本發(fā)明屬于醫(yī)用配制品領(lǐng)域，具體涉及一種靶向前列腺癌細(xì)胞的納米殼聚糖超聲微泡及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自從Gramiak于1967年首次發(fā)現(xiàn)可增強(qiáng)超聲顯影的微小空氣泡后，超聲造影劑(UCAs)便得到了不斷的發(fā)展，與此同時(shí)，超聲探測(cè)技術(shù)也隨之發(fā)展起來(lái)。隨著超聲造影劑的發(fā)展，超聲造影劑不再局限于超聲成像方面，而且開始朝著藥物遞送方面發(fā)展，因此，以超聲造影劑為基礎(chǔ)，結(jié)合藥物遞送系統(tǒng)的超聲分子影像學(xué)技術(shù)，已被臨床應(yīng)用于某些疾病的診斷、治療以及評(píng)估。

目前，納米微泡能夠進(jìn)入血管外間隙，對(duì)血管外的組織進(jìn)行超聲顯影。然而，現(xiàn)有的超聲造影劑的靶向性低、組織穿透力低、親和力低。

為了能夠使微泡具有靶向的作用，在微泡的膜材上進(jìn)行修飾成為了熱點(diǎn)。隨著研究的進(jìn)展，具有特異性的抗體開始進(jìn)入人們的視野。然而，抗體大多時(shí)候被作為內(nèi)容物，無(wú)法發(fā)揮其特異性的優(yōu)點(diǎn)，難以對(duì)微泡起到靶向性的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有的超聲微泡的靶向性低、組織穿透力低的缺點(diǎn)，提供了一種靶向性高、組織穿透力強(qiáng)的靶向納米殼聚糖超聲微泡即靶向性前列腺納米超聲微泡。

本發(fā)明的另一目的在于提供由上述靶向前列腺癌細(xì)胞的納米殼聚糖超聲微泡的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述靶向前列腺癌細(xì)胞的納米殼聚糖超聲微泡的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種靶向前列腺癌細(xì)胞的納米殼聚糖超聲微泡，包括殼聚糖外殼和包裹在殼聚糖外殼內(nèi)的低沸點(diǎn)惰性物，在殼聚糖外殼上連接有靶向性的前列腺特異性抗體。其結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。

所述低沸點(diǎn)惰性物為十二氟戊烷、氮?dú)狻朔?、六氟化硫中的一種以上。

采用本發(fā)明的靶向納米超聲微泡，其殼聚糖外殼上的特異性抗體，具有靶向性好、分子較為穩(wěn)定等眾多優(yōu)點(diǎn)，因此，殼聚糖外殼與上述特異性抗體結(jié)合之后，能夠具有靶向性，從而實(shí)現(xiàn)組織靶向性高、穿透力強(qiáng)、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。

一種靶向前列腺癌細(xì)胞的納米殼聚糖超聲微泡采用(油/水/油)復(fù)合乳液-溶劑蒸發(fā)法制備，具體制備步驟如下：

1)將殼聚糖、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨與3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸羥基琥珀酰亞胺酯進(jìn)行混合，加熱反應(yīng)，得到改性殼聚糖；向改性殼聚糖中加入的前列腺抗體，采用磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)體系pH，繼續(xù)反應(yīng)，得到殼聚糖-前列腺特異性抗體復(fù)合物；所述pH為6.3～6.8，優(yōu)選為6.5，調(diào)節(jié)pH的物質(zhì)為磷酸鹽緩沖溶液，優(yōu)選pH＝6.5的磷酸鹽緩沖溶液使得體系的pH保持不變；

2)將低沸點(diǎn)惰性物、殼聚糖-前列腺特異性抗體復(fù)合物與水?dāng)嚢杌旌?，得到初乳?/p>

3)向油相溶劑中加入分散劑和助劑，混合均勻，加入初乳，高速攪拌，加入交聯(lián)劑進(jìn)行固化，得到固化產(chǎn)物；

4)向固化產(chǎn)物中加入沉淀劑進(jìn)行沉淀，洗滌，高速離心，將顆粒進(jìn)行干燥，得到靶向前列腺癌細(xì)胞的納米殼聚糖超聲微泡。

步驟1)中所述殼聚糖、甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨與3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸羥基琥珀酰亞胺酯質(zhì)量比為(40-60):(20-40):(20-40)。

