專利名稱：來源于擔(dān)子菌培養(yǎng)物的新型物質(zhì)、其制造方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗腫瘤作用等生理活性的物質(zhì)。更具體而言，本發(fā)明涉及能增強(qiáng)大豆等異黃酮類糖苷配基生理活性及擔(dān)子菌培養(yǎng)物生理活性的新型物質(zhì)，其制造方法及其作為健康食品組合物、動(dòng)物或水產(chǎn)養(yǎng)殖用飼料組合物及抗腫瘤劑的用途。
已知，大豆異黃酮有染料木苷(genistin)、異黃酮苷(daidzin)、glycitin等。它們分別是以染料木黃酮(genistein)、大豆苷元(daidzein)、黃豆黃素(glycitein)為糖苷配基的葡萄糖糖苷。大豆異黃酮在大豆種子中以葡萄糖糖苷或其衍生物的形式存在。
大豆異黃酮的生理活性作用主要是基于糖苷配基的作用，葡萄糖糖苷形式的生理活性作用沒那么強(qiáng)。這是由于糖苷狀態(tài)下不易被小腸吸收。
分解大豆異黃酮糖苷，得到其糖苷配基的方法有幾個(gè)提案。例如，通過大豆中β-葡萄糖苷酶的作用而轉(zhuǎn)換成糖苷配基的方法(特開平1-258669)；提取醬油餅或醬油汁中生成的異黃酮糖苷配基的方法(特開平5-170756)；讓曲霉菌作用于大豆蛋白而得到含糖苷配體的異黃酮化合物的方法(特開平8-214787號(hào))；提取植物蛋白后，通過β-葡萄糖苷酶或酯酶的作用而轉(zhuǎn)化成糖苷配基的方法(特表平9-503781，美國特許第5763389號(hào))；讓微生物來源的酶作用于大豆胚軸而得到使所含異黃酮化合物糖苷配基化的方法(特開平11-89589號(hào))。
糖苷配基中，尤其是染料木黃酮具有抑制酪氨酸激酶、抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶、抑制新血管生成的生理活性作用。但是，要達(dá)到抑制新血管生成的生理活性作用，血漿中染料木黃酮的濃度必須高，僅靠從腸道攝取染料木苷來滿足染料木黃酮的必需量是很困難的，這是由于染料木苷是腸道難以吸收的糖苷。要達(dá)到充分的生理活性效果，必須攝取必要量糖苷配基形式的染料木黃酮。
另一方面，擔(dān)子菌，如香菇和靈芝等等菌絲體及其培養(yǎng)物具有免疫增強(qiáng)活性和抗腫瘤作用等生理活性，一部分可用作抗癌劑。
近年來，這些抗癌劑多與具有腫瘤新生血管抑制作用的物質(zhì)聯(lián)合應(yīng)用。這是由于聯(lián)合應(yīng)用對(duì)同一治療目的發(fā)揮不同作用機(jī)制的物質(zhì)預(yù)期可取得較高治療效果。
已知具有腫瘤新生血管抑制作用的物質(zhì)有，如以鯊魚軟骨作原料的粘多糖混合物和制管張素(angiostatin)等，其中一部分已實(shí)際應(yīng)用。
腫瘤新生血管抑制作用是指阻礙或抑制增長的腫瘤產(chǎn)生血管新生促進(jìn)物質(zhì)，生成新血管，以供給自身增殖所必須的營養(yǎng)和氧分的作用。
腫瘤新生血管抑制物質(zhì)是防止腫瘤細(xì)胞血管新生，抑制、阻礙其生長過度的物質(zhì)，由于其施用可消除腫瘤，所以可用于癌癥治療。
腫瘤新生血管抑制物質(zhì)可通過口腔攝取或靜脈注射而發(fā)揮作用，但，目前能口腔服用的物質(zhì)很少。靜脈注射的缺點(diǎn)是患者的負(fù)擔(dān)大。
用于口服的鯊魚軟骨要達(dá)到腫瘤新生血管抑制作用，必須每天大量攝取大約20克以上，其缺點(diǎn)是由于它有魚腥味和令人不快的味道很難攝取。為了抑制這種令人不快的腥味，賦予它在胃的強(qiáng)酸環(huán)境下不溶解，而保持到腸內(nèi)，在腸內(nèi)溶解、吸收的性質(zhì)，將鯊魚軟骨粉碎制成微粉末狀，再用油脂類和糖類等對(duì)該微粉末進(jìn)行包衣等復(fù)雜處理。
另外，制管張素還沒有實(shí)際應(yīng)用。所以，需要能口服且安全性高的腫瘤新生血管抑制物質(zhì)。
再者，本發(fā)明的目的是提供該新型物質(zhì)的制造方法及該物質(zhì)作為健康食品、動(dòng)物或水產(chǎn)養(yǎng)殖用飼料及抗腫瘤劑的用途。
鑒于上述目的，本發(fā)明者們進(jìn)行了廣泛研究，結(jié)果在含有大豆種子和其加工制品等異黃酮類的材料(異黃酮類含有材料)存在下培養(yǎng)擔(dān)子菌，通過擔(dān)子菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的作用將葡萄糖糖苷的異黃酮(染料木苷等)分解成葡萄糖和糖苷配基(染料木黃酮等)，使糖苷配基與培養(yǎng)擔(dān)子菌而產(chǎn)生的物質(zhì)一起蓄積在培養(yǎng)體系中，得到具有異黃酮類的糖苷配基的生理活性和擔(dān)子菌培養(yǎng)物生理活性，且它們的生理活性比單獨(dú)培養(yǎng)上述糖苷配基和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的混合物增強(qiáng)了的新型物質(zhì)，從而完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明涉及具有以下生理活性的物質(zhì)，其制造方法，及應(yīng)用該物質(zhì)的健康食品組合物、動(dòng)物或水產(chǎn)養(yǎng)殖用飼料組合物及抗腫瘤劑。
1)一種具有生理活性作用的物質(zhì)，它是用存在含異黃酮類材料的培養(yǎng)基培養(yǎng)具有β-葡萄糖苷酶活性的擔(dān)子菌而得到的，其生理活性包括異黃酮類的糖苷配基和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的生理活性。
2)一種具有生理活性作用的物質(zhì)，它是用存在含異黃酮類材料和β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基培養(yǎng)具有β-葡萄糖苷酶活性的擔(dān)子菌而得到的，其生理活性包括異黃酮類的糖苷配基和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的生理活性。
3)上述1或2的物質(zhì)，它協(xié)同增加異黃酮類的糖苷配基生理活性和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的生理活性。
4)上述1-3任一項(xiàng)中的物質(zhì)，其異黃酮類的糖苷配基為染料木黃酮。
5)上述1-4任一項(xiàng)中的物質(zhì)，其生理活性為抗腫瘤作用。
6)上述5的物質(zhì)，其抗腫瘤作用為腫瘤新生血管抑制作用。
