一種黃胸鼠pcr鑒定引物及鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物檢測鑒定技術(shù)，具體地說涉及對黃胸鼠的PCR鑒定引物及使用該引物鑒定黃胸鼠的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鼠類是鼠疫、流行性出血熱、鉤端螺旋體病等多種病原體的儲(chǔ)存宿主，對人類的生產(chǎn)、生活和健康構(gòu)成嚴(yán)重的威脅。某些病原體對宿主有一定的專一性，不同種鼠種對流行病學(xué)具有不同意義。城市內(nèi)的老鼠則以黃胸鼠、褐家鼠和小家鼠等家棲鼠為主【1】。其中，黃胸鼠是目前大多數(shù)城市里的優(yōu)勢鼠種，它活躍于各飲食飯店、賓館食堂、食品加工廠及居民小區(qū)，是衛(wèi)生城市、文明城市創(chuàng)建除四害中主要禍?zhǔn)?。此外，黃胸鼠抗藥性強(qiáng)，容易對抗凝血滅鼠劑的產(chǎn)生抗藥性【2】，因此對黃胸鼠的治理變得越來越困難。因此，能夠快速鑒定黃胸鼠，可以有的放失的采取措施，進(jìn)行有效的防治，以達(dá)到事半功倍的滅鼠效果。
[0003]目前，鼠種的鑒定依然僅限于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法。這種方法不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且在某些方面具有很大的局限性，如:黃胸鼠，褐家鼠及其幼鼠時(shí)期形態(tài)非常接近，僅靠形態(tài)學(xué)個(gè)體常無法給出確切的結(jié)論。
[0004]利用PCR的基因擴(kuò)增法已被廣泛利用于各個(gè)領(lǐng)域。PCR法是以極微量的DNA為摸板，短時(shí)間內(nèi)將目的DNA區(qū)域擴(kuò)增至數(shù)十萬倍的方法，因其精度高而廣泛被利用于醫(yī)學(xué)和微生物領(lǐng)域。VKORCl (維生素環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位I)是一個(gè)與維生素K相關(guān)的基因【3】，雖然人類VKORCl基因多態(tài)性研究報(bào)道比較多【4】，而對鼠類VKORCl基因的研究國內(nèi)外鮮有報(bào)道【5'6】。而且鼠類VKOCRl基因序列比較保守，在鼠分類上具有重要的參考價(jià)值。
[0005]參考文獻(xiàn):
[0006][I]章士軍，王智泉，陳郁，等.南通市區(qū)鼠夾法和鼠籠法捕鼠情況的分析[J].中華衛(wèi)生殺蟲藥械，2013，19 (2):152-154.
[0007][2]王智泉，章士軍，陳郁，等.南通市黃胸鼠對殺鼠靈的抗藥性研究[J].中華衛(wèi)生殺蟲藥械，2014，20 (3): 223-225.
[0008][3]王智泉，李海波，章士軍，等.南通市家棲鼠VKORCl基因與其抗藥性的相關(guān)研究[J].中華衛(wèi)生殺蟲藥械，2014，20 (I):23-25.
[0009][4]賀寶霞，石磊，趙樹進(jìn).CYP2C9和VKORCl基因多態(tài)性與warfarin個(gè)體化用藥研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué).2008，29 (4) 684-686.
[0010][5] Tanaka K.D., Kawai Y.K., Ikenaka Y., et al.“A novel mutat1n inVKORCland its effect on enzymatic activity in Japanese warfarin-resistantrats [J].J.Vet.Med.Sc1.，2013，5 (2): 135-139.
