專利名稱：耐儲(chǔ)藏水稻的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水稻種子脂氧合酶-3(LOX-3)缺失體的快速比色篩選法，屬于生物技術(shù)育種與開(kāi)發(fā)領(lǐng)域，專用于包括常規(guī)稻和雜交稻的耐儲(chǔ)藏品種(脂氧合酶-3缺失體)的快速篩選。
糧食安全是一個(gè)全球性的戰(zhàn)略問(wèn)題，我國(guó)是世界第一的人口大國(guó)，糧食儲(chǔ)備更是政治穩(wěn)定和國(guó)民經(jīng)濟(jì)長(zhǎng)期高速發(fā)展的戰(zhàn)略基礎(chǔ)。水稻是我國(guó)的主要糧食作物，其產(chǎn)量占全國(guó)糧食作物的近一半；同時(shí)，大米是我國(guó)人民的主食，隨著人民生活水平的不斷提高，對(duì)大米的品質(zhì)也提出了越來(lái)越嚴(yán)格的要求。但是，稻谷在一般儲(chǔ)藏條件下第二年就會(huì)發(fā)生陳化變質(zhì)現(xiàn)象，而且隨著儲(chǔ)藏過(guò)程中溫度和濕度的加大，陳化過(guò)程更會(huì)迅速加快。近年來(lái)，我國(guó)糧食的連年豐收也使得稻谷儲(chǔ)藏中的陳化問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重。據(jù)農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)，每年因?yàn)殛惢瘑?wèn)題損失的作為食用和種子的稻谷占總產(chǎn)量的3％。一般來(lái)講，建設(shè)耐儲(chǔ)的高標(biāo)準(zhǔn)低溫冷庫(kù)和氣調(diào)庫(kù)可提高稻米的儲(chǔ)藏品質(zhì)，但耗資巨大，是我國(guó)目前的經(jīng)濟(jì)能力所難以承受的，因此從儲(chǔ)藏谷物本身來(lái)解決陳化變質(zhì)問(wèn)題無(wú)疑是一條經(jīng)濟(jì)有效的途徑。研究表明，脂質(zhì)的降解是導(dǎo)致谷物儲(chǔ)藏期間品質(zhì)下降并產(chǎn)生陳米霉味的根源。脂氧合酶(Lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12)是一種含非血紅素鐵的蛋白質(zhì)，專一催化含有順、順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸及其相應(yīng)的酯類，從而氧化生成具有共軛雙鍵的脂氫過(guò)氧化物，后者進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成為一些揮發(fā)性的氣體化合物。水稻種子中含有三種LOX同工酶，分別定名為L(zhǎng)OX-1，LOX-2和LOX-3，最適pH為4.5，5.5和7.0，其中LOX-3活性約占總活性的80～90％。進(jìn)一步的研究表明，水稻種子LOX能催化亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸的氧化，最終生成醛、酮等揮發(fā)性物質(zhì)，產(chǎn)生陳米霉味，嚴(yán)重影響其耐貯性。LOX-3的缺失可以大大的阻止脂質(zhì)的氧化作用，降低稻谷的氧化變質(zhì)，使其不會(huì)因陳化變質(zhì)作用而降低品質(zhì)，保持谷物的清新氣味。1993年，Suzuki等(見(jiàn)Japan J Breed，43405-409)首次采用LOX-3的單克隆抗體技術(shù)發(fā)現(xiàn)泰國(guó)水稻品種Daw Dam是一種LOX-3的缺失體材料，其耐儲(chǔ)藏特性也已被證實(shí)。上述LOX-3缺失體材料的發(fā)現(xiàn)，使通過(guò)遺傳育種手段培育不含或低含量LOX的耐儲(chǔ)藏水稻新品種成為可能。但是Suzuki等采用LOX-3的單克隆抗體技術(shù)進(jìn)行篩選，其價(jià)格昂貴、步驟復(fù)雜，且一般育種工作者難以掌握該技術(shù)，迄今一些相關(guān)實(shí)驗(yàn)室也難以進(jìn)行有關(guān)測(cè)定。因此，在大量的種質(zhì)資源中篩選和在分離群體中選擇耐儲(chǔ)藏水稻新品系(LOX缺失體材料)時(shí)采用單克隆抗體技術(shù)是非常困難且不經(jīng)濟(jì)的。