7)上述5的物質(zhì)，其抗腫瘤作用為腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用。
8)上述7的物質(zhì)，其腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用為腫瘤細(xì)胞編程死亡誘導(dǎo)作用。
9)上述1-4任一項(xiàng)中的物質(zhì)，其中含異黃酮類的材料為大豆種子，來源于大豆種子的加工制品或竹芋根。
10)上述1或2的物質(zhì)，其中具有β-葡萄糖苷酶活性的擔(dān)子菌為靈芝菌或香菇菌。
11)一種具有生理活性作用的物質(zhì)的制造方法，其特征是用存在含異黃酮類材料的培養(yǎng)基培養(yǎng)具有β-葡萄糖苷酶活性的擔(dān)子菌，得到含異黃酮類的糖苷配基和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的成分。
12)上述11的具有生理活性作用的物質(zhì)的制造方法，它是預(yù)先培養(yǎng)擔(dān)子菌，提高β-葡萄糖苷酶活性后，將含異黃酮類材料加入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到含異黃酮類的糖苷配基和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的成分。
13)一種具有生理活性作用的物質(zhì)的制造方法，其特征是用存在含異黃酮類材料和β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基培養(yǎng)擔(dān)子菌，得到含異黃酮類的糖苷配基和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的成分。
14)上述11-13任一具有生理活性作用的物質(zhì)的制造方法，其中異黃酮類的糖苷配基為染料木黃酮。
15)上述11-14任一項(xiàng)中的制造方法，其中生理活性為抗腫瘤作用。
16)上述15的制造方法，其中抗腫瘤作用為腫瘤新生血管抑制作用。
17)上述15的制造方法，其中抗腫瘤作用為腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用。
18)上述17的制造方法，其中腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用為腫瘤細(xì)胞編程死亡誘導(dǎo)作用。
19)上述11或12的制造方法，其中含異黃酮類的材料為大豆種子，來源于大豆種子的加工制品或竹芋根。
20)上述11或13的制造方法，其中具有β-葡萄糖苷酶活性的擔(dān)子菌為靈芝菌或香菇菌。
21)一種健康食品，它是具有上面1-10任一項(xiàng)中記載的生理活性作用的物質(zhì)。
22)一種飼料組合物，它是具有上面1-10任一項(xiàng)中記載的生理活性作用的物質(zhì)。
23)一種抗腫瘤劑，它是具有上面1-10任一項(xiàng)中記載的生理活性作用的物質(zhì)。發(fā)明的詳細(xì)說明(本發(fā)明化合物的制造方法)以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
具有本發(fā)明生理活性作用的物質(zhì)可用作為代表例的以下方法獲得。
即，將擔(dān)子菌接種到包含麥芽浸膏、酵母浸膏、纖維素、酒石酸銨等成分的培養(yǎng)基中，在一定條件下，培養(yǎng)到產(chǎn)生以β-葡萄糖苷酶為代表的各種酶的酶活性增高階段，加入大豆種子及其加工品等含異黃酮類的材料，在β-葡萄糖苷酶活性增高的溫度、pH條件下攪拌、通氣培養(yǎng)，直到異黃酮糖苷基本上全部轉(zhuǎn)化成糖苷配基后，將整個(gè)培養(yǎng)體系加熱，使體系內(nèi)的酶失活，終止反應(yīng)，必要時(shí)通過冷凍干燥等手段進(jìn)行干燥、粉末化，得到本發(fā)明的物質(zhì)。
本發(fā)明中所使用的含異黃酮類的材料可直接使用大豆種子、脫脂大豆或它們適宜組織的一部分(表皮、胚乳、胚軸等)，或應(yīng)用水或酒精類或其混合物的抽提物。具體例可舉出豆乳，用適宜手段從大豆種子分離出的異黃酮類可適宜使用。
本發(fā)明中的“異黃酮類”包含作為葡萄糖糖苷的異黃酮，丙二酰染料木苷、乙酰染料木苷等葡萄糖糖苷衍生物，及是葡萄糖糖苷的構(gòu)成成分的糖苷配基，含有其中任一項(xiàng)的材料，均為“異黃酮類含有材料”。
本發(fā)明中，由大豆、脫脂大豆等制造的加工品，如豆醬、醬油、納豆等加工品，均可作為異黃酮類含有材料使用，只要它們含有異黃酮就行。
除大豆之外，含有異黃酮類的植物有，如竹芋、紅色三葉草、紫花苜蓿、Lathyrus ugoensis，荷蘭筧、染料木等豆科植物類，或者用水、酒精類抽提這些含有異黃酮類植物的組織而得到的抽提液也可用作含有異黃酮類材料使用。特別使用是優(yōu)選富含染料木黃酮的竹芋根。
本發(fā)明中應(yīng)用的具有β-葡萄糖苷酶活性的擔(dān)子菌包括如下的擔(dān)子菌。
埃杜香菇(Lentinus edodes)、透明靈芝(Ganoderma lucidum)、平蓋靈芝(Ganoderma applanatum)、灰側(cè)耳菌(Pleurotusostreatus)、火菇菌(Flammulina velutipes)、Pholiota nameko、雜色革蓋菌(Coriolus versicolor)、木耳(Auriculariaauricula)、群交裂褶菌(Schizophyllum commune)、奇果菌(Griforaumbellate)、草菇小包腳菇(Volvariella volvacea)、雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)、Albatrellus cofluens、口蘑菌(Tricholomagiganteum)。
本發(fā)明中在含有異黃酮類材料的存在下培養(yǎng)上述擔(dān)子菌。
除上述含有異黃酮類的材料之外，培養(yǎng)基中可添加其它各種碳源或氮源。碳源包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、蔗糖、上等白糖、黑糖、糖蜜、黑糖蜜、麥芽提取物等。
氮源包括，如肉湯、蛋白胨、谷蛋白餐、大豆粉、干燥酵母、酵母提取物、硫酸銨、酒石酸銨鹽、尿素等。
此外，必要時(shí)可添加鈉鹽、鎂鹽、錳鹽、鐵鹽、鈣鹽、磷酸鹽等無機(jī)鹽類和肌醇、維生素B1鹽酸鹽、L-精氨酸、生物素等維生素類。
