAC的編碼序列的表達(dá)盒，在相同載體中成對結(jié)合HPP氧化酶和HGAH、HPP氧化酶和HGAC、HGAH和HGAC。
根據(jù)本發(fā)明的第三個實(shí)施例，植物細(xì)胞或植物含有根據(jù)本發(fā)明的三個表達(dá)盒，第一個表達(dá)盒用于HPP氧化酶，第二個表達(dá)盒用于HGAH和第三個表達(dá)盒用于HGAC。
根據(jù)上述本發(fā)明的植物細(xì)胞或植物還可含有上述感興趣的其它蛋白質(zhì)或肽的表達(dá)盒。
較佳地，表達(dá)盒被穩(wěn)定地整合入植物細(xì)胞或植物的基因組。更佳地，根據(jù)本發(fā)明所述植物是可結(jié)實(shí)的，根據(jù)本發(fā)明所述的表達(dá)盒被轉(zhuǎn)移到它們的后代。
本發(fā)明還涉及上述轉(zhuǎn)基因植物的種子，該種子含有根據(jù)本發(fā)明編碼HPP氧化酶、HGAH或HGAC的表達(dá)盒。
根據(jù)本發(fā)明轉(zhuǎn)化植物中的各種表達(dá)盒可起源于相同轉(zhuǎn)化的親本植物，在這種情況下，植物是從用包含于相同載體中的各種表達(dá)盒進(jìn)行的單一的轉(zhuǎn)化/再生過程得來的，或者用幾個載體轉(zhuǎn)化得來。也可通過雜交親本植物得到，該親本植物各個含有根據(jù)本發(fā)明的至少一個表達(dá)盒。
植物細(xì)胞和植物的轉(zhuǎn)化本發(fā)明的另一個主題是通過引入根據(jù)上述本發(fā)明的至少一個核酸序列或表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物的方法，該轉(zhuǎn)化可通過任何適合的已知方法獲得，這些方法廣泛描述于專門文獻(xiàn)和具體地在本發(fā)明引用的參考文獻(xiàn)中，更具體地用根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和植物的方法。
一系列的方法包括轟擊細(xì)胞、原胚胞或具有DNA序列附著的顆粒的組織。另一系列的方法包括作為轉(zhuǎn)移進(jìn)入植物的方法，使用嵌合的基因插入根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蛎r(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒?？墒褂闷渌姆椒?，如微注射或電穿孔，或使用PEG直接沉淀。本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄟx擇有功能的天然宿主有機(jī)體，尤其是植物細(xì)胞或植物。
當(dāng)要求引入一些核酸序列或表達(dá)盒時，可以使用根據(jù)本發(fā)明的具有各種表達(dá)盒的單一載體進(jìn)行。它們也可使用幾個載體(每個載體含有至少一個表達(dá)盒)通過共轉(zhuǎn)化引入宿主有機(jī)體。
一般而言，根據(jù)本發(fā)明，通過植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和而后從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞植物(較佳的是可結(jié)實(shí)的)的再生得到轉(zhuǎn)基因植物。通過任何適當(dāng)?shù)姆椒ǐ@得再生，它依賴于種類的特性，例如上述參考文獻(xiàn)中描述的。對于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞和再生植物的方法將在如下專利和專利申請中具體涉及US 4,459,355，US 4,536,475，US5,464,763，US 5,177,010，US 5,187,073，EP 267,159，EP 604 662，EP 672 752，US 4,945,050，US 5,036,006，US 5,100,792，US 5,371,014，US 5,478,744，US5,179,022，US 5,565,346，US 5,484,956，US 5,508,468，US 5,538,877，US5,554,798，US 5,489,520，US 5,510,318，US 5,204,253，US 5,405,765，EP 442174，EP 486 233，EP 486 234，EP 539 563，EP 674 725，WO 91/02071和WO 95/06128。
選擇性除草本發(fā)明的一個主題還涉及使用HPPD抑制因子，特別是上述除草劑，對植物，具體是農(nóng)作物選擇性除草的方法，特征是該除草劑用于根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物，在農(nóng)作物播種前、發(fā)芽前和發(fā)芽后是一樣的。
本發(fā)明還涉及在含有根據(jù)本發(fā)明的種子或轉(zhuǎn)化植物的田間的一片區(qū)域除草的方法，該方法包括在所述田間的區(qū)域施用一定劑量的HPPD-抑制除草劑，該劑量對雜草有毒，而基本不會影響根據(jù)本發(fā)明的種子或轉(zhuǎn)化植物。
本發(fā)明還涉及栽培根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物的方法，該方法包括在適合所述植物生長的田間的一片區(qū)域內(nèi)播下所述轉(zhuǎn)化植物的種子，在雜草存在的情況下，對所述田間的所述區(qū)域施用一個劑量的如上所述的以HPPD作為靶標(biāo)的除草劑，該除草劑對雜草有毒，基本上不影響所述的種子和所述的轉(zhuǎn)化植物，當(dāng)它們達(dá)到所需的成熟，收割該植物，從收獲的植物中隨意地分離種子。
根據(jù)本發(fā)明，“基本不影響所述種子或所述轉(zhuǎn)化植物”的表達(dá)是指根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物在施用一個劑量的對雜草有毒的除草劑時顯示出輕微的或零植物毒性。根據(jù)本發(fā)明，“對雜草有毒的劑量”的表述是指除草劑施用的劑量殺死了雜草。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“輕微的植物毒性”是指發(fā)黃葉子的百分?jǐn)?shù)少于25％，較佳地少于10％，更佳地少于5％。還應(yīng)理解根據(jù)本發(fā)明對另外一種可比較的但未轉(zhuǎn)化(即它不含有至少一個根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)盒)的植物施用相同的毒性劑量，將導(dǎo)致觀察到的所述植物的植物毒性癥狀比根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物上觀察到的癥狀嚴(yán)重。
在上述兩個方法中，以HPPD作為靶標(biāo)的除草劑的施用可根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行，在農(nóng)作物播種前、發(fā)芽前和發(fā)芽后是一樣的。
為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“除草劑”是指具有除草活性的物質(zhì)自身或與一種改變其效果的添加劑結(jié)合，例如，一種增強(qiáng)活性的(增效劑)或限制活性的(安全劑)試劑。預(yù)先具體描述了HPPD-抑制除草劑。當(dāng)然，對于它們實(shí)際的應(yīng)用，上述除草劑用本來已知的方式與農(nóng)業(yè)化學(xué)中常規(guī)使用的制劑的佐劑相結(jié)合使用。
當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物含有另一個耐受另外一種除草劑的基因(如編碼EPSPS的基因，它可能突變或未突變，賦予植物對草甘膦的耐受性)，或者當(dāng)轉(zhuǎn)化植物對另一種除草劑天然不敏感，根據(jù)本發(fā)明的方法可包括HPPD抑制劑與所述的除草劑(如草甘膦)結(jié)合同時施用或在不同的時間施用。
通過以下的實(shí)施例將更加清楚地理解本發(fā)明的各個方面。
通過舉例的形式給出下文實(shí)施例中描述的所有方法和操作以及相應(yīng)的選擇，通過各種方法可得到相同的結(jié)果。這個選擇與結(jié)果的質(zhì)量無關(guān)，因此，本領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員可使用任何適合的方法來得到相同的結(jié)果。操縱DNA片段的大多數(shù)方法描述于Coligan等(1995)，Ausubel等，(1995)；Maniatis等(1982)和Sambrook等。
上述引用的目錄參考將作為文獻(xiàn)結(jié)合入本專利申請，具體的是定義編碼天然、嵌合或突變的HPPD的核酸序列任選地與信號肽或轉(zhuǎn)運(yùn)肽結(jié)合的目錄參考。
實(shí)施例I編碼來自球形節(jié)桿菌的HPP氧化酶的基因的鑒別HPP氧化酶(HPPO)通過脫羧反應(yīng)將HPP轉(zhuǎn)化為4-HPA。由此該酶催化構(gòu)建新辟HPPD旁路代謝途徑所需的第一酶活性。HPP氧化酶活性的特征是存在于紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)S1的粗提物中(Suemoti等，1995)或或存在于球形節(jié)桿菌的部分純化的提取物中(Blakley，1977)。根據(jù)我們的知識，蛋白質(zhì)未被純化。為了能夠引入該酶活性進(jìn)入植物，需要鑒別它們的基因，可是使用各種方法(1)插入誘變和因此通過酶活性的缺失鑒別基因，(2)使用基因組文庫進(jìn)行微生物功能的互補(bǔ)，(3)為了找回核酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化。
使用了三種方法。由于這些技術(shù)不能鑒別HPPO基因，功能互補(bǔ)和插入突變使用得相對較少。
I.1材料和方法I.1.1-培養(yǎng)條件I.1.1.1-豐富培養(yǎng)基Luria-Bertani(LB；Bio101銷售)培養(yǎng)基用于在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)細(xì)菌(大腸桿菌，熒光假單胞菌(P.fluorescens))。為了培養(yǎng)球形節(jié)桿菌，較佳地使用5％的綿羊紅(Biomerieux)強(qiáng)化的Columbia-ANC培養(yǎng)基。該強(qiáng)化的培養(yǎng)基含有兩種抑制革蘭氏陰性微生物的抗生素(萘啶酸和結(jié)腸霉素)。盡管在豐富培養(yǎng)基中三種細(xì)菌在37℃的條件下生長，球形節(jié)桿菌和熒光假單胞菌通常培養(yǎng)于29℃。
I.1.1.2-MAg培養(yǎng)基Blakley(1997)描述的培養(yǎng)基發(fā)生沉淀，因此在使用前需要過濾。為了獲得最佳的“最低限度”的培養(yǎng)基，我們通常改變培養(yǎng)基?？紤]的因素包括球形節(jié)桿菌的生長率和HPPO的酶活性。選擇的培養(yǎng)基(MAg)是M9培養(yǎng)基(Maniatis等，1982)，將它稍做改動Na2HPO4·12H2O(6g/L)；KH2PO4(3g/L)；NH4Cl(1g/L)；NaCl(0.5g/L)；CaCl2(6mg/L)；FeSO47H2O(6mg/L)；酵母提取物(20mg/L)；和最后，濃度為1g/L的底物(HPP或酪氨酸或的檸檬酸鹽)。該培養(yǎng)基是高壓蒸汽滅菌的。使用前，1mL滅菌的1M MgSO4加入每升培養(yǎng)基中。
該最低限度的培養(yǎng)基還用于培養(yǎng)熒光假單胞菌。
I.1.2-構(gòu)建球形節(jié)桿菌基因文庫沒有用于制備完整的細(xì)菌cDNA文庫的可靠方法。因此我們決定建立球形節(jié)桿菌基因文庫。為建立此基因文庫，我們選擇粘粒系統(tǒng)。制備該粘粒文庫用于功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，而后用于尋找含有hppO基因的粘粒。
I.1.2.1-粘粒載體pLAFR5I.1.2.1.1-載體的描述我們選擇偶聯(lián)的粘粒載體pLAFR5(Keen等，1988)，它可以接受約20kb的插入。具有轉(zhuǎn)移起點(diǎn)和具有廣譜革蘭氏陰性宿主的復(fù)制起點(diǎn)，它可通過三腸胃外偶聯(lián)，轉(zhuǎn)移到其它的細(xì)菌種類中，用于在各個細(xì)菌種類中檢測功能的互補(bǔ)。它具有對四環(huán)素的抗性。
I.1.2.1.2-載體的制備使用堿性裂解方法純化質(zhì)粒pLAFR5(Maniatis等，1982)，用RNA酶處理然后用Bam HI和Sca I消化。用Bam HI消化使它能夠打開位點(diǎn)，在該位點(diǎn)中“連接”用Sau3A消化的基因組DNA的插入片段。用Sca I消化使它能夠釋放允許包膜的cos位點(diǎn)。經(jīng)用苯酚然后氯仿提取后，DNA用乙醇沉淀。干燥DNA溶于水。這樣制備的載體貯藏于-20℃。
I.1.2.2.-球形節(jié)桿菌基因組DNA的制備Blakley(1997)描述的在培養(yǎng)基(200mL)中制備的一種24-小時培養(yǎng)物(200mL，180rpm，29℃)在3000g、4℃離心15分鐘。用10mL的溶解溶液(TE ph8；0.5％SDS；1mg蛋白酶K)溶解的細(xì)胞顆粒在37℃水浴中培養(yǎng)，并每20分鐘輕微搖動一次。90分鐘后，溶解細(xì)胞的懸浮液到灌入聚丙烯JA-20管中。然后加入10mL苯酚/氯仿/異戊基醇(25/24/1)，隨后在4℃下6000g離心15分鐘。然后上清液轉(zhuǎn)移到一個新的JA-20管中，其中加入1.8mL的10M醋酸銨和10mL的異丙醇。4℃下20,000g離心20分鐘后，用70％的乙醇洗滌沉淀。干燥的沉淀用1mL TE(pH8)溶解，然后轉(zhuǎn)移到2mL的Eppendorf管，其中加入10μLRNA酶(10mg/mL)。37℃下30分鐘后，加入800μL苯酚/氯仿/異戊基醇。離心后上清液轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管中并用0.8mL的氯仿提取。上清液然后轉(zhuǎn)移到最后一個Eppendorf管中，其中加入200μL10M的醋酸銨和800μL異丙醇。離心后，用70％的乙醇洗滌沉淀，一旦干燥用500μL的水溶解。然后基因組DNA在20℃貯存。
I.1.2.3-球形節(jié)桿菌基因組DNA的受控消化只有40-45kb的粘粒可以被包膜。因?yàn)樵撦d體是21.5kb，球形節(jié)桿菌基因組DNA的插入片段應(yīng)在19-22kb大小之間。通過進(jìn)行球形節(jié)桿菌基因組DNA的受控消化得到這些片段。為了確定受控消化的最佳條件，球形節(jié)桿菌基因組DNA的消化用各個量的Sau 3A限制酶進(jìn)行。它顯示最佳的消化條件是在37℃，使用0.08Sau3A酶單位30分鐘。這樣消化的基因組DNA大小在15-22kb之間。這樣消化的基因組DNA用苯酚然后用氯仿提取，最后用乙醇沉淀。
I.1.2.4-球形節(jié)桿菌基因組DNA連接進(jìn)入粘粒載體在最終10μL的體積中進(jìn)行連接反應(yīng)，該體積中含有500ng用Bam HI和Sca I消化的pLAFR-5,650ng用Sau 3A消化的基因組DNA，320單位的T4DNA連接酶(N.E.B)和5mM的ATP。在12℃下過夜進(jìn)行連接反應(yīng)(約16小時)。5mM的ATP可避免平頭末端(Sca I)間的連接(Feretti和Sgaramella，1981)，這樣不具有插入片段的載體二聚體在λ噬菌體的頭部不被包膜。
I.1.2.5-粘粒的包膜和粘粒文庫的擴(kuò)增使用GIGAPACK II XL試劑盒(Stratagene)根據(jù)廠商的說明進(jìn)行粘粒的包膜，提供了比用常規(guī)轉(zhuǎn)化技術(shù)得到的轉(zhuǎn)染效率更高的效率。為了擴(kuò)增粘粒文庫，Keen等(1988)建議使用大腸桿菌DH-1和HB101。具體地，當(dāng)菌株在麥芽糖上培養(yǎng)，它們產(chǎn)生膜結(jié)合蛋白，它能使噬菌體更好地附著從而使粘粒的轉(zhuǎn)染更有效。根據(jù)Stratagene的建議擴(kuò)增的該文庫貯存于-80℃。為了評價該粘粒文庫，從大約30個克隆分離的質(zhì)粒DNA用Apa I或Eco RI消化。限制性特性保留于0.8％的瓊脂糖凝膠上。
I.1.3-HPP氧化酶的純化I.1.3.1-HPP氧化酶活性的比色測定為了能夠控制純化步驟，使用Blakley(1977)描述的比色測定方法測定HPP氧化酶的活性。通過在2M HCl溶液中加入2，4-二硝基苯肼(2，4-DNPH)停止該酶反應(yīng)。在羧基功能的α位點(diǎn)2，4-DNPH與酮功能反應(yīng)(例如HPP)。這樣形成了一種腙，它可以通過堿化培養(yǎng)基顯示。在酶反應(yīng)過程中當(dāng)HPP完全轉(zhuǎn)化為4-HPA，腙不能形成，因此在堿性培養(yǎng)基中得到2，4-DNPH的特征性黃色。如果在酶反應(yīng)過程中HPP沒有完全轉(zhuǎn)化為4-HPA，腙的形成是可能的。在堿性培養(yǎng)基中這些腙的顏色是棕色的。作為HPP消耗量的函數(shù)得到這兩個極端間的顏色變化。在445或450nm處進(jìn)行吸收測定。為了使該測定更易于操作，我們使用96-孔微平板形式。該反應(yīng)混合物包括GSH(900μM)；HPP(135μM)；YPP(1.8mM)；MgCl2(4.5mM)；FAD(4μM)；磷酸鉀緩沖溶液(90mM)pH7.4。該混合物放置于冰上。50μL的測定部分和150μL的反應(yīng)混合物放入每個孔中。在30℃20分鐘后，用13μL的2，4-DNPH溶液(0.1％在2M HCl中)停止酶反應(yīng)?；旌衔镌诃h(huán)境溫度下反應(yīng)20分鐘。通過加入13μL的10M NaOH溶液顯示腙的形成。為了制備標(biāo)準(zhǔn)范圍，制備了具有各種HPP濃度的反應(yīng)混合物。用50μL的蛋白質(zhì)提取物緩沖溶液取代50μL的蛋白質(zhì)部分。作出每個2，4-DNPH的新溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線(2，4-DNPH溶液在黑暗中穩(wěn)定6個月)。該測定的優(yōu)越性是它的迅速性和簡易性，但它具有測試底物消失而并非產(chǎn)物出現(xiàn)的缺陷性。另外，具有假陽性存在的可能性酪氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶活性將給出與HPPO活性相同的結(jié)果。特別是，在兩個例子中，酮的功能消失了。因此我們開發(fā)了一個迅速而敏感的HPLC方法，該方法能夠證實(shí)4-HPA的生產(chǎn)。
I.1. 3.2-用HPLC分析活性測定使用小Spherisorb ODS2柱(50×4.4mm，顆粒大小3μM)開發(fā)了一種HPLC的方法。在等度條件A90％、B10％下(其中緩沖液A水，0.1％TFA和緩沖液B乙腈)進(jìn)行層析，流速為0.8mL/min，隨后在230nm處進(jìn)行洗提。在這些條件下，注入5分鐘后可以分離4-HPA、HGA、3，4-DHPA和HPP。柱是由Merck定做的。
I.1.3.3-蛋白質(zhì)的純化在建立這一方法的過程中尋求簡易的方法。
I.1.3.3.1-初步測定初步測定的目的是確定混合物(NaCl、KCl、1-丙醇、己二醇等)的影響以及pH對酶活的影響。用培養(yǎng)于含有酪氨酸作為唯一碳源(MAg-酪氨酸)的MAg培養(yǎng)基中的球形節(jié)桿菌的粗提物進(jìn)行反應(yīng)。檢驗(yàn)的混合物加入反應(yīng)培養(yǎng)基中。為測定pH對HPPO酶活的影響，制備各種磷酸鹽緩沖溶液。
I.1.3.3.2-純化方法將球形節(jié)桿菌菌株在LB瓊脂培養(yǎng)基或Columbia-ANC瓊脂培養(yǎng)基上鋪板。29℃培養(yǎng)16小時后，菌落移出接種于5mL的LB培養(yǎng)基中，在生長條件下29℃、180rpm培養(yǎng)8小時。然后50μL的這種預(yù)培養(yǎng)物接種于1.5L的MAg-酪氨酸或MAg-HPP培養(yǎng)基中，然后在具有細(xì)棒的錐形瓶中以29℃、180rpm進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)48小時后，通過4℃、5000g離心15分鐘收集細(xì)胞。然后該細(xì)胞重懸浮于50mM pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，再如前述進(jìn)行離心。沉淀溶解在2mL的50mM pH7.4的Tris-HCl緩沖溶液中。細(xì)胞在冰浴中超聲處理(Vibra Cell，Sonic MaterialsINC.，Connecticut，USA)15分鐘，功率4，30％脈沖。不能溶解的碎片經(jīng)4℃、20 000g離心25分鐘除去。回收上清液，該上清液含有“粗提物”。將該上清液在液氮中冰凍然后貯存于-80℃(6個月內(nèi)不會明顯地?fù)p失活性)。將沒有預(yù)先脫鹽的粗提物填充到在pH7.4的50mM的磷酸鹽緩沖液中平衡的“EMD/DEAE 650S”弱陰離子交換柱(Merck)中。通過使用NaCl濃度梯度得到洗脫的酶活性(在pH7.4的50mM的磷酸鹽緩沖溶液中)。集中包含酶活性的部分。得到的蛋白質(zhì)溶液用pH7.4的50mM的磷酸鹽緩沖溶液稀釋2.7倍。然后蛋白質(zhì)填充到“source Q”強(qiáng)陰離子交換柱(XK16，Pharmacia)(30mL，Pharmacia)中，該柱用pH7.4的50mM的磷酸鹽緩沖溶液預(yù)平衡。集中經(jīng)酶活性鑒別的蛋白質(zhì)部分的值，然后通過UVIKON 10kDa膜濃縮。然后得到的蛋白質(zhì)提取物使用在pH7.4的10mM的磷酸鹽緩沖溶液中平衡的“PD10”柱(Pharmacial)經(jīng)凝膠過濾技術(shù)脫鹽，并用相同的緩沖液洗提。然后將蛋白質(zhì)填充到用pH7.4的10mM的磷酸鹽緩沖溶液平衡的羥磷灰石柱(XK9/15，Pharmacia)(2mL；羥磷灰石DNA級Bio-Gel？HTP凝膠；Bio-Rad)上。通過使用磷酸鹽梯度洗提酶活性。集中并濃縮含有酶活性的部分。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的濃度大于1mg/mL通過加入FAD、GSH和甘油保存活性蛋白質(zhì)以獲得如下最終濃度27μMFAD，110μMGSH、0.8％的甘油。這樣制備的蛋白質(zhì)可以貯存于-80℃至少6個月。
I.1.3.3.3-蛋白質(zhì)的測定根據(jù)Bradford方法(1976)使用標(biāo)準(zhǔn)？-球蛋白測定蛋白質(zhì)。
I.1.3.3.4-蛋白質(zhì)凝膠的染色根據(jù)Laemmli方法(1970)在10％聚丙烯酰胺凝膠上測定蛋白質(zhì)部分。遷移后凝膠中的蛋白質(zhì)可使用考馬斯蘭方法(Chua，1980)或使用硝酸銀方法(Schoenle等，1984)進(jìn)行染色。
I.1.4-N-末端和內(nèi)部肽的蛋白質(zhì)微量測序蛋白質(zhì)的微量測序使用Edman方法(Laursen，1971)進(jìn)行。為了在測序中得到最好的結(jié)果，在同一天制備凝膠。
I.1.4.1-制備丙烯酰胺凝膠及其電泳根據(jù)Laemmi方法(1970)使用Hoefer？微型凝膠系統(tǒng)制備凝膠(8.5％、10％、12％)。用“變性的加樣藍(lán)”(denaturing loading blue)溶液(150mM Tris-HCl、pH6.8、4％SDS、2％(v/v)β-巰基乙醇、3.3％(v/v)甘油、0.03％溴苯酚藍(lán)、qs 10mL的milliQ水)將蛋白質(zhì)稀釋到1/3。煮沸5分鐘后蛋白質(zhì)填充到丙烯酰胺凝膠上。使用變性的遷移緩沖液(25Mm Tris基底；250mM甘氨酸；0.014％(v/v)β-巰基乙醇；0.1％SDS)在環(huán)境溫度下進(jìn)行遷移，每膠施以15mA的電流強(qiáng)度。
I.1.4.2-N-末端測序的制備為了能夠進(jìn)行N-末端的測序，使用半-干轉(zhuǎn)移技術(shù)將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜(PROBLOTT-Applied Biosystems)上。使用“半干電印跡儀”設(shè)備(Bio-Rad)(300mA)和在CAPS-基底的培養(yǎng)基(轉(zhuǎn)移緩沖液10mM CAPS，Ph11.0；10％(v/v)甲醇)中進(jìn)行多肽的電轉(zhuǎn)移30分鐘。轉(zhuǎn)移緩沖溶液不含有甘氨酸，它具有“污染”測序的危險。轉(zhuǎn)移后，用milliQ水沖洗膜幾秒鐘。然后在以胺黑為基底的染色溶液中浸泡幾秒鐘(Aldrich；ref.19.524-3)。該溶液含有45％(v/v)的甲醇、1％(v/v)乙酸、0.1％(m/v)的胺黑和63.9％(v/v)的水。當(dāng)看到對應(yīng)于感興趣的蛋白質(zhì)的帶，膜用milliQ水徹底沖洗，然后在空氣中晾干。將含有感興趣的蛋白質(zhì)的膜的部分(kDa)切下，用于測序。
I.1.4.3-關(guān)于內(nèi)部肽測序的制備為了在凝膠中顯示出蛋白質(zhì)，使用胺黑染色方法，該方法與用于染色PVDF膜的方法稍有不同。遷移后，用包括50％甲醇、10％乙酸、40％milliQ水的溶液固定凝膠30分鐘2次。用含有45％甲醇、10％乙酸、45％水和0.003％(w/v)胺黑的溶液進(jìn)行染色。蛋白質(zhì)漸漸出現(xiàn)。當(dāng)染色足以確定蛋白質(zhì)的位置，用milliQ水徹底沖洗凝膠。剪下感興趣的帶，然后在真空離心蒸發(fā)濃縮器(Savant)中脫水。失去了約1/3長度的凝膠帶用于測序。用Lys-C內(nèi)切蛋白酶(測序級，Boehringer)消化蛋白質(zhì)后得到內(nèi)部肽。聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)在150μL的含有0.03％SDS、pH8.6的Tris-HCl緩沖溶液(0.1M)中消化，在35℃、0.4？g的Lys-C內(nèi)切蛋白酶存在的情況下消化18小時。消化的蛋白質(zhì)注入DEAE-C18 HPLC柱(直徑為1mm)；用含有1％TFA的乙腈梯度(從2-75％)洗提肽。Lys-C內(nèi)切蛋白酶特異性地在賴氨酸的羧基端切割多肽。
I.1.5.1-使用球形節(jié)桿菌MndD基因理論的確認(rèn)MndD基因的一部分(867bp)使用引物“OZ-MndD-S711”ACGTCACCGAAGAGGATGAA AAC和“OZ-MndD-AS1578”ACGGCCATTT CGGACTTTTC經(jīng)PCR擴(kuò)增。使用如下步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增95℃5分鐘；25個循環(huán)95℃45秒，56℃45秒，72℃1分鐘，72℃5分鐘；保持4℃。該反應(yīng)混合物在最終的50μL體積中含有200-500μM的dNTP、20-200ng的粘?；蚧蚪MDNA和100pmol的各個引物。
I.1.5.2-通過PCR鑒別編碼HPP氧化酶的基因部分使用“Advantage-GC基因組PCR”試劑盒(Clontech)進(jìn)行PCR。該試劑盒包括一個“GC-溶解(GC-melt)”三甲銨乙內(nèi)酯-基的佐劑和耐熱聚合酶混合物和其它組分-主要是具有嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)(Tth)。擴(kuò)增在球形節(jié)桿菌基因組DNA上進(jìn)行，使用如下的步驟94℃5分鐘；30個循環(huán)94℃20秒，60℃30秒，72℃3分鐘，72℃6分鐘；保持4℃。該反應(yīng)條件是50μL的反應(yīng)體積中包括400μM的dNTP、50ng的基因組DNA、100pmol的各個引物和1X“GC-溶解”。在這些條件下，我們擴(kuò)增937bp的帶，我們稱之為Z2。
還可使用Epicentre Tth或Tbr(Thermus brockianus-Finnzyme)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Tbr是唯一檢驗(yàn)的可以進(jìn)行PCR而不需要添加劑(DMSO，甘油、三甲銨乙內(nèi)酯)的耐熱聚合酶；它還是一個高度保真的酶。
I.1.6-粘粒文庫的篩選使用洋地黃毒苷-標(biāo)記冷探針技術(shù)篩選粘粒文庫(Boehringer Mannheim，1995)。