本發(fā)明的目的是提供一種耐儲(chǔ)藏水稻的篩選方法，篩選出水稻種子脂氧合酶-3(LOX-3)缺失體，用該方法篩選水稻種子脂氧合酶-3(LOX-3)缺失體具有簡(jiǎn)單、快速和低成本的特點(diǎn)，能鑒定包括各種常規(guī)稻和雜交稻的種子脂氧合酶-3(LOX-3)缺失體材料，適用于水稻的遺傳和新品種選育與開(kāi)發(fā)。
實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所提供的耐儲(chǔ)藏水稻的篩選方法，所需步驟如下1)計(jì)量待測(cè)水稻和LOX-3缺失體材料(作為對(duì)照)的種子，切下種子單胚；2)取單胚分別放入試管中；3)在各試管中吸取0.5-1.5ml溶液A(含0.01-0.2％(V/V) Tween-20、0.5-5mmol/L亞油酸或亞麻酸、0.2-0.4mol/L pH8.2-9.0的硼酸緩沖液的溶液)，室溫(20-30℃)下放置5-30min后，再分別加入50-400μl溶液B(含5-25％(V/V)醋酸、5-25％(V/V)飽和碘化鉀的溶液)和50-400μl溶液C(0.5-5％(W/V)淀粉)；4)4-50hr后觀察待測(cè)水稻種胚和已知LOX-3缺失體材料種胚的反應(yīng)顯色差別，含有正常LOX-3活性的單粒種胚的試管均呈略帶紫的橙紅色或紫紅色，LOX-3缺失的單粒種胚和LOX-3缺失體顏色則呈淡乳白色略偏黃。
5)該水稻種胚脂氧合酶-3(LOX-3)缺失體的篩選方法，也可以在4-50hr后以蒸餾水作為對(duì)照，比色測(cè)定410nm吸光值(A410，下同)，計(jì)算待測(cè)水稻與LOX-3缺失體材料種胚A410差異是否達(dá)到顯著水平；判斷待測(cè)水稻種胚LOX-3的缺失情況樣本與對(duì)照兩者A410差異呈顯著或極顯著水平，表明樣本不是LOX-3缺失體；反之，則為缺失體。
6)上述水稻種胚脂氧合酶-3(LOX-3)缺失體的篩選方法，最好是以在4-50hr后觀察待測(cè)水稻種胚和已知LOX-3缺失體材料種胚的反應(yīng)顯色差別的同時(shí)，以蒸餾水作為對(duì)照，比色測(cè)定A410，計(jì)算待測(cè)水稻與LOX-3缺失體材料種胚A410差異是否達(dá)到顯著或極顯著水平；根據(jù)色差與顯著水平結(jié)果，判斷待測(cè)水稻種胚LOX-3的缺失情況含有正常LOX-3活性的單粒種胚的試管均呈略帶紫的橙紅色或紫紅色，LOX-3缺失的單粒種胚的試管均呈淡乳白色略偏黃。樣本與對(duì)照兩者A410差異呈顯著或極顯著水平，表明樣本不是LOX-3缺失體；反之，則為缺失體。
本發(fā)明首先研究并試驗(yàn)了不同pH值和濃度的硼酸緩沖液對(duì)該方法靈敏度的影響，并尋求最佳試驗(yàn)條件。本方法的原理是KI在脂氧合酶的催化產(chǎn)物脂氫過(guò)氧化物的作用下游離出碘，最終導(dǎo)致淀粉呈紫紅色或橙紅色。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)水稻種胚中LOX-1，LOX-2和LOX-3的最適pH分別為4.5，5.5和7.0，而且LOX-3活性占總活性的80～90％。因此適當(dāng)偏堿的硼酸緩沖液可以盡量地抑制LOX-1和LOX-2活性。另一方面，H+濃度(反應(yīng)液還含有一定濃度的醋酸)也會(huì)影響碘與淀粉的呈色反應(yīng)。