培養(yǎng)可按照普通中溫菌的培養(yǎng)進(jìn)行，pH2-6，10-45℃，優(yōu)選在15-30℃的溫度下進(jìn)行攪拌、通氣培養(yǎng)。優(yōu)選培養(yǎng)持續(xù)到將異黃酮糖苷基本上全部轉(zhuǎn)換成糖苷配基。培養(yǎng)時(shí)間要根據(jù)細(xì)菌的量和異黃酮含有材料的形式而定，但通常為4-20天，優(yōu)選6-12天。
培養(yǎng)終止后，給整個(gè)培養(yǎng)體系加熱，使體系內(nèi)的酶失活，終止反應(yīng)。具有本發(fā)明生理活性的物質(zhì)可為粉末狀，通過將培養(yǎng)液和菌絲體的混和液濃縮干燥后進(jìn)行粉碎處理而得到。可應(yīng)用冷凍干燥法將之干燥后進(jìn)行粉碎處理而得到微粉末。
本發(fā)明中可與上述擔(dān)子菌一起聯(lián)合應(yīng)用β-葡萄糖苷酶制劑，增強(qiáng)擔(dān)子菌的酶活性。
這一目的中使用的酶制劑包括曲霉菌屬、芽孢桿菌屬、根霉菌屬等微生物來源的酶制劑，或以大豆、杏仁等植物為來源的酶制劑。應(yīng)用大豆、杏仁等植物時(shí)，可直接應(yīng)用這些種子的粉碎物。
擔(dān)子菌培養(yǎng)基中異黃酮類含有材料的添加比率對(duì)異黃酮糖苷向糖苷配基和糖的轉(zhuǎn)換量(染料木苷向染料木黃酮的轉(zhuǎn)換)有很大的影響。
例如，大豆異黃酮制劑(含40％的異黃酮)與香菇菌一起，在含有麥芽提取物、酵母提取物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，要得到向染料木黃酮的大量轉(zhuǎn)換，向培養(yǎng)基中添加大豆制劑的適宜濃度為3-10％，優(yōu)選5％以下。
培養(yǎng)過程中由擔(dān)子菌產(chǎn)生的β-葡萄糖苷酶的活性變化對(duì)糖苷配基生成有很大影響。用與前面相同的培養(yǎng)基10-60℃培養(yǎng)靈芝菌，觀察β-葡萄糖苷酶的活性變化和培養(yǎng)基pH變化。發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶的活性在pH2.0-6.0之間最高，溫度在40-70℃左右時(shí)，酶活性更高。(藥理活性)推測(cè)本發(fā)明的生理活性物質(zhì)不是已知具有抗腫瘤作用和免疫增強(qiáng)作用的培養(yǎng)擔(dān)子菌而產(chǎn)生的生理活性物質(zhì)與已知具有血管新生抑制作用的異黃酮類糖苷配基(染料木黃酮)的簡單混和，而是二者以某種形式結(jié)合形成一體的物質(zhì)，或者是培養(yǎng)過程中產(chǎn)生某種未知物質(zhì)。其理由是僅培養(yǎng)擔(dān)子菌得到的物質(zhì)與染料木黃酮單純混和得不到與本發(fā)明的物質(zhì)相同的生理活性(腫瘤血管新生抑制作用)。
僅培養(yǎng)擔(dān)子菌而生成的物質(zhì)具有抗腫瘤作用和免疫增強(qiáng)作用，無腫瘤血管新生抑制作用。
本發(fā)明的物質(zhì)干燥、粉末化以后是褐色粉末，具有獨(dú)特深苦味和炒熟的黃豆面那樣的香味。其化學(xué)成分分析結(jié)果和生理學(xué)特性如下所示(測(cè)定方法參照后面的實(shí)施例)。
(1)本發(fā)明物質(zhì)的化學(xué)成分1)水分30％以下2)蛋白質(zhì)7.0-10.0％3)脂質(zhì)5.0-8.0％4)糖質(zhì)75.0-85.0％5)食物纖維0.5-2.0％6)灰2.0-5.0％7)異黃酮類(每1克冷凍干燥粉末)異黃酮苷0.00-0.60mg大豆苷元 28.00-30.00mg染料木苷 0.00-0.40mg
染料木黃酮55.00-65.00mgGlycitin 0.00-0.50mg黃豆黃素 12.00-15.00mg(2)生理學(xué)特性1)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用抑制小鼠黑素瘤細(xì)胞、小鼠大腸癌、小鼠肺癌細(xì)胞、小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞、大鼠乳腺癌細(xì)胞、人前列腺癌細(xì)胞、人膀胱癌細(xì)胞等細(xì)胞的增殖。
2)腫瘤血管新生抑制作用抑制小鼠的腫瘤血管新生。
本發(fā)明物質(zhì)的腫瘤血管新生抑制作用是象后面實(shí)施例所示的那樣通過應(yīng)用小鼠腫瘤細(xì)胞的體外(in vitro)及體內(nèi)(in vivo)試驗(yàn)，應(yīng)用雞蛋膜的離體(ex ovo)試驗(yàn)(CAM法絨毛膜尿囊膜)來確認(rèn)的。產(chǎn)業(yè)上利用的可能性(用作藥品)根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)用含異黃酮的廉價(jià)材料，可容易制造安全且容易口服、具有優(yōu)良生理活性作用的物質(zhì)。
本發(fā)明的物質(zhì)協(xié)同加強(qiáng)異黃酮類的糖苷配基具有的生理活性作用及擔(dān)子菌的培養(yǎng)生產(chǎn)物所具有的生理活性作用，根據(jù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)得結(jié)果，它不僅能用作癌癥的治療和/或預(yù)防劑(抗腫瘤劑)，而且可用作骨質(zhì)疏松、更年期紊亂、心血管疾患、腦功能障礙、酒精依賴癥、高血脂的治療和/或預(yù)防劑，或作為免疫增強(qiáng)劑、雌性激素樣物質(zhì)應(yīng)用。
另外，由于本發(fā)明的物質(zhì)以長期以來以用作食物的蘑菇和大豆等為原料，所以即使大量攝取也不會(huì)有安全問題，可用于增強(qiáng)上述異黃酮類的糖苷配基具有的生理活性作用及擔(dān)子菌的培養(yǎng)生產(chǎn)物所具有的生理活性作用的動(dòng)物或水產(chǎn)用養(yǎng)殖飼料及保健食品。
本發(fā)明的物質(zhì)作為食品、藥品時(shí)主要經(jīng)口服用，其攝取量因年齡、體重、癥狀、預(yù)期的治療效果、施用方法等而異，通常一個(gè)成年人每次施用100mg-5g左右(用干燥物換算)。
施用本發(fā)明的物質(zhì)時(shí)，一般以片劑、丸劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、糖漿劑等應(yīng)用。當(dāng)制備顆粒、片劑化或糖漿劑、涂抹劑時(shí)，必要時(shí)可使用輔助物質(zhì)(淀粉類、糊精、甜味劑、色素、香料等)。實(shí)施本發(fā)明的最佳狀態(tài)以下用實(shí)施例和比較例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限定于此。實(shí)施例1用存在異黃酮類含有材料的培養(yǎng)基培養(yǎng)擔(dān)子菌(1)(1)材料a.異黃酮類含有材料含異黃酮40％的大豆制品(美國，AHD公司制)。所含異黃酮成分(每1克制劑)如下異黃酮苷 80.25mg大豆苷元 2.20mg染料木苷 103.94mg染料木黃酮 2.48mgGlycitin 30.60mg黃豆黃素 3.67mgb.擔(dān)子菌Amino Up化學(xué)公司，25℃保存于麥芽提取物液體培養(yǎng)基中的透明靈芝菌(Ganoderma lucidum)。
