一種在真核細(xì)胞內(nèi)其穩(wěn)定性受藍(lán)光調(diào)控的光敏降解子desVVD的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因技術(shù)領(lǐng)域、生物化學(xué)領(lǐng)域、細(xì)胞生物學(xué)和生物物理學(xué)領(lǐng)域，涉及一 種在真核細(xì)胞內(nèi)其降解速率和穩(wěn)定性受藍(lán)光調(diào)控的光敏蛋白質(zhì)降解子。具體說，利用藍(lán)光 提高光敏降解子在真核細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性，而在避光條件下該光敏降解子在真核細(xì)胞內(nèi)發(fā)生 降解。融合該光敏降解子的融合蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞內(nèi)的降解和穩(wěn)定性同樣受到藍(lán)光調(diào)控。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因敲除和RNA干擾技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)功能最常用的方法。但是基因敲除 技術(shù)無法獲得看家基因編碼的蛋白質(zhì)缺失的表型。RNA干擾技術(shù)在研究蛋白質(zhì)功能中最大 的缺陷是對于穩(wěn)定性高的蛋白質(zhì)來說，編碼的mRNA降解后，該蛋白質(zhì)仍然在細(xì)胞內(nèi)存在很 長時間。RNA干擾是一個催化過程，沒有濃度依賴的關(guān)系。同時，RNA干擾存在明顯的非特異 性，可能對其它細(xì)胞過程產(chǎn)生影響[Raina等J Biol Chem, 2010, 285 (15) :11057-11060]。 因此，目前對于研究看家基因編碼的蛋白質(zhì)的功能還沒有特別有效和直接的方法。
[0003] 條件性控制蛋白質(zhì)降解的蛋白質(zhì)敲除技術(shù)是研究蛋白質(zhì)功能最直接的方法。 目前已經(jīng)報道的條件性控制蛋白質(zhì)降解的方法主要有兩種方式：溫度控制[Dohmen等 ，Science, 1994, 263 (5151) : 1273-1276]、化學(xué)小分子控制[Schneekloth 等，J Am Chem Soc. 2004,126(12) :3748-3754 ;Nishimura 等，Nature Methods. 2009,6(12):917-U978 ; Pratt 等，P Natl Acad Sci USA. 2007, 104 (27) : 11209-11214 ;Banaszynski 等，Cell. 2006,126(5):995-1004 ;Iwamoto, Chem Biol. 2010, 17(9):981-988 ;Bonger 等，Nat Chem Biol. 2011，7(8) :531-537]。溫度控制蛋白質(zhì)降解的方法最大的缺陷在于溫 度的改變可能較大程度地改變細(xì)胞的表型，因而難以區(qū)分表型的改變是由于溫度改變引起 還是蛋白質(zhì)降解引起的。
[0004] 化學(xué)小分子控制蛋白質(zhì)降解的方法有以下幾種方法：①化學(xué)小分子控制蛋白質(zhì)泛 素的發(fā)生進而控制革巴標(biāo)蛋白質(zhì)降解[Schneekloth等，J Am Chem Soc. 2004, 126 (12) : 3748- 3754Nishimura 等，Nature Methods. 2009, 6 (12) :917_U978];②化學(xué)小分子控制蛋白質(zhì)二 聚化，引起斷裂泛素的重組，進而導(dǎo)致泛素碳端連接的蛋白被切割分離，切割分離下來的蛋 白質(zhì)片段保持穩(wěn)定，而不含化學(xué)小分子的情況下，整個融合蛋白在氮端降解子的作用下降 解[Pratt 等，P Natl Acad Sci USA. 2007, 104(27) :11209-11214];③不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)在化 學(xué)小分子作用下保持穩(wěn)定[Banaszynski 等，Cell. 2006, 126 (5) :995-1004 ;Iwamoto, Chem Biol. 2010, 17(9) :981-988];④穩(wěn)定的蛋白質(zhì)在化學(xué)小分子誘導(dǎo)下暴露降解肽發(fā)生降解 [Bonger等，Nat Chem Biol. 2011，7 (8) :531-537]。