[0011][6] Rost S., Pelz H.J., Menzel S., et al.“Novel mutat1ns in theVKORClgene of wild rats and mice - a response to 50years of select1n pressureby warfarin”.BMC Genetics, 2009, 10:4.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明提供了一種黃胸鼠PCR鑒定引物及鑒定方法，以達(dá)到能夠針對難以從形態(tài)上進(jìn)行判斷的鼠類進(jìn)行簡單而且準(zhǔn)確的黃胸鼠鑒定的目的。該方法穩(wěn)定、高效而且成本低。
[0013]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0014]本發(fā)明提供了一種黃胸鼠PCR鑒定引物，其特征在于，其核苷酸序列分別為:
[0015]上游引物為:5’-CCTCGCACCAACTCCTGAA-3’ ；
[0016]下游引物為:5’ -TGGCTACCTAAACCTAAAGCAACT-3 ’。
[0017]本發(fā)明還提供了一種使用上述黃胸鼠PCR鑒定引物鑒定黃胸鼠的方法，包括以下步驟:
[0018]I)提取待鑒定物的總DNA ；
[0019]2)以步驟I)中提取到的總DNA為模板，利用上述黃胸鼠PCR鑒定引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0020]3)使用瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟2)中產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，以鑒定黃胸鼠。上述PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果在503bp出現(xiàn)特異性擴(kuò)增條帶，則為黃胸鼠的陽性判定結(jié)果。
[0021]本發(fā)明提供的技術(shù)方案達(dá)到了如下的有益效果:1)使用比較保守的鼠類VDORCl基因序列設(shè)計(jì)了 PCR引物，其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物特異于黃胸鼠鼠種，可以將黃胸鼠與其他鼠種區(qū)別開來；2)使用該引物的PCR鑒定方法可以針對難以從形態(tài)上進(jìn)行判斷的鼠類進(jìn)行黃胸鼠鑒定；3)該實(shí)驗(yàn)方法所需樣本量少，標(biāo)本采集容易實(shí)現(xiàn)，且方法操作簡單，結(jié)果穩(wěn)定而準(zhǔn)確，而且成本低。
【附圖說明】
[0022]圖1是不同鼠種PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果特異性結(jié)果。
[0023]圖2是分子標(biāo)記物DL2000的片段分子量對照表。
[0024]圖中，1、2.黃胸鼠；3、4.褐家鼠；5、6.大白鼠；7.白腹巨鼠；8.黑線姬鼠；9.DL2000
【具體實(shí)施方式】
[0025]為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步的介紹。
[0026]一、根據(jù)VKORCl基因序列，通過trnL序列設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)了黃胸鼠PCR鑒別引物，其核苷酸序列為:
[0027]上游引物為:5’-CCTCGCACCAACTCCTGAA-3’ ；
[0028]下游引物為:5’ -TGGCTACCTAAACCTAAAGCAACT-3 ’。
[0029]二、鼠尾DNA提取方法(柱式離心管法，捷瑞基因組提取試劑盒)
[0030]1、在液氮中將0.5?Icm的鼠尾部末端組織研磨成粉末，并轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中。
[0031]2、然后加入400 μ I裂解液和10 μ I的Proteinase K(蛋白酶).
[0032]3、震蕩混勻I分鐘，然后置于55°C水浴I?3小時(shí)，在此期間可以適當(dāng)取出混勻，
有助于充分裂解。
[0033]4、取出樣品，待降至室溫時(shí)輕輕震蕩混勻。
[0034]5、在經(jīng)過預(yù)處理好的樣品中，加入600ul提取液，用力搖勻，然后12，OOOrpm離心5
分鐘。溶液將分層，上層為水相層，下層為有機(jī)溶劑層，兩層溶液中間可能會(huì)有部分沉淀層，DNA在上層水相中。
[0035]6、用滅菌的槍頭將上層水相溶液仔細(xì)吸出到離心柱中，盡量避免吸到中間層的沉淀。
[0036]7、8，OOOrpm離心I分鐘，取下離心柱，倒掉收集管中廢液。
[0037]8、將離心柱放回收集管中，加入500 μ I Wash Solut1n(清洗液)，8，OOOrpm，室溫離心I分鐘。
[0038]9、重復(fù)步驟8 —次。
[0039]10、取下離心柱，棄去收集管中的廢液。將柱放回收集管中，12，OOOrpm，室溫離心I分鐘，以除去殘留Wash Solut1n(清洗液)。
[0040]11、將離心柱放入新的潔凈1.5ml