步驟1)中所述加熱反應(yīng)的條件為于50-60℃下反應(yīng)4～8h，優(yōu)選為6h。

步驟1)中所述的前列腺抗體與改性殼聚糖的質(zhì)量比為(80-100)：30，優(yōu)選摩爾比為1:1；所述前列腺抗體購(gòu)買自上海瑞齊科技有限公司，型號(hào)為Rsm-1625M，所述前列腺抗體為PSA抗體、PSMA抗體中的一種或兩種。

步驟1)中所述繼續(xù)反應(yīng)的條件為于50-60℃下反應(yīng)3～8h。

步驟2)中所述低沸點(diǎn)惰性物與水相的質(zhì)量比為(10-40)：(5-30)，所述水相是指殼聚糖-前列腺特異性抗體復(fù)合物與水，殼聚糖-前列腺特異性抗體復(fù)合物與水的質(zhì)量比為(5-10)：(10-25)；所述攪拌混合的時(shí)間為1-2h。

步驟3)中所述初乳中低沸點(diǎn)惰性物、油相溶劑和交聯(lián)劑的質(zhì)量比為(10-40)：(30-80)：(0-5)；所述高速攪拌的轉(zhuǎn)速為6000-10000r/min，高速攪拌的時(shí)間為1-2h，所述固化的時(shí)間為2-5h，優(yōu)選為3h。

步驟3)中所述油相溶劑、分散劑與助劑的質(zhì)量比為(30～80)：(5～15)：(5～15)。

步驟4)中所述沉淀劑為異丙醇，所述沉淀劑加入后需攪拌均勻，然后進(jìn)行靜置沉淀；所述洗滌是指分別用異丙醇、蒸餾水洗滌3-5次，所述高速離心的轉(zhuǎn)速為6000-20000rpm；所述干燥是指冷凍干燥，冷凍的溫度優(yōu)選為-20℃。

步驟2)中所述低沸點(diǎn)惰性物即內(nèi)核油相為十二氟戊烷、氮?dú)?、八氟丙烷、六氟化硫中的一種以上；步驟3)中所述油相溶劑為蓖麻油，分散劑為吐溫60；助劑為正丁醇；所述交聯(lián)劑為戊二醛。

進(jìn)一步地，上述殼聚糖與連接的抗體包括PSA抗體、PSMA抗體(商業(yè)藥品試劑，上海瑞齊科技有限公司，型號(hào)為Rsm-1625M)中的一種或兩種的混合。

所述靶向前列腺癌細(xì)胞的納米超聲微泡的粒徑為400-800納米。

所述靶向前列腺癌細(xì)胞的納米超聲微泡用于超聲顯影的領(lǐng)域，特別是前列腺癌細(xì)胞的超聲顯影。

本方法將特異性抗體連接到微泡的外殼上，充分發(fā)揮抗體的特異性，并令微泡具有特異性的特點(diǎn)，從而達(dá)到對(duì)特定部位增強(qiáng)超聲顯影的目的。

相比與現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：

(1)所制備微泡粒徑范圍在400-800納米之間，即其組織穿透力強(qiáng)；

(2)使用前列腺特異性抗體接枝后的微泡具有靶向性定位前列腺癌細(xì)胞、穩(wěn)定性好、組織穿透力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；

(3)所制備超聲微泡在超聲波作用下，利用超聲微泡的聲學(xué)非線性效應(yīng)，可獲取高對(duì)比度的管腔影像，成像效果好，可以觀察管腔的結(jié)構(gòu)形態(tài)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的靶向前列腺癌細(xì)胞的納米超聲微泡的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為實(shí)施例1制備的靶向前列腺癌細(xì)胞的納米超聲微泡的光學(xué)顯微鏡圖(放大倍數(shù)為100倍)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