I.1.6.1-Z2-Dig探針的的制備在50μL的最終體積中通過PCR用洋地黃毒苷標(biāo)記探針，在段落II.5.2中描述的條件下，除dNTP混合物以外，該混合物還含有90μMdUTP-Dig；135μMdTTP；225μMdATP；225μMdCTP；225μMdGTP。擴(kuò)增的探針通過裝載3μL的反應(yīng)物到0.8％的瓊脂糖凝膠上確定其數(shù)量。一種輕微的背景噪聲出現(xiàn)，即PCR不是十分專一的。為了避免所有后續(xù)問題，整個PCR裝載到凝膠上，使用Qiaex II試劑盒(Qiagan)提取感興趣的帶。
I.1.6.2-轉(zhuǎn)移粘粒文庫到雜交N膜(Hybond N membrane)上使用在大腸桿菌HB101中制備的粘粒文庫的甘油原液接種2mL的LBT15培養(yǎng)基。生長8小時后，測定其OD600；為了在每個培養(yǎng)皿(144cm2)中得到約1000個克隆，制備了血清稀釋液。在37℃生長16小時后，根據(jù)Boehringer Mannheim的建議(1995)，細(xì)菌轉(zhuǎn)移到Hybond N膜上(Amersham)并溶解。釋放的DNA通過暴露于紫外線(45秒傳遞120mJ-Stratalinker；Strategene)固定在膜上。如Boehringer Mannheim(1995)建議的，通過進(jìn)行蛋白質(zhì)酶K的處理，將細(xì)胞碎片從膜上除去。
I.1.6.3-預(yù)雜交-雜交-檢測通過使用洋地黃毒苷標(biāo)記探針(Boehringer Mannheim(1995))的雜交技術(shù)，在一個放置于搖動平臺的袋中進(jìn)行預(yù)雜交和雜交步驟。預(yù)雜交(5？SSC；0.5％SDS；0.1％N-月桂基肌氨酸；1％封阻劑；(Boehringer Mannheim，參考文獻(xiàn)1096 176)；100？g/mL超聲處理和變性的大麻哈魚精液)在65℃進(jìn)行4小時。膜的雜交在68℃進(jìn)行過夜(含有20ng/mL的洋地黃毒苷標(biāo)記探針的新鮮預(yù)雜交培養(yǎng)基在100℃變性5分鐘)。第二天，用緩沖液A(0.5？SSC；0.1％SDS，65℃)洗滌4次除去過量的探針和具體的雜交產(chǎn)物。然后在環(huán)境溫度下緩沖溶液B(138mM蘋果酸，142mM NaCl，用NaOH調(diào)節(jié)pH為7.5，0.3％的Tween 20)中平衡該膜5分鐘，然后它們用封阻劑飽和30分鐘(Boehringer Mannheim)，雜交前在新鮮的封阻劑溶液中用堿性偶聯(lián)的磷酸酶抗-洋地黃毒苷抗體(“抗-洋地黃毒苷-AP，F(xiàn)ab片段”；Boehringer Mannheim)稀釋到1/10 000。30分鐘后在緩沖溶液B中沖洗膜15分鐘2次，然后在堿性磷酸酶反應(yīng)緩沖溶液(0.1M Tris；0.1M NaCl；0.05M MgCl2，pH9.5)中平衡5分鐘。用1ml的準(zhǔn)備-使用的CSPD覆蓋該膜，然后在37℃下培養(yǎng)15分鐘。在37℃下的這一步驟使堿性磷酸酶迅速活化與抗體偶聯(lián)。通過暴露HyperfilmECL 1-15分鐘培育該膜。
I.1.6.4-通過DNA印跡(Southern)和PCR分析陽性粘粒在膜上雜交中鑒別的粘粒通過PCR和Southern技術(shù)證實(shí)。在這個例子中，通過堿溶解純化的粘粒DNA為限制酶所消化，然后在0.8％的瓊脂糖凝膠中分離。經(jīng)Southern技術(shù)在20？SSC中將凝膠轉(zhuǎn)移到Hybond N+膜上(Amersham)(Ausubel等，1995)。轉(zhuǎn)移后，用2？SSC沖洗膜，然后使用紫外線(45秒內(nèi)傳遞120mJ-Stratalinker；Stratagene)將DNA固定在膜上。然后使用前面描述的冷探針技術(shù)培育膜。
I.1.7-克隆載體和宿主細(xì)菌PCR-擴(kuò)增的DNA序列通常克隆入質(zhì)粒p-GEMT-easy(Promega)，它允許使用“藍(lán)-白”技術(shù)進(jìn)行篩選。對于過量表達(dá)，使用質(zhì)粒Pkk223-3(Pharmacia)，它將基因置于tac啟動子的控制下。通常使用大腸桿菌DH5(New England Biolabs)或大腸桿菌XLl Blue(Stratagene)進(jìn)行克隆。對于過量克隆，大腸桿菌BL21(DE3)是優(yōu)選的。
I.1.8己酰乳酸合成酶的酶活己酰乳酸合成酶(ALS)的活性使用Chang和Duggleby(1997)描述的比色法測定。在總體積為250μL的微量培養(yǎng)板中進(jìn)行反應(yīng)。對于各個反應(yīng)，在37℃，225μL的反應(yīng)培養(yǎng)基中培育25μL的酶30分鐘，該培養(yǎng)基包括50mM Kpi，PH7.0；50mM丙酮酸鈉；1mM TPP；10mM MgCl2；10μM FAD。通過加入25μL的10％的硫酸反應(yīng)停止。然后60℃培養(yǎng)微量培養(yǎng)板15分鐘。然后加入在4M NaOH中的250μL的0.5％肌氨酸和250μL 5％的？-萘酚(？-萘酚溶液應(yīng)在使用前10分鐘制備)。然后60℃培養(yǎng)微量培養(yǎng)板15分鐘，然后在室溫下培養(yǎng)15分鐘。一種櫻桃紅出現(xiàn)。在525nm進(jìn)行讀數(shù)(λM＝22 700M-1cm-1)。
I.2-結(jié)果-討論根據(jù)文中建立HPPD旁路代謝途徑，HPP氧化酶是我們希望引入植物的第一種酶活性。為了能夠識別編碼HPP氧化酶的活性的基因，使用了各種方法(1)插入突變因此通過酶活性的缺失識別基因，(2)使用基因文庫進(jìn)行微生物的功能性互補(bǔ)，(3)為了找回核酸序列純化蛋白質(zhì)。第三種方法是優(yōu)選的。
I.2.1-HPPO的純化I.2.1.1-培養(yǎng)條件的優(yōu)化開始純化蛋白質(zhì)前，確定允許在細(xì)菌中表達(dá)的培養(yǎng)條件是有用的。培養(yǎng)條件最優(yōu)化的結(jié)果顯示，當(dāng)球形節(jié)桿菌的生長依賴于碳源如琥珀酸鹽、延胡索酸鹽或葡萄糖時檢測不到HPP氧化酶活性。另一方面，當(dāng)使用HPP、酪氨酸或苯丙氨酸作為唯一的碳源培養(yǎng)球形節(jié)桿菌時檢測到HPP氧化酶活性。如果酵母提取物的量增加(例如200mg.L-1代替20mg.L-1)，觀察到產(chǎn)生的酶活的下降。在這些觀察的基礎(chǔ)上確定MAg培養(yǎng)基。最后，觀察到高-密度的培養(yǎng)物(在最初的穩(wěn)定期；OD600-1)比培養(yǎng)物在指數(shù)生長期內(nèi)(OD600～0.4)表現(xiàn)出較弱的HPP氧化酶活性。
I.2.1.2-初步的分析我們已經(jīng)確定了用于HPPO生產(chǎn)的最適的培養(yǎng)基，我們現(xiàn)在尋找在純化過程中不會削弱HPP氧化酶穩(wěn)定性的條件。由于色譜法包括陰離子交換樹脂，并且色譜法作為pH的一個功能，了解酶對pH和對鹽的敏感性是重要的。我們觀察到如Blakley(1997)所證實(shí)的最適的pH在pH7.0-7.8之間。由于要觀察到酶活性的下降需要大于750mM的濃度，顯示出酶對于鹽(NaCl和KCL)相對不敏感。我們現(xiàn)在知道酶活良好表達(dá)的條件并且我們已確定在純化過程中HPP氧化酶活性對可能干預(yù)的因子的敏感性，因此HPPO的純化可以開始了。
I.2.2.3-HPPO的純化為純化HPPO，使用上面描述的方法。用150-200mM NaCl溶液，在50mM磷酸緩沖溶液(pH7.4)中，從DEAE EMD 650S洗提酶活。收集含有酶活的片段并在4℃保存過夜。在這一步，冰凍事實(shí)上會導(dǎo)致活性的損失。然后蛋白質(zhì)裝載到SourceQ樹脂上。然后用150-200mM NaCl溶液，在50mM磷酸緩沖溶液(pH7.4)中洗提酶活性。收集含有酶活的片段，然后集中于UVIKON 10kDa膜，在4℃保存過夜。最后，通過對羥基磷灰石圓柱使用磷酸鹽梯度，在第三個步驟中純化HPPO。酶活通過濃度為30mM左右的磷酸鹽洗脫。在羥基磷灰石圓柱出口、含有HPP氧化酶酶活的部分在用硝酸銀染色的SDS-8.5％的PAGE凝膠上分析。凝膠上顯示產(chǎn)生兩個蛋白帶。通過酶活性分布圖和蛋白質(zhì)洗脫分布圖之間的比較我們認(rèn)為HPPO符合高分子蛋白質(zhì)的特征(約60kDa)。在進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，開始用1.5g的提取自球形節(jié)桿菌的溶解蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，我們回收了150μg蛋白質(zhì)混合物(包括約70μg HPPO)，沒有測定到有關(guān)特異性活性的純化因子。結(jié)果，我們使用了全部反應(yīng)條件以洗脫酶活性。此外，該問題還在于蛋白的鑒別，而不在于純化方法的改進(jìn)。HPLC分析在每一個純化步驟的結(jié)束時進(jìn)行的反應(yīng)，顯示與4-HPA標(biāo)準(zhǔn)(SIGMA)具有相同存留時間的產(chǎn)物的出現(xiàn)。將包含在丙烯酰胺凝膠中的40pmol的HPPO蛋白(60kDa)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上用于測序。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上用于測定N-末端序列，而蛋白質(zhì)包含于凝膠中用于測定內(nèi)部肽的序列。
I.2.2.4-HPPO測序的結(jié)果用Lys-C內(nèi)切蛋白酶消化HPPO后，在HPLC出口處得到幾個內(nèi)部肽。這一結(jié)果表明該蛋白質(zhì)含有不多的賴氨酸；具體地說，Lys-C內(nèi)切蛋白酶在賴氨酸之后進(jìn)行酶切。如果賴氨酸相對稀少，用內(nèi)肽酶K消化產(chǎn)生長肽片段，該片段仍然吸附在柱里，甚至使用完全疏水的條件也不能被洗提。基于層析峰的形狀和表觀量，選定了三種肽然后測序。以它們離開HPLC柱的次序命名它們肽No.4，肽No.6，肽No.11。其序列分別是(A)WWAEALK，AAAGRILRLL DDAAGANASK，XDNRFTAVDF XT(其中X是一個未確定的氨基酸)。以40％的起始產(chǎn)率得到最初30個N-末端氨基酸序列TSLTVSGRVA QVLSSYVSD VFGVMGNGNV Y。沒有發(fā)現(xiàn)對應(yīng)于起始密碼子(ATG或GTG)的氨基酸(甲硫氨酸或纈氨酸)。得到的最初產(chǎn)量(等量的15pmol BSA)與得到的內(nèi)部肽的產(chǎn)量相比較(等量的30-35pmol BSA)說明一些蛋白質(zhì)在N-末端被阻斷。得到的N-末端序列和內(nèi)部序列在基本數(shù)據(jù)上沒有顯示同源性?；诘玫降碾男蛄?，合成簡并的寡核苷酸以使用PCR鑒別HPPO基因。
I.2.3-PCR技術(shù)的確定和hppo基因部分的鑒別I.2.3.1-PCR技術(shù)的確定節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.)基因組DNA的主要部分鳥嘌呤和胞嘧啶堿基的含量(GC％)在59％和66％之間；然而對于活潑節(jié)桿菌(A.agilis)(前面所述的活潑微球菌(Micrococcus agilis))其鳥嘌呤和胞嘧啶堿基的含量為67-69％(Koch等，1995)，對于黑藍(lán)節(jié)桿菌(A.atrocyaneus)是70％(Jones等，1991)和對于鑒定于北極冰上的節(jié)桿菌是73％(Junge等，1998)。這些高含量的鳥嘌呤和胞嘧啶可使其更難以進(jìn)行PCR。因此，我們使用基因編碼球形節(jié)桿菌“錳依賴的過氧化物酶”(MndD)確定我們的PCR方法(基因組DNA、聚合酶等)(Boldt等1995)。該HPP酶的降解途徑催化3，4-二羥苯乙酸的芳香環(huán)的打開。為了控制MndD基因的擴(kuò)增，我們測試了購買自幾個供應(yīng)商的水生棲熱菌(Thermophilus aquaticus)(Taq)耐熱聚合酶(Perkin Elmer，ATGC，Appligene，Qiagen，Sigma)。在所有的情況下，得到MndD基因的擴(kuò)增。然而，在相同的條件下，使用簡并的引物編碼HPPO肽，即使使用添加劑(DMSO、甘油)也沒有得到hppo基因的擴(kuò)增。
I.2.3.2-用PCR技術(shù)鑒別hppo基因的N-末端部分我們具體擴(kuò)增了936bp的DNA序列，該序列可能對應(yīng)于hppo基因的N-末端部分。首先使用簡并的引物0x3TTNGCNCCNG CNGCRTCRTC和OZ10NGAYGTNTTYGGNGTNATGGG NAAYGG分別對應(yīng)于肽No.6的部分和N-末端肽序列的部分，其次，使用“先進(jìn)的GC基因組PCR”試劑盒(Clontech)擴(kuò)增。該Clontech試劑盒設(shè)計(jì)用于在富含GC堿基的基因組上進(jìn)行PCR。它含有耐熱聚合酶(包括Tth)和內(nèi)銨鹽基的添加劑的混合物。Tth是一種純化于嗜熱棲熱菌的耐熱聚合酶。每個引物的簡并性是1024，即在1024中有一個引物顯示正在尋找的基因的核酸序列。簡并性起源于一種氨基酸可以被幾個密碼子編碼的事實(shí)，例如，丙胺酸被4個密碼子編碼(GCA、GCC、GCG、CGT)。用于引物的簡并密碼限定如下N＝A或T或G或C；R＝A或G；Y＝T或C。理論雜交溫度分別是55.4℃和57.6℃。盡管PCR中使用60℃的雜交溫度，單獨(dú)的0X3引物允許非特異性擴(kuò)增。我們使用兩個簡并的引物，通過PCR具體擴(kuò)增了936bp的DNA片段。我們必須確定該擴(kuò)增的DNA正確對應(yīng)于尋找的hppo基因。
I.2.4-936bp的DNA片段的特征用PCR擴(kuò)增的936bp的DNA片段在瓊脂糖凝膠上純化。然后根據(jù)廠商的說明方便地將該片段克隆入pGEM-T，然后測序。當(dāng)?shù)玫降暮怂嵝蛄斜环g，觀察到在兩個末端該序列編碼完全的肽No.6和大部分的N-末端序列。因此我們確信擴(kuò)增了編碼純化的和微量測序的蛋白質(zhì)HPPO的基因部分。該核酸序列含有73％的鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)堿基；還注意到在信使RNA的最初250個堿基可能形成次級“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)。這種高含量的G和C堿基以及次級結(jié)構(gòu)的存在可部分解釋在獲得該基因部分的PCR擴(kuò)增中遇到的困難。936bp的核酸序列以及相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列與基礎(chǔ)數(shù)據(jù)中記錄的序列不顯示同源性。我們現(xiàn)在得到了來自內(nèi)部肽No.6的N-末端的936bp的序列。由于蛋白質(zhì)約60kDa，尋找約1650bp的基因。因此還剩余約700bp有待鑒定。為此，我們將篩選在粘粒pLAFR中生產(chǎn)并在大腸桿菌HB101中擴(kuò)增的球形節(jié)桿菌基因組文庫。
I.2.5-篩選球形節(jié)桿菌粘粒文庫制備的基因組文庫轉(zhuǎn)移到膜上然后使用以洋地黃毒苷標(biāo)記的936bp DNA片段作為探針進(jìn)行篩選。標(biāo)準(zhǔn)方法適合“常規(guī)的”DNA(60％AT)，而該936bp片段顯示23％ATD的估計(jì)比例。如果我們保持如常規(guī)DNA情況下相同的dUTP-Dig/dTTP比率，我們得到一個弱標(biāo)記探針以及因此而得到不敏感的檢測。所以我們優(yōu)化dUTP-Dig/dTTP比例以適合于標(biāo)記探針的需要(段落II.7.1)。基因組文庫的篩選使之能夠鑒別具有不同限制特性的4種粘粒(Cos1A、Cos2A、Cos4A Cos17A1)。將使用粘粒獲得的Southern雜交的結(jié)果與使用球形節(jié)桿菌基因組DNA獲得的結(jié)果進(jìn)行比較，我們選擇粘粒2A。
圖14以用Not I限制性酶消化粘粒作為例子描述了使用的方法。首先觀察到用Not I消化的粘粒載體沒有Z2-Dig探針雜交。另外，觀察到粘粒1A顯示在2.3kb的單一的雜交帶，而粘粒2A、4A和Cos17A在4.3和2.3kb的兩個雜交帶?，F(xiàn)在，用Not I消化球形節(jié)桿菌基因組產(chǎn)生4.3和2.3kb的兩個帶；因此，我們認(rèn)為粘粒1A不含有所找尋的全部信息?；谄渌南拗坪褪褂孟嗤姆椒ǔフ沉?A和17A。然后在Z2-Dig探針的中部鑒定的Not I位點(diǎn)的兩邊約3kb的距離測定粘粒2A的序列?；蚪MDNA的雜交結(jié)果還顯示基因存在于單一的拷貝中。我們鑒定了粘粒2A，我們測定其序列大于6.2kb?，F(xiàn)在我們可以分析衍生自球形節(jié)桿菌基因組的DNA序列。
I.2.6-6.2kb的球形節(jié)桿菌基因組DNA的全面分析使用載體Nti軟件，從經(jīng)粘粒2A的測序得到6255bp的核酸序列確定潛在的基因位置。發(fā)現(xiàn)通過PCR鑒定的936bp序列是潛在基因的一部分。因此該潛在基因可能相當(dāng)于hppO基因。通過BLASTX算法進(jìn)行同源性搜索鑒定了4個潛在的基因A、B、C、D(圖3)。基因A將編碼氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，基因B將編碼磷酸組氨醇胺轉(zhuǎn)移酶；然而，以前的研究顯示該酶在革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌中具有酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的活性(Nester和Montoya，1976)，基因C將編碼轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因，而基因D將編碼操縱子調(diào)節(jié)基因。
I.2.7-hppO基因的分析I.2.7.1-概述在得到的6256bp序列上，hppO基因(綠色)界定在位置3143上的ATG起始密碼子的5’端和位置4823上的終止密碼子TAG(紅色)的3’端之間。因此該基因具有1680bp的實(shí)際長度。它顯示具有高含量的G和C堿基(71.4％)。在核酸序列中尋找同源性(BLASTN)沒有得到鑒定。為了更全面地表征該基因，尋找轉(zhuǎn)錄和翻譯的特異性元件。
I.2.7.2-表征hppO基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的元件鑒定了潛在的轉(zhuǎn)錄啟動子盒(圖4)。稱作“Pribnow盒”的盒“-10”位于3082到3088之間(AAAAATA)，盒“-35”位于3055到3059之間(TTGCA)。這樣確定的這些盒與規(guī)范序列(分別為TATAAT和TTGACA；Singer和Berg，1992)稍有不同。這可反映允許組成性轉(zhuǎn)錄的因子間的弱相互作用或不同的轉(zhuǎn)錄因子間所需的相互作用。在位置3096的腺嘌呤可能是轉(zhuǎn)錄起始堿基。最后，在位置3068到3072之間(TGTGA)鑒定到相當(dāng)于CAP蛋白質(zhì)(分解代謝基因活化蛋白)結(jié)合位點(diǎn)的序列。發(fā)現(xiàn)該CAP蛋白結(jié)合位點(diǎn)與在優(yōu)化的培養(yǎng)條件中得到的結(jié)果是一致的?？傊琱ppO基因的轉(zhuǎn)錄可能在弱啟動子的控制下，具體地為葡萄糖所調(diào)節(jié)。Shine-Dalgarno序列(Singer和Berg，1992)允許核糖體小亞基的結(jié)合。根據(jù)AGGA共有序列類推，在翻譯起始密碼子(ATG)上游12個堿基處鑒定到Shine-Dalgarno序列(GACGAT；在位置3131-3136)。還觀察到信使RNA 5’端部分(約250個堿基)能夠形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)在，在啟動子ATG區(qū)域內(nèi)的該mRNA區(qū)域的次級結(jié)構(gòu)影響翻譯的起始步驟。因此，當(dāng)啟動子ATG或Shine-Dalgarno序列在細(xì)胞間配對，起始是零或相對無效。因此可提出這樣的問題是否觀察到的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)在調(diào)節(jié)翻譯中可能起作用。
I.2.7.3-在tac啟動子的控制下HPPO的表達(dá)HPPO的過量表達(dá)有利于確定動力學(xué)特征，以允許抗體的生產(chǎn)，還有利于結(jié)構(gòu)分析的目的。在兩個階段，基因被克隆進(jìn)入載體pKK223-3。在確定用于鑒別hppO基因的條件下和使用引物HPP-C-sense(CATGACTTCA CTTACAGTGT CC)和HPP-C-term(CAAACTGAGT AGCAGCTCAGG)通過PCR擴(kuò)增的基因被克隆進(jìn)入載體pGEMT-easy。選擇在1ac啟動子反義方向上顯示hppO基因的克隆。然后用Eco RI消化。通過這樣做恢復(fù)hppO基因，并將其插入到用Eco RI消化的載體pKK223-3中。選擇在tac啟動子控制下顯示hppO基因的克隆pKK3-2。當(dāng)通過加入IPTG誘導(dǎo)克隆pKK3-2的表達(dá)時，可檢測到HPP氧化酶的活性。然而在變性的丙烯酰胺凝膠上分離的粗提物中沒有檢測到過量表達(dá)的蛋白質(zhì)(57.4kDa)。因此過量表達(dá)的方法尚待改進(jìn)。為了便于過量表達(dá)的蛋白質(zhì)的純化我們還設(shè)想克隆HPPO作為與Tag序列的融合(GST、聚組胺酸、蛋白質(zhì)A等)。我們剛剛確定地顯示鑒定的編碼HPP氧化酶活性的基因。然而在蛋白質(zhì)序列水平上進(jìn)行同源序列的尋找(BLASTX或BLASTP)，觀察到HPPO蛋白質(zhì)與乙酰乳酸合成酶(ALS)、丙酮酸氧化酶(POX)、丙酮酸脫氫酶(PDH)顯示出25％以上的同一性。因此可能鑒別非常保守的基序，如有關(guān)TPP協(xié)同因子結(jié)合的基序(圖5)。另外，HPPO的疏水特征與ALS得到的疏水性(未顯示)很接近。為了確定堅(jiān)定的基因確實(shí)編碼HPPO而不是具有HPP氧化酶類型的次級活性的ALS、POX或PDH，我們決定測試HPPO的次級活性。
I.2.8-HPPO對ALS蛋白質(zhì)同源性的找尋顯示HPPO顯示出ALS具有25％以上的同一性。這一結(jié)果，盡管起初讓人吃驚，具有一定的邏輯性。具體地說，這兩種酶使用FAD和TPP作為反應(yīng)協(xié)同因子。它們都進(jìn)行脫羧作用。而且，ALS的一種底物是丙酮酸；現(xiàn)在，我們的底物是？-取代的丙酮酸羥苯基丙酮酸。因此可能活性位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)接近，從而這些蛋白質(zhì)共有酶活性。為了在HPPO中尋找ALS的活性，我們使用重組的大亞基和從擬南芥(Arabidopsis thaliana)(Chang和Duggleby，1997)和大腸桿菌(Hill和Duggleby，1998)中純化ALS作為我們進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中的陽性對照。得到的結(jié)果顯示HPPO沒有顯示任何ALS的活性。在這種情況下，我們顯示測定的兩種ALS不具有HPP氧化酶的活性。最后，我們觀察到HPPO不被115ppm的imazapyr(ALS抑制因子，氨腈)顯示。這些結(jié)果明確地顯示，盡管具有共同點(diǎn)(蛋白質(zhì)序列和疏水性)，ALS和HPPO是明顯不同的酶，它們不具有次級酶活性。
實(shí)施例2編碼4-HPA 1-羥化酶的基因的鑒定4-HPA 1-羥化酶(HPAH)通過羥化反應(yīng)伴隨乙?；湹闹脫Q將4-HPA轉(zhuǎn)化為HGA。該酶的活性已在紅串紅球菌S1(Suemori等，1995)的粗提物上或食酸假單胞菌(Hareland，1975)部分純化的提取物上表征。Suemori等將其純化(1996)，但是該蛋白質(zhì)和基因序列沒有公開。為了能夠向植物中引入這種酶的活性，需要鑒定該基因。
可以預(yù)想各種方法(1)使用基因組文庫的表型的和/或功能的互補(bǔ)，(2)插入突變和因此通過酶活性的丟失鑒定基因，(3)為了找回核酸序列純化蛋白質(zhì)。因?yàn)樵诩賳伟母鱾€種類和菌株上已證實(shí)了許多分子生物學(xué)方法的效率，所以我們選擇食酸假單胞菌進(jìn)行這三種方法。通過舉例，將涉及小-Tn5轉(zhuǎn)座子(De Lorenzo等，1990)，廣宿主譜載體如pBBR1MCS(Kovach等，1994，1995；D’Souza等，2000)，和通過偶聯(lián)轉(zhuǎn)移的技術(shù)。小-Tn5轉(zhuǎn)座子可用于擾亂基因(de Lorenzo等，1990；Fedi等，1996；Campos-Garcia等，2000)或引導(dǎo)基因進(jìn)入細(xì)菌的基因組(Prieto等，1999)。我們通過表性互補(bǔ)開始我們的方法，因?yàn)樵摲椒ㄋ坪踝钛杆俸妥詈啙?。隨后同時進(jìn)行其它兩種方法。然而，這里我們不進(jìn)行插入突變的方法，因?yàn)楹竺娌皇褂迷摲椒ā?br> II.1-材料和方法II.1.1-在大腸桿菌中構(gòu)建食酸假單胞菌基因組文庫我們使用粘粒pLAFR5和食酸假單胞菌的基因組DNA構(gòu)建該文庫。我們使用宿主菌株大腸桿菌HB101。
II.1.2-4-HPA 1-羥化酶的純化II.1.2.1-分光光度活性測定在Hareland等(1975)描述的由4-HPA 1-羥化酶催化的反應(yīng)中，消耗了分子氧、NADH、H+。我們選擇在NADH、H+氧化成NAD+后測定酶活性。反應(yīng)成分包括300μMNADH、H+；6.7μM FAD；100mM Kpi；1mM DDT；10-50？g的蛋白質(zhì)。通過加入底物1mM 4-HPA引發(fā)反應(yīng)。隨后在340nm或292nm反應(yīng)進(jìn)行2-10分鐘。具體地說，NADH、H+的消耗使得在340nm處吸光率下降，而尿黑酸的生產(chǎn)使在292nm處的吸光率增加。分光光度測定非常迅速，常規(guī)是在純化步驟中蛋白質(zhì)洗提后使用。
II.1.2.2-HPLC活性測定用HPLC分析酶反應(yīng)可以證實(shí)HGA的生產(chǎn)(保留時間、紫外光譜)。在與上述相同的條件下進(jìn)行酶的測定。然而，通過加入1/3體積的20％高氯酸停止反應(yīng)。然后使用90％的相A和10％的相B或92％的相A和8％的相B等度洗脫用HPLC分析反應(yīng)。相A是含有0.1％的三氟乙酸(TFA)的milliQ水，相B相當(dāng)于乙腈。在90％-10％的等度洗脫中，HGA洗脫1.2分鐘，而在92％-8％的等度洗脫中，HGA洗脫1.4分鐘。洗脫通常在230nm記錄。Van den Tweel等(1986)使用2，2’-二吡啶(非血紅素鐵蛋白抑制因子)抑制尿黑酸過氧化酶并因此允許HGA的累積。為此，2mM的2，2’-二吡啶加入一些反應(yīng)基質(zhì)。在這些色譜分析條件下，可以鑒定4-HPA和HGA。HPLC系統(tǒng)包括Alliance 2690 HPLC(Waters)和996二極管數(shù)組檢測器(Waters)。
II.1.2.3-HPAH蛋白質(zhì)的純化在含有4-HPA作為唯一碳源的M63培養(yǎng)基上，在29℃、220rpm培養(yǎng)食酸假單胞菌48小時。6℃下3000g離心細(xì)菌15分鐘(Beckmann J2/21 M/E離心)。在超聲處理的緩沖液(0.1M Kpi，pH7.2，1mM MgSO4；1mM DTT；1mM鹽酸苯甲脒；5mM的己酸)中提取細(xì)菌沉淀。鹽酸苯甲脒和己酸是蛋白酶抑制因子。超聲處理進(jìn)行9分鐘，超聲處理每40秒在功率5進(jìn)行20秒(Vibra Cell，Sonic MaterialsINC.，Connecticut，USA)。在超聲處理過程中，樣品在冰溶解的溫度保存。超聲處理的提取物4℃、15000g離心15分鐘。回收的上清液用1％的硫酸鏈霉素沉淀。在4℃、15000g離心15分鐘除去沉淀。上清液在PD10柱(Pharmacia)上脫鹽，然后裝載到在緩沖液A(20mM Kpi，pH7.2，10％的甘油，1mM MgSO4；1mM DTT)中平衡的DEAE/EMD 650S柱上。使用緩沖液B(緩沖液A；1M KCl；100μM FAD)進(jìn)行洗脫。KCl濃度在150mM的區(qū)域內(nèi)4-HPA 1-羥化酶的活性被洗脫。活性片段，通過UVIKON 10kDa膜濃縮，然后在PD10柱上脫鹽，再裝載到在緩沖液A(上述)中平衡的Red親和柱(Red 120瓊脂糖型3000CL，SIGMA Ref R-0503)。在兩相中進(jìn)行洗脫。首先是使用增加了FAD使最終濃度為50μM的緩沖液A洗滌Red柱。其次，洗脫蛋白質(zhì)；為此緩沖液A在FAD(3mM)和在NADH、H+(10mM)中強(qiáng)化。收集含有感興趣的蛋白質(zhì)的片段，濃縮并在-80℃冷凍。
