一種宮頸癌相關(guān)的熱休克蛋白復(fù)合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明公開了一類能有效激活乳頭瘤病毒(HPV)特異性T細(xì)胞的熱休克蛋白復(fù)合物及其制備方法，以及其在治療和預(yù)防宮頸癌中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]腫瘤尤其是惡性腫瘤是當(dāng)今世界嚴(yán)重危害人類健康的疾病，而宮頸癌是嚴(yán)重威脅婦女的生命健康的惡性腫瘤之一，其與乳腺癌一起被稱為女性“雙癌”疾病。據(jù)統(tǒng)計，全球范圍內(nèi)，每年大約有53萬左右的宮頸癌新發(fā)病例，約27.5萬死亡病例，其中85%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。在我國，每年新發(fā)病例約有10萬，約占女性腫瘤的5%，且近年來呈現(xiàn)地區(qū)增長及發(fā)病年齡提前的現(xiàn)象。由于其對女性健康的重大危害及其所造成的社會問題，針對宮頸癌的相關(guān)研究一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和免疫學(xué)等研究的不斷進(jìn)展，宮頸癌治療在傳統(tǒng)的手術(shù)和放化療基礎(chǔ)上，結(jié)合生物治療的綜合治療體系已成為研究的熱點(diǎn)。
[0003]手術(shù)治療是早期宮頸癌重要的首選治療手段，也是某些晚期宮頸癌不可缺少的綜合治療手段。放射治療歷來是宮頸癌的主要治療手段，術(shù)前放療可縮小腫瘤體積，降低癌細(xì)胞活性及術(shù)中播散，提高手術(shù)完整切除率。術(shù)后放療的目的則是補(bǔ)充手術(shù)的不足，提高局部控制率，減少復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。晚期宮頸癌不能手術(shù)，則首選放療。并且隨著化療技術(shù)的發(fā)展，近年來化療也成為宮頸癌綜合治療的一部分。新輔助化療(術(shù)前化療)已被證實可明顯提高患者的5年生存率，并越來越受到學(xué)者的重視。術(shù)前腔內(nèi)放療，然后再行根治性手術(shù)，其治療效果更好。
[0004]近年來的研究證實高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌的主要致病因素，通過激活針對HPV的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體被認(rèn)為可以很好的預(yù)防宮頸癌的發(fā)生。然而目前沒有針對HPV激活特異性T細(xì)胞治療和預(yù)防宮頸癌的報道。
[0005]gp96是熱休克蛋白HSP90家族中的重要成員，主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(EndoplasmicReticulum)，在正常組織和腫瘤中均有廣泛表達(dá)。正常情況下gp96在細(xì)胞中呈低水平表達(dá)，而熱休克、葡萄糖缺乏、細(xì)菌和病毒感染等均可使其表達(dá)量上調(diào)。gp96分子具有結(jié)合多肽的能力，能結(jié)合含有5-25個氨基酸的肽段。熱休克蛋白HSP78是細(xì)胞質(zhì)中HSP70家族中的成員，分子量約78kDa。HSP78分子作為分子伴侶能與細(xì)胞中各種短肽結(jié)合。目前已證實gp96和HSP78分子可以結(jié)合多種組織特異性抗原多肽，包括泡狀口炎病毒抗原區(qū)肽、小鼠H-2Kb限制的卵清蛋白抗原表位肽、H-2La限制的白血病表位肽、乙肝病毒抗原肽等。
[0006]在細(xì)胞外，gp96可將結(jié)合的短肽交叉呈遞給I類MHC分子，從而激活⑶8+ T細(xì)胞，引發(fā)機(jī)體細(xì)胞免疫反應(yīng)。gp96還可以活化樹突細(xì)胞(DC)促進(jìn)MHC I類和MHC II類分子以及共刺激因子的表達(dá)，從而提高免疫反應(yīng)。因而gp96-多肽復(fù)合物是優(yōu)良的細(xì)胞免疫激活劑。
[0007]腫瘤自體gp96因為攜帶有患者自身腫瘤的抗原肽，可以激活患者個體特異性的T細(xì)胞反應(yīng)，從而殺傷腫瘤細(xì)胞，已成功應(yīng)用于黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等的臨床治療。而宮頸癌相關(guān)的臨床應(yīng)用未見報道。
[0008]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服腫瘤細(xì)胞免疫編輯導(dǎo)致的低下的免疫反應(yīng)，能夠在宮頸癌患者中誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(殺傷性T細(xì)胞，CTL)，利用CTL的特異性殺傷能力治療和預(yù)防宮頸癌，同時對正常細(xì)胞及組織無破壞作用。