LOX-3缺失與否對(duì)上述的呈色反應(yīng)是不一樣的。含有正常LOX-3活性(例日本水稻品種越光)的單粒種胚的試管均呈略帶紫的橙紅色或紫紅色，相應(yīng)的已知LOX-3缺失體Daw Dam顏色則呈淡乳白色略偏黃。以含有正常LOX-3活性的日本水稻品種越光(Koshihikari)和LOX-3缺失體材料泰國(guó)水稻品種Daw Dam為材料。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用pH9.0或8.2的硼酸緩沖溶液作為A液，反應(yīng)24-40h時(shí)，含有正常LOX-3活性的越光單粒種胚的試管均呈略帶紫的橙紅色，相應(yīng)的LOX-3缺失體Daw Dam顏色偏淡或微黃色；相反，pH7.4的硼酸緩沖液處理的兩品種顏色基本均為微黃色。從色差上看，0.4mol/L pH9.0的硼酸緩沖液效果最明顯。另一方面，表1的結(jié)果表明，隨著硼酸緩沖液pH值和濃度的增加，Δ410也基本上在不斷加大，表明比色法的靈敏度與緩沖溶液的pH和濃度有關(guān)，其中pH為9.0的0.2和0.4mol/L硼酸緩沖液效果最好，與相應(yīng)Daw Dam對(duì)照的差異達(dá)P＜0.01水平，pH為8.2的0.4mol/L硼酸緩沖液則達(dá)P＜0.05水平，和上述色差的結(jié)果基本也是一致的。因此，采用0.2和0.4mol/L的pH9.0以及0.4mol/L的pH8.2硼酸緩沖溶液可以得到滿意的結(jié)果。
表1不同硼酸緩沖液對(duì)比色法靈敏度的影響A410平均值處理越光Daw Dam靈敏度硼酸緩沖液，pH9.0，0.1mol/L0.6790±0.03800.6204±0.06600.05860.2mol/L0.7558±0.0751**0.5750±0.01730.18080.4mol/L0.7762±0.0821**0.5218±0.03980.2544PH8.2，0.1mol/L0.6270±0.03550.5924±0.01770.03460.2mol/L0.5958±0.04000.5486±0.03650.04720.4mol/L0.6844±0.0703*0.5552±0.02680.1292PH7.4，0.1mol/L0.6174±0.05270.6060±0.03140.01140.2mol/L0.5294±0.04750.5324±0.0272 -0.00300.4mol/L0.5172±0.00880.5140±0.02210.0032注靈敏度以ΔA410(410越光-410Daw Dam)表示。*P＜0.05，**P＜0.01.
在上述耐儲(chǔ)藏水稻的快速篩選法建立后，1999到2000年，對(duì)Daw Dam/IR-BB7和Daw Dam/信粳5號(hào)的F2分離群體進(jìn)行LOX-3缺失性的調(diào)查，同時(shí)利用LOX-3單克隆抗體技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果是一致的，即LOX-3活性的存在與否符合3∶1的比例，從而驗(yàn)證了LOX-3是由單隱性基因控制的結(jié)論。
本發(fā)明所提供的耐儲(chǔ)藏水稻的篩選方法，除鑒定結(jié)果準(zhǔn)確外，還具有以下優(yōu)點(diǎn)1)方法簡(jiǎn)單，一般工作人員即可操作，不需提取單粒種子種胚的蛋白質(zhì)，2)樣品用量少，單粒種子的種胚即可進(jìn)行驗(yàn)證，3)速度快，一批樣品(樣品量為500個(gè)左右)最多只需2天左右即可拿出鑒定結(jié)果，4)成本極低，只需若干試管和一些簡(jiǎn)單的化學(xué)試劑以及一臺(tái)721分光光度計(jì)，與LOX-3單克隆抗體技術(shù)檢測(cè)相比，不需配置CO2培養(yǎng)箱等單克隆抗體制備和Western印跡所需的相關(guān)設(shè)備以及相關(guān)昂貴的試劑及實(shí)驗(yàn)耗材；5)適用范圍廣，本方法不僅適用于常規(guī)稻，也適用于雜交稻。


圖1為耐儲(chǔ)藏水稻篩選方法的步驟圖。