II.1.3-N-末端和內(nèi)部肽的蛋白質(zhì)微量測序運(yùn)用在HPP氧化酶中所述的方法對該純化蛋白進(jìn)行測序。但是，為了生產(chǎn)內(nèi)部肽，用胰島素代替Lys-C肽鏈內(nèi)切酶消化蛋白質(zhì)。胰蛋白酶在賴氨酸和精氨酸之后進(jìn)行酶切。用胰蛋白酶消化通常導(dǎo)致產(chǎn)生的片段比用Lys-C肽鏈內(nèi)切酶消化得到的片段小。為了能夠精確地測定回收肽的序列，有時需要用HPLC再次純化回收的肽。
II.1.4-通過簡并PCR鑒定編碼HPAH的基因部分在43頁上給出的簡并性密碼[最初的]用于簡并性引物的合成。在200μL的試管，最終體積為50μL中進(jìn)行PCR。該反應(yīng)溶液含有Perkin Elmer緩沖液，250μMdNTP，50ng的食酸假單胞菌基因組DNA，和2個酶單位的AmpliTaq(PerkinElmer)。使用“Hybaid Touchdown”熱循環(huán)94℃ 3分鐘，然后45個循環(huán)94℃ 30秒，50℃ 1分鐘，72℃ 1分鐘30秒，隨后在回到4℃前，在72℃最終延長5分鐘。裝載10μL到1％的瓊脂糖凝膠后評價PCR。在這種條件下鑒定到536bp的帶。
II.1.5-篩選食酸假單胞菌粘粒文庫粘粒文庫鋪板于LBT15培養(yǎng)基，并在37℃下培養(yǎng)16個小時。然后該培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到4℃。1小時后，根據(jù)Grunstein和Hogness的方法(1975)，集落轉(zhuǎn)移到HybondN膜上(Amersham)。使用以前鑒定和純化的536bp PCR片段雜交膜。用32p進(jìn)行檢測。使用“DNA Ready to Go”試劑盒(Pharmacia)標(biāo)記探針。在小瓶中進(jìn)行預(yù)雜交、雜交和洗滌。將膜在含有5×SSC、6％Denhardt’s和0.5％SDS的溶液中，68℃預(yù)雜交4小時。68℃雜交16小時。在65℃下，2？SSC、0.1％SDS中進(jìn)行洗滌。通過暴露于Kodak或Amersham膠片顯影。
II.1.6-惡臭假單胞菌生長培養(yǎng)基在Luria-Bertani(LB)或含有100？g/mL利福平的2YT豐富培養(yǎng)基上培養(yǎng)惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)。根據(jù)需要加入其它的抗生素(例如15μg/mL四環(huán)素)。含有1.5g/L的4-HPA作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基M63用于測試功能的互補(bǔ)。在這種情況下，略去抗生素。所有的培養(yǎng)物在29℃制備。
II.1.7-通過電穿孔轉(zhuǎn)化惡臭假單胞菌將在29℃，180rpm生長約16小時的惡臭假單胞菌培養(yǎng)物接種于1L的LB利福平(100μg/mL)培養(yǎng)基。當(dāng)OD600在1.2的區(qū)域內(nèi)，在4℃下、3000g離心15分鐘收集細(xì)胞。除去培養(yǎng)基，細(xì)胞在4℃下用400mL的10％的甘油提取。該細(xì)胞在在4℃下、3000g再離心20分鐘。在4℃下進(jìn)一步分別用200和100mL的10％的甘油進(jìn)行兩次洗滌。最后，細(xì)菌用3-10mL的10％的甘油提取，然后分布到100μL的等分試樣中并立即冷凍到液氮中。這樣制備的細(xì)菌在-80℃至少保存6個月。在制備過程中，觀察到由于細(xì)胞溶解損失了細(xì)菌。粘粒(TetR)DNA通過電穿孔引入惡臭假單胞菌(RifR)。80ng的粘粒DNA電穿孔(Bio-Rad Gene PulserTM)進(jìn)入100μL的電感受態(tài)的惡臭假單胞菌是在2mm的電穿孔杯中，0.9伏特的電壓下，用200電阻的電穿孔儀進(jìn)行。約為4.5毫秒。電震蕩以后，細(xì)胞用900μL的LB提取，并在29℃、180rpm培養(yǎng)1小時30分鐘。轉(zhuǎn)化的惡臭假單胞菌在LB Rif100Tet15瓊脂培養(yǎng)基上挑選。
II.1.8-廣譜宿主載體pBBR1MCS-GmR的修飾我們使用廣譜革蘭氏陰性宿主載體pBBR1MCS系列(Kovach等，1994，1995)。這些具有支氣管包特菌(Bordetella bronchiseptica)復(fù)制起始的質(zhì)粒在大腸桿菌中每個細(xì)胞復(fù)制約20-30個拷貝。它們含有兩個Not I位點(diǎn)。為了方便隨后的克隆，存在于質(zhì)粒pBBR1MCS-GmR上多克隆位點(diǎn)(MCS)外的Not I位點(diǎn)被除去。為此，用Sfi I(50℃)分解質(zhì)粒，然后為了得到平頭末端用T4 DNA聚合酶處理。然后質(zhì)粒自身重新連接(T4 DNA連接酶-New England Biolab)。連接后(16小時、16℃)，為了除去可能的“野生型”質(zhì)粒用Sfi I進(jìn)行消化，然后電穿孔大腸桿菌DH5。從在LB Gm20培養(yǎng)基上選擇的克隆分離質(zhì)粒DNA。質(zhì)粒DNA具有兩次消化的特征Not I和Not I/Bgl II。選擇了一個克隆pBBR1MCS-Gm-Not-U。
I I.1.9-pBBR1MCS-Gm-U中Ccos8的亞克隆用Not I限制粘粒Ccos8，然后將其填充到瓊脂糖凝膠上。遷移后，觀察到6個DNA帶1.7；3；4；5；8；10kbp。該帶用Quiaex II純化。并且，用Not I限制性酶切pBBR1MCS-Gm-U，使用蝦堿性磷酸酶(SAP)脫去磷酸。然后使用變化的“插入/載體“比率將各個帶連接進(jìn)入載體(T4 DNA連接酶，16小時，16℃)。用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHα 5。
II.1.10-大腸桿菌和惡臭假單胞菌間的三親株接合為了從大腸桿菌DHα 5轉(zhuǎn)移各個Ccos8(GmR)亞克隆進(jìn)入惡臭假單胞菌(RifR)，使用De Lorenzo等(1990)描述的方法在濾器上進(jìn)行三親株接合?；厥盏募?xì)菌鋪板于LB Rif100Gm20和具有4-HPA作為唯一碳源的M63上。
II.1.11-質(zhì)粒p5kbc的消除為了快速消除惡臭假單胞菌的質(zhì)粒p5kbc，使用不匹配的復(fù)制原點(diǎn)策略，p5kbc的消除還必須使用抗生素。與質(zhì)粒p5kbc(GmR)互補(bǔ)的惡臭假單胞菌(Rif100)用pBBR1MCS-KnR轉(zhuǎn)化。檢驗(yàn)得到的克隆(Rif100GmRKnR)的互補(bǔ)活性。然后該克隆培養(yǎng)于兩種培養(yǎng)基上LB Rif100Kn150Gm20和LB Rif100Kn150。在進(jìn)行過程中，保持用于p5kbc和pBBR1MCS-KnR僅用于或pBBR1MCS-KnR的選擇的壓力。在29℃進(jìn)行生長。每三天進(jìn)行傳代培養(yǎng)。在第八次傳代培養(yǎng)時，不論其最初的培養(yǎng)基是什么，集落傳代培養(yǎng)于4種不同的培養(yǎng)基上(M63，M63+4-HPA，LB Rif100Kn150Gm20和LBRif100Kn150)。2天和7天后記錄其狀態(tài)生長。
II.1.12-用于測試酶活性的蛋白鑒定。
II.1.12.1-惡臭假單胞菌的粗提物的制備兩種惡臭假單胞菌克隆在LB Gm20上培養(yǎng)24小時。第一種含有質(zhì)粒pBBR1MCS-Gm-Not-U，而第二種含有互補(bǔ)質(zhì)粒p5kbc。在緩沖液(0.1M Kpi；1mMMgSO4；1mM DTT；1mM鹽酸苯甲脒；5mM己酸)中超聲處理后，然后在4℃下、20 000g離心10分鐘，使用測定酶活性的兩種方法檢驗(yàn)上清液的4-HPA 1-羥化酶活性。還用SDS-10％PAGE分析了粗提物。
II.1.12.2-轉(zhuǎn)移到膜上，N端測序如實(shí)施例I進(jìn)行測序。
II.1.12.3-S75凝膠過濾使用10K MacrosepTM(Pall Filtron)在4℃下濃縮2小時，將洗脫液(5mL)濃縮10倍。濃縮的500μL洗脫液以0.7mL/min的流速注入用700mL的緩沖液(0.02MKpi；pH7.2；10％甘油；1mM MgSO4；1mM DTT；4℃)預(yù)平衡的SuperdexTM 75預(yù)備級凝膠過濾柱(Hiload 16/60，Pharmacia)。在4℃下以1mL/min的流速進(jìn)行色譜分析。每分鐘收集片段并在4℃貯存。
II.1.12.4-pBBR1MCS FT12？1的構(gòu)建為了構(gòu)建質(zhì)粒pBBR1MCS FT12？1，使用兩步克隆的策略。用Nsi I和Not I消化質(zhì)粒p5kbc。獲得的插入序列，編碼基因1、hpaH和3，克隆到用Psi I和NotI消化的pBBR1MCS-Gm-Not-U中。得到的克隆，稱作pBBR1MCS FT12，用Hind III和Asc I酶切，然后形成平頭末端，最后再連接。在這樣做的過程中，基因1和3被破壞，hpaH基因在原始載體lac啟動子的作用下。這樣得到了質(zhì)粒pBBR1MCSFT12？1(圖6)。
II.1.12.5-PL1la2的構(gòu)建實(shí)驗(yàn)室擁有一種稱作“克隆L”的質(zhì)粒。該構(gòu)建相當(dāng)于克隆熒光假單胞菌HPPD基因啟動子進(jìn)入載體pBBR1MCS-KnR。該HPPD基因啟動子在惡臭假單胞菌和大腸桿菌中發(fā)揮功能。質(zhì)?！翱寺”為Bam HI和Hind III所消化，這使得可以恢復(fù)包含啟動子和熒光假單胞菌的HPPD基因的插入片段。然后該插入片段連接進(jìn)入經(jīng)Bam HI和Hind III消化的載體pBBR1MCS-GmR。得到的克隆稱作pBBRG-L-HPPD。得到的質(zhì)粒，用Nco I消化以除去編碼HPPD的基因，與用PCR擴(kuò)增和用AflIII消化的hpaC基因連接。得到的構(gòu)建物稱作pBBRG-L-ORF1。為了用PCR擴(kuò)增hpaC基因，使用在基因的起始和末尾能夠引入Afl III位點(diǎn)的引物(Afl III位點(diǎn)與NotI位點(diǎn)相容)。使用的引物是位于基因的5’GCAGGATGCA CATGTCCACC AAGAC和位于基因的3’CGGACGCCGA CATGTATCAG CCTTC。使用1單位的KlenTaq聚合酶(Sigma)、250μM的Dntp、200nM的各個引物和50ng的質(zhì)粒p5kbc進(jìn)行PCR。PCR在Perkin Elmer9600上進(jìn)行的程序如下95℃3分鐘；然后20個循環(huán)94℃1分鐘，60℃30秒，68℃3分鐘；最后進(jìn)行最后一步68℃10分鐘。先前得到的質(zhì)粒pBBR1MCS FT12？1用Ssp I和Not I酶切。用Pfu處理使Not I位點(diǎn)成為平頭末端。含有由lac啟動子控制的hpaH基因的恢復(fù)的片段(2468bp)，連接進(jìn)入Ssp I消化的pBBRG-L-ORF1。選擇在反義方向含有hpaC基因和hpaH基因的克隆并稱之為pL1lac2。所有這些克隆在大腸桿菌DH5α中進(jìn)行。
II.2-結(jié)果可以預(yù)想用于鑒定編碼食酸假單胞菌的4-HPA 1-羥化酶活性的基因的各種方法。我們最初決定使用表型染色的方法。該方法看來簡單而快速。事實(shí)上，我們實(shí)驗(yàn)室擁有用于檢測HGA生產(chǎn)的表型篩選工具?，F(xiàn)在，尋找轉(zhuǎn)化4-HPA為HGA的酶。
II.2.1-表型染色方法在實(shí)驗(yàn)室中我們觀察到使用酪氨酸或4-HPA作為唯一碳源大腸桿菌K12不能生長。另外，我們知道大腸桿菌K12含有允許從HPP合成酪氨酸的酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性。該酶活性是可逆的，因此細(xì)胞可以從酪氨酸生產(chǎn)HPP。如果豐富培養(yǎng)基在酪氨酸(1g/L)中強(qiáng)化，酪氨酸被引入細(xì)菌，在細(xì)菌中積累然后根據(jù)HPP和酪氨酸間轉(zhuǎn)換反應(yīng)的平衡常數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)镠PP。在實(shí)驗(yàn)室中，我們已經(jīng)觀察到，如果我們引導(dǎo)熒光假單胞菌HPPD進(jìn)入大腸桿菌K12，然后在酪氨酸脫氨基過程中生產(chǎn)的HPP轉(zhuǎn)化為尿黑酸(HGA)。由于有HPPD催化的反應(yīng)是可逆的，HGA在細(xì)胞中累積，在那里它被氧化然后自發(fā)地聚合形成褐黃色素，其顏色是棕色的。因此這給了我們檢測HGA生產(chǎn)的方法。尋找的4-HPA 1-羥化酶轉(zhuǎn)化4-HPA為HGA。因此含有食酸假單胞菌基因組文庫的大腸桿菌HB101在4-HPA強(qiáng)化的2YT瓊脂培養(yǎng)基上鋪板。兩天后，兩個菌落變成棕色因此它們生產(chǎn)尿黑酸。然而，在這兩個菌落的粗提物上檢測到的酶活型揭示HPPD型的酶活性，而尋找的4-HPA 1-羥化酶的活性是不連續(xù)的，或甚至是不存在的。優(yōu)先該方法可以選擇克隆，其粘粒含有編碼食酸假單胞菌HPPD而不是4-HPA 1-羥化酶的基因。對食酸假單胞菌粗提物的體外初步研究中，沒有鑒別到HPPD的活性?？梢哉J(rèn)為當(dāng)細(xì)菌在豐富培養(yǎng)基上培養(yǎng)時食酸假單胞菌的HPPD活性可以被表達(dá)，而當(dāng)4-HPA是唯一碳源時4-HPA 1-羥化酶的活性將被表達(dá)。既然這一方法不能鑒別4-HPA 1-羥化酶，我們決定純化該酶。一旦鑒別到該蛋白質(zhì)，就可以找回相應(yīng)的基因。
II.2.2-4-HPA 1-羥化酶的純化為了進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化，分析了其4-HPA依賴的NADH、H+氧化酶活性。通過使用上述的純化方法，蛋白質(zhì)被純化形成實(shí)際的勻質(zhì)性。特異性NADH、H+氧化酶活性的富集因子通常依賴于制劑在50和100之間。在SDS-PAGE上，蛋白質(zhì)具有60kDa的明顯的分子量。事實(shí)上，觀察到NADH、H+氧化酶活性和HGA的生產(chǎn)在離去的DEAE/EMD 650S上可以看到。另一方面，當(dāng)離開一個親和性柱，很難檢測到HGA的生產(chǎn)；然而由于4-HPA加入到反應(yīng)基質(zhì)中，NADH、H+氧化酶的活性保留。如果將該酶是單體的假說作為基礎(chǔ)，允許HGA生產(chǎn)的的催化活性的損失可以通過假設(shè)在其通過Red柱傳代的過程中一部分蛋白質(zhì)被破壞(例如丟失了強(qiáng)聯(lián)合的協(xié)同因子)得到解釋。催化NADH、H+的氧化的位點(diǎn)將不被影響。也可假設(shè)找尋的酶是一種異二聚體。催化活性的丟失可通過HGA生產(chǎn)的單體的丟失解釋。在文獻(xiàn)中已鑒定了許多異二聚體黃素單加氧酶，在不同的細(xì)菌種類中它們都具有一個芳香的底物，(Adachi等，1964；Arunachalam等，1992，1994；Prieto等，1993；Prieto和Garcia，1994；Arunachalam和Massey，1994；Takizawa等，1995；Xun，1996；Xun和Sandvik，2000)。然而，有兩個假說解釋這些異二聚體酶的功能(1)Arunachalam等(1992，1994)提出惡臭假單胞菌的4-羥苯乙酸3羥化酶包括65kDa的同二聚體黃素蛋白以及38.5kDa的偶聯(lián)蛋白。單獨(dú)的黃素蛋白能夠在不依賴4-HPA存在的情況下氧化NADH、H+。NADH、H+的氧化使之能夠更新NAD+“庫”，但以化學(xué)計(jì)量比生產(chǎn)H2O2。如果加入偶聯(lián)蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)復(fù)合物變得能夠羥基化4-HPA為3，4-二羥苯乙酸。因此，NADH、H+的氧化不是多余的并允許代謝物的合成。單獨(dú)的偶聯(lián)蛋白質(zhì)不具有酶活性。
(2)Prieto等(1993，1994)和Xun和Sandvik(2000)提出大腸桿菌W(ATCC11105)的4-HPA 3-羥化酶被認(rèn)為是兩種成分的黃素可擴(kuò)散的單加氧酶(TC-FDM)的新成員。這兩種成分是第一，由HpaB基因編碼的59kDa的單體酶4-羥苯乙酸3-羥化酶，第二，19kDa的單體黃素由HpaC基因編碼的NADH氧化還原酶。在這種情況下，經(jīng)黃素消耗NADH、H+FAD被還原NADH、H+氧化還原酶。然后FADH2被加氧酶所利用以允許使用分子氧氧化底物。
我們純化的酶強(qiáng)烈地氧化NADH、H+，但是生產(chǎn)出非常少的尿黑酸。另外，NADH、H+的氧化依賴于4-HPA的加入。這表明我們具有Prieto等描述的類型的酶。因此，我們認(rèn)為該純化的酶是所找尋4-HPA 1-羥化酶(HPAH)。隨后可能為了優(yōu)化酶活性需要鑒定偶聯(lián)蛋白質(zhì)。所以用純化的蛋白質(zhì)繼續(xù)進(jìn)行生化方法。
II.2.3-內(nèi)部肽和N-端序列的生產(chǎn)純化的蛋白質(zhì)送到Pasteur研究所進(jìn)行微量測序。這樣獲得了N-端序列SHPAISLQAL RGSGADIQSI HIPYER和分別以它們離開柱(ATDFITPK、LGVGQPMVDK、VVFAGDSAHG VSPFX、VTALEPQAEG AL、IDFQLGWDAD PEEEK、LSVPATLHGS)的次序的函數(shù)命名的肽No.11C、12D、20A、22B、23和24的6個內(nèi)部肽。在N-端序列沒有發(fā)現(xiàn)通常對應(yīng)于基因的起始密碼子(ATG或GTG)的氨基酸(甲硫氨酸或纈氨酸)。在蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上使用BLASTP算法分析同源性沒能鑒定出同源蛋白質(zhì)。在獲得的蛋白質(zhì)序列的基礎(chǔ)上，合成相應(yīng)的變性的寡核苷酸。為了鑒定編碼純化的和部分測序的HPAH蛋白質(zhì)的基因部分，在PCR反應(yīng)中使用了這些寡核苷酸。
II.2.4-PCR片段的生產(chǎn)使用分別編碼肽23和12D的簡并的引物Hy4RTCYTCNGGRT CNGCRTCCCA和Hy5FGGNGTNGGNC ARCCNATGGT獲得編碼4-HPA 1-羥化酶的擴(kuò)增的基因部分(536bp)。這些引物的雜交溫度為55.4℃，并分別顯示128和512的簡并性?？寺≡摂U(kuò)增的序列進(jìn)入載體pGEMT-easy然后測序。分析得到的序列使之可以找到除了編碼肽Hy4R和Hy5F的序列外還有編碼內(nèi)部肽22B的核酸序列。后面的元件可以證實(shí)我們確實(shí)擴(kuò)增了編碼純化HPAH蛋白質(zhì)的基因部分。在這一階段，使用BLASTX算法在蛋白質(zhì)基礎(chǔ)上搜索同源性提出羥化酶、氧化酶和單加氧酶具有弱的同源性。為了尋找完全具有完全基因的粘粒使用536bp PCR-擴(kuò)增序列，我們能夠篩選出食酸假單胞菌粘粒文庫。
II.2.5-食酸假單胞菌粘粒文庫的篩選篩選粘粒文庫，使用上述得到的序列作為探針，可以鑒定通過Southern技術(shù)轉(zhuǎn)移后在其限制性和雜交特點(diǎn)基礎(chǔ)上不同的4組粘粒。粘粒1、2、和6號形成第一組，粘粒3、7和9號形成第二組，而粘粒5和8號形成第三組。最后一組是由粘粒4號呈遞的。另外雜交結(jié)果表明搜尋的hpaH在食酸假單胞菌基因組中作為單一的拷貝存在。我們鑒定含有至少一部分編碼純化的HPAH蛋白質(zhì)的基因粘粒。同時，我們觀察到惡臭假單胞菌在4-HPA 1上不能生長，但使用HGA作為唯一碳源可以生長。因此這給了我們一個功能互補(bǔ)的極好的篩選方法；這樣我們可以確定這些粘粒中哪一個具有編碼4-HPA 1-羥化酶活性的功能性基因。
II.2.6-與粘粒的功能性互補(bǔ)使用電穿孔將前面鑒定的9個粘粒引入惡臭假單胞菌。然后得到的克隆在含有4-HPA作為唯一碳源的M63培養(yǎng)基上再培養(yǎng)。7-8天后，只有含有8號粘粒的細(xì)菌成功生長；也就是說，只有粘粒8號含有可為惡臭假單胞菌所利用的允許4-HPA向HGA轉(zhuǎn)化的全部表達(dá)信息。該粘粒稱作Ccos8。重復(fù)進(jìn)行用所有粘粒的轉(zhuǎn)化。一定時期后(6-10天)總是粘粒8允許互補(bǔ)。為了能夠繼續(xù)我們的方法確定表達(dá)4-HPA 1-羥化酶活性的最小DNA片段，需要亞克隆Ccos8。通過功能性互補(bǔ)篩選選擇感興趣的亞克隆。
II.2.7-通過功能性互補(bǔ)進(jìn)行亞克隆用Not I消化粘?？梢缘玫酱笮≡?.7和10kb之間的6個DNA片段。這些片段亞克隆進(jìn)入pBBR1MCS-Gm-Not-U。得到Ccos8的5個亞克隆。限制性分析顯示4和10kb的片段沒有亞克隆。另一方面，我們觀察到最初觀察到的5kb的帶實(shí)際上是5.1和5.2kb的兩個帶。這些克隆通過三親株接合從大腸桿菌傳遞到惡臭假單胞菌。5天后，只有惡臭假單胞菌含有對應(yīng)于生長在以4-HPA作為唯一碳源的M63上的粘粒Ccos8的5.2帶亞克隆。所以我們就鑒定出含有4-HPA 1-羥化酶活性的最小片段。對應(yīng)于5.2kb的克隆被稱作5kbC。為了證實(shí)功能性互補(bǔ)的結(jié)果，我們使用不匹配的復(fù)制原點(diǎn)策略消除質(zhì)粒p5kbc，并且在使用的抗生素選擇壓力下強(qiáng)制消除該質(zhì)粒p5kbc。我們觀察到當(dāng)惡臭假單胞菌失去了質(zhì)粒p5kbc時它也失去了在以4-HPA作為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長的能力。據(jù)此我們得出結(jié)論質(zhì)粒p5kbc明顯地攜帶4-HPA 1-羥化酶活性。因此我們能夠測定5.2kb的插入序列，這使我們能夠鑒定功能性hapH基因。
II.2.8-5.2kb序列的分析測定質(zhì)粒p5kbc的5.2kb的插入序列。這樣核酸同源性的搜索(BLASTN)使之可以鑒定插入序列的3個部分。在堿基1和1465之間的第一部分與質(zhì)粒BirminghamIncP-alpha的一部分完全同源。因此可能該序列衍生自pLAFR5。在堿基1466和1695之間的第二核酸部分顯示與克隆質(zhì)粒M13mp8/pUC的一部分完全同源。因此該序列也是pLAFR5的一部分；具體地說，pLAFR5的多克隆位點(diǎn)起源于Puc8(Keen等，1988)。因此，分別位于1689和1695的Eco RI和Sma I位點(diǎn)(圖7)可能是pLAFR5的克隆位點(diǎn)。堿基1696和5264間(即3568bp)的第三部分沒有顯示任何強(qiáng)烈的同源性。這一部分的DNA起源于食酸假單胞菌基因組。當(dāng)使用BLASTX算法分析5.2kb序列鑒定出可能的蛋白質(zhì)(圖7)。這樣，由基因1編碼的蛋白質(zhì)與β-內(nèi)酰胺酶、脫水酶和環(huán)化酶顯示出弱的同源性。由于前面得到了編碼內(nèi)部肽的序列發(fā)現(xiàn)該純化的蛋白質(zhì)由基因2所編碼；因此它可能就是4-HPA 1-羥化酶。該蛋白質(zhì)的序列表明該蛋白質(zhì)與加氧酶和羥化酶顯示一些同源性。由基因3編碼的潛在的蛋白質(zhì)在基本數(shù)據(jù)上顯示沒有同源性。最后，基因4可能編碼一個操縱子調(diào)節(jié)基因。
現(xiàn)在將進(jìn)行更詳細(xì)的hpaH基因的分析。根據(jù)得到的N-末端蛋白質(zhì)序列，4-HPA1-羥化酶蛋白質(zhì)的ATG起始密碼子實(shí)際上是ATG相的GTG起始密碼子下游的78bp。發(fā)現(xiàn)允許核糖體結(jié)合的Shine-Dalgarno序列AGGA在起始密碼子ATG的上游但不是GTG起始密碼子的上游，這證實(shí)編碼區(qū)開始于ATG起始密碼子。GTG和ATG密碼子之間的部分可能不對應(yīng)于前蛋白質(zhì)。這樣確定hpaH基因有1737bp長并以TGA終止密碼子結(jié)束。該基因含有70.9％的GC堿基。
現(xiàn)在我們精確測定了hpaH基因的界限，將對其翻譯產(chǎn)物HPAH蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。
II.2.9-HPAH蛋白質(zhì)的分析使用通用密碼系統(tǒng)翻譯hpaH序列。這樣得到563個氨基酸的蛋白質(zhì)，它具有62.2kDa的分子量。蛋白質(zhì)同源性的搜索(BLASTP)表明HPAH顯示與革蘭氏陽性生物的蛋白質(zhì)基本上約15-25％的同一性，酶活的編碼與所搜索的非常不同。這樣，粘土鏈霉菌(Streptomyces argillaceus)加氧酶、大腸桿菌3-(3-羥苯基)丙酸酯羥化酶(EC 1.14.13.-)，鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas sp) 2，4-二水楊酸單加氧酶，該酶催化金霉素鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens)的四環(huán)素的6-羥基化作用，并發(fā)現(xiàn)潛在的弗式鏈霉菌(Streptomyces fradiae)加氧酶。事實(shí)上，HPAH顯示與酚單加氧酶(pheA)家族和2，4-二氯苯酚羥化酶(tfdB)家族的蛋白質(zhì)同源。使用ClustalW算法對上述蛋白質(zhì)進(jìn)行排序?qū)Ρ?圖8)。這可以顯示非常保守的序列框。此外還注意到用FAD相互作用的三個單元。對應(yīng)于？-？-？結(jié)構(gòu)單元的第一個單元(GXGXXG)允許FAD的ADP成分與蛋白質(zhì)相互作用。第二個單元，(A/C)DG，與FAD結(jié)合，而第三個單元，G(R)VXX(A)GD(A)XH，允許與FAD的黃素成分相互作用。盡管酶使用NADH、H+，沒有鑒別到相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)(GDH)。這種NADH、H+結(jié)合位點(diǎn)的缺乏是在其它FAD單加氧酶中經(jīng)常觀察到的特征。最后，觀察到一個單元(DXXXLXWKLX XXXXXXXXXX LLXXYXXER)，該單元在其它的羥化酶中也有發(fā)現(xiàn)(Ferranez等，1997)，但是不明白它的意義。盡管大腸桿菌的3-(3-羥苯基)丙酸酯羥化酶催化結(jié)構(gòu)上接近4-HPA的培養(yǎng)基上的羥基化反應(yīng)，該生物信息分析所需的信息不能確定我們已經(jīng)確實(shí)鑒定到了4-HPA 1-羥化酶。要做到這一點(diǎn)唯一的方法是表達(dá)hpaH基因并研究其酶活性。
II.2.10-包含4-HPA 1-羥化酶活性的蛋白質(zhì)的鑒定II.2.10.1-編碼4-HPA 1-羥化酶的hpaH基因的表達(dá)為了證實(shí)hpaH基因編碼4-HPA 1-羥化酶的活性，需要表達(dá)該基因。為了這樣做，使用兩步克隆策略，使之可以消除基因1和3并將hpaH基因置于起始載體pBBR1MCS-Gm-Not-U的lac啟動子的控制下。得到的質(zhì)粒稱作pBBRIMCS FT12？1。在豐富培養(yǎng)基上，從用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的惡臭假單胞菌培養(yǎng)物生產(chǎn)粗提物。使用分光光度法找尋酶的活性(在340和292nm)顯示該克隆明確地具有由加入4-HPA誘導(dǎo)的NADH、H+氧化酶的活性，但不具有從4-HPA合成尿黑酸的能力。另一方面，具有與HGA非常接近的保留時間(tr＝1.2分鐘對比1.4分鐘)但UV光譜極為不同的分子Z出現(xiàn)。我們提出HPAH氧化NADH、H+以減少其協(xié)同因子FAD的假設(shè)。由于發(fā)動反應(yīng)的4-HPA的加入發(fā)生破壞4-HPA的FAD的再氧化。因此4-HPA轉(zhuǎn)化為代謝物Z。該代謝物的UV光譜表明其環(huán)不再是芳香族的環(huán)，但是可能未飽和。圖2描述了代謝物Z的結(jié)構(gòu)假說。該實(shí)驗(yàn)顯示在缺乏IPTG誘發(fā)物的惡臭假單胞菌中l(wèi)ac啟動子是功能性的，它表明lac I抑制蛋白在惡臭假單胞菌中自然條件下是不存在的。我們還證實(shí)最初純化的蛋白質(zhì)(HPAH)確實(shí)是依賴4-HPA的NADH、H+氧化酶，該酶轉(zhuǎn)化4-HPA為代謝物Z。HPAH不產(chǎn)生HGA。因此需要鑒定依賴于4-HPA的該NADH、H+氧化酶的配偶體蛋白，加入它可以恢復(fù)4-HPA 1-羥化酶活性。