[0010]本發(fā)明的一個目的是提供一種與gp96和HSP78結(jié)合的多肽形成的抗宮頸癌復(fù)合物。所述的多肽可以分別是宮頸癌相關(guān)乳頭瘤病毒E6抗原蛋白上第25-33位的氨基酸序列，其序列可以是ELQTTIHEI，或其變異序列；乳頭瘤病毒E6抗原蛋白上第29-37位的氨基酸序列，其序列可以是TIHEIILEC，或其變異序列；乳頭瘤病毒E6抗原蛋白上第110-118位的氨基酸序列，其序列可以是CINCQKPLC，或其變異序列。
[0011]本發(fā)明的復(fù)合物既包括熱休克蛋白以非共價鍵與多肽結(jié)合形成的復(fù)合物，又包括熱休克蛋白以共價鍵與多肽結(jié)合形成的復(fù)合物。本發(fā)明提供了制備本發(fā)明中如上所述抗原多肽與熱休克蛋白gp96和HSP78的復(fù)合物的方法。
[0012]本發(fā)明所訴的表位肽可以以熱休克蛋白復(fù)合物形式在HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠中誘導(dǎo)形成特異性的CTL。
[0013]本發(fā)明所訴的表位肽可以在體外單獨(dú)或以熱休克蛋白復(fù)合物形式刺激HLA-A2陽性宮頸癌患者PBMC分泌IFN- γ，且這種作用在自體gp96免疫后顯著增強(qiáng)。
[0014]本發(fā)明所訴的表位肽可以單獨(dú)或以熱休克蛋白復(fù)合物形式提高HLA-A2陽性宮頸癌患者特異性T細(xì)胞反應(yīng)。
[0015]本發(fā)明所述的特異性CTL的誘導(dǎo)可以被Treg細(xì)胞的抑制劑增強(qiáng)。
[0016]首次從五例HPV陽性宮頸癌腫瘤組織中純化的熱休克蛋白gp96復(fù)合物中分離出一特異9肽，經(jīng)氨基酸序列分析為“ELQTTIHEI”，經(jīng)查詢發(fā)現(xiàn)該序列位于宮頸癌相關(guān)乳頭瘤病毒E6抗原蛋白上第25-33位，人工合成該序列并與體外表達(dá)的gp96蛋白組裝，體外合成gp96-9肽復(fù)合物，將該gp96-9肽復(fù)合物免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因小鼠，能刺激小鼠產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，且應(yīng)用調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的抑制劑可以增強(qiáng)gp96-9肽復(fù)合物的免疫效果2倍以上。實驗結(jié)果表明gp96-9肽復(fù)合物可開發(fā)成為一種新型宮頸癌的治療性藥物。
[0017]
附圖簡要說明
圖1.小鼠(BALB/chu A2+)的特異性CTL反應(yīng)。以gp96-9肽復(fù)合物按0、1、3周的周期免疫小鼠，最后一次免疫3天后檢測特異性細(xì)胞裂解率。效應(yīng)細(xì)胞CTL對靶細(xì)胞的裂解百分率以4小時標(biāo)準(zhǔn)51Cr釋放法測定，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之比分別是10、25、50和100，圖中裂解率為10只小鼠平均值。
[0018]圖2.gp96_肽段I免疫的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞可抑制裸鼠皮下接種的宮頸癌細(xì)胞的生長。雌性裸鼠背部皮下接種人宮頸癌細(xì)胞Caski，荷瘤7天后轉(zhuǎn)輸不同來源的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞。抗原肽I組(n=20)的接受經(jīng)過gp96-抗原肽I復(fù)合物免疫的BALB/c HLA A2+小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞；無關(guān)肽對照組(n=20)接受經(jīng)過gp96-無關(guān)肽(HBcAg87-95)復(fù)合物免疫的Balb/c HLA A2+小鼠的脾臟淋巴細(xì)胞。
[0019]
圖3.小鼠(BALB/cHWA2+)的特異性CTL反應(yīng)。以宮頸癌患者腫瘤組織來源gp96或小鼠肝臟gp96按0、1、3周的周期免疫小鼠，最后一次免疫3天后檢測9肽特異性T細(xì)胞的變化。以IFN- γ的ELISP0T方法檢測小鼠脾臟淋巴細(xì)胞中9肽特異性T細(xì)胞。無關(guān)肽HBcAg82 90肽為陰性對照。結(jié)果顯示只有宮頸癌患者來源的gp96抗原復(fù)合物能激活9肽特異性的T細(xì)胞，表明復(fù)合物中包含相關(guān)的抗原。