實(shí)施例11999年秋季，對(duì)日本鈴木保宏(Suzuki Y.)研究員提供的泰國(guó)水稻品種Daw Dam進(jìn)行鑒定。共取40個(gè)單株，每份樣本20粒種子，脫殼切單胚。取上述材料的單胚分別加入至各試管中，吸取0.5ml溶液A(0.1％ Tween-20和1mmol/L亞油酸溶于0.2mol/L pH9.0的硼酸緩沖溶液)，室溫下放置10min后再分別各加入200μl溶液B(含15％(V/V)醋酸、15％(V/V)飽和碘化鉀的溶液)和溶液C(5％(V/V)淀粉)。48hr后觀察顏色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，泰國(guó)水稻品種DawDam單粒種胚在48hr后均為乳白色略偏黃。同時(shí)采用單克隆抗體技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，在Daw Dam所有單粒種胚中均未發(fā)現(xiàn)LOX-3特征條帶。由此證明上述乳白色略偏黃的顏色為L(zhǎng)OX-3缺失體的特征反應(yīng)，Daw Dam為L(zhǎng)OX-3缺失體。
實(shí)施例22000年秋季，對(duì)日本的粳稻品種秋光(Hinohikari)進(jìn)行鑒定，對(duì)照品種為泰國(guó)水稻品種Daw Dam。共取20個(gè)單株，每份樣本20粒種子，脫殼切單胚。取上述材料的單胚分別加入至各試管中，吸取1.5ml溶液A(0.12％ Tween-20和5mmol/L亞麻酸溶于0.2mol/L pH9.0的硼酸緩沖溶液)，室溫下放置10min后再分別各加入200μl溶液B(含10％(V/V)醋酸、5％(V/V)飽和碘化鉀的溶液)和溶液C(1.2％(V/V)淀粉)。48hr后觀察顏色并比色測(cè)定A410，以蒸餾水作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，泰國(guó)水稻品種Daw Dam在48hr后為乳白色略偏黃，粳稻品種秋光(Hinohikari)則顯橙紅色略帶紫，與Daw Dam A410的差異呈顯著水平，同時(shí)采用單克隆抗體技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，在秋光的所有單粒種胚中均發(fā)現(xiàn)LOX-3特征條帶，表明上述橙紅色略帶紫為L(zhǎng)OX-3的特征反應(yīng)，粳稻品種秋光(Hinohikari)不是LOX-3缺失體。
實(shí)施例32000年秋季，對(duì)日本的粳稻品種秋光(Hinohikari)進(jìn)行鑒定，對(duì)照品種為泰國(guó)水稻品種Daw Dam。共取30個(gè)單株，每份樣本20粒種子，脫殼切單胚。取上述材料的單胚分別加入至各試管中，吸取1.5ml溶液A(0.1％ Tween-20和5mmol/L亞油酸溶于0.2mol/L pH9.0的硼酸緩沖溶液)，室溫下放置10min后再分別各加入200μl溶液B(含10％(V/V)醋酸、5％(V/V)飽和碘化鉀的溶液)和溶液C(1％(V/V)淀粉)。36hr后觀察顏色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，泰國(guó)水稻品種Daw Dam在48hr后為乳白色略偏黃，粳稻品種秋光(Hinohikari)則顯橙紅色略帶紫，表明粳稻品種秋光(Hinohikari)不是LOX-3缺失體。
實(shí)施例42000年秋季，對(duì)日本的粳稻品種秋光(Hinohikari)進(jìn)行鑒定，對(duì)照品種為泰國(guó)水稻品種Daw Dam。共取25個(gè)單株，每份樣本20粒種子，脫殼切單胚。取上述材料的單胚分別加入至各試管中，吸取1.5ml溶液A(0.08％ Tween-20和3mmol/L亞麻酸溶于0.2mol/L pH9.0的硼酸緩沖溶液)，室溫下放置10min后再分別各加入200μl溶液B(含10％(V/V)醋酸、5％(V/V)飽和碘化鉀的溶液)和溶液C(1％(V/V)淀粉)。50hr后比色測(cè)定A410，以蒸餾水作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者A410差異呈顯著水平(P＜0.05)證明粳稻品種秋光(Hinohikari)不是LOX-3缺失體。
實(shí)施例52000年冬季，對(duì)國(guó)際水稻所的秈稻品種IR36進(jìn)行鑒定，對(duì)照品種為泰國(guó)水稻品種Daw Dam。共取20個(gè)單株，每份樣本30粒種子，脫殼切單胚。取上述材料的單胚分別加入至各試管中，吸取1ml溶液A(0.12％ Tween-20和1mmol/L亞油酸溶于0.3mol/L pH9.0的硼酸緩沖溶液)，室溫下放置10min后再分別各加入200μl溶液B(含20％(V/V)醋酸、25％(V/V)飽和碘化鉀的溶液)和溶液C(1％(V/V)淀粉)。40hr后觀察顏色。結(jié)果表明，泰國(guó)水稻品種DawDam在40hr后為乳白色略偏黃，IR36則顯橙紅色，表明IR36不是LOX-3缺失體。