II.2.10.2-通過凝膠過濾鑒定HPAC蛋白質(zhì)我們已經(jīng)看到在紅色親和柱上HPAH純化的過程中4-HPA 1-羥化酶的活性消失。我們因此提出這樣的假說，即4-HPA-依賴性NADH、H+氧化酶的配偶體蛋白質(zhì)沒有與紅色120瓊脂糖親和樹脂親合并因此在流動相中被回收的假說。因此我們決定純化流動相并尋找當(dāng)加入到HPAH中能夠恢復(fù)4-HPA 1-羥化酶活性的蛋白質(zhì)。為了做到這一點(diǎn)，經(jīng)超濾濃縮流動相(10K MacrosepTM)，然后填充到S75凝膠過濾柱上。使用1mL/min的流速并收集1mL的片段。然后在正常的反應(yīng)條件下進(jìn)行酶反應(yīng)，在紅色柱上混合50μL的各個片段和10μL事先純化的HPAH。然后用HPLC分析停止的反應(yīng)。觀察到當(dāng)加入HPAH蛋白質(zhì)片段90-108能夠產(chǎn)生更多的代謝物Z。在沒有引入HPAH的同樣的片段中檢測到代謝物Z的生產(chǎn)。并且，在對應(yīng)于這些片段的丙烯酰胺凝膠上，我們觀察到與HPAH分子量相等的蛋白質(zhì)。我們得出結(jié)論流動相還含有少量的蛋白質(zhì)。當(dāng)片段109-143加入到HPAH蛋白質(zhì)中觀察到HGA的生產(chǎn)。HGA生產(chǎn)得越多，代謝物Z的生產(chǎn)越弱。尿黑酸的最大產(chǎn)量在116-128部分獲得。將95和145間的部分裝載到丙烯酰胺凝膠上顯示在109-143部分蛋白質(zhì)被高度富集，即該蛋白質(zhì)的色譜分布圖與HGA生產(chǎn)的分布圖一致。我們決定稱該蛋白質(zhì)為HPAC。該HPAC蛋白質(zhì)從凝膠上分離然后在N-端微量測序。得到的序列，MTTKTFA，顯示該蛋白質(zhì)由基因1編碼(圖7)，今后我們稱之為hpaC。該實(shí)驗(yàn)顯示4-HPA 1-羥化酶活性存在于HPAH和HPAC兩種蛋白質(zhì)中。然而我們還沒有弄清這兩種蛋白質(zhì)間的相互作用的特性(1)HPAH和HPAC都是酶，或者(2)HPAH具有酶活性，作為與HPAC相互作用的一項(xiàng)功能該酶活性是可改變的。
II.2.10.3-HPAH和HPAC間相互作用的特性前面的實(shí)驗(yàn)證實(shí)HPAH和HPAC蛋白質(zhì)是還原4-HPA 1-羥化酶活性所必需的。提出了解釋這些蛋白質(zhì)各自作用的兩種假說。在本段中，我們提出的結(jié)果表明HPAC本身是一種酶。收集來自凝膠過濾的片段100、101和102。它們含有HPAH，即NADH、H+氧化酶活性，該酶活性使之可以從4-HPA產(chǎn)生代謝物Z。此外，收集來自凝膠過濾的片段123、124和125。它們含有HPAC。使用HPAH和/或HPAC進(jìn)行各種酶反應(yīng)。這些反應(yīng)分兩步進(jìn)行。第一步反應(yīng)用HPAH進(jìn)行(或分別用HPAC)，30分鐘后經(jīng)加熱處理(100℃，10分鐘)停止反應(yīng)。然后加入HPAC(或分別為HPAH)繼續(xù)反應(yīng)30分鐘。最后加入高氯酸停止反應(yīng)。還進(jìn)行了用水替代其中一種酶的反應(yīng)。最后，經(jīng)10kD NanosepTM(Pall Filtron)過濾反應(yīng)物而不煮沸它們進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。
表1 概括得到的結(jié)果
我們觀察到產(chǎn)生HGA的唯一途徑是同時具有HPAH和HPAC兩種蛋白質(zhì)或者以此順序相繼加入這兩種蛋白質(zhì)。當(dāng)只有HPAH時，或當(dāng)HPAC在HPAH前引入時，僅檢測到代謝物Z。最終，HPAC蛋白質(zhì)對4-HPA不具有酶活性。這些結(jié)果表明代謝物Z是反應(yīng)中間體。HPAH將4-HPA轉(zhuǎn)化為代謝物Z，該反應(yīng)允許NADH、H+的氧化。然后代謝物Z由HPAC轉(zhuǎn)化為HGA。由于加入HPAC前通過過濾HPAH蛋白質(zhì)可以被變性或除去，兩種蛋白質(zhì)間的物理的相互作用似乎不必要。我們已經(jīng)顯示在體外4-HPA 1-羥化酶的活性依賴于HPAC和HPAH蛋白質(zhì)。然而，HPAC蛋白質(zhì)在離開凝膠過濾時是不純的，它僅僅被富集。因此它保留了這樣的可能性，事實(shí)上，在這個富集的提取物中含有另一種將代謝物Z轉(zhuǎn)化為HGA的蛋白質(zhì)。為了除去該可以物質(zhì)，我們決定在相同的載體上克隆兩個基因(hpaC和hpaH)；在這種情況下，我們將產(chǎn)生4-HPA 1-羥化酶活性并因此能夠使惡臭假單胞菌在含有4-HPA作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上生長。
II.2.10.4-用hpaC和hpaH進(jìn)行惡臭假單胞菌的功能的互補(bǔ)質(zhì)粒pL1lac2(圖9)是一個載體pBBR1MCS-GMR，該載體含有在熒光假單胞菌HPPD啟動子控制下的hpaC基因，和在相反的方向，在lac啟動子的控制下的hpaH基因。使用電穿孔將質(zhì)粒引入惡臭假單胞菌。然后細(xì)菌在含有或不含有作為唯一碳源的4-HPA的基本培養(yǎng)基上鋪板。5天后，僅在含有4-HPA作為唯一碳源的培養(yǎng)皿上看到菌落。8天后，菌落具有一定大小。從這些菌落中提取質(zhì)粒DNA證實(shí)全質(zhì)粒pL1lac2的存在。而且，當(dāng)用含有hpaC基因或hpaH基因的載體pBBR1MCS-GMR轉(zhuǎn)化細(xì)菌時，惡臭假單胞菌不能在4-HPA上生長。在本實(shí)驗(yàn)中得到的功能性互補(bǔ)證實(shí)hpaC和hpaH基因是啟動4-HPA 1-羥化酶活性所必需的，并足以啟動所搜索的4-HPA 1-羥化酶的活性。
實(shí)施例III各種胞質(zhì)表達(dá)盒的構(gòu)建III.1-HPACHPAC基因是在從基因組DNA粘粒文庫衍生得到的質(zhì)粒上(p5kbC)使用PCR從食酸假單胞菌分離得到的，使用如下寡核苷酸起始ORF1(Af1III)GCAGGATGCA CATGTCCACC AAGACORF1 Fin(HindIII)CGGACGCAAG CTTGCATCAG CCTTC根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行反應(yīng)。擴(kuò)增的片段，大小為993bp，依據(jù)供應(yīng)商的方法亞克隆進(jìn)入質(zhì)粒pGEMT-easy(Promega)。這樣得到的質(zhì)粒pOZ進(jìn)行測序。通過EcoRI+SpeI消化得到的表達(dá)盒克隆進(jìn)入用相同的酶打開的質(zhì)粒pBluescriptII-KS+，得到質(zhì)粒pEPA13。CsVMV啟動子分離自質(zhì)粒pCH27，該質(zhì)粒衍生自含有在CsVMV控制下的除草劑耐受基因表達(dá)盒的質(zhì)粒pUC19。對此，用產(chǎn)生平頭末端的Pfu聚合酶在熱循環(huán)儀上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR在95℃5分鐘一個循環(huán)，30個循環(huán)[95℃30秒、57℃30秒、72℃1分鐘]，72℃3分鐘。使用的引物是N-CsVMVGCCCTCGAGG TCGACGGTAT TGATCAGCTT CC引導(dǎo)XhoI和BclI位點(diǎn)C-CsVMVCGCTCTAGAA TTCAGATCTA CAAAC(EcoRI)產(chǎn)生的565bp的片段在插入事先用XhoI+EcoRI消化的質(zhì)粒pEPA13前用XhoI+EcoRI消化；得到質(zhì)粒pEPA14。Nos終止子從質(zhì)粒pRD11分離得到，該質(zhì)粒衍生自pBluescriptII-SK(-)，其中Nos終止子經(jīng)HindII+NotI消化被克隆。得到的292bp的片段克隆進(jìn)入用相同的酶打開的質(zhì)粒pEPA14，得到pEPA15。
pEPA15表達(dá)盒＝CsVMV啟動子-hpa C-Nos終止子(
圖10；SEQID No.19)。
III.2.HPAHHPAH基因是在從基因組DNA粘粒文庫衍生得到的質(zhì)粒上(p5kbC)使用PCR從食酸假單胞菌分離得到的，使用如下寡核苷酸起始ORF2(Af1III)CAGAGGACGA ACAACATGTC CCACCORF2 Fin3(HindIII)CTGTGGATGA AGCTTAAGAG GTTCAGGC根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行反應(yīng)。擴(kuò)增的片段，大小為1729bp，以平頭末端亞克隆進(jìn)入用EcoRV消化的質(zhì)粒pBluescriptII SK。這樣得到的質(zhì)粒pEPA16進(jìn)行測序。CaMV35S啟動子從質(zhì)粒pCH14分離得到，該質(zhì)粒衍生自含有GUS表達(dá)盒的質(zhì)粒pBI 121CaMV 35S啟動子-GUS-Nos終止子。對此，用產(chǎn)生平頭末端的Pfu聚合酶在熱循環(huán)儀上進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR在95℃5分鐘一個循環(huán)，30個循環(huán)[95℃30秒、63℃30秒、72℃1分鐘]，72℃3分鐘。使用的引物是N-CaMVGCATGCCTCG AGCCCACAGA TGG引導(dǎo)XhoI位點(diǎn)C-CaMVCCACCCGGGG ATCCTCTAGA G引導(dǎo)BamHI位點(diǎn)產(chǎn)生的839bp的片段在插入事先用XhoI+BclI消化的質(zhì)粒pEPA16前用XhoI+BamHI消化這樣得到質(zhì)粒pEPA17。在如前述相同的條件下使用PCR從質(zhì)粒pRD11分離得到Nos終止子，該條件是95℃5分鐘一個循環(huán)，30個循環(huán)[95℃30秒、57℃30秒、72℃1分鐘]，72℃3分鐘。使用的引物是N-NosCAAGCTTATC GATACCGTCG ACG引導(dǎo)Hind IIIC-NosGSSTTGCGGC CGCAATTCCC GACCTAGGA ACATAG引導(dǎo)Not I和AvrII。
得到的305bp的片段在克隆進(jìn)入用相同的酶打開的質(zhì)粒pEPA17前用Not I+Hind III消化，得到pEPA18。
pEPA18表達(dá)盒＝CaMV 35S啟動子-hpaH-Nos終止子(
圖11；SEQ ID No.17)。
III.3.HPPOHPPO基因是在從基因組DNA粘粒文庫衍生得到的粘粒2A上使用PCR從球形節(jié)桿菌分離得到的，使用如下寡核苷酸N-term-HPPO-ScaIGAATTCAGTA CTTCACTTAC AGTGTCCGGC引導(dǎo)EcoRI和ScaI限制性位點(diǎn)；C-term-HPPO-AsuII-XhoIGAATTCTCGA GTTCGAACAA ACTGAGTAGC AGCTCA引導(dǎo)EcoRI、XhoI和AsuII位點(diǎn)。
根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)條件進(jìn)行反應(yīng)。得到的1800bp的片段依據(jù)供應(yīng)商的方法克隆進(jìn)入載體pGEMT-easy(Promega)。這樣得到的質(zhì)粒pOZ151進(jìn)行測序。通過用SphI+XhoI消化得到的表達(dá)盒克隆進(jìn)入用相同的酶打開的質(zhì)粒pBBR1-MCS(Gm)，得到質(zhì)粒pEPA20。組蛋白簡單啟動子分離自質(zhì)粒pCH9，該質(zhì)粒衍生自含有EPSPS表達(dá)盒的質(zhì)粒pUC組蛋白簡單啟動子-內(nèi)含子2-OTP-EPSPS-組蛋白終止子。對此，用產(chǎn)生平頭末端的Pfu聚合酶進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)PCR在95℃5分鐘一個循環(huán)，5個循環(huán)[95℃30秒、45℃30秒、72℃1分鐘]，72℃3分鐘。使用的引物是N-SHGCTTGCATGC CTAGGTCGAG GAGAAATATG引導(dǎo)SphI和AvrII位點(diǎn)C-SHCATGAGGGGT TCGAAATCGA TAAGC產(chǎn)生的970bp的片段在插入事先用SphI+ScaI消化的質(zhì)粒pEPA20前用SphI消化；在得到的質(zhì)粒pEPA21中，在簡單組蛋白啟動子的后面重復(fù)HPPO基因的起始ATG。在如前述相同的條件下，通過PCR組蛋白終止子分離自相同的質(zhì)粒pCH9，該條件是在95℃5分鐘一個循環(huán)，35個循環(huán)[95℃30秒、55℃30秒、72℃1分鐘]，72℃3分鐘，使用如下引物N-HisterCTAGACCTAG GGGATCCCCC GATC引導(dǎo)AvrIIC-HisterCCCACTAGTG TTTAAATGAT CAGTCAGGCC GAAT引導(dǎo)SpeI和BclI。
得到的726bp的片段在克隆進(jìn)入用SpeI打開的質(zhì)粒pEPA21前用SpeI+AvrII消化，得到pEPA22。
pEPA22表達(dá)盒＝組蛋白簡單啟動子-hppO-組蛋白終止子(
圖12；SEQ IDNo.15)。
III.4.基因的聯(lián)合含有HPAC基因的表達(dá)盒從pEPA15用NotI消化提取并克隆進(jìn)入pEPA18(NotI+Bsp120I)以形成pEPA19
圖13；SEQ ID No.21)。后者用AvrII消化以克隆提取的表達(dá)盒進(jìn)入pEPA22的AvrII+SpeI位點(diǎn)。含有3個構(gòu)建物的質(zhì)粒是pEPA23(
圖14；SEQ ID No.22)。
III.5.二元載體為了用土壤桿菌轉(zhuǎn)化植物，可以用BclI提取三種構(gòu)建物，以將該構(gòu)建物引入土壤桿菌的二元載體。
縮寫3，4-DHPA 3，4-二羥苯乙酸4-HPA 4-羥苯乙酸DNA脫氧核糖核酸ApcI 氣壓化學(xué)電離RNA核糖核酸mRNA 信使核糖核酸ETB溴乙錠BLAST 堿基局部對比搜索方法BSA牛血清清蛋白C100羧芐青霉素(100μg/ml)CRLDLa Dargoire研究中心Da 道爾頓DKN異噁唑草酮二酮腈DMSO 甲基亞砜dATP 2’-脫氧腺苷5’-三磷酸dCTP 2’-脫氧胞苷5’-三磷酸dGTP 2’-脫氧鳥苷5’-三磷酸dNTP 2’-脫氧核苷5’-三磷酸dTTP 2’-脫氧胸苷5’-三磷酸DTE二硫赤蘚糖醇DTT1，4-二硫赤蘚糖醇EDTA 乙二胺四乙酸FAD黃素腺嘌呤二核苷酸
FPLC 快速蛋白質(zhì)液體色譜Gm20慶大霉素(20μg/mL)HGA尿黑酸HPLC 高效液相層析HPP羥苯丙酮酸HPPD 羥苯丙酮酸過氧化酶HPPO 羥苯丙酮酸氧化酶IFT異噁唑草酮IPTG 異丙基-β-硫代半乳糖吡喃糖苷Kn50卡那霉素(50μg/mL)Kb 千堿基Km 米-曼氏常數(shù)L-DOPA 3，4-羥苯丙氨酸LB Luria Bertani培養(yǎng)基Min分鐘MJ 毫焦耳MNDD 錳依賴性過氧化酶MndD 編碼MNDD的基因NAD+(H，H+) 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，輔酶1(氧化型/還原型)GMO基因修飾生物OTP優(yōu)化的轉(zhuǎn)移酶Bp 堿基對pBBR1MCS-Gm耐受慶大霉素的質(zhì)粒pBBR1MCSPCR聚合酶鏈反應(yīng)ppm百萬分之一PVDF 聚偏氟乙烯qs 數(shù)量足以Q.r. 呼吸系數(shù)Rif100利福平NMR核磁共振SDS十二烷基硫酸鈉Sec秒
TBE 三羥甲基硼酸鹽EDTATEV 煙草蝕刻病毒TFA 三氟乙酸TrEMBL 翻譯的核苷酸序列資料庫Tris三羥甲基氨基甲烷U.V.紫外線vs 對比X-gal 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖吡喃糖苷參考文獻(xiàn)Abe，H.；Uchiyama，M.；Sato，R.(1974)從裙帶菜(Undaria pinnatifida)分離苯乙酸及作為生長素樣的物質(zhì)對羥基衍生物。Agric.Biol.Chem.38897-898Adachi，K.；Takeda，Y.；Senoh，S.；Kita，(1964)卵形假單胞桿菌(Pseudomonasovalis)中的對羥基苯乙酸的代謝。Biochem.Biophys.Acta 93483-493Appert，C.；Logemann，E.；Hahlbrock，K.；Schmid，J.；Amrhein，N.；(1994)歐芹(Petroselinum crispum Nym)的四種苯丙氨酸脫氨酶同工酶的結(jié)構(gòu)和催化特性；Eur.J.Biochem.；225491-499Arunachalam，U.；Massey，V.；Vaidyanathan，C.S.(1992)對羥苯乙酸3羥化酶。J.Biol.Chem.26725848-25855Arunachalam，U.；Massey，V.(1994)對羥苯乙酸3羥化酶氧化半反應(yīng)的研究。J.Biol.Chem.26911795-11801Arunachalam，U.；Massey，V.；Miller，S.M.(1994)對羥苯乙酸3羥化酶的機(jī)制。J.Biol.Chem.269150-155Aubert，S.(1994)甘油對不含葉綠素的植物細(xì)胞代謝的多重影響。論文。University Joseph Fourier-Grenoble-FranceAubert，S.；Gout，E.；Bligny，R.；Marty-Mazars，D.；Barrieu，F(xiàn).；Alabouvette，J；Marty，F(xiàn).；Douce，R.(1996a)在失去碳的情況下高等植物細(xì)胞自噬的超微結(jié)構(gòu)和生化特征提供呼吸底物給線粒體進(jìn)行控制。J.Cell Biol.1331251-1263Aubert，S.；Alban，C.；Bligny，R.；Douce，R.(1996b)在缺乏碳水化合物的高等植物細(xì)胞中β-甲基巴豆酰-輔酶A羧化酶的誘導(dǎo)亮氨酸代謝中MCC酶作用的證據(jù)。FEBS Lett.383175-180
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序 列 表<110>阿方蒂農(nóng)科股份有限公司(Aventis cropscience S.A.)<120>通過旁路代謝途徑的耐受除草劑的植物<130>鈍端基因<140>
<141>
<160>22<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1683<212>DNA<213>球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)<220>
<221>CDS<222>(1)..(1683)<400>1atg act tca ctt aca gtg tcc ggc cgg gtg gcg cag gtc ctc agc agc 48Met Thr Ser Leu Thr Val Ser Gly Arg Val Ala Gln Val Leu Ser Ser1 5 10 15tat gtc agc gat gtg ttc ggt gtg atg ggc aac gga aac gtc tac ttc 96Tyr Val Set Asp Val Phe Gly Val Met Gly Asn Gly Asn Val Tyr Phe20 25 30ctg gac gcc gcc gag aag gag ggc ctc cgc ttc acg gcc gta cgc cat 144Leu Asp Ala Ala Glu Lys Glu Gly Leu Arg Phe Thr Ala Val Arg His35 40 45gaa ggt gcc gcc atc gcg gcg gcg gac gcc tac tat cgg gca tcc ggg 192Glu Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ala Asp Ala Tyr Tyr Arg Ala Ser Gly50 55 60cgc ctg gcg gcg ggg acc acc acc tac ggc ccc ggt tac acc aac gcc 240Arg Leu Ala Ala Gly Thr Thr Thr Tyr Gly Pro Gly Tyr Thr Asn Ala65 70 75 80ctg acg gcc ctc gcc gag gcg gtc cag gcg cag atc ccc gtg gtg ctc 288Leu Thr Ala Leu Ala Glu Ala Val Gln Ala Gln Ile Pro Val Val Leu85 90 95gtc acc ggg gac gcc ccg agc agc ggc gcc cgg cct tgg gac gtg gac 336Val Thr Gly Asp Ala Pro Ser Ser Gly Ala Arg Pro Trp Asp Val Asp100 105 110cag gcc gcg atc gcc gcc ggg ctg ggg gcg gcg acc ttc acg gtc acc 384Gln Ala Ala Ile Ala Ala Gly Leu Gly Ala Ala Thr Phe Thr Val Thr115 120 125cgt gaa gcc gca ggc tcc atc acg cag gaa gcg gtg gag tac gca ctt 432Arg Glu Ala Ala Gly Ser Ile Thr Gln Glu Ala Val Glu Tyr Ala Leu130 135 140gcc cgg cgg acc gcc gtc gtg atc gcc gtt cca tac gac ctg tcg gcc 480Ala Arg Arg Thr Ala Val Val Ile Ala Val Pro Tyr Asp Leu Ser Ala145 150 155 160ctt gag gcg gcg gag gaa gat ctt ccc gtg ccg ccg gcg gcc tcg gtt 528Leu Glu Ala Ala Glu Glu Asp Leu Pro Val Pro Pro Ala Ala Ser Val
165 170 175ccg gac gcc atc ggc ggc gga ctc gga cgg gcg gcc gaa gtg cgg gcg 576Pro Asp Ala Ile Gly Gly Gly Leu Gly Arg Ala Ala Glu Val Arg Ala180 185 190gcc gaa ttg ctg gcg ggc gcg aag cgg ccg ctc atc ctt gcc ggc cgc 624Ala Glu Leu Leu Ala Gly Ala Lys Arg Pro Leu Ile Leu Ala Gly Arg195 200 205ggt gcg cac ctc gca gga gcc ggc ccc gaa ctc cgg gaa ctc gcc gac 672Gly Ala His Leu Ala Gly Ala Gly Pro Glu Leu Arg Glu Leu Ala Asp210 215 220cgc ctc ggc gcg ctc acg gcc ggc acc gca ctg gcg ctg aac ctg ctg 720Arg Leu Gly Ala Leu Thr Ala Gly Thr Ala Leu Ala Leu Asn Leu Leu225 230 235 240cag ggc gag ggg tac ctc ggc gtc gcg ggc ggc ttc ggc acg gat acc 768Gln Gly Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ala Gly Gly Phe Gly Thr Asp Thr245 250 255gcc gcc ggg ctc atg ggc gag gcg gac gtg gtg ctc gtg gcg gga gcc 816Ala Ala Gly Leu Met Gly Glu Ala Asp Val Val Leu Val Ala Gly Ala260 265 270agc ctg acc ccc ttc acc atg cgc ttc ggc cac ctg atc ggc ccg gac 864Ser Leu Thr Pro Phe Thr Met Arg Phe Gly His Leu Ile Gly Pro Asp275 280 285gcc acc gtg atc cag atc gac acc gcc atg gag ccg acg gac ccg cgg 912Ala Thr Val Ile Gln Ile Asp Thr Ala Met Glu Pro Thr Asp Pro Arg290 295 300gtg gac ctg ttt gtc agt gcg gac gcg aag gcc gct gcc ggc cgg atc 960Val Asp Leu Phe Val Ser Ala Asp Ala Lys Ala Ala Ala Gly Arg Ile305 310 315 320ctc cgg ctg ctg gat gac gcc gcc ggg gcc aat gcg tcg aag gcc tgg 1008Leu Arg Leu Leu Asp Asp Ala Ala Gly Ala Asn Ala Ser Lys Ala Trp325 330 335cgc gcg gaa gca ctc aag cgt ctg gcc gaa gga ccc tgc cac cac ccc 1056Arg Ala Glu Ala Leu Lys Arg Leu Ala Glu Gly Pro Cys His His Pro340 345 350ggc acc gca gag acc acg gac ggc cgc ctt gac ccc cgg gcg ctt gct 1104Gly Thr Ala Glu Thr Thr Asp Gly Arg Leu Asp Pro Arg Ala Leu Ala355 360 365tcg gca ctg gat gcc gtc ctg ccg gaa cgc cgc acc gtg gtc cag gac 1152Ser Ala Leu Asp Ala Val Leu Pro Glu Arg Arg Thr Val Val Gln Asp370 375 380ggc ggg cac ttc ctg ggc tgg gca ccc atg tac tgg cgc atc ccc cgt 1200Gly Gly His Phe Leu Gly Trp Ala Pro Met Tyr Trp Arg Ile Pro Arg385 390 395 400cct cag gac ctg gtc atg gtg ggg acc gcg tac cag tcg atc ggg ctt 1248Pro Gln Asp Leu Val Met Val Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Ile Gly Leu405 410 415ggc ctg gcc agc gcc gtg ggg gcg tcc cgg gcc gtg gac gac ggc aat 1296Gly Leu Ala Ser Ala Val Gly Ala Ser Arg Ala Val Asp Asp Gly Asn420 425 430atc ctg gtg ctg gcg gcg ggc gac ggc gga ttc ctg atg ggc ctg tcc 1344Ile Leu Val Leu Ala Ala Gly Asp Gly Gly Phe Leu Met Gly Leu Ser