(2)培養(yǎng)條件a.培養(yǎng)基麥芽提取物(Oriental酵母公司) 10.00g酵母提取物(味之素公司)1.25g水1.0升(L)b.培養(yǎng)方法培養(yǎng)基高壓滅菌后，4℃保存。將靈芝菌接種到該培養(yǎng)基(pH5.5)中，25℃、130rpm振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，每2日測(cè)定培養(yǎng)液中β-葡萄糖苷酶的活性。酶活性比培養(yǎng)開始時(shí)高時(shí)，將粉末大豆制品(異黃酮含有材料)以2.5％的濃度添加到培養(yǎng)基中，再繼續(xù)培養(yǎng)。測(cè)定染料木黃酮和染料木苷含量，到染料木苷全部轉(zhuǎn)換成染料木黃酮時(shí)，終止培養(yǎng)。培養(yǎng)終止后，將整個(gè)培養(yǎng)液在121℃加熱處理30分鐘，終止酶反應(yīng)并進(jìn)行滅菌處理。接著冷凍干燥，制成粉末。
培養(yǎng)液中β-葡萄糖苷酶的活性測(cè)定是，用β-葡萄糖苷酶標(biāo)準(zhǔn)品(0riental酵母公司，來源于酵母)，與對(duì)硝基酚-β-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma公司)反應(yīng)，測(cè)定400nm的吸光度。
培養(yǎng)液中異黃酮生產(chǎn)量的測(cè)定是，使用異黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(染料木苷、染料木黃酮，Sigma公司)，按照Franke，A.A.等的方法(J.Agric.Food Chem.421905-1913，1994)，用乙腈-水-醋酸(10/90/0.1→40/60/0.1)從ODS柱(TSKgel-80Tm，4.5×150mm)上洗脫(0.8ml/min)，測(cè)定260nm的吸光度。
如上所得本發(fā)明的物質(zhì)(發(fā)明物質(zhì)1)為褐色微粉末，具有如下特性。在以下分析中，通過70℃減壓干燥法測(cè)定水分，用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)，用酸分解法測(cè)定脂質(zhì)，用酶-重量法測(cè)定食物纖維，用直接灰化法測(cè)定灰分，通過差值求出糖質(zhì)。
a.化學(xué)性質(zhì)1)水分0.7％2)蛋白質(zhì)8.％3)脂質(zhì)6.254)糖質(zhì)80.6％5)食物纖維1.0％6)灰分2.7％7)異黃酮類(每1克干粉末)異黃酮苷 痕量大豆苷元 28.47mg染料木苷 痕量染料木黃酮 59.11mgGlycitin 痕量黃豆黃素 13.53mgb.生理學(xué)特性1)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用(體外)用B16/BL6小鼠黑素瘤細(xì)胞、Colon 26小鼠大腸細(xì)胞、SST-2大鼠乳腺癌細(xì)胞、T24人膀胱癌細(xì)胞及Du145人前列腺癌細(xì)胞進(jìn)行腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用。將實(shí)施例1的物質(zhì)(發(fā)明物質(zhì)1)懸浮到蒸餾水中高壓滅菌，以100μg/ml-0.1μg/ml的連續(xù)濃度加到細(xì)胞中。用溶解到0.1％乙醇中的染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)作陽性對(duì)照。用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基將腫瘤細(xì)胞懸浮液調(diào)整到1-2×106孔，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，向其中加入發(fā)明物質(zhì)1或染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品，再培養(yǎng)48小時(shí)。用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)2，5-二苯基四溴化鈉)法，用小平板讀數(shù)器(microplate reader)測(cè)定細(xì)胞增殖。發(fā)明物質(zhì)1對(duì)各種培養(yǎng)癌細(xì)胞的增殖抑制效果如表1所示，以對(duì)未處理對(duì)照組腫瘤增殖的腫瘤抑制率表示。數(shù)值高，這提示癌細(xì)胞的增殖抑制效果高。
表1發(fā)明物質(zhì)1對(duì)各種培養(yǎng)癌細(xì)胞增殖的抑制率(％)發(fā)明物質(zhì)1濃度(μg/ml) B-16 Colon 26 SST-2 Du145 T-2412.5 53.7 11.4 39.6 27.0 4.325.0 72.0 48.7 36.2 60.0 31.250.0 78.5 78.3 52.9 85.5 77.9100.0 86.4 78.8 61.3 87.4 98.5從表1可以看出，發(fā)明物質(zhì)1以濃度依賴的方式抑制各種培養(yǎng)癌細(xì)胞的增殖，具有較高的腫瘤細(xì)胞增殖抑制效果。
2)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(體外)在用1％明膠包被的96孔微量板中預(yù)培養(yǎng)小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞LE-1細(xì)胞24小時(shí)，用10-0.1μg/ml濃度的發(fā)明物質(zhì)1處理后，再培養(yǎng)24小時(shí)。用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖。如表2所示，發(fā)明物質(zhì)1以濃度依賴的方式抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，具有較高的增殖抑制效果。由此可以斷定發(fā)明物質(zhì)1具有血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制作用，即血管新生抑制作用。