實(shí)施例62000年冬季，對(duì)國(guó)際水稻所的秈稻品種IR36進(jìn)行鑒定，對(duì)照品種為泰國(guó)水稻品種Daw Dam。共取20個(gè)單株，每份樣本30粒種子，脫殼切單胚。取上述材料的單胚分別加入至各試管中，吸取1ml溶液A(0.12％ Tween-20和1mmol/L亞油酸溶于0.3mol/L pH9.0的硼酸緩沖溶液)，室溫下放置10min后再分別各加入200μl溶液B(含20％(V/V)醋酸、25％(V/V)飽和碘化鉀的溶液)和溶液C(1％(V/V)淀粉)。50hr后比色測(cè)定A410，以蒸餾水作為對(duì)照。結(jié)果表明，兩者A410差異呈極顯著水平(P＜0.01)，說(shuō)明IR36不是LOX-3缺失體。
實(shí)施例72000年冬季，對(duì)國(guó)際水稻所的秈稻品種IR36進(jìn)行鑒定，對(duì)照品種為泰國(guó)水稻品種Daw Dam。共取20個(gè)單株，每份樣本30粒種子，脫殼切單胚。取上述材料的單胚分別加入至各試管中，吸取1ml溶液A(0.12％ Tween-20和1mmol/L亞油酸溶于0.3mol/L pH9.0的硼酸緩沖溶液)，室溫下放置10min后再分別各加入200μl溶液B(含20％(V/V)醋酸、25％(V/V)飽和碘化鉀的溶液)和溶液C(1％(V/V)淀粉)。40hr后觀察顏色并比色測(cè)定A410，以蒸餾水作為對(duì)照。結(jié)果表明，泰國(guó)水稻品種Daw Dam在40hr后為乳白色略偏黃，IR36則顯橙紅色，兩者A410差異呈極顯著水平(P＜0.01)，表明IR36不是LOX-3缺失體。
實(shí)施例82000年秋季，對(duì)南鑒6678和南鑒8426進(jìn)行LOX-3缺失性的鑒定，以泰國(guó)水稻品種Daw Dam作為對(duì)照。共取10個(gè)單株，每份樣本30粒種子，脫殼切單胚。取上述材料的單胚分別加入至各試管中，吸取1.2ml溶液A(0.08％Tween-20和1mmol/L亞油酸溶于0.4mol/L pH9.0的硼酸緩沖溶液)，室溫下放置10min后再分別各加入200μl溶液B(含5％(V/V)醋酸、25％(V/V)飽和碘化鉀的溶液)和溶液C(1％(V/V)淀粉)。48hr后觀察顏色并比色測(cè)定A410，以蒸餾水作為對(duì)照。結(jié)果表明南鑒6678和南鑒8426是新的LOX-3缺失體。
實(shí)施例92000年秋季，對(duì)Daw Dam/IR-BB7和Daw Dam/信粳5號(hào)的F2分離群體進(jìn)行LOX-3缺失性的調(diào)查，以泰國(guó)水稻品種Daw Dam作為對(duì)照。共取200個(gè)單株，每份樣本10粒種子，脫殼切單胚。取上述材料的單胚分別加入至各試管中，吸取0.8ml溶液A(0.08％ Tween-20和1mmol/L亞油酸溶于0.4mol/L pH9.0的硼酸緩沖溶液)，室溫下放置10min后再分別各加入200μl溶液B(含12％(V/V)醋酸、10％(V/V)飽和碘化鉀的溶液)和溶液C(5％(V/V)淀粉)。40hr后觀察顏色并比色測(cè)定A410，以蒸餾水作為對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，，上述分離群體LOX-3活性的存在與否符合3∶1的比例，從而驗(yàn)證了LOX-3是由單隱性基因控制的結(jié)論。