435 440 445gac ctg gaa tcg ctc gtg ggc gcg gcg agc agc gcc gtc gtg gtg atc 1392Asp Leu Glu Ser Leu Val Gly Ala Ala Ser Ser Ala Val Val Val Ile450 455 460tac aac gac gcc gcc tac ggg gcc gag atc cat cag tac ggc tca cgg 1440Tyr Asn Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Glu Ile His Gln Tyr Gly Ser Arg465 470 475 480ggg ctc acc gaa aag ccc atg ctg atc ccc gaa gtg gac ttc agc ggg 1488Gly Leu Thr Glu Lys Pro Met Leu Ile Pro Glu Val Asp Phe Ser Gly485 490 495att gcc cgc gcg atc ggg gcg gaa tcc gca atc atc cgc aag ctg tcg 1536Ile Ala Arg Ala Ile Gly Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Lys Leu Ser500 505 510gac ctc tcc gcg ctc acg gac tgg atc gag gcc ggc gcc agg gga acc 1584Asp Leu Ser Ala Leu Thr Asp Trp Ile Glu Ala Gly Ala Arg Gly Thr515 520 525ttc gtg gcc gac tgc cgc atc acc tca agc gtc cgg gcc ccg tgg ctg 1632Phe Val Ala Asp Cys Arg Ile Thr Ser Ser Val Arg Ala Pro Trp Leu530 535 540agc gaa tgg atg agg gcc tcg caa gcg gcg aag gag gcg gtg gcg ggc 1680Ser Glu Trp Met Arg Ala Ser Gln Ala Ala Lys Glu Ala Val Ala Gly545 550 555 560tag 1683<210>2<211>56l<212>
<213>球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)<400>2Met Thr Ser Leu Thr Val Ser Gly Arg Val Ala Gln Val Leu Ser Ser1 5 10 15Tyr Val Ser Asp Val Phe Gly Val Met Gly Asn Gly Asn Val Tyr Phe20 25 30Leu Asp Ala Ala Glu Lys Glu Gly Leu Arg Phe Thr Ala Val Arg His35 40 45Glu Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ala Asp Ala Tyr Tyr Arg Ala Ser Gly50 55 60Arg Leu Ala Ala Gly Thr Thr Thr Tyr Gly Pro Gly Tyr Thr Asn Ala65 70 75 80Leu Thr Ala Leu Ala Glu Ala Val Gln Ala Gln Ile Pro Val Val Leu85 90 95Val Thr Gly Asp Ala Pro Ser Ser Gly Ala Arg Pro Trp Asp Val Asp100 105 110Gln Ala Ala Ile Ala Ala Gly Leu Gly Ala Ala Thr Phe Thr Val Thr115 120 125Arg Glu Ala Ala Gly Ser Ile Thr Gln Glu Ala Val Glu Tyr Ala Leu130 135 140Ala Arg Arg Thr Ala Val Val Ile Ala Val Pro Tyr Asp Leu Ser Ala
145 150 155 160Leu Glu Ala Ala Glu Glu Asp Leu Pro Val Pro Pro Ala Ala Ser Val165 170 175Pro Asp Ala Ile Gly Gly Gly Leu Gly Arg Ala Ala Glu Val Arg Ala180 185 190Ala Glu Leu Leu Ala Gly Ala Lys Arg Pro Leu Ile Leu Ala Gly Arg195 200 205Gly Ala His Leu Ala Gly Ala Gly Pro Glu Leu Arg Glu Leu Ala Asp210 215 220Arg Leu Gly Ala Leu Thr Ala Gly Thr Ala Leu Ala Leu Asn Leu Leu225 230 235 240Gln Gly Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ala Gly Gly Phe Gly Thr Asp Thr245 250 255Ala Ala Gly Leu Met Gly Glu Ala Asp Val Val Leu Val Ala Gly Ala260 265 270Ser Leu Thr Pro Phe Thr Met Arg Phe Gly His Leu Ile Gly Pro Asp275 280 285Ala Thr Val Ile Gln Ile Asp Thr Ala Met Glu Pro Thr Asp Pro Arg290 295 300Val Asp Leu Phe Val Ser Ala Asp Ala Lys Ala Ala Ala Gly Arg Ile305 310 315 320Leu Arg Leu Leu Asp Asp Ala Ala Gly Ala Asn Ala Ser Lys Ala Trp325 330 335Arg Ala Glu Ala Leu Lys Arg Leu Ala Glu Gly Pro Cys His His Pro340 345 350Gly Thr Ala Glu Thr Thr Asp Gly Arg Leu Asp Pro Arg Ala Leu Ala355 360 365Ser Ala Leu Asp Ala Val Leu Pro Glu Arg Arg Thr Val Val Gln Asp370 375 380Gly Gly His Phe Leu Gly Trp Ala Pro Met Tyr Trp Arg Ile Pro Arg385 390 395 400Pro Gln Asp Leu Val Met Val Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Ile Gly Leu405 410 415Gly Leu Ala Ser Ala Val Gly Ala Ser Arg Ala Val Asp Asp Gly Asn420 425 430Ile Leu Val Leu Ala Ala Gly Asp Gly Gly Phe Leu Met Gly Leu Ser435 440 445Asp Leu Glu Ser Leu Val Gly Ala Ala Ser Ser Ala Val Val Val Ile450 455 460Tyr Asn Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Glu Ile His Gln Tyr Gly Ser Arg465 470 475 480Gly Leu Thr Glu Lys Pro Met Leu Ile Pro Glu Val Asp Phe Ser Gly485 490 495Ile Ala Arg Ala Ile Gly Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Lys Leu Ser500 505 510
Asp Leu Ser Ala Leu Thr Asp Trp Ile Glu Ala Gly Ala Arg Gly Thr515 520 525Phe Val Ala Asp Cys Arg Ile Thr Ser Ser Val Arg Ala Pro Trp Leu530 535 540Ser Glu Trp Met Arg Ala Ser Gln Ala Ala Lys Glu Ala Val Ala545 550 555 560Gly<210>3<21l>1944<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)HPPO突變體<220>
<22l>CDS<222>(55)..(1737)<400>3ccgacgtcgc atgctcccgg ccgccatggc ggccgcggga attcgattga attc atg 57Met1act tca ctt aca gtg tcc ggc cgg gtg gcg cag gtc ctc agc agc tat 105Thr Ser Leu Thr Val Ser Gly Arg Val Ala Gln Val Leu Ser Ser Tyr5 10 15gtc agc gat gtg ttc ggt gtg atg ggc aac gga aac gtc tac ttc ctg 153Val Ser Asp Val Phe Gly Val Met Gly Asn Gly Asn Val Tyr Phe Leu20 25 30gac gcc gcc gag aag gag ggc ctc cgc ttc acg gcc gta cgc cat gaa 201Asp Ala Ala Glu Lys Glu Gly Leu Arg Phe Thr Ala Val Arg His Glu35 40 45ggt gcc gcc atc gcg gcg gcg gac gcc tac tat cgg gca tcc ggg cgc 249Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ala Asp Ala Tyr Tyr Arg Ala Ser Gly Arg50 55 60 65ctg gcg gcg ggg acc acc acc tac ggc ccc ggt tac acc aac gcc ctg 297Leu Ala Ala Gly Thr Thr Thr Tyr Gly Pro Gly Tyr Thr Asn Ala Leu70 75 80acg gcc ctc gcc gag gcg gtc cag gcg cag atc ccc gtg gtg ctc gtc 345Thr Ala Leu Ala Glu Ala Val Gln Ala Gln Ile Pro Val Val Leu Val85 90 95acc ggg gac gcc ccg agc agc ggc gcc cgg cct tgg gac gtg gac cag 393Thr Gly Asp Ala Pro Ser Ser Gly Ala Arg Pro Trp Asp Val Asp Gln100 105 110gcc gcg atc gcc gcc ggg ctg ggg gcg gcg acc ttc acg gtc acc cgt 441Ala Ala Ile Ala Ala Gly Leu Gly Ala Ala Thr Phe Thr Val Thr Arg115 120 125gaa gcc gca ggc tcc atc acg cag gaa gcg gtg gag tac gca ctt gcc 489Glu Ala Ala Gly Ser Ile Thr Gln Glu Ala Val Glu Tyr Ala Leu Ala130 135 140 145cgg cgg acc gcc gtc gtg atc gcc gtt cca tac gac ctg tcg gcc ctt 537Arg Arg Thr Ala Val Val Ile Ala Val Pro Tyr Asp Leu Ser Ala Leu
150 155 160gag gcg gcg gag gaa gat ctt ccc gtg ccg ccg gcg gcc tcg gtt ccg 585Glu Ala Ala Glu Glu Asp Leu Pro Val Pro Pro Ala Ala Ser Val Pro165 170 175gac gcc atc ggc ggc gga ctc gga cgg gcg gcc gaa gtg cgg gcg gcc 633Asp Ala Ile Gly Gly Gly Leu Gly Arg Ala Ala Glu Val Arg Ala Ala180 185 190gaa ttg ctg gcg ggc gcg aag cgg ccg ctc atc ctt gcc ggc cgc ggt 681Glu Leu Leu Ala Gly Ala Lys Arg Pro Leu Ile Leu Ala Gly Arg Gly195 200 205gcg cac ctc gca gga acc ggc ccc gaa ctc cgg gaa ctc gcc gac cgc 729Ala His Leu Ala Gly Thr Gly Pro Glu Leu Arg Glu Leu Ala Asp Arg210 215 220 225ctc ggc gcg ctc acg gcc ggc acc gca ctg gcg ctg aac ctg ctg cag 777Leu Gly Ala Leu Thr Ala Gly Thr Ala Leu Ala Leu Asn Leu Leu Gln230 235 240ggc gag ggg tac ctc ggc gtc gcg ggc ggc ttc ggc acg gat acc gcc 825Gly Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ala Gly Gly Phe Gly Thr Asp Thr Ala245 250 255gcc ggg ctc atg ggc gag gcg gac gtg gtg ctc gtg gcg gga gcc agc 873Ala Gly Leu Met Gly Glu Ala Asp Val Val Leu Val Ala Gly Ala Ser260 265 270ctg acc ccc ttc acc atg cgc ttc ggc cac ctg atc ggc ccg gac gcc 921Leu Thr Pro Phe Thr Met Arg Phe Gly His Leu Ile Gly Pro Asp Ala275 280 285acc gtg atc cag atc gac acc gcc atg gag ccg acg gac ccg cgg gtg 969Thr Val Ile Gln Ile Asp Thr Ala Met Glu Pro Thr Asp Pro Arg Val290 295 300 305gac ctg ttt gtc agt gcg gac gcg aag gcc gct gcc ggc cgg atc ctc 1017Asp Leu Phe Val Ser Ala Asp Ala Lys Ala Ala Ala Gly Arg Ile Leu310 315 320cgg ctg ctg gat gac gcc gcc ggg gcc aat gcg tcg aag gcc tgg cgc 1065Arg Leu Leu Asp Asp Ala Ala Gly Ala Asn Ala Ser Lys Ala Trp Arg325 330 335gcg gaa gca ctc aag cgt ctg gcc gaa gga ccc tgc cac cac ccc ggc 1113Ala Glu Ala Leu Lys Arg Leu Ala Glu Gly Pro Cys His His Pro Gly340 345 350acc gca gag acc acg gac ggc cgc ctt gac ccc cgg gcg ctt gct tcg 1161Thr Ala Glu Thr Thr Asp Gly Arg Leu Asp Pro Arg Ala Leu Ala Ser355 360 365gca ctg gat gcc gtc ctg ccg gaa cgc cgc acc gtg gtc cag gac ggc 1209Ala Leu Asp Ala Val Leu Pro Glu Arg Arg Thr Val Val Gln Asp Gly370 375 380 385ggg cac ttc ctg ggc tgg gca ccc atg tac tgg cgc atc ccc cgt cct 1257Gly His Phe Leu Gly Trp Ala Pro Met Tyr Trp Arg Ile Pro Arg Pro390 395 400cag gac ctg gtc atg gtg ggg acc gcg tac cag tcg atc ggg ctt ggc 1305Gln Asp Leu Val Met Val Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Ile Gly Leu Gly405 410 415ctg gcc agc gcc gtg ggg gcg tcc cgg gcc gtg gac gac ggc aat atc 1353Leu Ala Ser Ala Val Gly Ala Ser Arg Ala Val Asp Asp Gly Asn Ile
420 425 430ctg gtg ctg gcg gcg ggc gac ggc gga ttc ctg atg ggc ctg tcc gac 1401Leu Val Leu Ala Ala Gly Asp Gly Gly Phe Leu Met Gly Leu Ser Asp435 440 445ctg gaa tcg ctc gtg ggc gcg gcg agc agc gcc gtc gtg gtg atc tac 1449Leu Glu Ser Leu Val Gly Ala Ala Ser Ser Ala Val Val Val Ile Tyr450 455 460 465aac gac gcc gcc tac ggg gcc gag atc cat cag tac ggc tca cgg ggg 1497Asn Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Glu Ile His Gln Tyr Gly Ser Arg Gly470 475 480ctc acc gaa aag ccc atg ctg atc ccc gaa gtg gac ttc agc ggg att 1545Leu Thr Glu Lys Pro Met Leu Ile Pro Glu Val Asp Phe Ser Gly Ile485 490 495gcc cgc gcg atc ggg gcg gaa tcc gca atc atc cgc aag ctg tcg gac 1593Ala Arg Ala Ile Gly Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Lys Leu Ser Asp500 505 510ctc tcc gcg ctc acg gac tgg atc gag gcc ggc gcc agg gga acc ttc 1641Leu Ser Ala Leu Thr Asp Trp Ile Glu Ala Gly Ala Arg Gly Thr Phe515 520 525gtg gcc gac tgc cgc atc acc tca agc gtc cgg gcc ccg tgg ctg agc 1689Val Ala Asp Cys Arg Ile Thr Ser Ser Val Arg Ala Pro Trp Leu Ser530 535 540 545gaa tgg atg agg gcc tcg caa gcg gcg aag gag gcg gtg gcg ggc tag 1737Glu Trp Met Arg Ala Ser Gln Ala Ala Lys Glu Ala Val Ala Gly550 555 560ggccggcctc gtcgaaatgc cgccctccaa cccaactcag taccagctca gggcgttctc1797agggctggga acgccctgag ctgctactca tttgttcgaa ctcgagaatt caatcactag1857tgaattcgcg gccgcctgca ggtcgaccat atgggagagc tcccaacgcg ttggatgcat1917agcttgagta ttctatagtg tcaccta1944<210>4<211>S61<212>
<213>人工序列<223>人工序列的描述球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)HPPO突變體<400>4Met Thr Ser Leu Thr Val Ser Gly Arg Val Ala Gln Val Leu Ser Ser1 5 10 15Tyr Val Ser Asp Val Phe Gly Val Met Gly Asn Gly Asn Val Tyr Phe20 25 30Leu Asp Ala Ala Glu Lys Glu Gly Leu Arg Phe Thr Ala Val Arg His35 40 45Glu Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ala Asp Ala Tyr Tyr Arg Ala Ser Gly50 55 60Arg Leu Ala Ala Gly Thr Thr Thr Tyr Gly Pro Gly Tyr Thr Asn Ala65 70 75 80Leu Thr Ala Leu Ala Glu Ala Val Gln Ala Gln Ile Pro Val Val Leu85 90 95
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450 455 460Tyr Asn Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Glu Ile His Gln Tyr Gly Ser Arg465 470 475 480Gly Leu Thr Glu Lys Pro Met Leu Ile Pro Glu Val Asp Phe Ser Gly485 490 495Ile Ala Arg Ala Ile Gly Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Lys Leu Ser500 505 510Asp Leu Ser Ala Leu Thr Asp Trp Ile Glu Ala Gly Ala Arg Gly Thr515 520 525Phe Val Ala Asp Cys Arg Ile Thr Ser Ser Val Arg Ala Pro Trp Leu530 535 540Ser Glu Trp Met Arg Ala Ser Gln Ala Ala Lys Glu Ala Val Ala Gly545 550 555 560<210>5<211>1962<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)HPPO突變體<220>
<221>CDS<222>(111)..(1793)<400>5aggtgacact atagaatact caagctatgc atccaacgcg ttgggagctc tcccatatgg60tcgacctgca ggcggccgcg aattcactag tgattggaag gatccggtgc atg act 116Met Thr1tca ctt aca gtg tcc ggc cgg gtg gcg cag gtc ctc agc agc tat gtc 164Ser Leu Thr Val Ser Gly Arg Val Ala Gln Val Leu Ser Ser Tyr Val5 10 15agc gat gtg ttc ggt gtg atg ggc aac gga aac gtc tac ttc ctg gac 212Ser Asp Val Phe Gly Val Met Gly Asn Gly Asn Val Tyr Phe Leu Asp20 25 30gcc gcc gag aag gag ggc ctc cgc ttc acg gcc gta cgc cat gaa ggt 260Ala Ala Glu Lys Glu Gly Leu Arg Phe Thr Ala Val Arg His Glu Gly35 40 45 50gcc gcc atc gcg gcg gcg gac gcc tac tat cgg gca tcc ggg cgc ctg 308Ala Ala Ile Ala Ala Ala Asp Ala Tyr Tyr Arg Ala Ser Gly Arg Leu55 60 65gcg gcg ggg acc acc acc tac ggc ccc ggt tac acc aac gcc ctg acg 356Ala Ala Gly Thr Thr Thr Tyr Gly Pro Gly Tyr Thr Asn Ala Leu Thr70 75 80gcc ctc gcc gag gcg gtc cag gcg cag atc ccc gtg gtg ctc gtc acc 404Ala Leu Ala Glu Ala Val Gln Ala Gln Ile Pro Val Val Leu Val Thr85 90 95ggg gac gcc ccg agc agc ggc gcc cgg cct tgg gac gtg gac cag gcc 452
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<213>人工序列<223>人工序列的描述球形節(jié)桿菌(Arthrobacter globiformis)HPPO突變體<400>6Val Phe Gly Val Met Gly Asn Gly Asn Val Tyr Phe Leu Asp Ala Ala1 5 10 15Glu Lys Glu Gly Leu Arg Phe Thr Ala Val Arg His Glu Gly Ala Ala20 25 30
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<221>CDS<222>(1)..(966)<400>9atg acc acc aag acc ttt gcc tcc gcc gcc gac crc gaa atc aag cag 48Met Thr Thr Lys Thr Phs Ala Ser Ala Ala Asp Leu Glu Ile Lys Glnl 5 10 15gtc agc ttc gac aag ctc tcc gag cac gcc tat gcc tac acg gcc gaa 96Val Ser Phe Asp Lys Leu Ser Glu His Ala Tyr Ala Tyr Thr Ala Glu20 25 30ggc gac ccc aac acc ggc atc atc att ggc gac gac gcg gtg atg gtg 144Gly Asp Pro Asn Thr Gly Ile Ile Ile Gly Asp Asp Ala Val Met Val35 40 45atc gac acc cag gcc acg ccc gtc atg gcc cag gac gtg atc cgc cgc 192Ile Asp Thr Gln Ala Thr Pro Val Met Ala Gln Asp Val Ile Arg Arg50 55 60atc cgt gag gtc acg gac aag ccc atc aag tac gtg acg ctg tcg cac 240Ile Arg Glu Val Thr Asp Lys Pro Ile Lys Tyr Val Thr Leu Ser His65 70 75 80tac cac gcg gtg cgc gtg ctg ggc gcc tcg gcc ttc ttc gcg gaa ggc 288Tyr His Ala Val Arg Val Leu Gly Ala Ser Ala Phe Phe Ala Glu Gly85 90 95gcc gaa cac atc att gcc agc cag gac acc tac gac ctc atc gtg gag 336Ala Glu His Ile Ile Ala Ser Gln Asp Thr Tyr Asp Leu Ile Val Glu100 105 110cgc ggc gag cag gac aag gcc agc gag atc ggc cgc ttt ccc cgc ctg 384Arg Gly Glu Gln Asp Lys Ala Ser Glu Ile Gly Arg Phe Pro Arg Leu115 120 125ttc cag aac gtg gaa agc gtg ccc gat ggc atg acc tgg ccc acc ctc 432