不過，依賴蛋白質(zhì)相互作用的方式，需要 表達(dá)兩個復(fù)雜的融合蛋白，因此在應(yīng)用上存在一定的限制。目前真正將蛋白質(zhì)敲除技術(shù)應(yīng) 用于基因功能發(fā)現(xiàn)或控制細(xì)胞生理的只有③這種方法。小分子化合物改變蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的 過程是一個不可逆過程，尤其是在活體內(nèi)，小分子化合物的清除嚴(yán)重依賴其代謝的速率。同 時該方法不具有空間分辨率。另外，可能要考慮到小分子化合物較高的成本，阻礙了該方法 的應(yīng)用。
[0005] 光遺傳學(xué)已經(jīng)成為生命科學(xué)研究最炙手可熱的一門新興學(xué)科。光遺傳學(xué)技術(shù)可 以實現(xiàn)快速地、時空地、非侵入地對系統(tǒng)進行擾動，已經(jīng)在許多神經(jīng)科學(xué)研究方面獲得了 應(yīng)用，包括光控制蛋白質(zhì)相互作用、光控基因表達(dá)、光控信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、光控制蛋白質(zhì)聚集、光控 蛋白質(zhì)活性等方面。光、氧、電壓敏感（LOV)結(jié)構(gòu)域是一類對光響應(yīng)的光敏蛋白結(jié)構(gòu)域， 它們普遍存在于細(xì)菌、真菌和植物[Crosson等，Biochemistry. 2003, 42 (1) : 2-10]。LOV 結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合FAD或FMN、對藍(lán)光敏感并發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)的半胱氨酸黃素加成產(chǎn)物，進 而發(fā)生結(jié)構(gòu)域構(gòu)象改變和/或二聚化[Crosson等，Plant Cell. 2002, 14(5) :1067-1075 ; Christie, Annual review of plant biology. 2007, 58:21-45] 〇
[0006] 最近，兩個基于光遺傳學(xué)的蛋白質(zhì)降解調(diào)控方法相繼獲得了報道[Renicke 等，Chem Biol. 2013, 20 (4) : 619-626 ;Bonger 等，Acs Chem Biol. 2013]，這兩個系統(tǒng)都是基 于一個原理，黑暗下Lov2屏蔽降解標(biāo)簽，而藍(lán)光照射下，由于lov2上的J a螺旋解離，使降 解標(biāo)簽暴露，被蛋白酶體識別并降解。由于革巴標(biāo)蛋白質(zhì)在融合光敏蛋白1〇ν2的冋時還融合 了一個降解子，因此，該方法最大的缺陷在于無論在光照還是黑暗條件下靶標(biāo)蛋白質(zhì)的濃 度都發(fā)生了下降，同時靶標(biāo)蛋白質(zhì)的濃度在光照與黑暗下的區(qū)別并不是非常顯著。
[0007] 來自于粗糙麥胞桿菌的vivid (VVD)是一類最小的LOV結(jié)構(gòu)域，利用該結(jié) 構(gòu)域構(gòu)建的光遺傳學(xué)方法具有響應(yīng)快速、光靈敏度高、可逆性強、時空分辨率高、 細(xì)胞毒性低等優(yōu)點，該光敏蛋白已經(jīng)應(yīng)用于藍(lán)光控制基因表達(dá)系統(tǒng)[Wang等，Nat Methods. 2012, 9(3):266-U264]。
[0008] 本發(fā)明者首先發(fā)現(xiàn)野生型的VVD在真核細(xì)胞內(nèi)其穩(wěn)定性沒有顯著的差別，通過預(yù) 試驗選擇，優(yōu)選穩(wěn)定性受藍(lán)光調(diào)節(jié)的一類VVD突變體，稱為光敏蛋白質(zhì)降解子desVVD (簡稱 光敏降解子）。在宿主細(xì)胞中，光敏降解子desWD在藍(lán)光照射下保持穩(wěn)定，而在避光處理 的環(huán)境中發(fā)生降解。將靶標(biāo)蛋白融合在這類蛋白的氮端或碳端都會造成其在真核細(xì)胞內(nèi)的 穩(wěn)定性受到藍(lán)光的調(diào)控。融合這類光敏降解子的靶標(biāo)蛋白的降解調(diào)控具有顯著的時空分辨 率。這類光敏降解子可以適用于酵母細(xì)胞、果蠅細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的 調(diào)控。這類光敏降解子已經(jīng)成功使功能蛋白質(zhì)的水平受藍(lán)光的調(diào)控，從而完成了本發(fā)明。 [0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種光敏降解子desVVD的編碼基因。