[0020]圖4.宮頸癌患者免疫自體腫瘤gp96復(fù)合物后9肽特異性T細(xì)胞的變化。以IFN-γ的ELISP0T方法檢測患者外周血中9肽特異性T細(xì)胞。無關(guān)肽HBcAg82 9。肽為陰性對照。
[0021]【具體實施方式】:
下面用實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0022]實施例1.從宮頸癌組織中純化gp96蛋白
選擇HPV陽性和HPV陰性的宮頸癌患者組織純化gp96復(fù)合物。將宮頸癌組織勻漿后離心，用30%/70%飽和度(NH4) #04沉淀，沉淀溶解后采用ConA Sepharose (GE公司)進(jìn)行親和層析，用8%的α-甲基葡萄糖苷洗脫結(jié)合的蛋白，糖苷洗脫液以Hitrap-Q (GE公司層析系統(tǒng))進(jìn)行陰離子層析，經(jīng)過這三步純化獲得>95%純度的gp96蛋白。gp96蛋白用gp96/grp94單克隆抗體(Santa Cruz公司)進(jìn)行Western鑒定。其純度用SDS-PAGE、銀染和反相HPLC鑒定。
[0023]
實施例2.從gp96蛋白釋放非共價結(jié)合的多肽
將純化的gp96蛋白加入三氟乙酸(TFA)使其終濃度達(dá)到0.2% (pH約2.0)，然后用超濾法(分子截留為30 kDa, Millipore公司)分離多肽，將多肽混合物進(jìn)行MALD1-T0F質(zhì)譜(ABI 4700)分析，多肽分子量大多在600-1200 Da之間。
[0024]
實施例3.反相HPLC分析多肽
多肽混合物凍干后溶于溶液A(0.065% TFA, 2%乙腈)，反相層析柱C18上樣(S^hasilpeptide C18 ；5 μ m 粒度；4.6 X 250mm，GE 公司)，從 O 至 65% 溶液 B (0.05% TFA，100% 乙腈)進(jìn)行梯度洗脫，流速為I mL/min，用214nm波長檢測。比較HPV+與HPV腫瘤組織HPLC圖譜，發(fā)現(xiàn)一個HPV+組織共有而HPV組織中沒有的肽峰。
[0025]
實施例4.多肽微量測序與序列分析
收集該特異肽峰用MALD1-T0F質(zhì)譜(ABI公司4700系統(tǒng))鑒定其純度，只發(fā)現(xiàn)分子量為1083 Da的單一峰。對該肽微量測序(Procise 491.蛋白測序儀，ABI公司)，其氨基酸序列為“ELQTTIHEI”，5份腫瘤組織得到的序列一致。在蛋白數(shù)據(jù)庫中查詢該序列(NCBI)，發(fā)現(xiàn)它位于HPV蛋白E6的25-33位。
[0026]
實施例5.gp96蛋白與人工合成的多肽體外快速組裝
人工合成9肽“ELQTTIHEI” (委托吉爾生化有限公司合成)，將gp96蛋白與多肽進(jìn)行體外組裝，體外結(jié)合反應(yīng)體系:
2.7 mmol/L KCl, 1.47 mmol/L KH2PO4,8.1 mmol/L Na2HPO4,138mmol/L NaCl, 10%(V/V)甘油，3.0 mmol/L 9肽，0.421 mmol/L gp96蛋白，60°C反應(yīng)10分鐘，超濾法(截留分子量30 kDa，Millipore公司)去除未結(jié)合的多肽。
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實施例6表達(dá)宮頸癌相關(guān)抗原肽I和熱休克蛋白gp96的融合蛋白本實例提供了宮頸癌相關(guān)抗原肽l(ELQTTIHEI)與熱休克蛋白gp96以共價鍵形成的融合蛋白的方法。我們?nèi)斯ず铣苫パa(bǔ)的核酸序列(5’ GATCC GAGCTGCAAACAACTATACATGATATAA 3’及 5’ GATCT TATATCATGTATAGTTGTTTGCAGCTC G 3’)，并通過復(fù)性獲得雙鏈DNA片段，核酸序列對應(yīng)于該肽的氨基酸序列，同時還在序列的5’端引入限制性酶切位點(diǎn)BamH I粘性末端，3端引入限制性酶切位點(diǎn)Bgl II的粘性末端，獲得粘性片段I。我們通過PCR在gp96的基因兩端分別引入限制性酶切位點(diǎn)Bgl II和Xho I，限制性酶切獲得粘性片段2。我們酶切真核表達(dá)載體pSeCTag2/Hygr0 A獲得BamH I, Xho I雙切的粘性片段3。將3個DNA片段用T4連接酶連接，將抗原肽-gp96表達(dá)框插入到表達(dá)載體pSecTag2/Hygro A0將基因工程載體pSecTag2 /HygroB-Seql-hgp96通過電穿孔的方式轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，以潮霉素B抗生素篩選陽性克隆，并通過ELISA檢測培養(yǎng)上清中的gp96獲得高產(chǎn)細(xì)胞株。
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