專利名稱：基于G₄DNA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因檢測試劑的制備方法，具體的說，涉及基于(^4DNA酶顯色的可 視化基因檢測試劑的制備方法。該試劑不但能夠快速定性檢測豬瘟病毒，而且還適用于其 它病原微生物核酸的定性檢測，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
自上世紀以來，人們已經(jīng)認識到核酸是決定遺傳性質(zhì)的關(guān)鍵物質(zhì)。對于大部分生 物體而言，DNA是遺傳信息的載體；而在部分病毒中，這個角色由RNA承擔。每一種生物都 有自己特定的核酸序列，各種各樣的生物性狀最終都能在特定核酸序列中找到根源。因此， 對特定序列核酸的檢測在生命科學(xué)及其相關(guān)的領(lǐng)域，醫(yī)療衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)、環(huán)境、司法等都有廣 泛的應(yīng)用前景。具體來說，通過檢測樣品中是否存在某種核酸，就可以判斷出檢測對象是否 攜帶某種病原體及其耐藥性，患有某種疾病或處于某種遺傳狀態(tài)。因此，核酸分析技術(shù)在病 原微生物的鑒定診斷，分型和耐藥性檢測，疾病診斷與預(yù)后，SNP檢測等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng) 用，并發(fā)揮著重要的作用。人們不斷發(fā)展各類檢測核酸的技術(shù)，使之更靈敏、準確，經(jīng)濟、快 捷，以滿足各領(lǐng)域?qū)NA檢測的不同需要。
最近幾年，具有過氧化物酶活性的DNA酶(DNAzyme)逐漸受到人們重視(Rich， Α. ； Zhang, S. Timeline Z-DNA the long road to biological function, Nat. Rev. Genet. 2003, 4, 566-572.)。它能夠催化雙氧水氧化2，2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑 啉-6-石黃酸)[2，2-azinobis (3-ethylbenzothiozoline) - 6-sulfonic acid, ABTS]等過 氧化物酶顯色底物，生成有顏色的物質(zhì)，并且DNA過氧化物酶能夠作為催化標簽融入各種 檢測探針中，實現(xiàn)用肉眼檢測目標物。DNA過氧化物酶是Dipankar Sen課題組發(fā)現(xiàn)的，它 是G-四鏈體DNA與氯高鐵血紅素(Hemin)形成的復(fù)合物。DNA過氧化物酶作為催化標簽有 著自己獨特的優(yōu)勢，例如DNA過氧化物酶可以在檢測體系中由G-四鏈體與Hemin原位組 裝形成，不需要額外的制備純化步驟；它是一種DNA序列，可在合成過程中直接加入核酸探 針序列中，或者通過堿基對互補與探針相連，省去額外的標記步驟；DNA序列穩(wěn)定，有活性 的結(jié)構(gòu)很容易在溶液中形成，這樣在運輸存儲過程中不需要特殊的條件。
豬瘟(Classical Swine Fever, CSF)和口蹄疫一樣，是豬的一種高度致死性接 觸性傳染病。目前，全世界仍有50多個國家和地區(qū)存在豬瘟。世界動物衛(wèi)生組織(OIE) 2005年出版的《陸生動物衛(wèi)生法典》中將豬瘟列為必須報告疫病之一。我國是豬瘟高發(fā)國 家，也將豬瘟列為“一類動物疫病”。豬瘟于1833年首先發(fā)現(xiàn)于美國的Ohio州，1904年由 Schweinitz EA 和 Dorset M 證明豬癌病原體是豬癌病毒(Classical Swine Fever Virus, CSFV)。豬瘟病毒是一種具有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒科(Flaviridac)瘟病 毒屬(Pestivirus)的成員。基因組是由 5，非編碼區(qū)(5，untranslated rigion, 5' UTR), 一個大的開放閱讀框(ORF)和3，非編碼區(qū)組成(3，untranslated rigion, 3，UTR) ORF 編碼一個由3898個氨基酸殘基組成的多聚蛋白，多聚蛋白在翻譯過程中或翻譯后，被病毒 自身編碼的蛋白酶和宿主細胞的蛋白酶加工成12種成熟的蛋白，包括四種結(jié)構(gòu)蛋白C，E0,E1, E2 和八種非結(jié)構(gòu)蛋白 Npro, P7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 和 NS5B。