表2發(fā)明物質(zhì)1對(duì)小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制率(％)發(fā)明物質(zhì)1濃度(μg/ml) LE-112.5 52.425.0 63.550.0 67.6100.0 76.9
3)發(fā)明物質(zhì)1、染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品及擔(dān)子菌培養(yǎng)物對(duì)各種腫瘤細(xì)胞的50％增殖抑制濃度(IC50)比較(體外)用3LL小鼠肺癌細(xì)胞、Colon 26小鼠大腸癌細(xì)胞、PC3人前列腺癌細(xì)胞、Du145人前列腺癌細(xì)胞及LNCaP人前列腺癌細(xì)胞檢測(cè)發(fā)明物質(zhì)1、染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)及擔(dān)子菌培養(yǎng)物(在與實(shí)施例1相同的條件下，只培養(yǎng)擔(dān)子菌而得到的產(chǎn)物)對(duì)它們的50％增殖抑制濃度(IC50)。
即，將發(fā)明物質(zhì)1、染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品及擔(dān)子菌培養(yǎng)物懸浮到蒸餾水中高壓滅菌，以1000μg/ml-0.1μg/ml的連續(xù)濃度加到細(xì)胞中。用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基將腫瘤細(xì)胞懸浮液調(diào)整到1-2×105孔，37℃培養(yǎng)24小時(shí)，向其中加入發(fā)明物質(zhì)1或染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品，再培養(yǎng)48小時(shí)。用MTT法通過小平板讀數(shù)器(microplate reader)測(cè)定細(xì)胞增殖。其結(jié)果如表3所示。數(shù)值低，這提示低濃度可抑制培養(yǎng)癌細(xì)胞增殖的50％。
表3發(fā)明物質(zhì)1、染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品、擔(dān)子菌培養(yǎng)物對(duì)各種癌細(xì)胞的IC50(μg/ml)3LL Colon 26 PC3 Du145 LNCaP發(fā)明物質(zhì)1 11.031.4426.09 19.6023.52染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品 31.7951.22 35.77 55.2869.40擔(dān)子菌培養(yǎng)物 ＞10003.32 ＞1000＞1000377.78如表3所示，發(fā)明物質(zhì)1對(duì)任一培養(yǎng)癌細(xì)胞均有較高的癌細(xì)胞增殖抑制效果。發(fā)明物質(zhì)1對(duì)各種培養(yǎng)癌細(xì)胞增殖抑制的IC50均顯著低于染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品及擔(dān)子菌培養(yǎng)物中的任一種。該事實(shí)說明發(fā)明物質(zhì)1完全不同于染料木黃酮標(biāo)準(zhǔn)品及擔(dān)子菌培養(yǎng)物中的任一種。
發(fā)明物質(zhì)1的腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用是由于誘導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞的編程死亡(apoptosis)。將50000個(gè)T24細(xì)胞在小室玻片內(nèi)培養(yǎng)24小時(shí)，加入培養(yǎng)基以使發(fā)明物質(zhì)1的濃度達(dá)200μg/ml，再培養(yǎng)48小時(shí)后，固定玻片上的細(xì)胞，用TUNEL染色試劑盒染色后，可以清楚看到經(jīng)發(fā)明物質(zhì)1處理的癌細(xì)胞發(fā)生編程死亡。
4)腫瘤細(xì)胞編程死亡誘導(dǎo)作用為了在DNA水平確認(rèn)發(fā)明物質(zhì)1的腫瘤細(xì)胞編程死亡誘導(dǎo)作用，通過電泳檢測(cè)發(fā)生編程死亡細(xì)胞的基因特異的DNA梯帶。
方法給SHR/NCrj大鼠(雄性，6周齡)皮下接種SST-2(人乳腺癌)，確認(rèn)腫瘤形成后，通過自由攝取施用2周含1％發(fā)明物質(zhì)1的水，再經(jīng)口強(qiáng)制施用含10％發(fā)明物質(zhì)1的水1周。對(duì)照組自由攝取3周0.05％NaHCO3水溶液。其后，從腫瘤組織提取DNA，電泳，檢測(cè)DNA梯帶。結(jié)果施用了發(fā)明物質(zhì)1的組中可明確看到DNA梯帶，這表明發(fā)明物質(zhì)1在DNA水平誘導(dǎo)編程死亡。
另外，應(yīng)用流式細(xì)胞儀來檢測(cè)發(fā)明物質(zhì)1對(duì)腫瘤細(xì)胞編程死亡的誘導(dǎo)作用，它是通過核DNA染色來分析施用了發(fā)明物質(zhì)1的大鼠乳腺癌細(xì)胞生長、分裂及分化過程(細(xì)胞周期)中的細(xì)胞數(shù)。
細(xì)胞培養(yǎng)將10ml用含10％FBS(胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的SST-2大鼠乳腺癌細(xì)胞(10×106/ml)10ml移到內(nèi)徑10cm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)1小時(shí)后，如下加入樣品。
對(duì)照DMSO(10μl，終濃度0.1％以下)發(fā)明物質(zhì)1處理以100mg/ml的濃度將發(fā)明物質(zhì)1的溶解到DMSO中，取10μl加到10ml細(xì)胞培養(yǎng)液中。發(fā)明物質(zhì)1的終濃度為100μg/ml。添加樣品后再培養(yǎng)48小時(shí)，培養(yǎng)終止后收集細(xì)胞，用70％乙醇將細(xì)胞懸浮液固定24小時(shí)。再懸浮到含0.1％葡萄糖和Rnase(100U/ml)的PBS(磷酸緩沖生理鹽水)，室溫30分鐘。在進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)以前，用碘化丙錠(propidium iodide)(PI50μg/ml)將細(xì)胞染色10分鐘。用流式細(xì)胞儀分析經(jīng)發(fā)明物質(zhì)1處理的SST-2細(xì)胞的細(xì)胞周期。