[0011] 本發(fā)明的第二個目的是提供包含所述光敏降解子desVVD編碼基因的質(zhì)粒載體。
[0012] 本發(fā)明的第三個目的是提供所述光敏降解子desVVD編碼基因編碼的光敏降解子 desWD。
[0013] 本發(fā)明的第四個目的是提供所述光敏降解子desVVD的制備方法。
[0014] 本發(fā)明的第五個目的是提供所述光敏降解子desVVD與靶標(biāo)蛋白的融合蛋白。
[0015] 本發(fā)明的第六個目的是提供所述光敏降解子desVVD與所述融合蛋白在真核宿主 細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)水平的調(diào)控方法。
[0016] 本發(fā)明的第一個方面，提供一種光敏降解子desVVD的編碼基因，所述編碼基因是 在野生型VVD截去氮端36個氨基酸殘基基礎(chǔ)上至少含有Y50W突變的突變體的編碼基因。
[0017] 優(yōu)選地，所述編碼基因選自序列表中的序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35、37 和 39 所示的基因。
[0018] 本發(fā)明的第二個方面，提供包含所述光敏降解子desVVD的編碼基因的表達(dá)載體。
[0019] 本發(fā)明的第三個方面，提供所述編碼基因編碼的光敏降解子desVVD，其穩(wěn)定性在 真核細(xì)胞內(nèi)受藍(lán)光調(diào)控。
[0020] 優(yōu)選地，所述光敏降解子desVVD的序列選自序列表中的序列2、4、6、8、10、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 和 40。
[0021] 本發(fā)明的第四個方面，提供光敏降解子desVVD的制備方法。
[0022] 光敏降解子desVVD的制備方法是利用大腸桿菌克隆菌株將光敏降解子desVVD的 編碼基因構(gòu)建到真核宿主細(xì)胞表達(dá)載體中，將該真核宿主細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化真核宿 主細(xì)胞并表達(dá)光敏降解子desVVD。
[0023] 在構(gòu)建的光敏降解子desVVD的真核宿主細(xì)胞表達(dá)載體基礎(chǔ)上，設(shè)計突變引物，并 以此引物擴增包含突變序列的真核宿主細(xì)胞表達(dá)載體，環(huán)化后轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株，可 構(gòu)建包含新的突變類型的光敏降解子desVVD的真核宿主細(xì)胞表達(dá)載體，進而表達(dá)并分離 純化新的突變類型的光敏降解子desVVD。
[0024] 本發(fā)明的第五個方面，提供光敏降解子desVVD與靶標(biāo)蛋白的融合蛋白，其中所 述革巴標(biāo)蛋白選自 mCherry、SFGFP、Flue、Ura3-mCherry，His3-mCherry，Sir2-mCherry， Hst2_mCherry 和 mAZ-mCherry〇
[0025] 優(yōu)選地，本發(fā)明的光敏降解子desVVD與靶標(biāo)蛋白的融合蛋白中，所述靶標(biāo)蛋白選 自mCherry、SFGFP和Fluc，所述融合蛋白分別為mCherry-desVVD融合蛋白、SFGFP-desVVD 融合蛋白和Fluc-desVVD融合蛋白。
[0026] 本發(fā)明的第六個方面，提供了光敏降解子desVVD或其與靶標(biāo)蛋白的融合蛋白在 真核宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)水平的調(diào)控方法，即通過控制藍(lán)光的強弱控制蛋白質(zhì)水平的高 低，或通過不斷切換光照和黑暗的光照條件使蛋白質(zhì)水平發(fā)生大幅度振蕩。