傳統(tǒng)的豬瘟檢測方法主要包括病毒的分離和生物學(xué)試驗、電鏡技術(shù)、免疫熒光技 術(shù)、補體結(jié)合試驗、核酸雜交、聚丙烯酰胺凝膠電泳等，這些方法在病毒病診斷和進出口檢 驗檢疫中起了重要作用，但普遍存在著明顯的不足，諸如周期長，操作繁瑣，特異性和敏感 性差，不規(guī)范，不適用于大批量檢測，給豬瘟的檢測帶來巨大困難。因此，如何快速、準確測 定豬瘟病毒是豬瘟檢測面臨的主要難題之一。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于G4DNA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方 法，該試劑不但能夠快速定性檢測豬瘟病毒，而且還適用于病原微生物核酸的定性檢測，方 便、快捷、經(jīng)濟實惠。
本發(fā)明DNA過氧化物酶序列為G-四鏈體DNA，包含4段GGG序列，很容易拆 分、組裝的特性，將DNA過氧化物酶序列分成了兩個部分，采用3 1拆分的模式構(gòu)建 探針，即一條探針中含有3段序列，另外一條只含有一段序列，也就是說將序列 d (GGGTAGGGCGGGTTGGG)不對稱分為d(GGGTAGGGCGGG)和d (TGGG)分別與兩條結(jié)合序列的 3’和5’端融合形成探針，這兩條結(jié)合序列與靶DNA的部分序列互補。當不存在靶DNA時， 探針呈游離狀態(tài)，分成兩個部分的DNA過氧化物酶序列不能組裝成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，不能表 現(xiàn)出過氧化物酶活性，故體系中沒有信號的變化。在有靶單鏈DNA存在的情況下，在變性與 退火過程中，探針與模板特異性結(jié)合，兩拆分部分相互靠近從而組裝成G-四鏈體結(jié)構(gòu)，與 Hemin結(jié)合后表現(xiàn)出過氧化物酶活性，在顯色體系的條件下釋放肉眼可見的綠光。這樣可以 通過體系中DNA過氧化物酶催化的顏色反應(yīng)檢測靶DNA。
由于通常從樣品中獲得的核酸量是不足以直接用于分析的，因此，在用(^4DNA酶進 行顯色反應(yīng)之前必需對被檢測的核酸進行基因擴增。其次，由于(^4DNA酶顯色反應(yīng)時只有 一條PCR產(chǎn)物可以與探針雜交，而其對應(yīng)的互補鏈由于PCR雙鏈的自身退火，會干擾所需要 的雜交反應(yīng)，降低雜交信號，因此需要復(fù)制出單鏈。本發(fā)明選擇不對稱PCR，利用濃度有明顯 差異的特異性上、下游引物進行不對稱PCR擴增；如果目標基因是RNA，則應(yīng)加上反轉(zhuǎn)錄的 步驟。不對稱PCR進行完成后，可以直接加入G4DNA酶反應(yīng)液，探針等試劑，直接進行下一 步的顯色反應(yīng)，從而實現(xiàn)了檢測的方便、快捷。
本發(fā)明是通過采用如下的技術(shù)方案來實現(xiàn)發(fā)明目的的。
基于(^4DNA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方法，其特征在于包括如下步 驟A、目標基因的提取選取經(jīng)豬瘟病毒感染后的PK-15細胞，經(jīng)_70°C凍融3次，每次10-30分鐘后，取200μ1 加RNA裂解液(Trizol) Iml混勻，室溫靜置10-15分鐘，加0. 2ml氯仿，再室溫靜置3-5分 鐘，于4°C 12000g/min離心10-15分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管，加0. 5ml異丙醇，室溫 沉淀10-20分鐘，再于40C 12000g/min離心10分鐘，輕輕倒出上清，加Iml 75%乙醇于4°C 7500g/min離心5分鐘，棄上清，RNA沉淀在室溫下自然晾干，加DEPC處理過的水20 μ 1得 到目標基因RNA;所述75%乙醇采用無菌雙蒸水按體積比配制而成。
B、cDNA 的制備采用基因提取試劑盒取步驟A所得到的目標基因RNA 10 μ 1，加入反向引物W3 (-) 1μ 1 (20Mmol/L)和dNIPs (三磷酸脫氧核苷酸)1 μ 1 (10Mmol/L)，65°C孵育5分鐘，再迅 速置冰上5分鐘，然后加逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4μ 1 (5XbufTer)，RNA酶抑制劑1 μ 1，DTT (二 硫蘇糖醇)2 μ 1 (0. lmol/L)，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μ 1，于42°C反應(yīng)50分鐘、75°C反應(yīng)10分鐘， 即得至Ij cDNA ；所述基因提取試劑盒選自hvitrogen公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。
