一種棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌的pcr檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術和生物醫(yī)學領域，特別涉及一種棘腹蛙的金黃色葡萄球 菌的PCR檢測試劑及檢測方法，適用于感染金黃色葡萄球菌的棘腹蛙的檢測。
【背景技術】
[0002] 棘腹蛙是一種營養(yǎng)豐富且具藥用價值的大型山區(qū)食用蛙，其鮮肉干樣中蛋白質(zhì)含 量為16. 25%、脂肪含量為1.26%，具有豐富的滋補功效和藥用價值，隨著人民生活水平的 不斷提高，棘腹蛙的食用價值也在逐漸上升，具有較好的開發(fā)前景。同時作為脊椎動物進化 中的過渡動物，是進行解剖學、遺傳學和胚胎發(fā)育學研究較為理想的實驗動物。由于環(huán)境 污染嚴重、野生棲息地遭受破壞、人類大肆捕殺等因素造成棘腹蛙野生種群數(shù)量大量減少； 為保護其野生資源，同時滿足市場需求，棘腹蛙的人工養(yǎng)殖逐漸受到重視。但是，隨著養(yǎng)殖 數(shù)量的不斷增多，隨之而來的多種病害對棘腹蛙養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生嚴重威脅。感染蛙類 的病原菌主要有溫和氣單胞菌、嗜水氣單胞菌、鏈球菌等，可見棘腹蛙細菌性疾病是人工養(yǎng) 殖過程中常見且危害極大的一類疾病，對細菌性疾病的研究也是棘腹蛙人工養(yǎng)殖的一個重 點。目前還沒有過棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌的報道。
[0003] 葡萄球菌根據(jù)生化反應和產(chǎn)生色素的不同可分為金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌 和腐生葡萄球菌三種，其中金黃色葡萄球菌致病力較強，是動物化膿感染中最常見的病原 菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥、膿毒癥等全 身感染。從而給動物水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來了巨大傷害。近年來，雖然中國特種經(jīng)濟動物養(yǎng)殖業(yè)得 到了迅猛發(fā)展，但由于養(yǎng)殖戶的管理水平、養(yǎng)殖場的硬件和軟件設施不能進行規(guī)范化管理 等原因，已經(jīng)有多起由該菌引起的人畜感染的報道，且已日益被關注。為了及早發(fā)現(xiàn)棘腹蛙 是否被金黃色葡萄球菌感染，有必要建立一種快速、準確、靈敏的檢測方法。
[0004] 傳統(tǒng)病原菌的診斷需要進行顯微鏡觀察，缺乏進行快速、準確、敏感的檢測方法。
[0005] CN104726594A公開了一種檢測金黃色葡萄球菌的檢測試劑盒，采用的引物有：
[0006] 上游引物：5 ' -AACAAGATCGCTATGGTAGAACATTGGC-3 ' nuc
[0007] 下游引物：5' -CTTCTCTCTAGCAAGTCCCTTTTCCACTA-3' hlyA
[0008] 上游引物：5' -AAAAGCAAGTTAGCTCATTTCACATCGT-3' hlyA
[0009] 下游引物：5' -TTACCGTTCTCCACCATTCCCAAG-3' invA
[0010] 上游引物：5' -CAATCAGTCCTAACGACGACCCTTC-3' invA
[0011] 下游引物：5 ' -GCCGCCAAACCTAAAACCAGC-3 ' tIh
[0012] 上游引物：5 ' -CGAACGAGAACGCAGACATTACG-3 ' tIh
[0013] 下游引物：5' -CGGGTTAGGGAAGCGCCATT-3' ipaH
[0014] 上游引物：5' -GGTAAATCTGCTGTTCAGTCTCACGC-3' ipaH 下游引物：5' -TTTACGGACTG GTTCTCCCTCTGG-3'。
[0015] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)采用上述引物的PCR試劑盒檢測棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌不敏感， 缺乏特異性。為此有必要尋找一種操作簡單、特異、快速、敏感等優(yōu)點的檢測棘腹蛙感染金 黃色葡萄球菌的PCR檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 本發(fā)明提供了一種檢測棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌的PCR檢測試劑盒及其檢測 方法。該檢測試劑盒及檢測方法能快速、高效、特異性的用于棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌的 檢測。