其結(jié)果顯示經(jīng)發(fā)明物質(zhì)1處理的SST-2細(xì)胞，其細(xì)胞周期停止在DNA合成與細(xì)胞分裂的間隔期(G1期)和向DNA合成期(S期)過渡的時(shí)期(G1S期)，提示細(xì)胞不能進(jìn)行DNA的合成。G1S期的DNA含量由總體的65.48％減少到55.91％，經(jīng)發(fā)明物質(zhì)1處理的SST-2細(xì)胞的編程死亡由1.94％增加到5.20％。該結(jié)果表明，SST-2細(xì)胞通過停止在G1S期誘導(dǎo)編程死亡。
大豆異黃酮類、染料木黃酮及擔(dān)子菌提取物等誘導(dǎo)細(xì)胞編程死亡已經(jīng)有報(bào)道(例如，Cancer Res.58，5231-38，1998；Jpn.J.CancerRes.91，164-173，2000；Biochem.Biophys.Res.Commun.，194，944-950，1992；J.Nat.Prod.1998，61，485-487)，但如前所述，發(fā)明物質(zhì)1明顯不同于染料木黃酮及擔(dān)子菌提取物，發(fā)明物質(zhì)1對(duì)癌細(xì)胞的編程死亡誘導(dǎo)作用由本發(fā)明者們初次發(fā)現(xiàn)。
5)腫瘤血管新生抑制試驗(yàn)(體外)用雙層小室(double chamber)法進(jìn)行血管新生抑制試驗(yàn)。
本實(shí)驗(yàn)中，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)小鼠大腸癌細(xì)胞Colon 26，在其孔的內(nèi)側(cè)插入開了直徑為8μm的內(nèi)孔，內(nèi)孔上鋪被膠原膠，在其上培養(yǎng)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞LE-1。外側(cè)孔內(nèi)大腸癌細(xì)胞產(chǎn)生的血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激因子從內(nèi)側(cè)孔的底孔進(jìn)行刺激，形成新生血管。確認(rèn)新生血管形成以后，將發(fā)明物質(zhì)1加到外側(cè)孔，再培養(yǎng)3天。培養(yǎng)后，對(duì)膠原膠上的細(xì)胞進(jìn)行拍照，通過計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖象處理，用圖象分析軟件NIH Image來計(jì)算血管內(nèi)皮細(xì)胞生成的管腔總長度以及內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)，用對(duì)正常細(xì)胞管腔長度的比率計(jì)算出血管新生抑制率。結(jié)果如表4所示，經(jīng)發(fā)明物質(zhì)1處理后，新生血管大大消失。
表4發(fā)明物質(zhì)1的腫瘤血管新生抑制效果(體外)細(xì)胞數(shù) 管腔長 血管新生抑制率(％)未處理細(xì)胞22 1593 -發(fā)明物質(zhì)1 1 70 95.66)腫瘤血管新生抑制試驗(yàn)(體內(nèi))用背部皮下法體內(nèi)進(jìn)行血管新生抑制試驗(yàn)。用小鼠大腸癌細(xì)胞Colon 26(1×107細(xì)胞)充滿兩面貼了孔徑為0.45um濾膜(Millipore公司)的Millipore環(huán)，接種到BALB/c小鼠背部皮下。每天強(qiáng)制經(jīng)口施用1克發(fā)明物質(zhì)1，小室移植后第5天摘出小室，照相記錄血管的分布。將照片輸入到計(jì)算機(jī)，用圖象分析軟件NIH Image進(jìn)行綠色濾光片處理，對(duì)血管分布進(jìn)行數(shù)字化處理后，用移植部位的血管面積來計(jì)算面積率。結(jié)果如表5所示。經(jīng)腫瘤細(xì)胞處理的小鼠，Colon 26誘導(dǎo)皮下血管的面積約為正常小鼠的2倍，與此相對(duì)，攝取了發(fā)明物質(zhì)1的小鼠與正常小鼠沒有差異，這表明經(jīng)口攝取發(fā)明物質(zhì)1可顯著抑制腫瘤血管新生。
表5發(fā)明物質(zhì)1的腫瘤血管新生抑制效果(體內(nèi))面積 面積率(％)正常(未處理) 385412.8腫瘤細(xì)胞處理 720026.9用發(fā)明物質(zhì)1處理 301810.87)血管新生抑制試驗(yàn)(離體(ex ovo))通過應(yīng)用雞受精卵的CAM法(chorioallantoic membrance)進(jìn)行離體血管新生抑制試驗(yàn)。這是觀察卵黃膜上血管新生的方法，可將血管新生抑制物質(zhì)直接施用到卵黃上，打開卵殼直接觀察血管新生的抑制。將10日齡的雞卵于37℃、60％濕度培養(yǎng)3天后，把卵殼打開一小口，用注射器吸出3ml的蛋清，用防水膠帶封口，再在該孔的對(duì)側(cè)打開10×1.0cm的洞，確認(rèn)胚胎中血管生成后將洞封閉，再培養(yǎng)3天。其后，將滅菌的發(fā)明物質(zhì)1的磷酸緩沖生理鹽水從該洞加到卵內(nèi)，再培養(yǎng)4天后，打開卵殼，拍照記錄卵黃膜上的血管分布。將照片輸入到計(jì)算機(jī)，用圖象分析軟件NIH Image進(jìn)行綠色濾光片處理，對(duì)血管分布進(jìn)行數(shù)字化處理后，用移植部位的血管面積來計(jì)算面積率。結(jié)果如表6所示。經(jīng)發(fā)明物質(zhì)1處理的卵黃膜上分布的血管面積減少，與正常卵相比其抑制率高達(dá)86.4％，這表明有血管新生抑制效果。
表6發(fā)明物質(zhì)1的血管新生抑制效果(ex ovo)面積 面積率(％) 抑制率(％)正常卵(未處理)8716738.3 -發(fā)明物質(zhì)1處理 118625.286.4實(shí)施例2用存在異黃酮類含有材料的培養(yǎng)基培養(yǎng)擔(dān)子菌(2)用下述原料，在與實(shí)施例1同樣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，得到本發(fā)明的物質(zhì)(發(fā)明物質(zhì)2)。