[0027] 發(fā)明詳述
[0028] 野生型的VVD在真核宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性在藍(lán)光照射和避光兩種條件下并沒有 顯著的差別。經(jīng)過突變篩選，本發(fā)明提供了一系列在真核細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性受藍(lán)光調(diào)控的光敏 蛋白的突變體。
[0029] 本文所用術(shù)語"光敏蛋白質(zhì)降解子"、或"光敏降解子"或"desVVD"，指一類在 真核宿主細(xì)胞內(nèi)其穩(wěn)定性受藍(lán)光調(diào)控的光敏蛋白結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合FAD或FMN、對藍(lán)光 敏感并發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)的半胱氨酸黃素加成產(chǎn)物，進而發(fā)生結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化和/或二聚 化[Crosson 等，Plant Cell. 2002, 14(5):1067-1075 ;Christie，Annual review of plant biology. 2007, 58:21-45]。
[0030] 在藍(lán)光照射下，光敏降解子desVVD在真核宿主細(xì)胞中保持穩(wěn)定，而在避光處理的 環(huán)境中發(fā)生降解。
[0031] 本文所用術(shù)語"真核宿主細(xì)胞"指真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞、果蠅細(xì)胞S2、哺乳動物 細(xì)胞HEK293和Hela，但不局限于這些種類的真核細(xì)胞。
[0032] 本文所用術(shù)語"革巴標(biāo)蛋白"指可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)，包含mCherry、SFGFP、 Flue、Ura3_mCherry、His3_mCherry、Sir2_mCherry、Hst2_mCherry、mAZ-mCherry 等，但不 局限于這些蛋白質(zhì)。
[0033] 本文所用術(shù)語"融合蛋白"指光敏降解子desVVD與靶標(biāo)蛋白融合而成的蛋白質(zhì)， 其穩(wěn)定性在真核細(xì)胞內(nèi)受藍(lán)光調(diào)控。
[0034] 本文所用術(shù)語"蛋白質(zhì)水平"指在宿主細(xì)胞中光敏降解子desVVD或其與靶標(biāo)蛋白 融合蛋白的蛋白質(zhì)含量。
[0035] 本發(fā)明提供了一種光敏降解子desVVD的編碼基因，所述編碼基因是在野生型WD 截去氮端36個氨基酸殘基基礎(chǔ)上至少含有Y50W突變的突變體的編碼基因，優(yōu)選地，所述 編碼基因選自序列表中的序列 1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37 和39所不的基因。
[0036] 具體地說，本發(fā)明的編碼基因選自序列1所示VVD(50)的編碼基因、序列3所示的 WD(50,56)的編碼基因、序列5所示VVD(50,71)的編碼基因、序列7所示VVD(50,56,71)的 編碼基因、序列9所示VVD (40, 50, 56, 71)的編碼基因、序列11所示VVD (50, 56, 71，76)的編 碼基因、序列13所示VVD (40, 50, 56, 71，76)的編碼基因、序列15所示VVD (48, 50, 56, 71)的 編碼基因、序列17所示VVD (50, 51，56, 71)的編碼基因、序列19所示VVD (48, 50, 51，56, 71) 的編碼基因、序列21所示VVD (48, 50, 52, 56, 71)的編碼基因、序列23所示 VVD(48, 50, 55, 56, 71)的編碼基因、序列25所示VVD(50, 51，55, 56, 71)的編碼基因、序 列 27 所示 VVD (48, 50, 51，52, 56, 71)的編碼基因、序列 29 所示 VVD (48, 50, 51，55, 56, 71) 的編碼基因、序列31所示VVD (48, 50, 51，52, 55, 56, 71)的編碼基因、序列33所示 VVD (48, 50, 56, 67, 71)的編碼基因、序列35所示VVD (48, 50, 55, 56, 67, 71)的編碼基因、序 列 37 所示 VVD (48, 50, 51，52, 56, 67, 71)的編碼基因和序列 39 所示 VVD (50, 56, 69, 71)的 編碼基因。
