一種利用熒光pcr技術(shù)對(duì)小鼠的分型鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于小鼠分型鑒定方法領(lǐng)域，特別涉及一種利用熒光PCR技術(shù)對(duì)小鼠的分 型鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因打靶技術(shù)自誕生以來一直是研究基因功能的重要手段之一，揭示了許多重要 基因的生物學(xué)功能。除此之外，研究人員也憧憬能利用基因打靶技術(shù)對(duì)特定基因進(jìn)行敲除 或者修飾，從而達(dá)到治療疾病或者改善畜禽生產(chǎn)性狀的目的。但早期基因打靶技術(shù)效率極 低，難以真正應(yīng)用到醫(yī)療或者畜禽改良實(shí)踐中。CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種新興的基因定點(diǎn) 編輯技術(shù)逐漸成熟并在多個(gè)動(dòng)植物物種中成功得到應(yīng)用，極大地促進(jìn)了基因功能的研究。 CRISPR/Cas系統(tǒng)廣泛分布于細(xì)菌和古生菌基因組中，是在進(jìn)化過程中形成的一種適應(yīng)性 免疫系統(tǒng)，可以降解入侵病毒或質(zhì)粒DNA。
[0003] CRISPR/Cas系統(tǒng)的出現(xiàn)為基因工程提供了一個(gè)強(qiáng)有力的應(yīng)用新工具，它將給基 因組定向編輯的研究和應(yīng)用領(lǐng)域帶來突破性的技術(shù)革命，特別是在基因功能解析、人類疾 病靶向治療等應(yīng)用中有巨大的潛力和廣闊的前景；有望加速重要農(nóng)作物水稻、小麥性狀改 良與分子定向育種。更令人鼓舞的是，其操作簡單、實(shí)驗(yàn)周期短、節(jié)約成本，有利于在普通 實(shí)驗(yàn)室推廣這一技術(shù)，因此，CRISPR/Cas系統(tǒng)的廣泛應(yīng)用將對(duì)生物學(xué)研究產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影 響。利用CriSpr/CaS9技術(shù)的基因敲除小鼠也越來越多，傳統(tǒng)的對(duì)敲除小鼠進(jìn)行的分型的 方法是通過T7E1酶切來鑒定。這種方法首先通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出大量的需要鑒定位點(diǎn)的 模板，再通過一個(gè)退火的過程會(huì)在雜合鏈上形成一個(gè)缺口，最后使用T7E1酶切并觀察瓊脂 糖電泳PCR產(chǎn)物條帶來鑒定小鼠的基因型。然而，這種方法過于繁瑣，需要經(jīng)過一段時(shí)間退 火才可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)；使用酶切方法，如果酶切的效率低也會(huì)產(chǎn)生假陰性的結(jié)果；使 用瓊脂糖電泳，分辨率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種利用熒光PCR技術(shù)對(duì)小鼠的分型鑒定方 法，經(jīng)過PCR擴(kuò)增后通過產(chǎn)物大小及峰圖直觀分辨小鼠類型。
[0005] 本發(fā)明的一種利用熒光PCR技術(shù)對(duì)小鼠的分型鑒定方法，包括：
[0006] ⑴小鼠飼養(yǎng)和樣本采集：
[0007] SPF級(jí)C57BL/6J小鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），SPF級(jí)利用Crispr/Cas9 系統(tǒng)敲除mircoRNA的C57BL/6J小鼠（中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心構(gòu)建），得到的小鼠為Founder 小鼠；
[0008] 將2只Founder小鼠與C57BL/6J小鼠雜交，得到Fl代小鼠，F(xiàn)l代雜合小鼠得到 F2代；
[0009] (2) DNA抽?。喝∩鲜鯢l代小鼠 Icm尾組織（一20°C保存?zhèn)溆茫?，然后提取DNA ;
[0010] 采用動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒（生工生物工程有限公司），按照說明書進(jìn)行抽提 得到DNA，以0. 8%瓊脂糖凝膠電泳確定DNA質(zhì)量和濃度；
[0011] ⑶引物設(shè)計(jì)：
[0012] 在Crispr/Cas9系統(tǒng)敲除的基因位點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物（根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫 中 C57BL/6J小鼠的 microRNA 的序列，使用 Primer3 在線軟件（http://frodo. wi. mit. edu/ primerf/)進(jìn)行初步引物設(shè)計(jì)，再利用〇lig〇6人工設(shè)計(jì)，然后合成（上海生工生物工程技術(shù) 服務(wù)有限公司）），且在上游引物的5'端使用FAM熒光修飾，得到熒光引物；
[0013] (4)熒光PCR技術(shù)鑒定：