(1)原料a.異黃酮類含有材料將北海道產(chǎn)的整粒大豆(染料木苷0.730mg/g，染料木黃酮0.041mg/g，均為無水物換算)用自來水浸泡一晚，使之吸水，加入10倍量的水，100℃煮30分鐘，除去固形物后的豆乳。異黃酮的含有量如下異黃酮的含有量(μg/ml)異黃酮苷11.68大豆苷元 2.51染料木苷45.22染料木黃酮 3.51Glycitin 5.62黃豆黃素11.33b.擔(dān)子菌Amino Up化學(xué)公司，25℃保存于麥芽提取物瓊脂培養(yǎng)基中的埃杜香菇菌(Lentinus edodes)。
(2)所得本發(fā)明物質(zhì)(發(fā)明物質(zhì)2)與發(fā)明物質(zhì)1一樣是褐色微粉末，具有如下的化學(xué)、生理學(xué)特性(測(cè)定方法與實(shí)施例1相同)。
a)化學(xué)特性1)水分0.9％2)蛋白質(zhì)12.9％3)脂質(zhì)1.3％4)糖質(zhì)73.9％5)食物纖維3.1％6)灰7.9％7)異黃酮類(每1克冷凍干燥粉末)異黃酮苷 痕量大豆苷元 20.50mg染料木苷 痕量染料木黃酮 37.20mgGlycitin 痕量黃豆黃素 8.49mgb)生理學(xué)特性用與實(shí)施例1相同的方法對(duì)發(fā)明物質(zhì)2進(jìn)行腫瘤細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(體外)、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(體內(nèi))、腫瘤血管新生抑制試驗(yàn)(體外)、腫瘤血管新生抑制試驗(yàn)(體內(nèi))、血管新生抑制試驗(yàn)(離體)。結(jié)果如表7-11所示。
表7發(fā)明物質(zhì)2對(duì)各種培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制率(％)(體外)發(fā)明物質(zhì)2濃度(μg/ml) B-l6 Colon 26 SST-2 Dul45 T-2412.5 23.27.9 20.817.1 0.025.0 52.223.958.530.0 9.650.0 75.441.865.437.1 28.1100.0 86.073.384.669.8 54.5由表7可知發(fā)明物質(zhì)2對(duì)各種培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞顯示高的抑制率，這表明其癌細(xì)胞增殖抑制效果高。
表8發(fā)明物質(zhì)2對(duì)小鼠腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖抑制率(％)發(fā)明物質(zhì)2濃度(μg/ml) LE-112.539.625.036.250.052.9100.0 61.3由表8可知發(fā)明物質(zhì)2以濃度依賴方式高度抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，具有血管新生抑制作用。
表9發(fā)明物質(zhì)2對(duì)腫瘤血管新生抑制效果(體外)細(xì)胞數(shù) 管腔長 新生血管抑制率(％)正常細(xì)胞(未處理) 221593-用發(fā)明物質(zhì)2處理161366 14.3表9表明發(fā)明物質(zhì)2處理后新生血管形成減少，具有高達(dá)14.3％的抑制率。
表10發(fā)明物質(zhì)2對(duì)腫瘤血管新生的抑制效果(體內(nèi))面積面積率(％)正常(無處理) 3854 12.8腫瘤細(xì)胞處理 7200 26.9用發(fā)明物質(zhì)2處理 2494 10.6表10表明，腫瘤細(xì)胞處理的小鼠中Colon 26誘導(dǎo)的皮下血管面積約為正常小鼠的2倍，而施用了發(fā)明物質(zhì)2的小鼠與正常小鼠相比無變化。這表明，通過攝取發(fā)明物質(zhì)2可抑制腫瘤血管新生。
表11血管新生抑制效果(ex ovo)面積 面積率(％) 抑制率(％)正常細(xì)胞(未處理) 9716738.3 -發(fā)明物質(zhì)2處理3430014.8 61.3表11表明，經(jīng)發(fā)明物質(zhì)2處理的卵黃膜上分布的血管面積減少，與正常卵相比，顯示了抑制率高達(dá)61.3％的血管新生抑制效果。比較例擔(dān)子菌單獨(dú)培養(yǎng)物與染料木黃酮混合物的生理作用使用與實(shí)施例1同樣的靈芝菌作擔(dān)子菌，除省略添加異黃酮類含有材料外，在與實(shí)施例1同樣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)、冷凍干燥，得到褐色粉末(比較物質(zhì)1)。比較物質(zhì)1的化學(xué)性質(zhì)如下(分析法與實(shí)施例1相同)。
化學(xué)性質(zhì)水分 1.6％蛋白質(zhì) 12.9％脂質(zhì) 1.6％糖質(zhì)71.4％食物纖維 3.8％
灰分 8.7％然后將94g比較物質(zhì)1分散到1升水中，加溫到60℃，加入3g染料木黃酮(Sigma公司)，繼續(xù)攪拌30分鐘，然后真空冷凍干燥，得到干粉末(比較物質(zhì)2)。
對(duì)發(fā)明物質(zhì)1、發(fā)明物質(zhì)2、比較物質(zhì)1和比較物質(zhì)2進(jìn)行離體(ex ovo)血管新生抑制試驗(yàn)，用荷瘤小鼠進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤試驗(yàn)。離體血管新生抑制試驗(yàn)與實(shí)施例1同樣進(jìn)行，用荷瘤小鼠進(jìn)行的體內(nèi)腫瘤增殖抑制試驗(yàn)按如下方法進(jìn)行。
將B-16黑素瘤細(xì)胞(1×105細(xì)胞)接種到C57/BL小鼠皮下，分別以5％的濃度將發(fā)明物質(zhì)1、2和比較物質(zhì)1、2混和成粉末飼料，接種腫瘤的同時(shí)自由攝取21天。第21天摘除腫瘤，測(cè)定質(zhì)量。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表12和13所示。
表12血管新生抑制效果的比較(ex ovo)面積率(％) 抑制率(％)對(duì)照(未處理) 38.3-發(fā)明物質(zhì)1 5.2 86.4發(fā)明物質(zhì)2 14.8 61.3比較物質(zhì)1 27.0 29.5比較物質(zhì)2 23.0 40.0表13荷瘤小鼠腫瘤增殖抑制效果的比較(體內(nèi))腫瘤重量(平均值g) 標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)照(未處理) 1.44 0.59發(fā)明物質(zhì)10.28 0.32 與對(duì)照有顯著性差異為0.1％以下發(fā)明物質(zhì)20.68 0.34 與對(duì)照有顯著性差異為1％以下比較物質(zhì)11.35 0.56 與對(duì)照無顯著性差異比較物質(zhì)20.83 0.59 同上如表12、13所顯示的那樣，離體血管新生抑制試驗(yàn)效果和用荷瘤小鼠進(jìn)行的體內(nèi)腫瘤增殖抑制試驗(yàn)效果中，比較物質(zhì)1和2與對(duì)照無差異，而發(fā)明物質(zhì)1和2有較高抑制效果。