實(shí)施例102000年冬季，對(duì)雜交稻品種汕優(yōu)63進(jìn)行鑒定，對(duì)照品種為泰國(guó)水稻品種Daw Dam。共取20個(gè)單株，每份樣本30粒種子，脫殼切單胚。取上述材料的單胚分別加入至各試管中，吸取1ml溶液A(0.12％ Tween-20和1mmol/L亞油酸溶于0.3mol/L pH9.0的硼酸緩沖溶液)，室溫下放置10min后再分別各加入200μl溶液B(含20％(V/V)醋酸、25％(V/V)飽和碘化鉀的溶液)和溶液C(1％(V/V)淀粉)。40hr后觀察顏色并比色測(cè)定A410，以蒸餾水作為對(duì)照。結(jié)果表明，泰國(guó)水稻品種Daw Dam在40hr后為乳白色略偏黃，汕優(yōu)63則顯橙紅色，兩者A410差異呈極顯著水平(P＜0.01)，表明汕優(yōu)63不是LOX-3缺失體。
權(quán)利要求
1.一種耐儲(chǔ)藏水稻的篩選方法，其步驟如下1)計(jì)量待測(cè)水稻和LOX-3缺失體材料(作為對(duì)照)的種子，切下種子單胚；2)取單胚分別放入試管中；3)在各試管中吸取0.5-1.5ml溶液A(含0.01-0.2％(V/V) Tween-20、0.5-5mmol/L亞油酸或亞麻酸、0.2-0.4mol/L pH8.2-9.0的硼酸緩沖液的溶液)，室溫下放置5-30min后，再分別加入50-400μl溶液B(含5-25％(V/V)醋酸、5-25％(V/V)飽和碘化鉀的溶液)和50-400μl溶液C(0.5-5％(W/V)淀粉)；4)4-50hr后觀察待測(cè)水稻種胚和已知LOX-3缺失體材料種胚的反應(yīng)顯色差別，含有正常LOX-3活性的單粒種胚的試管均呈略帶紫的橙紅色或紫紅色，LOX-3缺失的單粒種胚和已知LOX-3缺失體的顏色則呈淡乳白色略偏黃。
2.一種耐儲(chǔ)藏水稻的篩選方法，其步驟如下1)計(jì)量待測(cè)水稻和LOX-3缺失體材料(作為對(duì)照)的種子，切下種子單胚；2)取單胚分別放入試管中；3)在各試管中吸取0.5-1.5ml溶液A(含0.01-0.2％(V/V) Tween-20、0.5-5mmol/L亞油酸或亞麻酸、0.2-0.4mol/L pH8.2-9.0的硼酸緩沖液的溶液)，室溫下放置5-30min后，再分別加入50-400μl溶液B(含5-25％(V/V)醋酸、5-25％(V/V)飽和碘化鉀的溶液)和50-400μl溶液C(0.5-5％(W/V)淀粉)4)4-50hr后以蒸餾水作為對(duì)照，比色測(cè)定410nm吸光值(A410，下同)，計(jì)算待測(cè)水稻與LOX-3缺失體材料Daw Dam種胚的A410差異是否達(dá)到顯著或極顯著水平判斷待測(cè)水稻種胚LOX-3的缺失情況樣本與對(duì)照兩者A410差異呈顯著或極顯著水平，表明樣本不是LOX-3缺失體；反之，則是缺失體。
3.權(quán)利要求1或2所述的耐儲(chǔ)藏水稻的篩選方法，其特征在于在4-50hr后觀察待測(cè)水稻種胚和已知LOX-3缺失體材料種胚的反應(yīng)顯色差別的同時(shí)，以蒸餾水作為對(duì)照，比色測(cè)定A410，計(jì)算待測(cè)水稻與LOX-3缺失體材料種胚A410差異是否達(dá)到顯著或極顯著水平。根據(jù)色差與顯著水平結(jié)果，判斷待測(cè)水稻種胚LOX-3的缺失情況含有正常LOX-3活性的單粒種胚的試管均呈略帶紫的橙紅色或紫紅色，LOX-3缺失的單粒種胚的試管則呈淡乳白色略偏黃；樣本與對(duì)照兩者A410差異呈極顯著或顯著水平，表明樣本不是LOX-3缺失體；反之，則是缺失體。
全文摘要
本發(fā)明耐儲(chǔ)藏水稻的篩選方法,屬于生物技術(shù)育種與開(kāi)發(fā)領(lǐng)域。步驟如下:計(jì)量待測(cè)水稻和脂氧合酶－3(LOX－3)缺失體材料的種子,切單粒種胚;分別加入0.5—1.5ml溶液A(含Tween－20、亞油酸或亞麻酸、硼酸緩沖液)、50－400μ1溶液B(含醋酸、飽和碘化鉀)和50—400μ1溶液C(含淀粉);4—50hr后觀察顯色差別;或比色測(cè)定A
文檔編號(hào)A01H1/04GK1288655SQ00132248
公開(kāi)日2001年3月28日 申請(qǐng)日期2000年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月14日
發(fā)明者萬(wàn)建民, 沈文飚, 翟虎渠, 楊世湖, 江玲, 周彤, 俞偉偉 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)