Phe Gln Asn Val Glu Ser Val Pro Asp Gly Met Thr Trp Pro Thr Leu130 135 140acc ttc acc ggc aag atg acg ctg tgg ctg ggc aag ctg gaa gtg cag 480Thr Phe Thr Gly Lys Met Thr Leu Trp Leu Gly Lys Leu Glu Val Gln145 150 155 160atc ctg cag ctg ggc cgc ggc cac acc aag ggc gac acc gtg gtc tgg 528Ile Leu Gln Leu Gly Arg Gly His Thr Lys Gly Asp Thr Val Val Trp165 170 175ctg ccc cag gac aag gtg ctg ttc agc ggc gac ctg gtg gag ttc ggc 576Leu Pro Gln Asp Lys Val Leu Phe Ser Gly Asp Leu Val Glu Phe Gly180 185 190gcc acg ccc tat gcg ggc gat gcc tac ttc cag gac tgg ccg cac acg 624Ala Thr Pro Tyr Ala Gly Asp Ala Tyr Phe Gln Asp Trp Pro Mis Thr195 200 205ctg gac gcc atc gcc gcc ctg cag ccc gaa aag ctc gtg ccc ggc cgg 672Leu Asp Ala Ile Ala Ala Leu Gln Pro Glu Lys Leu Val Pro Gly Arg210 215 220ggc gcc gcg ctg cag acg ccg gcc gag gtg cag gcc ggc ctg gcc ggc 720Gly Ala Ala Leu Gln Thr Pro Ala Glu Val Gln Ala Gly Leu Ala Gly225 230 235 240acg cgc gac ttc atc agc gac ctg tgg acc gag gtc aag gcc ggc gcc 768Thr Arg Asp Phe Ile Ser Asp Leu Trp Thr Glu Val Lys Ala Gly Ala245 250 255gat gcc cag cag gac ctg cgc aag gtc tac gag gcc gcc ttc gcc aag 816Asp Ala Gln Gln Asp Leu Arg Lys Val Tyr Glu Ala Ala Phe Ala Lys260 265 270ctg cag ccc aag tac ggc cag tgg gtg atc ttc aac cac tgc atg ccc 864Leu Gln Pro Lys Tyr Gly Gln Trp Val Ile Phe Asn His Cys Met Pro275 280 285ttc gat gtg acc cgc gcc tat gac gag gca tcg ggc cac gcc gac cca 912Phe Asp Val Thr Arg Ala Tyr Asp Glu Ala Ser Gly His Ala Asp Pro290 295 300cgc atc tgg acc gcc gag cgc gac cgc cag atg tgg ctg gcg ctc gaa 960Arg Ile Trp Thr Ala Glu Arg Asp Arg Gln Met Trp Leu Ala Leu Glu305 310 315 320ggc tga 966Gly<210>10<211>322<212>
<213>食酸假單胞菌(Pseudomonas acidovorana)<400>10Met Thr Thr Lys Thr Phe Ala Ser Ala Ala Asp Leu Glu Ile Lys Gln1 5 10 15Val Ser Phe Asp Lys Leu Ser Glu His Ala Tyr Ala Tyr Thr Ala Glu20 25 30Gly Asp Pro Asn Thr Gly Ile Ile Ile Gly Asp Asp Ala Val Met Val35 40 45Ile Asp Thr Gln Ala Thr Pro Val Met Ala Gln Asp Val Ile Arg Arg50 55 60
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<223>人工序列的描述食酸假單胞菌(Pseudomonas acidovorana)HPAC突變體<220>
<221>CDS<222>(1)..(966)<400>11atg tcc acc aag acc ttt gcc tcc gcc gcc gac ctc gaa atc aag cag 48Met Ser Thr Lys Thr Phe Ala Ser Ala Ala Asp Leu Glu Ile Lys Gln
1 5 10 15gtc agc ttc gac aag ctc tcc gag cac gcc tat gcc tac acg gcc gaa 96Val Ser Phe Asp Lys Leu Ser Glu His Ala Tyr Ala Tyr Thr Ala Glu20 25 30ggc gac ccc aac acc ggc atc atc att ggc gac gac gcg gtg atg gtg 144Gly Asp Pro Asn Thr Gly Ile Ile Ile Gly Asp Asp Ala Val Met Val35 40 45atc gac acc cag gcc acg ccc gtc atg gcc cag gac gtg atc cgc cgc 192Ile Asp Thr Gln Ala Thr Pro Val Met Ala Gln Asp Val Ile Arg Arg50 55 60atc cgt gag gtc acg gac aag ccc atc aag tac gtg acg ctg tcg cac 240Ile Arg Glu Val Thr Asp Lys Pro Ile Lys Tyr Val Thr Leu Ser His65 70 75 80tac cac gcg gtg cgc gtg ctg ggc gcc tcg gcc ttc ttc gcg gaa ggc 288Tyr His Ala Val Arg Val Leu Gly Ala Ser Ala Phe Phe Ala Glu Gly85 90 95gcc gaa cac atc att gcc agc cag gac acc tac gac ctc atc gtg gag 336Ala Glu His Ile Ile Ala Set Gln Asp Thr Tyr Asp Leu Ile Val Glu100 105 110cgc ggc gag cag gac aag gcc agc gag atc ggc cgc ttt ccc cgc ctg 384Arg Gly Glu Gln Asp Lys Ala Ser Glu Ile Gly Arg Phe Pro Arg Leu115 120 125ttc cag aac gtg gaa agc gtg ccc gat ggc atg acc tgg ccc acc ctc 432Phe Gln Asn Val Glu Ser Val Pro Asp Gly Met Thr Trp Pro Thr Leu130 135 140acc ttc acc ggc aag atg acg ctg tgg ctg ggc aag ctg gaa gtg cag 480Thr Phe Thr Gly Lys Met Thr Leu Trp Leu Gly Lys Leu Glu Val Gln145 150 155 160atc ctg cag ctg ggc cgc ggc cac acc aag ggc gac acc gtg gtc tgg 528Ile Leu Gln Leu Gly Arg Gly His Thr Lys Gly Asp Thr Val Val Trp165 170 175ctg ccc cag gac aag gtg ctg ttc agc ggc gac ctg gtg gag ttc ggc 576Leu Pro Gln Asp Lys Val Leu Phe Ser Gly Asp Leu Val Glu Phe Gly180 185 190gcc acg ccc tat gcg ggc gat gcc tac ttc cag gac tgg ccg cac acg 624Ala Thr Pro Tyr Ala Gly Asp Ala Tyr Phe Gln Asp Trp Pro His Thr195 200 205ctg gac acc atc gcc gcc ctg cag ccc gaa aag ctc gtg ccc ggc cgg 672Leu Asp Thr Ile Ala Ala Leu Gln Pro Glu Lys Leu Val Pro Gly Arg210 215 220ggc gcc gcg ctg cag acg ccg gcc gag gtg cag gcc ggc ctg gcc ggc 720Gly Ala Ala Leu Gln Thr Pro Ala Glu Val Gln Ala Gly Leu Ala Gly225 230 235 240acg cgc gac ttc atc agc gac ctg tgg acc gag gtc aag gcc ggc gcc 768Thr Arg Asp Phe Ile Ser Asp Leu Trp Thr Glu Val Lys Ala Gly Ala245 250 255gat gcc cag cag gac ctg cgc aag gtc tac gag gcc gcc ttc gcc aag 816Asp Ala Gln Gln Asp Leu Arg Lys Val Tyr Glu Ala Ala Phe Ala Lys260 265 270ctg cag ccc aag tac ggc cag tgg gtg atc ttc aac cac tgc atg ccc 864Leu Gln Pro Lys Tyr Gly Gln Trp Val Ile Phe Asn His Cys Met Pro
275 280 285ttc gat gtg acc cgc gcc tat gac gag gca tcg ggc cac gcc gac cca 912Phe Asp Val Thr Arg Ala Tyr Asp Glu Ala Ser Gly His Ala Asp Pro290 295 300cgc atc tgg acc gcc gag cgc gac cgc cag atg tgg ctg gcg ctc gaa 960Arg Ile Trp Thr Ala Glu Arg Asp Arg Gln Met Trp Leu Ala Leu Glu305 310 315 320ggc tga 966Gly<210>12<211>322<212>
<213>人工序列<223>人工序列的描述食酸假單胞菌(Pseudomonas acidovorana)HPAC突變體<400>12Met Ser Thr Lys Thr Phe Ala Ser Ala Ala Asp Leu Glu Ile Lys Gln1 5 10 15Val Ser Phe Asp Lys Leu Ser Glu His Ala Tyr Ala Tyr Thr Ala Glu20 25 30Gly Asp Pro Asn Thr Gly Ile Ile Ile Gly Asp Asp Ala Val Met Val35 40 45Ile Asp Thr Gln Ala Thr Pro Val Met Ala Gln Asp Val Ile Arg Arg50 55 60Ile Arg Glu Val Thr Asp Lys Pro Ile Lys Tyr Val Thr Leu Ser His65 70 75 80Tyr His Ala Val Arg Val Leu Gly Ala Ser Ala Phe Phe Ala Glu Gly85 90 95Ala Glu His Ile Ile Ala Ser Gln Asp Thr Tyr Asp Leu Ile Val Glu100 105 110Arg Gly Glu Gln Asp Lys Ala Ser Glu Ile Gly Arg Phe Pro Arg Leu115 120 125Phe Gln Asn Val Glu Ser Val Pro Asp Gly Met Thr Trp Pro Thr Leu130 135 140Thr Phe Thr Gly Lys Met Thr Leu Trp Leu Gly Lys Leu Glu Val Gln145 150 155 160Ile Leu Gln Leu Gly Arg Gly His Thr Lys Gly Asp Thr Val Val Trp165 170 175Leu Pro Gln Asp Lys Val Leu Phe Ser Gly Asp Leu Val Glu Phe Gly180 185 190Ala Thr Pro Tyr Ala Gly Asp Ala Tyr Phe Gln Asp Trp Pro His Thr195 200 205Leu Asp Thr Ile Ala Ala Leu Gln Pro Glu Lys Leu Val Pro Gly Arg210 215 220Gly Ata Ala Leu Gln Thr Pro Ala Glu Val Gln Ala Gly Leu Ala Gly225 230 235 240Thr Arg Asp Phe Ile Ser Asp Leu Trp Thr Glu Val Lys Ala Gly Ala
245 250 255Asp Ala Gln Gln Asp Leu Arg Lys Val Tyr Glu Ala Ala Phe Ala Lys260 265 270Leu Gln Pro Lys Tyr Gly Gln Trp Val Ile Phe Asn His Cys Met Pro275 280 285Phe Asp Val Thr Arg Ala Tyr Asp Glu Ala Ser Gly His Ala Asp Pro290 295 300Arg Ile Trp Thr Ala Glu Arg Asp Arg Gln Met Trp Leu Ala Leu Glu305 310 315 320Gly<210>13<211>966<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述食酸假單胞菌(Pseudomonas acidovorana)HPAC突變體<220>
<221>CDS<222>(1)..(966)<400>13atg tcc acc aag acc ttt gcc tcc gcc gcc gac ctc gaa atc aag cag 48Met Ser Thr Lys Thr Phe Ala Ser Ala Ala Asp Leu Glu Ile Lys Gln1 5 10 15gtc agc ttc gac aag ctc tcc gag cac gcc tat gcc tac acg gcc gaa 96Val Ser Phe Asp Lys Leu Ser Glu His Ala Tyr Ala Tyr Thr Ala Glu20 25 30ggc gac ccc aac acc ggc atc atc att ggc gac gac gcg gtg atg gtg 144Gly Asp Pro Asn Thr Gly Ile Ile Ile Gly Asp Asp Ala Val Met Val35 40 45atc gac acc cag gcc acg ccc gtc atg gcc cag gac gtg atc cgc cgc 192Ile Asp Thr Gln Ala Thr Pro Val Met Ala Gln Asp Val Ile Arg Arg50 55 60atc cgt gag gtc acg gac aag ccc atc aag tac gtg acg ctg tcg cac 240Ile Arg Glu Val Thr Asp Lys Pro Ile Lys Tyr Val Thr Leu Ser His65 70 75 80tac cac gcg gtg cgc gtg ctg ggc gcc tcg gcc ttc ttc gcg gaa ggc 288Tyr His Ala Val Arg Val Leu Gly Ala Ser Ala Phe Phe Ala Glu Gly85 90 95gcc gaa cac atc att gcc agc cag gac acc tac gac ctc atc gtg gag 336Ala Glu His Ile Ile Ala Set Gln Asp Thr Tyr Asp Leu Ile Val Glu100 105 110cgc ggc gag cag gac aag gcc agc gag atc ggc cgc ttt ccc cgc ctg 384Arg Gly Glu Gln Asp Lys Ala Ser Glu Ile Gly Arg Phe Pro Arg Leu115 120 125ttc cag aac gtg gaa agc gtg ccc gat ggc atg acc tgg ccc acc ctc 432Phe Gln Asn Val Glu Set Val Pro Asp Gly Met Thr Trp Pro Thr Leu130 135 140acc ttc acc ggc aag atg acg ctg tgg ctg ggc aag ctg gaa gtg cag 480
Thr Phe Thr Gly Lys Met Thr Leu Trp Leu Gly Lys Leu Glu Val Gln145 150 155 160atc ctg cag ctg ggc cgc ggc cac acc aag ggc gac acc gtg gtc tgg 528Ile Leu Gln Leu Gly Arg Gly His Thr Lys Gly Asp Thr Val Val Trp165 170 175ctg ccc cag gac aag gtg ctg ttc agc ggc gac ctg gtg gag ttc ggc 576Leu Pro Gln Asp Lys Val Leu Phe Ser Gly Asp Leu Val Glu Phe Gly180 185 190gcc acg ccc tat gcg ggc gat gcc tac ttc cag gac tgg ccg cac acg 624Ala Thr Pro Tyr Ala Gly Asp Ala Tyr Phe Gln Asp Trp Pro His Thr195 200 205ctg gac gcc atc gcc gcc ctg cag ccc gaa aag ctc gtg ccc ggc cgg 672Leu Asp Ala Ile Ala Ala Leu Gln Pro Glu Lys Leu Val Pro Gly Arg210 215 220ggc gcc gcg ctg cag acg ccg gcc gag gtg cag gcc ggc ctg gcc ggc 720Gly Ala Ala Leu Gln Thr Pro Ala Glu Val Gln Ala Gly Leu Ala Gly225 230 235 240acg cgc gac ttc atc agc gac ctg tgg acc gag gtc aag gcc ggc gcc 768Thr Arg Asp Phe Ile Ser Asp Leu Trp Thr Glu Val Lys Ala Gly Ala245 250 255gat gcc cag cag gac ctg cgc aag gtc tac gag gcc gcc ttc gcc aag 816Asp Ala Gln Gln Asp Leu Arg Lys Val Tyr Glu Ala Ala Phe Ala Lys260 265 270ctg cag ccc aag tac ggc cag tgg gtg atc ttc aac cac tgc atg ccc 864Leu Gln Pro Lys Tyr Gly Gln Trp Val Ile Phe Asn His Cys Met Pro275 280 285ttc gat gtg acc cgc gcc tat gac gag gca tcg ggc cac gcc gac cca 912Phe Asp Val Thr Arg Ala Tyr Asp Glu Ala Ser Gly His Ala Asp Pro290 295 300cgc atc tgg acc gcc gag cgc gac cgc cag atg tgg ctg gcg ctc gaa 960Arg Ile Trp Thr Ala Glu Arg Asp Arg Gln Met Trp Leu Ala Leu Glu305 310 315 320ggc tga 966Gly<210>14<211>322<212>人工序列<213>
<223>人工序列的描述食酸假單胞菌(Pseudomonas acidovorana)HPAC突變體<400>14Met Ser Thr Lys Thr Phe Ala Ser Ala Ala Asp Leu Glu Ile Lys Gln1 5 10 15Val Ser Phe Asp Lys Leu Ser Glu His Ala Tyr Ala Tyr Thr Ala Glu20 25 30Gly Asp Pro Asn Thr Gly Ile Ile Ile Gly Asp Asp Ala Val Met Val35 40 45Ile Asp Thr Gln Ala Thr Pro Val Met Ala Gln Asp Val Ile Arg Arg50 55 60Ile Arg Glu Val Thr Asp Lys Pro Ile Lys Tyr Val Thr Leu Ser His
65 70 75 80Tyr His Ala Val Arg Val Leu Gly Ala Ser Ala Phe Phe Ala Glu Gly85 90 95Ala Glu His Ile Ile Ala Ser Gln Asp Thr Tyr Asp Leu Ile Val Glu100 105 110Arg Gly Glu Gln Asp Lys Ala Ser Glu Ile Gly Arg Phe Pro Arg Leu115 120 125Phe Gln Asn Val Glu Ser Val Pro Asp Gly Met Thr Trp Pro Thr Leu130 135 140Thr Phe Thr Gly Lys Met Thr Leu Trp Leu Gly Lys Leu Glu Val Gln145 150 155 160Ile Leu Gln Leu Gly Arg Gly His Thr Lys Gly Asp Thr Val Val Trp165 170 175Leu Pro Gln Asp Lys Val Leu Phe Ser Gly Asp Leu Val Glu Phe Gly180 185 190Ala Thr Pro Tyr Ala Gly Asp Ala Tyr Phe Gln Asp Trp Pro His Thr195 200 205Leu Asp Ala Ile Ala Ala Leu Gln Pro Glu Lys Leu Val Pro Gly Arg210 215 220Gly Ala Ala Leu Gln Thr Pro Ala Glu Val Gln Ala Gly Leu Ala Gly225 230 235 240Thr Arg Asp Phe Ile Ser Asp Leu Trp Thr Glu Val Lys Ala Gly Ala245 250 255Asp Ala Gln Gln Asp Leu Arg Lys Val Tyr Glu Ala Ala Phe Ala Lys260 265 270Leu Gln Pro Lys Tyr Gly Gln Trp Val Ile Phe Asn His Cys Met Pro275 280 285Phe Asp Val Thr Arg Ala Tyr Asp Glu Ala Ser Gly His Ala Asp Pro290 295 300Arg Ile Trp Thr Ala Glu Arg Asp Arg Gln Met Trp Leu Ala Leu Glu305 310 315 320Gly<210>15<211>3549<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述表達(dá)盒<220>
<221>啟動子<222>(1)..(928)<220>
<221>CDS<222>(965)..(2647)<220>
<221>終止子<222>(2811)..(3549)<400>15tgcatgccta ggtcgaggag aaatatgagt cgaggcatgg atacactaag ttcccctgaa60gtgagcatga tctttgatgc tgagatgatt cccagagcaa gatagtttgt gctgcaagtg120acacaattgt aatgaaacca ccactcaacg aatttacttg tggctttgac atgtcgtgtg180ctctgtttgt atttgtgagt gccggttggt aattattttt gttaatgtga ttttaaaacc240tcttatgtaa atagttactt tatctattga agtgtgttct tgtggtctat agtttctcaa300agggaaatta aaatgttgac atcccattta caattgataa cttggtatac acaaactttg360taaatttggt gatatttatg gtcgaaagaa ggcaataccc attgtatgtt ccaatatcaa420tatcaatacg ataacttgat aatactaaca tatgattgtc attgtttttc cagtatcaat480atacattaag ctactacaaa attagtataa atcactatat tataaatctt tttcggttgt540aacttgtaat tcgtgggttt ttaaaataaa agcatgtgaa aattttcaaa taatgtgatg600gcgcaatttt attttccgag ttccaaaata ttgccgcttc attaccctaa tttgtggcgc660cacatgtaaa acaaaagacg attcttagtg gctatcactg ccatcacgcg gatcactaat720atgaaccgtc gattaaaaca gatcgacggt ttatacatca ttttattgta cacacggatc780gatatctcag ccgttagatt taatatgcga tctgattgct caaaaaatag actctccgtc840tttgcctata aaaacaattt cacatctttc tcacccaaat ctactcttaa ccgttcttct900tcttctacag acatcaattt ctctcgactc tagaggatcc aagcttatcg atttcgaacc960cctc atg act tca ctt aca gtg tcc ggc cgg gtg gcg cag gtc ctc agc 1009Met Thr Ser Leu Thr Val Ser Gly Arg Val Ala Gln Val Leu Ser1 5 10 15agc tat gtc agc gat gtg ttc ggt gtg atg ggc aac gga aac gtc tac 1057Ser Tyr Val Ser Asp Val Phe Gly Val Met Gly Asn Gly Asn Val Tyr20 25 30ttc ctg gac gcc gcc gag aag gag ggc ctc cgc ttc acg gcc gta cgc 1105Phe Leu Asp Ala Ala Glu Lys Glu Gly Leu Arg Phe Thr Ala Val Arg35 40 45cat gaa ggt gcc gcc atc gcg gcg gcg gac gcc tac tat cgg gca tcc 1153His Glu Gly Ala Ala Ile Ala Ala Ala Asp Ala Tyr Tyr Arg Ala Ser50 55 60ggg cgc ctg gcg gcg ggg acc acc acc tac ggc ccc ggt tac acc aac 1201Gly Arg Leu Ala Ala Gly Thr Thr Thr Tyr Gly Pro Gly Tyr Thr Asn65 70 75gcc ctg acg gcc ctc gcc gag gcg gtc cag gcg cag atc ccc gtg gtg 1249Ala Leu Thr Ala Leu Ala Glu Ala Val Gln Ala Gln Ile Pro Val Val80 85 90 95ctc gtc acc ggg gac gcc ccg agc agc ggc gcc cgg cct tgg gac gtg 1297Leu Val Thr Gly Asp Ala Pro Ser Ser Gly Ala Arg Pro Trp Asp Val100 105 110gac cag gcc gcg atc gcc gcc ggg ctg ggg gcg gcg acc ttc acg gtc 1345Asp Gln Ala Ala Ile Ala Ala Gly Leu Gly Ala Ala Thr Phe Thr Val115 120 125