所述反向引物W3 (-)的序列是 5，GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA 3，。
所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液的組成為250 mmol/L pH 8. 3的Tris_HCl(Tris-鹽酸)， 375 mmol/L KCl (氯化鉀)，15 mmol/L MgCl2 (氯化鎂)。
C、不對稱PCR的擴增取步驟B制好的cDNA 5 μ 1，加入到100 μ 1的不對稱PCR體系中進行反應(yīng)，循環(huán)條件 為95°C預(yù)變性2分鐘；94°C變性15秒，53°C退火15秒，72°C延伸15秒，擴增50-100個 循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘，得到PCR產(chǎn)物；所述100 μ 1不對稱PCR體系的組成為正向引物W3 ( + )2μ 1 (0. 4_4Mmol/L)和反向 引物 W3 (-) 2μ 1 (20ymol/L)，PCR 溶 10μ 1 (10 X buffer)，MgCl2 溶液 8 μ 1 (2. 5mmol/ L)，dNIPs溶液2μ 1 (10mmol/L),Taq DNA聚合酶2 μ 1 (2U)以及余量的無菌雙蒸水。
所述不對稱PCR反應(yīng)體系中的正向引物W3( + )序列是5’-gcgcgggtaacccgggat-3’ ，反向引物 W3 (-)序列是5’ - GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA - 3’。
Dj4DNA酶顯色反應(yīng)分別取G4DNA酶顯色反應(yīng)緩沖液20 μ 1，上游探針ftx)blL 2μ 1 (20 μ mol/L)和下游探 針ftx)blR 2 μ 1(20 μ mol/L)，加無菌雙蒸水補足為91 μ 1，加入至步驟C所得的含有100 μ 1 不對稱PCR反應(yīng)液的200 μ 1 PCR管中，95°C變性5 min ;30°C退火:3min，加入Hemin底物 0. 5μ 1 (50_ol/L)，放置 5min，再加入 8μ 1 (50 mmol/L) ATBS 禾口 0· 5 μ 1 (1 mo 1/DH2O2 顯色，觀察有無肉眼可見的綠色出現(xiàn)。
所述(^4DNA酶顯色反應(yīng)緩沖液的組成包括100 mmol/L的4_羥乙基哌嗪乙磺酸 (4-(2-hydroxyethyl)piperazine-l-ethanesPlfonic acid,HEPES)10 μ 1,2 mol/L 的氣化 鈉和0. 2mol/L的氯化鉀共10 μ 1。
所述上游探針 ProblL 的序列是 5’-tgggtaattttttatttatttaggt_3’。
所述下游探針 ProblR 的序列是 5’_cgccaccctattgtagataa cacttgggtagggcggg-3 。
所述上、下游探針的組成為(^4DNA酶中的G-四鏈體DNA，包含4段GGG序列，該序 列又被拆分為兩個部分一個部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模311 ο
本發(fā)明的基本原理是首先，G4DNA酶中的G-四鏈體DNA包含4段G你序列，通過將其拆分為兩個部分，一個 部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，從而形成3:1的拆分模式。
其次，包含兩條特異性基因序列的探針，即上、下游探針分別融合有拆分的G-四 鏈體DNA序列，也就是說兩條探針的3’端或5’端分別包含d (GGGTAGGGCGGG)或d (TGGG)。在探針呈游離狀態(tài)時，兩基團在空間結(jié)構(gòu)上距離遠，故體系中沒有信號的變化。在有目標單 鏈DNA存在的情況下，在變性與退火過程中，探針與模板特異性結(jié)合，兩基團相互靠近形成 G4DNA過氧化物酶，在顯色體系條件下的催化底物Hemin即可釋放肉眼可見的綠光。因此， 通過肉眼觀測溶液有無顏色變化，即可提示檢測對象是否帶有豬瘟病毒，變?yōu)榫G色為陽性， 不變色為陰性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益技術(shù)效果表現(xiàn)在1、檢測速度快，整個檢測過程共需2-3小時，但(^4DNA酶顯色步驟僅需15分鐘；2、檢測方法精確穩(wěn)定、重現(xiàn)性好；3、檢測步驟簡單，操作簡便，只需1人即可完成整個檢測過程，一次可檢測1-95個樣 品，減少了人力資源的浪費；4、可肉眼直接觀察顯色反應(yīng)，結(jié)果直觀；5、無需特殊的昂貴儀器，試劑便宜，檢測成本低廉，利于推廣使用。


