專利名稱：魚(yú)病多聯(lián)單克隆抗體治療制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域近年隨著我國(guó)海水養(yǎng)殖漁業(yè)的迅猛發(fā)展，魚(yú)病特別是由細(xì)菌引起的魚(yú)病越來(lái)越嚴(yán)重，每年海水養(yǎng)殖魚(yú)因病而死亡達(dá)30～40％，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。對(duì)養(yǎng)殖魚(yú)病的防治，國(guó)內(nèi)外迄今還停留在主要采用化學(xué)藥物及抗生素的初始階段，化學(xué)藥物的大量應(yīng)用會(huì)帶來(lái)不良的作用，一是引起病菌的耐菌性而失效，二是造成對(duì)環(huán)境的污染；使用抗生素，也會(huì)通過(guò)食物鏈對(duì)人類造成不良的影響。魚(yú)病單克隆抗體治療制劑迄今未見(jiàn)報(bào)道。
本發(fā)明的目的利用生物技術(shù)，生產(chǎn)多種魚(yú)病病菌的單克隆抗體，對(duì)魚(yú)病有良好的預(yù)防和治療作用，同時(shí)不會(huì)污染環(huán)境，也不會(huì)通過(guò)食物鏈對(duì)人類造成危害。
本發(fā)明的技術(shù)方案將鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛(ài)德華菌菌株(均由青島海洋大學(xué)提供)，進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，再將培養(yǎng)后的菌液腹腔注射免疫小鼠Ba／b／c小鼠，取免疫后小鼠脾細(xì)胞和SP2／0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，將細(xì)胞融合的細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)，用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(ELISA法)檢測(cè)陽(yáng)性克隆，將確定為陽(yáng)性的孔以有限稀釋法，進(jìn)行克隆化，再將陽(yáng)性克隆的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠制備出腹水型單抗，將以上腹水型單抗以ELISA法進(jìn)行效價(jià)，亞類及交叉試驗(yàn)，挑選效價(jià)較高的單克隆抗體，分別和致死量的病菌混合(1∶1～1∶2比例)，然后以腹腔注射感染海魚(yú)，對(duì)照組以生理鹽水取代單抗，觀察單抗對(duì)海魚(yú)的免疫保護(hù)率，結(jié)果顯示，抗鰻弧菌單抗中有3株單抗4A6、3B2、4E12，它們對(duì)海魚(yú)的保護(hù)率分別為80％、60％、50％；抗創(chuàng)傷弧菌單抗中有2株單抗1A1、3E9，它們對(duì)海魚(yú)的保護(hù)率分別為87％和89％；抗遲緩愛(ài)德華菌單抗中有兩株單抗3F7和1B4，它們對(duì)海魚(yú)的保護(hù)率分別為80％和60％。挑選出保護(hù)率較高的單抗按一定比例配制成魚(yú)病多聯(lián)單抗治療制劑。
具體實(shí)施例方式(一)材料1．菌種鰻弧菌、外傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株由青島海洋大學(xué)生命學(xué)院提供。以上菌種用作免疫原產(chǎn)生單克隆抗體。
溶藻弧菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、河弧菌、弗尼斯弧菌、霍利斯弧菌、擬態(tài)弧菌、少女弧菌、麥?zhǔn)匣【臉?biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自北京生物制品公司。腸毒性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌、腸出血性大腸桿菌、志賀氏菌屬的福氏志賀氏菌、絕氏志賀氏菌、痢疾志賀氏菌、宋氏志賀氏菌，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所。以上菌種用作單克隆抗體交叉試驗(yàn)。
2．細(xì)胞胞SP2／0小鼠骨髓瘤細(xì)胞株，由第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程研究中心惠贈(zèng)。
(二)實(shí)驗(yàn)方法1．免疫原細(xì)菌的制備及滅活鰻弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、遲緩愛(ài)德華氏菌以平板劃線培養(yǎng)于細(xì)菌培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜，無(wú)菌生理鹽水洗脫菌苔，3000rpm離心20分鐘，棄上清，加入1％的甲醛固定過(guò)夜。3000rpm離心20分鐘，棄上清，加無(wú)菌生理鹽水，比濁記數(shù)后，4℃冰箱保存，以備用作免疫原菌液。
2．Ba／b／c小鼠的免疫8周齡的Ba／b／c雌性小鼠10只，將以上滅活的細(xì)菌菌液(1×108個(gè)／ml)以0．5ml／只的量，腹腔注射免疫小鼠，于第一次免疫后第7、14、28天分別追加免疫，第31天取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
3．細(xì)胞融合(1)免疫脾細(xì)胞的制備①取免疫小鼠脾臟，放入盛有5ml不完全培養(yǎng)液的平皿中，置于200目的不銹鋼銅網(wǎng)上。用注射器內(nèi)芯研磨脾臟，并用平皿內(nèi)不完全培養(yǎng)液輕輕沖洗鋼網(wǎng)，使脾細(xì)胞全部通過(guò)網(wǎng)孔擠壓到溶液中。