acc cgt gaa gcc gca ggc tcc atc acg cag gaa gcg gtg gag tac gca 1393Thr Arg Glu Ala Ala Gly Ser Ile Thr Gln Glu Ala Val Glu Tyr Ala130 135 140ctt gcc cgg cgg acc gcc gtc gtg atc gcc gtt cca tac gac ctg tcg 1441Leu Ala Arg Arg Thr Ala Val Val Ile Ala Val Pro Tyr Asp Leu Ser145 150 155gcc ctt gag gcg gcg gag gaa gat ctt ccc gtg ccg ccg gcg gcc tcg 1489Ala Leu Glu Ala Ala Glu Glu Asp Leu Pro Val Pro Pro Ala Ala Ser160 165 170 175gtt ccg gac gcc atc ggc ggc gga ctc gga cgg gcg gcc gaa gtg cgg 1537Val Pro Asp Ala Ile Gly Gly Gly Leu Gly Arg Ala Ala Glu Val Arg180 185 190gcg gcc gaa ttg ctg gcg ggc gcg aag cgg ccg ctc atc ctt gcc ggc 1585Ala Ala Glu Leu Leu Ala Gly Ala Lys Arg Pro Leu Ile Leu Ala Gly195 200 205cgc ggt gcg cac ctc gca gga acc ggc ccc gaa ctc cgg gaa ctc gcc 1633Arg Gly Ala His Leu Ala Gly Thr Gly Pro Glu Leu Arg Glu Leu Ala210 215 220gac cgc ctc ggc gcg ctc acg gcc ggc acc gca ctg gcg ctg aac ctg 1681Asp Arg Leu Gly Ala Leu Thr Ala Gly Thr Ala Leu Ala Leu Asn Leu225 230 235ctg cag ggc gag ggg tac ctc ggc gtc gcg ggc ggc ttc ggc acg gat 1729Leu Gln Gly Glu Gly Tyr Leu Gly Val Ala Gly Gly Phe Gly Thr Asp240 245 250 255acc gcc gcc ggg ctc atg ggc gag gcg gac gtg gtg ctc gtg gcg gga 1777Thr Ala Ala Gly Leu Met Gly Glu Ala Asp Val Val Leu Val Ala Gly260 265 270gcc agc ctg acc ccc ttc acc atg cgc ttc ggc cac ctg atc ggc ccg 1825Ala Ser Leu Thr Pro Phe Thr Met Arg Phe Gly His Leu Ile Gly Pro275 280 285gac gcc acc gtg atc cag atc gac acc gcc atg gag ccg acg gac ccg 1873Asp Ala Thr Val Ile Gln Ile Asp Thr Ala Met Glu Pro Thr Asp Pro290 295 300cgg gtg gac ctg ttt gtc agt gcg gac gcg aag gcc gct gcc ggc cgg 1921Arg Val Asp Leu Phe Val Ser Ala Asp Ala Lys Ala Ala Ala Gly Arg305 310 315atc ctc cgg ctg ctg gat gac gcc gcc ggg gcc aat gcg tcg aag gcc 1969Ile Leu Arg Leu Leu Asp Asp Ala Ala Gly Ala Asn Ala Ser Lys Ala320 325 330 335tgg cgc gcg gaa gca ctc aag cgt ctg gcc gaa gga ccc tgc cac cac 2017Trp Arg Ala Glu Ala Leu Lys Arg Leu Ala Glu Gly Pro Cys His His340 345 350ccc ggc acc gca gag acc acg gac ggc cgc ctt gac ccc cgg gcg ctt 2065Pro Gly Thr Ala Glu Thr Thr Asp Gly Arg Leu Asp Pro Arg Ala Leu355 360 365gct tcg gca ctg gat gcc gtc ctg ccg gaa cgc cgc acc gtg gtc cag 2113Ala Ser Ala Leu Asp Ala Val Leu Pro Glu Arg Arg Thr Val Val Gln370 375 380gac ggc ggg cac ttc ctg ggc tgg gca ccc atg tac tgg cgc atc ccc 2161Asp Gly Gly His Phe Leu Gly Trp Ala Pro Met Tyr Trp Arg Ile Pro385 390 395
cgt cct cag gac ctg gtc atg gtg ggg acc gcg tac cag tcg atc ggg 2209Arg Pro Gln Asp Leu Val Met Val Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Ile Gly400 405 410 415ctt ggc ctg gcc agc gcc gtg ggg gcg tcc cgg gcc gtg gac gac ggc 2257Leu Gly Leu Ala Ser Ala Val Gly Ala Ser Arg Ala Val Asp Asp Gly420 425 430aat atc ctg gtg ctg gcg gcg ggc gac ggc gga ttc ctg atg ggc ctg 2305Asn Ile Leu Val Leu Ala Ala Gly Asp Gly Gly Phe Leu Met Gly Leu435 440 445tcc gac ctg gaa tcg ctc gtg ggc gcg gcg agc agc gcc gtc gtg gtg 2353Ser Asp Leu Glu Ser Leu Val Gly Ala Ala Ser Ser Ala Val Val Val450 455 460atc tac aac gac gcc gcc tac ggg gcc gag atc cat cag tac ggc tca 2401Ile Tyr Asn Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Glu Ile His Gln Tyr Gly Ser465 470 475cgg ggg ctc acc gaa aag ccc atg ctg atc ccc gaa gtg gac ttc agc 2449Arg Gly Leu Thr Glu Lys Pro Met Leu Ile Pro Glu Val Asp Phe Ser480 485 490 495ggg att gcc cgc gcg atc ggg gcg gaa tcc gca atc atc cgc aag ctg 2497Gly Ile Ala Arg Ala Ile Gly Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Lys Leu500 505 510tcg gac ctc tcc gcg ctc acg gac tgg atc gag gcc ggc gcc agg gga 2545Ser Asp Leu Ser Ala Leu Thr Asp Trp Ile Glu Ala Gly Ala Arg Gly515 520 525acc ttc gtg gcc gac tgc cgc atc acc tca agc gtc cgg gcc ccg tgg 2593Thr Phe Val Ala Asp Cys Arg Ile Thr Ser Ser Val Arg Ala Pro Trp530 535 540ctg agc gaa tgg atg agg gcc tcg caa gcg gcg aag gag gcg gtg gcg 2641Leu Ser Glu Trp Met Arg Ala Ser Gln Ala Ala Lys Glu Ala Val Ala545 550 555ggc tag ggccggcctc gtcgaaatgc cgccctccaa cccaactcag taccagctca 2697Gly560gggcgttctc agggctggga acgccctgag ctgctactca tttgttcgaa ctcgaggtcg2757acggtatcga taagcttgat atcgaattcc tgcagcccgg gggatccact aggggatccc2817ccgatccgcg tttgtgtttt ctgggtttct cacttaagcg tctgcgtttt acttttgtat2877tgggtttggc gtttagtagt ttgcggtagc gttcttgtta tgtgtaatta cgctttttct2937tcttgcttca gcagtttcgg ttgaaatata aatcgaatca agtttcactt tatcagcgtt2997gttttaaatt ttggcattaa attggtgaaa attgcttcaa ttttgtatct aaatagaaga3057gacaacatga aattcgactt ttgacctcaa atcttcgaac atttatttcc tgatttcacg3117atggatgagg ataacgaaag ggcggttcct atgtccggga aagttcccgt agaagacaat3177gagcaaagct actgaaacgc ggacacgacg tcgcattggt acggatatga gttaaaccga3237ctcaattcct ttattaagac ataaaccgat tttggttaaa gtgtaacagt gagctgatat3297aaaaccgaaa caaaccggta caagtttgat tgagcaactt gatgacaaac ttcagaattt3357tggttattga atgaaaatca tagtctaatc gtaaaaaatg tacagaagaa aagctagagc3417
agaacaaaga ttctatattc tggttccaat ttatcatcgc tttaacgtcc ctcagatttg3477atcgggctgc aggaattcgg cctgactgat catttaaaca ctagttctag agcggccgcc3537accgcggtgg ag3549<210>16<211>241<212>
<213>人工序列<223>人工序列的描述，表達(dá)盒<400>16Leu Arg Leu Leu Asp Asp Ala Ala Gly Ala Asn Ala Ser Lys Ala Trp1 5 10 15Arg Ala Glu Ala Leu Lys Arg Leu Ala Glu Gly Pro Cys His His Pro20 25 30Gly Thr Ala Glu Thr Thr Asp Gly Arg Leu Asp Pro Arg Ala Leu Ala35 40 45Ser Ala Leu Asp Ala Val Leu Pro Glu Arg Arg Thr Val Val Gln Asp50 55 60Gly Gly His Phe Leu Gly Trp Ala Pro Met Tyr Trp Arg Ile Pro Arg65 70 75 80Pro Gln Asp Leu Val Met Val Gly Thr Ala Tyr Gln Ser Ile Gly Leu85 90 95Gly Leu Ala Ser Ala Val Gly Ala Ser Arg Ala Val Asp Asp Gly Asn100 105 110Ile Leu Val Leu Ala Ala Gly Asp Gly Gly Phe Leu Met Gly Leu Ser115 120 125Asp Leu Glu Ser Leu Val Gly Ala Ala Ser Ser Ala Val Val Val Ile130 135 140Tyr Asn Asp Ala Ala Tyr Gly Ala Glu Ile His Gln Tyr Gly Ser Arg145 150 155 160Gly Leu Thr Glu Lys Pro Met Leu Ile Pro Glu Val Asp Phe Ser Gly165 170 175Ile Ala Arg Ala Ile Gly Ala Glu Ser Ala Ile Ile Arg Lys Leu Ser180 185 190Asp Leu Ser Ala Leu Thr Asp Trp Ile Glu Ala Gly Ala Arg Gly Thr195 200 205Phe Val Ala Asp Cys Arg Ile Thr Ser Ser Val Arg Ala Pro Trp Leu210 215 220Ser Glu Trp Met Arg Ala Ser Gln Ala Ala Lys Glu Ala Val Ala Gly225 230 235 240<210>17<211>2838<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述表達(dá)盒
<220>
<221>啟動子<222>(1)..(807)<220>
<221>CDS<222>(847)..(2538)<220>
<221>終止子<222>(2539)..(2838)<400>17ggccccccct cgagcccaca gatggttaga gaggcttacg cagcaggtct catcaagacg60atctacccga gcaataatct ccaggaaatc aaataccttc ccaagaaggt taaagatgca120gtcaaaagat tcaggactaa ctgcatcaag aacacagaga aagatatatt tctcaagatc180agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc acaaaccaag gcaagtaata240gagattggag tctctaaaaa ggtagttccc actgaatcaa aggccatgga gtcaaagatt300caaatagagg acctaacaga actcgccgta aagactggcg aacagttcat acagagtctc360ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg tggagcacga cacacttgtc420tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa gggcaattga gacttttcaa480caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc cagctatctg tcactttatt540gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc atcattgcga taaaggaaag600gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag atggaccccc acccacgagg660agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa agcaagtgga ttgatgtgat720atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc cttcgcaaga cccttcctct780atataaggaa gttcatttca tttggagaga acacggggga ctctagagga tcagaggacg840aacaac atg tcc cac ccc gcc atc tcc ctg caa gcg ctg cgc ggc agc 888Met Ser His Pro Ala Ile Ser Leu Gln Ala Leu Arg Gly Ser1 5 10ggc gca gac ata cag tcc atc cac atc ccc tac gag cgc cat gcc gac 936Gly Ala Asp Ile Gln Ser Ile His Ile Pro Tyr Glu Arg His Ala Asp15 20 25 30cag gac gcc ggt gcg gac acg ccc gcc cgg cat ccc gtc gtc atc gtc 984Gln Asp Ala Gly Ala Asp Thr Pro Ala Arg His Pro Val Val Ile Val35 40 45ggc gcc ggc ccc gtg ggc ctg tcg ctg gcc atc gac ctg gcc cag cgc 1032Gly Ala Gly Pro Val Gly Leu Ser Leu Ala Ile Asp Leu Ala Gln Arg50 55 60ggc cag cgc gtg gtg ctg ctg gac aac gac tgc cgg ctg tcc acg ggc 1080Gly Gln Arg Val Val Leu Leu Asp Asn Asp Cys Arg Leu Ser Thr Gly65 70 75tcg cgc gcc atc tgc ttt tcc aag cgc acg ctg gag atc tgg gac cgc 1128Ser Arg Ala Ile Cys Phe Ser Lys Arg Thr Leu Glu Ile Trp Asp Arg80 85 90ctg ggc gtg ggc cag ccc atg gtg gac aag ggc gtg tcc tgg aac ctg 1176
Leu Gly Val Gly Gln Pro Met Val Asp Lys Gly Val Ser Trp Asn Leu95 100 105 110ggc aag gtc ttc ttc aag gac cag ccg ctg tac cgc ttc gac ctg ctg 1224Gly Lys Val Phe Phe Lys Asp Gln Pro Leu Tyr Arg Phe Asp Leu Leu115 120 125ccc gag gac ggc cac gag cgc ccg gcc ttc atc aac ctg cag cag tac 1272Pro Glu Asp Gly His Glu Arg Pro Ala Phe Ile Asn Leu Gln Gln Tyr130 135 140tac gcc gag gcc tat ctg gtc gag cgc gca ctg cag ctg ccg ctg atc 1320Tyr Ala Glu Ala Tyr Leu Val Glu Arg Ala Leu Gln Leu Pro Leu Ile145 150 155gac ctg cgc tgg cac agc aag gtc acg gca ctg gag ccg cag gcc gag 1368Asp Leu Arg Trp His Ser Lys Val Thr Ala Leu Glu Pro Gln Ala Glu160 165 170ggc gcg ctg ctg acc gtg gag acg cct gac ggc agc tac cgc atc gat 1416Gly Ala Leu Leu Thr Val Glu Thr Pro Asp Gly Ser Tyr Arg Ile Asp175 180 185 190gcg caa tgg gtc ctg gcc tgc gat ggc tcg cgc tcg ccg ctg cgc ggc 1464Ala Gln Trp Val Leu Ala Cys Asp Gly Ser Arg Ser Pro Leu Arg Gly195 200 205ctg ctg ggc cag gaa agc cat ggc cgc atc ttc cgc gac cgc ttc ctg 1512Leu Leu Gly Gln Glu Set His Gly Arg Ile Phe Arg Asp Arg Phe Leu210 215 220atc gcc gac gtg aag atg cac gcc gaa ttc ccc acc gag cgc tgg ttc 1560Ile Ala Asp Val Lys Met His Ala Glu Phe Pro Thr Glu Arg Trp Phe225 230 235tgg ttc gac ccg ccc ttc cac ccg ggc cag agc gtg ctg ctg cac cgc 1608Trp Phe Asp Pro Pro Phe His Pro Gly Gln Ser Val Leu Leu His Arg240 245 250cag ccc gac gat gtc tgg cgc atc gac ttc cag ctg ggc tgg gac gcg 1656Gln Pro Asp Asp Val Trp Arg Ile Asp Phe Gln Leu Gly Trp Asp Ala255 260 265 270gac ccc gag gaa gag aaa aag ccc gag aac atc gtg ccg cgc atc cgc 1704Asp Pro Glu Glu Glu Lys Lys Pro Glu Asn Ile Val Pro Arg Ile Arg275 280 285gcc ctg ctg ggc aag gac gcg ccc ttc gag ctg gaa tgg gcc agc gtc 1752Ala Leu Leu Gly Lys Asp Ala Pro Phe Glu Leu Glu Trp Ala Ser Val290 295 300tac acc ttc gcc tgc ctg cgc atg gac cgc ttc gtc cat ggc cgc gtg 1800Tyr Thr Phe Ala Cys Leu Arg Met Asp Arg Phe Val His Gly Arg Val305 310 315gtc ttt gcg ggc gac agc gcc cac ggc gtc tcg ccg ttt ggc gca cgc 1848Val Phe Ala Gly Asp Ser Ala His Gly Val Ser Pro Phe Gly Ala Arg320 325 330ggc gcc aac agc ggc gtg cag gat gcc gag aac ctg gca tgg aag ctg 1896Gly Ala Asn Ser Gly Val Gln Asp Ala Glu Asn Leu Ala Trp Lys Leu335 340 345 350gac cgc gtg ctg cgc ggc cag gcc gat gcc tcg ctg atc gcc acc tac 1944Asp Arg Val Leu Arg Gly Gln Ala Asp Ala Ser Leu Ile Ala Thr Tyr355 360 365ggc gcc gag cgc gaa tac gcg gcc gac gag aac atc cgc aac tcc acg 1992
Gly Ala Glu Arg Glu Tyr Ala Ala Asp Glu Asn Ile Arg Asn Ser Thr370 375 380cgc gcc acc gac ttc atc acg ccc aag agc gag atc agc cgc ctg ttt 2040Arg Ala Thr Asp Phe Ile Thr Pro Lys Ser Glu Ile Ser Arg Leu Phe385 390 395cgc gac gcc gtg ctg gac ctg gcg cgc gac cat gaa ttc gcg cgc cgc 2088Arg Asp Ala Val Leu Asp Leu Ala Arg Asp His Glu Phe Ala Arg Arg400 405 410atc gtc aac agc ggg cgg ctg tcc gtg ccg gcc acg ctg cac ggc tcc 2136Ile Val Asn Ser Gly Arg Leu Ser Val Pro Ala Thr Leu His Gly Ser415 420 425 430gcg ctc aac acg cct gac acc gac acc ttc gac gga acg cag ctg ccc 2184Ala Leu Asn Thr Pro Asp Thr Asp Thr Phe Asp Gly Thr Gln Leu Pro435 440 445ggc gcc gtg ctg gcc gat gcg ccc atg cgc cgg ccc ggc gca gac ggc 2232Gly Ala Val Leu Ala Asp Ala Pro Met Arg Arg Pro Gly Ala Asp Gly450 455 460acg gcc tgg ctg ctg cgc gca ctg gga ccg gac ttc acg ctg ctg cac 2280Thr Ala Trp Leu Leu Arg Ala Leu Gly Pro Asp Phe Thr Leu Leu His465 470 475ttc gac ccc acg ccc gcc tgg gcg cag gcg ctg ccc ggc gtg ctc aac 2328Phe Asp Pro Thr Pro Ala Trp Ala Gln Ala Leu Pro Gly Val Leu Asn480 485 490ctg tcc atc gcg gcc gag ggc gag gcc cat gcg cca gac gcc gac ctc 2376Leu Ser Ile Ala Ala Glu Gly Glu Ala His Ala Pro Asp Ala Asp Leu495 500 505 510atc gat gcg cgc ggc ctg gcg gcc aaa cgc ctg gat gca cgc ccc ggc 2424Ile Asp Ala Arg Gly Leu Ala Ala Lys Arg Leu Asp Ala Arg Pro Gly515 520 525acc agc tac ctg ctg cgg cct gac cag cat gtc tgc gcg cgc tgg cgc 2472Thr Ser Tyr Leu Leu Arg Pro Asp Gln His Val Cys Ala Arg Trp Arg530 535 540cgc ccc gac gaa gcc agc gtg cgc gcc gcg ctg caa aga gcc tgc ggc 2520Arg Pro Asp Glu Ala Ser Val Arg Ala Ala Leu Gln Arg Ala Cys Gly545 550 555gcc gcc gcc acg gcc tga acctcttaag cttatcgata ccgtcgacga 2568Ala Ala Ala Thr Ala560atttccccga tcgttcaaac atttggcaat aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg2628gtcttgcgat gattatcata taatttctgt tgaattacgt taagcatgta ataattaaca2688tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg tttttatgat tagagtcccg caattataca2748tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg2808tgtcatctat gttcctaggt cgggaattgc 2838<210>18<211>284<212>