圖1為本發(fā)明對經(jīng)豬瘟病毒感染后的H(-15細胞、空白的冊-15細胞以及無菌雙 蒸水進行檢測的(^4DNA酶顯色反應(yīng)結(jié)果圖；圖2為本發(fā)明對經(jīng)豬瘟病毒感染后的H(-15細胞、空白的H(-15細胞以及無菌雙蒸水 進行檢測后利用紫外-可見分光光度計(UV-2550 UV-vis spectrophotometer 島津公司 產(chǎn)品)分析&DNA酶顯色反應(yīng)的光吸收結(jié)果圖(吸收波長為419nm)。
具體實施方式
基于(y)NA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方法，其特征在于包括如下步 驟A、目標基因的提取選取經(jīng)豬瘟病毒石門毒感染后的H(-15細胞，空白的H(-15細胞，以無菌雙蒸水作對 照，經(jīng)-70°C凍融3次，每次10-30分鐘后，取200 μ 1加RNA裂解液(Trizol) Iml混勻，室 溫靜置10-15分鐘，加0. 2ml氯仿，再室溫靜置3-5分鐘，于4°C 12000g/min離心10-15分 鐘，上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管，加0. 5ml異丙醇，室溫沉淀10-20分鐘，再于4°C 12000g/ min離心10分鐘，輕輕倒出上清，加Iml 75%乙醇于4°C 7500g/min離心5分鐘，棄上清， RNA沉淀在室溫下自然晾干，加DEPC處理過的水20 μ 1得到目標基因RNA ； 所述75%乙醇采用無菌雙蒸水按體積比配制而成。
B、cDNA 的制備采用基因提取試劑盒取步驟A所得到的目標基因RNA 10-12μ 1，加入反向引物W3(_) 1μ 1 (20Mmol/L)和dNTPs (三磷酸脫氧核苷酸)1 μ 1 (10 μ mol/L)，65°C孵育5分鐘，再迅 速置冰上5分鐘，然后加逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4μ 1 (5XbufTer)，RNA酶抑制劑1 μ 1，DTT (二 硫蘇糖醇)2 μ 1 (0. lmol/L)，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶1μ 1，于42°C反應(yīng)50分鐘、75°C反應(yīng)10分鐘， 即得至Ij cDNA ；所述基因提取試劑盒選自hvitrogen公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。
所述反向引物W3 (-)的序列是 5’ GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA 3’。7
所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液的組成為250 mmol/L pH 8. 3的Tris-HCl(Tris-鹽酸)， 375 mmol/L KCl (氯化鉀)，15 mmol/L MgCl2 (氯化鎂)。
C、不對稱PCR的擴增取步驟B制好的cDNA 5 μ 1，加入到100 μ 1的不對稱PCR體系中進行反應(yīng)，循環(huán)條件 為95°C預(yù)變性2分鐘；94°C變性15秒，53°C退火15秒，72°C延伸15秒，擴增50-100個 循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘，得到PCR產(chǎn)物；所述100 μ 1不對稱PCR體系的組成為正向引物W3 ( + )2μ 1 (0. 4_4 μ mol/L)和反向 引物 W3 (_)2 μ 1 (20Mmol/L)，PCR 溶液 10μ 1 (10 X buffer)，MgCl2 溶液 8 μ 1 (2. 5mmol/ L)，dNIPs溶液2μ 1 (10mmol/L),Taq DNA聚合酶2 μ 1 (2U)以及余量的無菌雙蒸水。
所述不對稱PCR反應(yīng)體系中的正向引物W3( + )序列是5’-gcgcgggtaacccgggat-3’ ，反向引物 W3 (_)序列是5’ - GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA - 3’。