[0017] 本發(fā)明的一種檢測棘腹蛙的金黃色葡萄球菌的PCR檢測試劑盒，包含2倍反應混 合緩沖液、上游引物、下游引物、Taq酶和滅菌的ddH20,其特征在于所述上游引物為S-F : 5 ' - AGGTAACGGCGTAAATAG - 3 '，所述下游引物 S-R : 5 ' - ACTTGCTTCAGGACCATA - 3 '。
[0018] 上述本發(fā)明的檢測試劑盒，所述2倍反應混合緩沖液包含以下成份：
[0020] 所述2倍反應混合緩沖液的量為1.0 ml。
[0021] 上述本發(fā)明的檢測試劑盒，所述上游引物和下游引物的濃度均為10 yM/L;所述 Taq酶為5U/ μ L Taq酶，其量為0· 5 μ L ;所述滅菌的CldH2O為1.0 mL。
[0022] 上述本發(fā)明的檢測試劑盒，還包含陽性對照液和陰性對照液，所述陽性對照液為 感染金黃色葡萄球菌的棘腹蛙的基因組DNA，所述陰性對照液為ddH20。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種采用本發(fā)明的檢測試劑盒檢棘腹蛙感染金黃色葡萄球菌的 方法，包含以下步驟：
[0024] (1)棘腹蛙DNA的提?。?br>[0025] ①取病蛙眼、口腔或胃部組織，剪碎后置于勻漿器中，加入勻漿液后冰浴研磨，研 磨碎裂后置離心管中；
[0026] ②加入1 % -3%的β -巰基乙醇溶液，混勻后60_70°C水浴0. 5-lh，每隔3-5分鐘 取出搖勻一次；
[0027] ③10000-15000rpm離心3_7min，離心后，移出上清液于另一無菌離心管中，棄沉 淀；
[0028] ④向上清液中加入等體積的按體積比20-30 :1的氯仿：異戊醇的混合溶劑，混勻 后，8000_12000rpm離心5_15min，取上清液至另一無菌離心管中；
[0029] ⑤加入等體積的氯仿，混勾后8000-12000rpm離心5-15min，再取上清液；
[0030] ⑥向上清液中加入0. 8-1. 2倍體積的2-4M NaAc溶液，混勻后再加入1. 5-2. 5倍 體積預冷的無水乙醇，充分混勻后于-18°C以下放置30min以上；
[0031] ⑦10000-15000rpm離心3_7min，棄上清液，所得DNA沉淀在室溫下瞭干；
[0032] ⑧用70-80 %的乙醇對DNA沉淀進行洗滌，干燥后沉淀溶于TE中，加 RNase A，37°C 消化20-40min，得到棘腹蛙DNA之后于-20°C保存；
[0033] (2) PCR反應體系：采用20 yL的PCR反應體系，在0. 2mL PCR反應管內(nèi)分別加入2 倍反應混合緩沖液10 μ L，上游引物、下游引物各0. 5 μ L，5U/ μ L Taq DNA聚合酶0. 5 μ L， DNA模板I. 0 μ L，用滅菌超純水加至總體積20 μ L，同時分別用陽性對照液和陰性對照液作 為模板，設置陽性和陰性對照組，混合均勻后離心數(shù)秒，置于PCR反應儀上反應；
[0034] (3) PCR反應條件：95°C預變性5分鐘；然后95°C變性30秒，56°C退火30秒，72°C 延伸30秒，共循環(huán)30次；72°C延伸7分鐘，最后4°C保存；
[0035] (4)PCR擴增產(chǎn)物的檢測：PCR反應結束后，取10 μ L反應產(chǎn)物放在含溴化乙錠 0. 5 μ g/mL的1 %瓊脂糖凝膠上，使用0. 5 X TAE緩沖液進行電泳，在紫外透射儀下觀察PCR 產(chǎn)物，檢查PCR產(chǎn)物的預期大??；
[0036] (5)結果與判定：在紫外燈下觀察并與標準分子量相對照，若檢測樣品在226bp處 出現(xiàn)明亮的條帶，而陰性對照沒有目的條帶，則為金黃色葡萄球菌陽性；若陽性對照可見目 的條帶，而檢測樣品無目的條帶出現(xiàn)，則為陰性，沒有或不是所要檢測的目的金黃色葡萄球 菌。
[0037] 在一具體實施方案中，一種檢測棘腹蛙的金黃色葡萄球菌的PCR檢測試劑盒，包 括：
[0038] (1)2倍反應混合緩沖液1.0 mL，包含以下成分：
[0041] (2)檢測引物的設計合成：根據(jù)GenBank中發(fā)布的棘腹蛙的基因序列，設計一 對特異性檢測引物，上游引物S-F : 5 ' -AGGTAACGGCGTAAATAG - 3 '，下游引物S-R : 5 ' - ACTTGCTTCAGGACCATA - 3'，濃度為 10 μ M ;
[0042] (3) Taq 酶 5U/ μ L ;
[0043] (4)滅菌的 ddH20 1.0 mT,；
[0044] (5)陽性對照液：感染金黃色葡萄球菌的棘腹蛙的基因組DNA ;
[0045] (6)陰性對照液：CldH2O。
[0046] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的檢測棘腹蛙的金黃色葡萄球菌的PCR檢測試劑盒及其 檢測方法具有以下特點及優(yōu)點：
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