<213>人工序列<223>人工序列的描述表達(dá)盒
<400>18Ile Val Pro Arg Ile Arg Ala Leu Leu Gly Lys Asp Ala Pro Phe Glu1 5 10 15Leu Glu Trp Ala Ser Val Tyr Thr Phe Ala Cys Leu Arg Met Asp Arg20 25 30Phe Val His Gly Arg Val Val Phe Ala Gly Asp Ser Ala His Gly Val35 40 45Ser Pro Phe Gly Ala Arg Gly Ala Asn Ser Gly Val Gln Asp Ala Glu50 55 60Asn Leu Ala Trp Lys Leu Asp Arg Val Leu Arg Gly Gln Ala Asp Ala65 70 75 80Ser Leu Ile Ala Thr Tyr Gly Ala Glu Arg Glu Tyr Ala Ala Asp Glu85 90 95Asn Ile Arg Asn Ser Thr Arg Ala Thr Asp Phe Ile Thr Pro Lys Ser100 105 110Glu Ile Ser Arg Leu Phe Arg Asp Ala Val Leu Asp Leu Ala Arg Asp115 120 125His Glu Phe Ala Arg Arg Ile Val Asn Ser Gly Arg Leu Ser Val Pro130 135 140Ala Thr Leu His Gly Ser Ala Leu Asn Thr Pro Asp Thr Asp Thr Phe145 150 155 160Asp Gly Thr Gln Leu Pro Gly Ala Val Leu Ala Asp Ala Pro Met Arg165 170 175Arg Pro Gly Ala Asp Gly Thr Ala Trp Leu Leu Arg Ala Leu Gly Pro180 185 190Asp Phe Thr Leu Leu His Phe Asp Pro Thr Pro Ala Trp Ala Gln Ala195 200 205Leu Pro Gly Val Leu Asn Leu Ser Ile Ala Ala Glu GIy Glu Ala His210 215 220Ala Pro Asp Ala Asp Leu Ile Asp Ala Arg Gly Leu Ala Ala Lys Arg225 230 235 240Leu Asp Ala Arg Pro Gly Thr Ser Tyr Leu Leu Arg Pro Asp Gln His245 250 255Val Cys Ala Arg Trp Arg Arg Pro Asp Glu Ala Ser Val Arg Ala Ala260 265 270Leu Gln Arg Ala Cys Gly Ala Ala Ala Thr Ala275 280<210>19<211>1839<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述表達(dá)盒<220>
<221>啟動子
<222>(1)..(547)<220>
<221>CDS<222>(574)..(1539)<220>
<221>終止子<222>(1540)..(1839)<400>19ccccctcgag gtcgacggta ttgatcagct tccagaaggt aattatccaa gatgtagcat60caagaatcca atgtttacgg gaaaaactat ggaagtatta tgtgagctca gcaagaagca120gatcaatatg cggcacatat gcaacctatg ttcaaaaatg aagaatgtac agatacaaga180tcctatactg ccagaatacg aagaagaata cgtagaaatt gaaaaagaag aaccaggcga240agaaaagaat cttgaagacg taagcactga cgacaacaat gaaaagaaga agataaggtc300ggtgattgtg aaagagacat agaggacaca tgtaaggtgg aaaatgtaag ggcggaaagt360aaccttatca caaaggaatc ttatccccca ctacttatcc ttttatattt ttccgtgtca420tttttgccct tgagttttcc tatataagga accaagttcg gcatttgtga aaacaagaaa480aaatttggtg taagctattt tctttgaagt actgaggata caacttcaga gaaatttgta540agtttgtaga tctgaattcg atgcaggatg cac atg tcc acc aag acc ttt gcc 594Met Ser Thr Lys Thr Phe Alal 5tcc gcc gcc gac ctc gaa atc aag cag gtc agc ttc gac aag ctc tcc 642Ser Ala Ala Asp Leu Glu Ile Lys Gln Val Ser Phe Asp Lys Leu Ser10 15 20gag cac gcc tat gcc tac acg gcc gaa ggc gac ccc aac acc ggc atc 690Glu His Ala Tyr Ala Tyr Thr Ala Glu Gly Asp Pro Asn Thr Gly Ile25 30 35atc att ggc gac gac gcg gtg atg gtg atc gac acc cag gcc acg ccc 738Ile Ile Gly Asp Asp Ala Val Met Val Ile Asp Thr Gln Ala Thr Pro40 45 50 55gtc atg gcc cag gac gtg atc cgc cgc atc cgt gag gtc acg gac aag 786Val Met Ala Gln Asp Val Ile Arg Arg Ile Arg Glu Val Thr Asp Lys60 65 70ccc atc aag tac gtg acg ctg tcg cac tac cac gcg gtg cgc gtg ctg 834Pro Ile Lys Tyr Val Thr Leu Set His Tyr His Ala Val Arg Val Leu75 80 85ggc gcc tcg gcc ttc ttc gcg gaa ggc gcc gaa cac atc att gcc agc 882Gly Ala Ser Ala Phe Phe Ala Glu Gly Ala Glu His Ile Ile Ala Ser90 95 100cag gac acc tac gac ctc atc gtg gag cgc ggc gag cag gac aag gcc 930Gln Asp Thr Tyr Asp Leu Ile Val Glu Arg Gly Glu Gln Asp Lys Ala105 110 115agc gag atc ggc cgc ttt ccc cgc ctg ttc cag aac gtg gaa agc gtg 978Ser Glu Ile Gly Arg Phe Pro Arg Leu Phe Gln Asn Val Glu Ser Val120 125 130 135ccc gat ggc atg acc tgg ccc acc ctc acc ttc acc ggc aag atg acg 1026Pro Asp Gly Met Thr Trp Pro Thr Leu Thr Phe Thr Gly Lys Met Thr140 145 150
ctg tgg ctg ggc aag ctg gaa gtg cag atc ctg cag ctg ggc cgc ggc 1074Leu Trp Leu Gly Lys Leu Glu Val Gln Ile Leu Gln Leu Gly Arg Gly155 160 165cac acc aag ggc gac acc gtg gtc tgg ctg ccc cag gac aag gtg ctg 1122His Thr Lys Gly Asp Thr Val Val Trp Leu Pro Gln Asp Lys Val Leu170 175 180ttc agc ggc gac ctg gtg gag ttc ggc gcc acg ccc tat gcg ggc gat 1170Phe Set Gly Asp Leu Val Glu Phe Gly Ala Thr Pro Tyr Ala Gly Asp185 190 195gcc tac ttc cag gac tgg ccg cac acg ctg gac gcc atc gcc gcc ctg 1218Ala Tyr Phe Gln Asp Trp Pro His Thr Leu Asp Ala Ile Ala Ala Leu200 205 210 215cag ccc gaa aag ctc gtg ccc ggc cgg ggc gcc gcg ctg cag acg ccg 1266Gln Pro Glu Lys Leu Val Pro Gly Arg Gly Ala Ala Leu Gln Thr Pro220 225 230gcc gag gtg cag gcc ggc ctg gcc ggc acg cgc gac ttc atc agc gac 1314Ala Glu Val Gln Ala Gly Leu Ala Gly Thr Arg Asp Phe Ile Ser Asp235 240 245ctg tgg acc gag gtc aag gcc ggc gcc gat gcc cag cag gac ctg cgc 1362Leu Trp Thr Glu Val Lys Ala Gly Ala Asp Ala Gln Gln Asp Leu Arg250 255 260aag gtc tac gag gcc gcc ttc gcc aag ctg cag ccc aag tac ggc cag 1410Lys Val Tyr Glu Ala Ala Phe Ala Lys Leu Gln Pro Lys Tyr Gly Gln265 270 275tgg gtg atc ttc aac cac tgc atg ccc ttc gat gtg acc cgc gcc tat 1458Trp Val Ile Phe Asn His Cys Met Pro Phe Asp Val Thr Arg Ala Tyr280 285 290 295gac gag gca tcg ggc cac gcc gac cca cgc atc tgg acc gcc gag cgc 1506Asp Glu Ala Ser Gly His Ala Asp Pro Arg Ile Trp Thr Ala Glu Arg300 305 310gac cgc cag atg tgg ctg gcg ctc gaa ggc tga tgcaagctta tcgataccgt1559Asp Arg Gln Met Trp Leu Ala Leu Glu Gly315 320cgacgaattt ccccgatcgt tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg1619ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa1679ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat1739tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc1799gcgcggtgtc atctatgtta ctagatcggg aattgcggcc 1839<210>20<211>142<212>
<213>人工序列<223>人工序列的描述表達(dá)盒<400> 20Lys Val Leu Phe Ser Gly Asp Leu Val Glu Phe Gly Ala Thr Pro Tyr1 5 10 15Ala Gly Asp Ala Tyr Phe Gln Asp Trp Pro His Thr Leu Asp Ala Ile
20 25 30Ala Ala Leu Gln Pro Glu Lys Leu Val Pro Gly Arg Gly Ala Ala Leu35 40 45Gln Thr Pro Ala Glu Val Gln Ala Gly Leu Ala Gly Thr Arg Asp Phe50 55 60Ile Ser Asp Leu Trp Thr Glu Val Lys Ala Gly Ala Asp Ala Gln Gln65 70 75 80Asp Leu Arg Lys Val Tyr Glu Ala Ala Phe Ala Lys Leu Gln Pro Lys85 90 95Tyr Gly Gln Trp Val Ile Phe Asn His Cys Met Pro Phe Asp Val Thr100 105 110Arg Ala Tyr Asp Glu Ala Ser Gly His Ala Asp Pro Arg Ile Trp Thr115 120 125Ala Glu Arg Asp Arg Gln Met Trp Leu Ala Leu Glu Gly130 135 140<210>21<211>4677<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述表達(dá)盒<400>21ccccctcgag gtcgacggta ttgatcagct tccagaaggt aattatccaa gatgtagcat60caagaatcca atgtttacgg gaaaaactat ggaagtatta tgtgagctca gcaagaagca120gatcaatatg cggcacatat gcaacctatg ttcaaaaatg aagaatgtac agatacaaga180tcctatactg ccagaatacg aagaagaata cgtagaaatt gaaaaagaag aaccaggcga240agaaaagaat cttgaagacg taagcactga cgacaacaat gaaaagaaga agataaggtc300ggtgattgtg aaagagacat agaggacaca tgtaaggtgg aaaatgtaag ggcggaaagt360aaccttatca caaaggaatc ttatccccca ctacttatcc ttttatattt ttccgtgtca420tttttgccct tgagttttcc tatataagga accaagttcg gcatttgtga aaacaagaaa480aaatttggtg taagctattt tctttgaagt actgaggata caacttcaga gaaatttgta540agtttgtaga tctgaattcg atgcaggatg cacatgtcca ccaagacctt tgcctccgcc600gccgacctcg aaatcaagca ggtcagcttc gacaagctct ccgagcacgc ctatgcctac660acggccgaag gcgaccccaa caccggcatc atcattggcg acgacgcggt gatggtgatc720gacacccagg ccacgcccgt catggcccag gacgtgatcc gccgcatccg tgaggtcacg780gacaagccca tcaagtacgt gacgctgtcg cactaccacg cggtgcgcgt gctgggcgcc840tcggccttct tcgcggaagg cgccgaacac atcattgcca gccaggacac ctacgacctc900atcgtggagc gcggcgagca ggacaaggcc agcgagatcg gccgctttcc ccgcctgttc960cagaacgtgg aaagcgtgcc cgatggcatg acctggccca ccctcacctt caccggcaag1020
atgacgctgt ggctgggcaa gctggaagtg cagatcctgc agctgggccg cggccacacc1080aagggcgaca ccgtggtctg gctgccccag gacaaggtgc tgttcagcgg cgacctggtg1140gagttcggcg ccacgcccta tgcgggcgat gcctacttcc aggactggcc gcacacgctg1200gacgccatcg ccgccctgca gcccgaaaag ctcgtgcccg gccggggcgc cgcgctgcag1260acgccggccg aggtgcaggc cggcctggcc ggcacgcgcg acttcatcag cgacctgtgg1320accgaggtca aggccggcgc cgatgcccag caggacctgc gcaaggtcta cgaggccgcc1380ttcgccaagc tgcagcccaa gtacggccag tgggtgatct tcaaccactg catgcccttc1440gatgtgaccc gcgcctatga cgaggcatcg ggccacgccg acccacgcat ctggaccgcc1500gagcgcgacc gccagatgtg gctggcgctc gaaggctgat gcaagcttat cgataccgtc1560gacgaatttc cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt1620tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat1680taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt1740atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg1800cgcggtgtca tctatgttac tagatcggga attgcggccc cccctcgagc ccacagatgg1860ttagagaggc ttacgcagca ggtctcatca agacgatcta cccgagcaat aatctccagg1920aaatcaaata ccttcccaag aaggttaaag atgcagtcaa aagattcagg actaactgca1980tcaagaacac agagaaagat atatttctca agatcagaag tactattcca gtatggacga2040ttcaaggctt gcttcacaaa ccaaggcaag taatagagat tggagtctct aaaaaggtag2100ttcccactga atcaaaggcc atggagtcaa agattcaaat agaggaccta acagaactcg2160ccgtaaagac tggcgaacag ttcatacaga gtctcttacg actcaatgac aagaagaaaa2220tcttcgtcaa catggtggag cacgacacac ttgtctactc caaaaatatc aaagatacag2280tctcagaaga ccaaagggca attgagactt ttcaacaaag ggtaatatcc ggaaacctcc2340tcggattcca ttgcccagct atctgtcact ttattgtgaa gatagtggaa aaggaaggtg2400gctcctacaa atgccatcat tgcgataaag gaaaggccat cgttgaagat gcctctgccg2460acagtggtcc caaagatgga cccccaccca cgaggagcat cgtggaaaaa gaagacgttc2520caaccacgtc ttcaaagcaa gtggattgat gtgatatctc cactgacgta agggatgacg2580cacaatccca ctatccttcg caagaccctt cctctatata aggaagttca tttcatttgg2640agagaacacg ggggactcta gaggatcaga ggacgaacaa catgtcccac cccgccatct2700ccctgcaagc gctgcgcggc agcggcgcag acatacagtc catccacatc ccctacgagc2760gccatgccga ccaggacgcc ggtgcggaca cgcccgcccg gcatcccgtc gtcatcgtcg2820gcgccggccc cgtgggcctg tcgctggcca tcgacctggc ccagcgcggc cagcgcgtgg2880tgctgctgga caacgactgc cggctgtcca cgggctcgcg cgccatctgc ttttccaagc2940gcacgctgga gatctgggac cgcctgggcg tgggccagcc catggtggac aagggcgtgt3000cctggaacct gggcaaggtc ttcttcaagg accagccgct gtaccgcttc gacctgctgc3060
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<223>人工序列的描述表達(dá)盒<400>22ccccctcgag gtcgacggta ttgatcagct tccagaaggt aattatccaa gatgtagcat60caagaatcca atgtttacgg gaaaaactat ggaagtatta tgtgagctca gcaagaagca120
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1.一種使植物對一種除草劑耐受的方法，其特征在于，在所述植物中表達(dá)至少一種酶，該酶能夠繞過所述除草劑抑制的旁路代謝途徑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述除草劑是HPPD抑制劑。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在植物中表達(dá)HPP氧化酶和/或HPAH和/或HPAC。
4.一種多肽，其特征在于，該多肽具有HPP氧化酶的活性。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，所述多肽對HPPD抑制劑不敏感。
6.如權(quán)利要求4或5所述的多肽，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID No.2的氨基酸序列，其片段以及與之同源的序列。
7.如權(quán)利要求6所述的多肽，其特征在于，所述多肽含有選自SEQ ID No.4和SEQ ID No.6的氨基酸序列，其片段以及與之同源的序列。
8.一種多肽，其特征在于，所述多肽具有HPAH的活性。
9.如權(quán)利要求8所述的多肽，其特征在于，所述多肽對HPPD抑制劑不敏感。
10.如權(quán)利要求8或9所述的多肽，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID No.8的氨基酸序列，其片段以及與其同源的序列。
11.一種多肽，其特征在于，所述多肽具有HPAC的活性。
12.如權(quán)利要求11所述的多肽，其特征在于，所述多肽對HPPD抑制劑不敏感。
13.如權(quán)利要求11或12所述的多肽，其特征在于，所述多肽含有SEQ ID No.10的氨基酸序列，及其片段以及與之同源的序列。
14.如權(quán)利要求13所述的多肽，其特征在于，所述多肽含有選自SEQ ID No.12和SEQ ID No.14的氨基酸序列，其片段以及與之同源的序列。
15.一種核酸序列，其特征在于，該核酸編碼如權(quán)利要求4-14任一所述的肽。
16.一種編碼HPP氧化酶的核酸序列，其特征在于，該核酸序列是一種核酸序列，選自SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.5或SEQ ID No.15的編碼序列，與之同源的序列，其片段以及能夠與所述SEQ ID No.1、3、5或15選擇性雜交的序列。
17.一種編碼HPAH的核酸序列，其特征在于，它含有選自編碼序列SEQ IDNo.7或SEQ ID No.17的核酸序列、與之同源的序列，其片段以及能夠與所述SEQID No.7或17選擇性雜交的序列。
18.一種編碼HPAC的核酸序列，其特征在于，它含有選自編碼序列SEQ ID No.9、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13或SEQ ID No.19的核酸序列、與之同源的序列，及其片段以及能夠與所述SEQ ID No.9、11、13或19選擇性雜交的序列。
19.一種包含編碼序列的表達(dá)盒，其特征在于，所述編碼序列含有如權(quán)利要求15-18任一所述的核酸序列。
20.一種克隆和/或表達(dá)載體，其特征在于，所述載體含有至少一個如權(quán)利要求19所述的表達(dá)盒。
21.一種轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，其特征在于，所述植物細(xì)胞含有至少一個如權(quán)利要求19所述的表達(dá)盒。
22.一種轉(zhuǎn)化的植物，其特征在于，所述植物含有至少一個如權(quán)利要求19所述的表達(dá)盒。
23.權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)化植物的種子，其特征在于，所述種子含有至少一個如權(quán)利要求19所述的表達(dá)盒。
24.一種轉(zhuǎn)化植物的方法，其特征在于，將至少一個權(quán)利要求19所述的表達(dá)盒引入植物的基因組。
25.一種用HPPD抑制劑對植物，特別是農(nóng)作物選擇性除草的方法，其特征在于，該除草劑施用于權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)化植物。
26.一種在具有如權(quán)利要求23所述的種子或如權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)化植物的田間的一片區(qū)域內(nèi)除草的方法，其特征在于，所述方法包括在所述的田間的區(qū)域內(nèi)施用一個劑量的HPPD-抑制性除草劑，該劑量對所述的雜草是有毒的，而基本上不影響根據(jù)本發(fā)明的種子或轉(zhuǎn)化的植物。
27.一種培育如權(quán)利要求22所述的轉(zhuǎn)化植物的方法，其特征在于，所述方法包括在適合培育所述植物的田間的一片區(qū)域內(nèi)播種如權(quán)利要求23所述的種子，在雜草存在的情況下，對所述田間的所述區(qū)域施用一個劑量的以HPPD為靶標(biāo)的除草劑，該劑量對所述的雜草是有毒的，而基本上不影響所述的種子或所述的轉(zhuǎn)化植物，然后當(dāng)植物達(dá)到期望的成熟度收割植物，任選地從收獲的植物中分離種子。
28.如權(quán)利要求25-27任一所述的方法，其特征在于，所述除草劑在出芽前和/或出芽后施用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備耐受除草劑的植物的新方法，具體地是HPPD抑制除草劑、編碼在所述的植物中能夠使用的酶的核酸序列，含有所述核酸序列的表達(dá)盒以及含有至少一種所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號A01H5/00GK1636065SQ01818096
公開日2005年7月6日 申請日期2001年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2000年10月30日
發(fā)明者O·津克, E·佩吉特, A·羅蘭, A·薩利安德, G·弗雷西內(nèi) 申請人:拜爾農(nóng)科股份有限公司