Dj4DNA酶顯色反應(yīng)分別取G4DNA酶顯色反應(yīng)緩沖液20 μ 1，上游探針ftx)blL 2μ 1 (20 μ mol/L)和下游探 針ftx)blR 2 μ 1(20 μ mol/L)，加無菌雙蒸水補足為91 μ 1，加入至D步驟所得的含有100 μ 1 不對稱PCR反應(yīng)液的200 μ 1 PCR管中，95°C變性5min ;30°C退火:3min，加入Hemin底物 0. 5μ 1 (50_ol/L)，放置 5min，再加入 8μ 1 (50 mmol/L) ATBS 禾口 0· 5 μ 1 (1 mo 1/DH2O2 顯色，觀察有無肉眼可見的綠色出現(xiàn)。
所述(^4DNA酶顯色反應(yīng)緩沖液的組成包括100 mmol/L的4_羥乙基哌嗪乙磺酸 (4-(2-hydroxyethyl)piperazine-l-ethanesPlfonic acid,HEPES)10 μ 1,2 mol/L 的氣化 鈉和0. 2mol/L的氯化鉀共10 μ 1。
所述上游探針 ProblL 的序列是 5’-tgggtaattttttatttatttaggt_3'。
所述下游探針 ProblR 的序列是 5，-cgccaccctattgtagataa cacttgggtagggcggg-3'。
所述上、下游探針的組成為(^4DNA酶中的G-四鏈體DNA，包含4段GGG序列，該序 列又被拆分為兩個部分一個部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模311 ο
權(quán)利要求
1.基于(^4DNA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方法，其特征在于包括如下步驟A、目標基因的提取選取經(jīng)豬瘟病毒感染后的PK-15細胞，經(jīng)-70°C凍融3次，每次10-30分鐘后，取200 μ 1 加RNA裂解液Iml混勻，室溫靜置10-15分鐘，加0. 2ml氯仿，再室溫靜置3_5分鐘，于 40C 12000g/min離心10-15分鐘，上清液轉(zhuǎn)移到另一個離心管，加0. 5ml異丙醇，室溫沉 淀10-20分鐘，再于40C 12000g/min離心10分鐘，輕輕倒出上清，加Iml 75%乙醇于4°C 7500g/min離心5分鐘，棄上清，RNA沉淀在室溫下自然晾干，加DEPC處理過的水20 μ 1得 到目標基因RNA;B、cDNA的制備采用基因提取試劑盒取步驟A所得到的目標基因RNA 10 μ 1，加入反向引物W3 (-) 1μ 1 (20Mmol/L)和dNIPs 1μ 1 (10Mmol/L)，65°C孵育5分鐘，再迅速置冰上5分鐘，然 后加逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液4μ 1 (5Xbuffer)，RNA酶抑制劑1 μ 1，DTT 2μ1 (0. lmol/L)，匪LV 逆轉(zhuǎn)錄酶1 μ 1，于42°C反應(yīng)50分鐘、75°C反應(yīng)10分鐘，即得到cDNA ；C、不對稱PCR的擴增取步驟B制好的cDNA 5 μ 1，加入到100 μ 1的不對稱PCR體系中進行反應(yīng)，循環(huán)條件 為95°C預(yù)變性2分鐘；94°C變性15秒，53°C退火15秒，72°C延伸15秒，擴增50-100個循 環(huán)；最后72°C延伸10分鐘，得到PCR產(chǎn)物；D、(^4DNA酶顯色反應(yīng)分別取G4DNA酶顯色反應(yīng)緩沖液20 μ 1，上游探針ftx)blL 2μ 1 (20 μ mol/L)和下游探 針ftx)blR 2μ l(20Mmol/L)，加無菌雙蒸水補足為91 μ 1，加入至D步驟所得的含有100 μ 1 不對稱PCR反應(yīng)液的200 μ 1 PCR管中，95°C變性5 min ;30°C退火:3min，加入Hemin底物 0. 5μ 1 (50mmmol/L)，放置 5min，再加入 8μ 1 (50 mmol/L) ATBS 禾口 0. 5 μ 1 (1 mo 1/DH2O2 顯色，觀察有無肉眼可見的綠色出現(xiàn)。
2.如權(quán)利要求1所述基于(^4DNA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方法，其特征在 于步驟A所述75%乙醇采用無菌雙蒸水按體積比配制而成。
3.如權(quán)利要求1所述基于&DNA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方法，其特征在 于步驟B所述反向引物W3 (_)的序列是5’ GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA 3’。