權(quán)利要求
1.一種具有生理活性作用的物質(zhì)，它是用存在含異黃酮類材料的培養(yǎng)基培養(yǎng)具有β-葡萄糖苷酶活性的擔(dān)子菌而得到的，其具有包括異黃酮類的糖苷配基和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的生理活性。
2.一種具有生理活性作用的物質(zhì)，它是用存在含異黃酮類材料和β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基培養(yǎng)具有β-葡萄糖苷酶活性的擔(dān)子菌而得到的，其具有包括異黃酮類的糖苷配基和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的生理活性。
3.權(quán)利要求1或2的物質(zhì)，它協(xié)同增加異黃酮類的糖苷配基的生理活性和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的生理活性。
4.上述1-3任一權(quán)利要求中的物質(zhì)，其中異黃酮類的糖苷配基為染料木苷。
5.上述1-4任一權(quán)利要求中的物質(zhì)，其中生理活性為抗腫瘤作用。
6.權(quán)利要求5的物質(zhì)，其中抗腫瘤作用為腫瘤新生血管抑制作用。
7.權(quán)利要求5的物質(zhì)，其中抗腫瘤作用為腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用。
8.權(quán)利要求7的物質(zhì)，其中腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用為腫瘤細(xì)胞的編程死亡誘導(dǎo)作用。
9.上述1-4任一權(quán)利要求的物質(zhì)，其中含異黃酮類材料為大豆種子，來源于大豆種子的加工制品或竹芋根。
10.權(quán)利要求1或2的物質(zhì)，其中具有β-葡萄糖苷酶活性的擔(dān)子菌為靈芝菌或香菇菌。
11.一種具有生理活性作用的物質(zhì)的制造方法，其特征是用存在含異黃酮類材料的培養(yǎng)基培養(yǎng)具有β-葡萄糖苷酶活性的擔(dān)子菌，得到含異黃酮類的糖苷配基和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的成分。
12.上述權(quán)利要求11的具有生理活性作用的物質(zhì)的制造方法，它是預(yù)先培養(yǎng)擔(dān)子菌，提高β-葡萄糖苷酶活性后，將含異黃酮類材料加入培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，得到含異黃酮類的糖苷配基和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的成分。
13.一種具有生理活性作用的物質(zhì)的制造方法，其特征是用存在含異黃酮類材料和β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基培養(yǎng)具有β-葡萄糖苷酶活性的擔(dān)子菌，得到含異黃酮類的糖苷配基和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的成分。
14.上述權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)記載的具有生理活性作用的物質(zhì)的制造方法，其中異黃酮類的糖苷配基為染料木苷。
15.上述權(quán)利要求11-14任一項(xiàng)記載的制造方法，其中生理活性為抗腫瘤作用。
16.上述權(quán)利要求15的制造方法，其中抗腫瘤作用為腫瘤新生血管抑制作用。
17.上述權(quán)利要求15的制造方法，其中抗腫瘤作用為腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用。
18.上述權(quán)利要求17的制造方法，其中腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用為腫瘤細(xì)胞的編程死亡誘導(dǎo)作用。
19.上述權(quán)利要求11或12的制造方法，其中含異黃酮類的材料為大豆種子，來源于大豆種子的加工制品或竹芋根。
20.上述權(quán)利要求11或13的制造方法，其中具有β-葡萄糖苷酶活性的擔(dān)子菌為靈芝菌或香菇菌。
21.一種健康食品，其含有上述權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)記載的具有生理活性作用的物質(zhì)。
22.一種飼料組合物，其含有上述權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)記載的具有生理活性作用的物質(zhì)作為有效成分。
23.一種抗腫瘤劑，其含有上述權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)記載的具有生理活性作用的物質(zhì)作為有效成分。
全文摘要
一種新型物質(zhì),其制造方法,含有該物質(zhì)的食品、飼料及藥劑,該新型物質(zhì)是用存在含異黃酮類材料的培養(yǎng)基培養(yǎng)具有β－葡萄糖苷酶活性的擔(dān)子菌而得到的,它具有異黃酮類的糖苷配基和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的生理活性,并被協(xié)同加強(qiáng)。本發(fā)明的物質(zhì)增強(qiáng)了異黃酮類的糖苷配基所具有的生理活性作用和擔(dān)子菌培養(yǎng)物的生理活性作用,不僅可作為抗腫瘤劑,而且可用作治療和/或預(yù)防骨質(zhì)疏松劑,作為免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用。
文檔編號(hào)A23K1/00GK1347459SQ00806244
公開日2002年5月1日 申請(qǐng)日期2000年12月14日 優(yōu)先權(quán)日1999年12月15日
發(fā)明者小砂憲一, 袁嵐, 三浦健人, 孫步祥 申請(qǐng)人:株式會(huì)社氨基厄普化學(xué)