②將脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加不完全培養(yǎng)液至30ml，混勻，1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③用不完全培養(yǎng)液將沉淀細(xì)胞再離心洗滌一次(重復(fù)步驟②)，將細(xì)胞垂懸至10ml，混勻，用細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)。
(2)SP2／0骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備①將4瓶擴(kuò)增培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞收集到50ml離心管內(nèi)。
②1000rpm離心5分鐘，棄去上清。
③再加入30ml不完全培養(yǎng)液，重復(fù)步驟②再離心洗滌一次，然后將細(xì)胞垂懸至10ml，混勻，記數(shù)。
(3)細(xì)胞融合①分別吸取含1×108個(gè)脾細(xì)胞和懸液和含2-3×107個(gè)骨髓瘤細(xì)胞的懸液，加入一支50ml離心管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)液至30ml，充分混勻。
②1000rpm離心7分鐘，棄去上清。
③加50％的融合劑PEG 0．7ml。
④加入25ml不完全培養(yǎng)液，使PEG稀釋而失去促融作用。
⑤800rpm離心7分鐘，棄去上清。
⑥加入20ml HAT培養(yǎng)液，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其垂懸并混勻。
⑦將細(xì)胞懸液加入輔有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔0．1ml，在37℃含5％CO2的孵箱中培養(yǎng)。
4．抗體檢測(cè)--間接ELISA法(1)用已知抗原滅活菌液包被。
(2)加有克隆長(zhǎng)生的孔中的培養(yǎng)上清100μl。
(3)加酶標(biāo)單抗鼠IgG抗體100μl。
(4)加底物液100μl，室溫避光顯色10～20分鐘。
(5)判定結(jié)果在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀492nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，空白對(duì)照調(diào)零，若待測(cè)孔OD值大于或等于陰性對(duì)照孔2．1倍，即為陽(yáng)性克隆。
5．克隆化--有限稀釋法將96孔板中待做克隆化的雜交瘤細(xì)胞用加樣器反復(fù)吹打均勻后記數(shù)，然后采取有限稀釋法進(jìn)行逐級(jí)稀釋，加到96孔板進(jìn)行培養(yǎng)。觀察克隆生長(zhǎng)，記錄單克隆孔，并及時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)。將陽(yáng)性單克隆的細(xì)胞轉(zhuǎn)到24孔板培養(yǎng)，待其增殖到一定數(shù)量后再轉(zhuǎn)入細(xì)胞瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)。
6．雜交瘤細(xì)胞的凍存將成對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞收集入離心管，1000rpm離心10分鐘，棄上清，加入1ml凍存液混勻，然后加到凍存管，在-70℃代溫冰箱過(guò)夜后移入液氮罐長(zhǎng)期保存。
7．腹水型單克隆抗體制備將培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞吹打下來(lái)，1000rpm離心10分鐘，收集上清作亞型試驗(yàn)，加無(wú)血清培養(yǎng)液到沉淀的細(xì)胞中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)／ml。每只Ba／b／c小鼠注射0．5ml，接種雜交瘤細(xì)胞后7～14天，拉頸脫臼處死小鼠，吸取腹水，離心，收集上清，分裝后-20℃凍存?zhèn)溆谩?br> 8．單克隆抗體的鑒定抗鰻弧菌單抗篩選到8株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的陽(yáng)性細(xì)胞株，分別命名為2H2、3B2、3D2、3A3、3C4、4A6、4E3和4E12。經(jīng)亞類鑒定其中2H2、3D2、3B2和4E12為IgG3；4E3為IgG2a；3A3、3C4、4A6為IgG1。經(jīng)效價(jià)測(cè)定，這些單抗效價(jià)為1×10-5～1×10-7。
抗創(chuàng)傷弧菌單抗篩選到12株能穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞株，命名為1B12、3E9、3F11、3E3、2G8、3D5、1E11、3H4、2F1、1A1、2F6和1G1。經(jīng)亞類鑒定，其中2F6為IgG3、1B12、3E3、3H4、1A1為IgG2a；2G8、3D5、2F1為IgG1。經(jīng)效價(jià)測(cè)定，以上單抗的效價(jià)為1×10-5～1×10-7。
抗溶藻弧菌單抗篩選到8株能穩(wěn)定分泌單抗的雜交瘤細(xì)胞中，命名為2E3、2E4、2G2、2G8、2D11、3A10、3B12和4C7。經(jīng)亞類鑒定，其中2E3為IgG3，2G2、2D11、3A10為IgG2a；2E4、3B12為IgG2b；2G8、4C7為IgG1。經(jīng)效價(jià)鑒定，以上單抗的效價(jià)為1×10-6～1×10-7。