[0037] 本發(fā)明提供了一類包含所述光敏降解子desVVD的編碼基因的質(zhì)粒載體（見下表 1)。
[0038] 表 1
CN 105177023 A 說明書 5/27 頁
[0040]
[0041] 本發(fā)明提供了一種由所述編碼基因編碼的光敏降解子desVVD，其序列選自序列表 中的序列 2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38 和 40。所述光敏降 解子desVVD的穩(wěn)定性在真核細(xì)胞內(nèi)受藍(lán)光調(diào)控。在藍(lán)光照射下，真核宿主細(xì)胞中的光敏降 解子desWD保持穩(wěn)定，在黑暗下，光敏降解子desWD發(fā)生降解。
[0042] 本發(fā)明提供的光敏降解子desVVD是粗糙麥胞桿菌的VVD至少包括Y50W突變的突 變體，還可以包含 Y40E、M48E、L51A、I52S、M55A、N56K、V67A、C71V、C76A 等突變的突變體， 或是這些突變位點的兩個、三個、四個、五個、六個、七個隨機組合而成的突變體。但是突變 不局限于在這些突變位點上，突變后的氨基酸殘基也不局限于給定的氨基酸殘基，突變位 點的總數(shù)也不局限于七個。
[0043] 本發(fā)明提供了制備穩(wěn)定的光敏降解子desVVD的方法。利用大腸桿菌克隆菌株將 光敏降解子desVVD的編碼基因構(gòu)建到真核宿主細(xì)胞表達(dá)載體中，將該真核宿主細(xì)胞表達(dá) 載體轉(zhuǎn)染/轉(zhuǎn)化真核宿主細(xì)胞并表達(dá)光敏降解子desVVD。
[0044] 本發(fā)明提供的制備光敏降解子desVVD的方法中，在構(gòu)建的表達(dá)截去氮端36個氨 基酸殘基的野生型VVD或是已知的一種突變類型的光敏降解子desVVD的真核宿主細(xì)胞表 達(dá)載體基礎(chǔ)上，設(shè)計突變引物，并以此引物擴增包含突變序列的真核宿主細(xì)胞表達(dá)載體，環(huán) 化后轉(zhuǎn)化大腸桿菌克隆菌株，構(gòu)建包含新的突變類型的光敏降解子desVVD的真核宿主細(xì) 胞表達(dá)載體，表達(dá)并分離純化新的突變類型的光敏降解子desVVD。
[0045] 本發(fā)明提供了靶標(biāo)蛋白與光敏降解子desVVD融合的融合蛋白，其穩(wěn)定性在真核 細(xì)胞內(nèi)受藍(lán)光調(diào)控。在藍(lán)光照射下，真核宿主細(xì)胞中的靶標(biāo)蛋白與光敏降解子desVVD融合 的蛋白保持穩(wěn)定，在黑暗下，該融合蛋白發(fā)生降解。
[0046] 本發(fā)明提供的靶標(biāo)蛋白與光敏降解子desVVD融合的融合蛋白中，靶標(biāo)蛋白可選 自 mCherry、SFGFP、Flue、Ura3_mCherry, His3_mCherry, Sir2_mCherry, Hst2_mCherry 和 mAZ-mCherry〇
[0047] 在一個優(yōu)選實施方案中，提供了紅色突光蛋白mCherry與光敏降解子desVVD融合 的mCherry-desVVD融合蛋白，所述融合蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)水平受藍(lán)光調(diào)控。
[0048] 在另一個優(yōu)選實施方案中，提供了綠色熒光蛋白SFGFP與desVVD融合的 SFGFP-desVVD融合蛋白，所述融合蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)水平受藍(lán)光調(diào)控。
[0049] 在另一個優(yōu)選實施方案中，提供了熒光素酶Fluc與desVVD融合的Fluc-desWD 融合蛋白，所述融合蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)水平受藍(lán)光調(diào)控。