4.如權(quán)利要求1所述基于(^4DNA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方法，其特征在 于步驟B所述逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液的組成為250 mmol/L pH 8. 3的Tris-HCl，375 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl20
5.如權(quán)利要求1所述基于(^4DNA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方法，其特征在 于步驟C所述ΙΟΟμ 1不對稱PCR體系的組成為正向引物W3 ( + )2μ 1 (0. 4-4ymol/ L)禾口反向引物 W3 (-) 2μ 1 (20Mmol/L)，PCR 溶液 10μ1 (10 X buffer)，MgCl2 溶液 8 μ 1 (2.5mmol/L)，dNIPs 溶液 2μ 1 (10mmol/L), Taq DNA 聚合酶 2 μ 1 (2U)以及余量的無菌雙 蒸水。
6.如權(quán)利要求1或5所述基于(^4DNA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方法，其特 征在于所述不對稱PCR體系中的正向引物W3 ( + )序列是5’-gcgcgggtaacccgggat-3’， 反向引物 W3 (_)序列是5’ - GTCCAACTGTGGACGTCAGGAA - 3’。
7.如權(quán)利要求1所述基于(^4DNA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方法，其特征在于步驟D所述(^4DNA酶顯色反應(yīng)緩沖液的組成包括100 mmol/L的4-羥乙基哌嗪乙磺酸 10μ l，2mol/L的氯化鈉和0. 2mol/L的氯化鉀共10 μ 1。
8.如權(quán)利要求1所述基于(^4DNA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方法，其特征在 于步驟 D 所述上游探針 ProblL 的序列是 5’-tgggtaattttttatttatttaggt_3’。
9.如權(quán)利要求1所述基于G4DNA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方法， 其特征在于步驟D所述下游探針ftx)blR的序列是5’_cgccaccctattgtagataa cacttgggtagggcggg-3 。
10.如權(quán)利要求1所述基于(y)NA酶顯色的可視化基因檢測試劑的制備方法，其特征在 于步驟D所述上、下游探針的組成為G4DNA酶中的G-四鏈體DNA，包含4段GGG序列，該序 列又被拆分為兩個部分一個部分包含3段GGG序列，另一部分包含1段GGG序列，拆分模31 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于G4DNA酶顯色的可視化豬瘟病毒基因檢測試劑的制備方法，包括選取病毒感染后的細胞，經(jīng)凍融裂解后，采用基因提取試劑盒提取目標基因，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄、滅活MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶后得到cDNA；將cDNA加入不對稱PCR體系，經(jīng)變性、退火及延伸擴增50-100個循環(huán)得到不對稱PCR產(chǎn)物；將上、下游探針和不對稱PCR產(chǎn)物加入到G4DNA酶顯色反應(yīng)緩沖液中，經(jīng)變性、退火后再加入Hemin、ATBS和H2O2進行顯色反應(yīng)，觀察有無肉眼可見的綠色出現(xiàn)，可判定有無豬瘟病毒感染。本發(fā)明檢測速度快、精確穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、檢測步驟簡單、操作簡便、可肉眼直接觀察顯色反應(yīng)，結(jié)果直觀、成本低廉。
文檔編號C12Q1/70GK102041318SQ201010555429
公開日2011年5月4日 申請日期2010年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年11月23日
發(fā)明者王毅, 魯小璐 申請人:成都巨星豬業(yè)有限公司, 王毅