抗遲緩愛(ài)德華菌單抗篩選到10株單抗雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1B4、4D3、4D5、3F7、5A11、5H5、6B11、6E1、6E6和6H3。經(jīng)亞類鑒定，其中1B4、3F7、5A11、5H5、6B11為IgG1，6E1為IgG2b；4D3、4D5、6E6、6H3為IgG3。經(jīng)效價(jià)測(cè)定，以上單抗的效價(jià)為1×10-6～1×10-7。
9．對(duì)海魚(yú)的免疫保護(hù)試驗(yàn)(1)將菌液(5LD50)與腹水型單克隆抗體1∶1(體積比混合，以0．1ml／條的量腹腔注射牙鲆，每條注射抗體量為100μg／條。對(duì)照組為同樣的菌液與生理鹽水1∶1混合，觀察5天內(nèi)牙鲆的存活率。保護(hù)率計(jì)算公式保護(hù)率(％)=(實(shí)驗(yàn)組存活率-對(duì)照組存活率)／對(duì)照組存活率×100％(2)結(jié)果經(jīng)單克隆抗體對(duì)海魚(yú)病治療保護(hù)試驗(yàn)，從四種病菌的單克隆抗體中，分別篩選到了對(duì)海魚(yú)有較好保護(hù)率的單抗。
抗鰻弧菌單克隆抗體中篩選到3株單抗4A6、3B2、4E12，它們對(duì)海魚(yú)的治療免疫保護(hù)率分為80％、60％、50％。
抗創(chuàng)傷弧菌單克隆抗體中篩選到2株單抗1A1、3E9，它們對(duì)海魚(yú)的保護(hù)率分別為87％和89％。
抗遲緩愛(ài)德華菌單抗中篩選到2株單抗3F7和1B4，它們對(duì)海魚(yú)的保護(hù)率分別為80％和60％。
抗溶藻弧菌單抗中未篩選到對(duì)海魚(yú)有保護(hù)作用的單抗，但篩選到一株2D11對(duì)乳鼠有很好保護(hù)作用，其保護(hù)率達(dá)90％。
10．制備成品將抗鰻弧菌單抗中的4A6，抗創(chuàng)傷弧菌單抗中的3E9，抗遲緩愛(ài)德華菌單抗中的3F7單抗以1∶1∶5的比例混和，制成魚(yú)病多聯(lián)單抗治療制劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明魚(yú)病多聯(lián)單克隆抗體治療制劑對(duì)海魚(yú)保護(hù)率達(dá)80％以上，治療效果好，不會(huì)污染環(huán)境，對(duì)人類不會(huì)造成損害，且所制備的含有海魚(yú)病特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株可通過(guò)生物效應(yīng)器無(wú)限擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)特異性單抗工業(yè)化大生產(chǎn)，具有很高的社會(huì)與經(jīng)濟(jì)效益。
權(quán)利要求
1．魚(yú)病多聯(lián)單克隆抗體治療制劑，其特征是將鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛(ài)德華菌進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，再將培養(yǎng)后的菌液腹腔注射免疫小鼠Ba／b／c，取免疫后小鼠脾細(xì)胞和SP2／0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，將細(xì)胞融合的細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)，用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法(ELISA法)檢測(cè)陽(yáng)性克隆，將確定為陽(yáng)性的孔以有限稀釋法，進(jìn)行克隆化，再將陽(yáng)性克隆的雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)增培養(yǎng)，腹腔注射接種到Ba／b／c小鼠制備出腹水型單抗；將以上腹水型單抗以ELISA法進(jìn)行效價(jià)，亞類及交叉試驗(yàn)，挑選效價(jià)較高的單克隆抗體；分別和致死量的病菌混合(1∶1～1∶2比例)，然后以腹腔注射感染海魚(yú)，對(duì)海魚(yú)進(jìn)行保護(hù)試驗(yàn)，挑選對(duì)海魚(yú)有較高保護(hù)率的單抗，按一定比例配制成魚(yú)病多聯(lián)單克隆抗體治療制劑。
全文摘要
魚(yú)病多聯(lián)單克隆抗體治療制劑,涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將鰻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、遲緩愛(ài)德華菌免疫小鼠,進(jìn)行細(xì)胞融合,再克隆化,制備出特異性很強(qiáng),且效價(jià)較高的單抗,再將以上單抗篩選出對(duì)魚(yú)類有較高保護(hù)率的抗病菌單抗,按一定比例配制成魚(yú)病多聯(lián)單抗治療制劑。該生物制劑對(duì)魚(yú)病有良好的預(yù)防和治療作用,同時(shí)不會(huì)污染環(huán)境,也不會(huì)通過(guò)食物鏈對(duì)人類造成危害。
文檔編號(hào)A01K61/00GK1292993SQ0011392
公開(kāi)日2001年5月2日 申請(qǐng)日期2000年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月20日
發(fā)明者黃威權(quán), 夏永娟, 李元, 李別虎, 金曉航, 張榮慶 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)