[0014] 將熒光引物對(duì)步驟（2)中的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增（對(duì)Fl和F2代DNA進(jìn)行相同條件 的擴(kuò)增），然后將PCR產(chǎn)物與分子內(nèi)標(biāo)（攜帶ROX的已知片段大小的DNA)混合，在測(cè)序儀上 經(jīng)過電泳分離，通過使用分子量內(nèi)標(biāo)法，進(jìn)行鑒定。
[0015] 其中鑒定過程中使用Genemapper軟件計(jì)算出PCR產(chǎn)物大小，從而達(dá)到鑒定小鼠基 因型的目的。
[0016] 所述步驟（1)中 mircoRNA 為 mircoRNA505。
[0017] 所述步驟（3)中引物為：L :AAACCAGCAAGTGTTGACGC ;R :CCCTGTTTGTCACTTGCAGA。
[0018] 所述步驟⑶中FAM為6' FAM。
[0019] 所述步驟⑷中PCR擴(kuò)增具體為：3 μ LDNA加入到Taq酶體系中，其中Taq酶體 系包含 1.5yL200nM 上下游引物、1.5yL 0.25mM 的 dNTP，5yL 10XPCR Buffer，lyl^9l 單位Taq酶，并使用礦物油覆蓋；同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，反應(yīng)程序?yàn)椋?5°C變性5min ;94°C變性 30s，56°C復(fù)性 lmin30s，72°C延伸 lmin，35 個(gè)循環(huán)，72°C，lOmin。
[0020] 所述步驟⑷中在測(cè)序儀上經(jīng)過電泳分離為：在377測(cè)序儀上經(jīng)過聚丙烯酰胺凝 膠電泳分離，其中測(cè)試儀功率為30W，分離時(shí)間為2h。
[0021] 所述步驟（4)中分子內(nèi)標(biāo)為攜帶ROX的已知片段大小的DNA，其中已知片段大小的 DNA的片段大小為79、105、131、151。
[0022] 步驟（4)中鑒定具體：使用GeneSCanTM672將測(cè)序儀上電泳分離的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù) 采集，然后使用Genemapper軟件對(duì)采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析PCR產(chǎn)物檢測(cè)峰的數(shù)目及位置， 計(jì)算出PCR產(chǎn)物大小，進(jìn)行鑒定。
[0023] 檢測(cè)峰的數(shù)目為單峰代表純合，雙峰代表雜合即為單敲小鼠，再根據(jù)檢測(cè)峰的位 置鑒定野生和雙敲小鼠。
[0024] 鑒定雙敲（單峰，峰的位置居于左側(cè)，表示產(chǎn)物長度較小），單敲（雙峰，左側(cè)峰與 雙敲小鼠一致，右側(cè)峰與野生型小鼠一致），野生型（單峰，峰的位置居于右側(cè)，表示產(chǎn)物長 度較長）小鼠。
[0025] 不同位置代表不同PCR產(chǎn)物大小，所述野生老鼠產(chǎn)物大小為112bp ;雙敲小鼠產(chǎn)物 大小為89bp ;單敲小鼠產(chǎn)物大小為89bp/112bp (如圖1)。
[0026] 通過使用分子量內(nèi)標(biāo)法具體指：利用攜帶ROX(紅色熒光染料）的已知片段大小 DNA的四種DNA混合物作為內(nèi)參，四種DNA片段大小分別為79、105、131、151。
[0027] 本發(fā)明利用熒光PCR技術(shù)方法可以簡潔、方便、準(zhǔn)確地鑒定Crispr/CaS9系統(tǒng)敲除 mircoRNA的小鼠。利用引物設(shè)計(jì)軟件在敲除位點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物，并且在上游引物 的5'端使用FAM熒光修飾。在經(jīng)過PCR的擴(kuò)增后，將PCR產(chǎn)物與已知片段大小的ROX混合， 在377測(cè)序儀上經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。通過已知片段大小的ROX使用分子量內(nèi)標(biāo) 法，使用Genemapper軟件計(jì)算出PCR產(chǎn)物大小，從而達(dá)到鑒定小鼠基因型的目的。其分辨 率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于瓊脂糖電泳。
[0028] 有益效果
[0029] 本發(fā)明利用熒光PCR技術(shù)準(zhǔn)確直接地鑒定出Crispr/Cas9系統(tǒng)敲除mircoRNA的 小鼠，使用一對(duì)在上游引物5'端用FAM熒光修飾的在敲除位點(diǎn)區(qū)域特異性的熒光引物，經(jīng) PCR擴(kuò)增后通過產(chǎn)物大小及峰圖直觀的分辨出小鼠類型。而傳統(tǒng)的對(duì)敲除小鼠進(jìn)行的分型 的方法是通過T7E1酶切來鑒定，這種方法首先通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出大量的需要鑒定位點(diǎn)的 模板，再通過一個(gè)退火的過程會(huì)在雜合鏈上形成一個(gè)缺口，最后使用T7E1酶切并觀察瓊脂 糖電泳PCR產(chǎn)物條帶來鑒定小鼠的基因型。然而，這種方法過于繁瑣，需要經(jīng)過一段時(shí)間退 火才可以