1)將40重量份殼聚糖、20重量份甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、20重量份3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸羥基琥珀酰亞胺酯進(jìn)行混合，60℃下反應(yīng)6小時(shí)，得到季銨化的改性殼聚糖；向改性殼聚糖中加入30重量份前列腺特異性抗體PSA抗體(上海瑞齊科技有限公司，型號(hào)為Rsm-1625M)，加入pH＝6.5的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖溶液，使體系的pH＝6.5，60℃下反應(yīng)4小時(shí)，得到殼聚糖-前列腺特異性抗體復(fù)合物；

2)將10重量份十二氟戊烷、5重量份殼聚糖-前列腺特異性抗體復(fù)合物和10重量份蒸餾水，混合均勻后，反應(yīng)1.5h，形成初乳；

3)在40重量份蓖麻油中加入10重量份吐溫60并滴加10重量份正丁醇作為有機(jī)相，60rpm攪拌均勻，然后加入初乳，10000r/min轉(zhuǎn)速下攪拌1h后，加入5重量份戊二醛作為交聯(lián)劑，固化3h，得到固化產(chǎn)物；

4)向固化產(chǎn)物中加入10重量份沉淀劑異丙醇，10000r/min攪拌0.5h，靜置沉降，除去沉淀的大顆粒，再分別用異丙醇、蒸餾水洗滌2次，然后14000rpm高速離心，棄去上清液，收集固體顆粒，-20℃真空冷凍干燥三天，得到粉末狀殼聚糖超聲微泡即靶向前列腺癌細(xì)胞的納米超聲微泡。

該微泡的包封率為90.2％，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，該微泡具有靶向前列腺癌細(xì)胞作用；粒徑為500-790nm；超聲影像中，明顯增強(qiáng)顯影；微泡的光學(xué)顯微鏡圖如圖2所示(放大倍數(shù)為100倍)。

實(shí)施例2

1)將50重量份殼聚糖、30重量份甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、20重量份3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸羥基琥珀酰亞胺酯進(jìn)行混合，60℃下反應(yīng)6小時(shí)，得到季銨化的改性殼聚糖；向改性殼聚糖中加入30重量份前列腺特異性抗體PSA抗體(上海瑞齊科技有限公司，型號(hào)為Rsm-1625M)，加入pH＝6.5的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖溶液,,使體系的pH＝6.5，60℃下反應(yīng)4小時(shí)，得到殼聚糖-前列腺特異性抗體復(fù)合物；

2)將40重量份氮?dú)狻?0重量份殼聚糖-前列腺特異性抗體復(fù)合物和20重量份蒸餾水，混合均勻后，反應(yīng)1.5h，形成初乳；

3)在40重量份蓖麻油中加入10重量份吐溫60并滴加10重量份正丁醇作為有機(jī)相，60rpm攪拌均勻，然后加入初乳，10000r/min轉(zhuǎn)速下攪拌lh后，加入5重量份戊二醛作為交聯(lián)劑，固化3h，得到固化產(chǎn)物；

4)向固化產(chǎn)物中加入10重量份異丙醇，10000r/min攪拌0.5h，靜置沉降，除去沉淀的大顆粒，再分別用異丙醇、蒸餾水洗滌2次，然后14000rpm高速離心，棄去上清液，收集固體顆粒，-20℃真空冷凍干燥三天，得到粉末狀殼聚糖超聲微泡即靶向前列腺癌細(xì)胞的納米超聲微泡。

該微泡的包封率為85.2％，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，該微泡具有靶向前列腺癌細(xì)胞作用，粒徑為400-600nm，超聲影像中，明顯增強(qiáng)顯影。

實(shí)施例3

1)將60重量份殼聚糖、20重量份甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、20重量份3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸羥基琥珀酰亞胺酯進(jìn)行混合，60℃下反應(yīng)6小時(shí)，得到季銨化的改性殼聚糖；向改性殼聚糖中加入30重量份前列腺特異性抗體PSMA抗體(商業(yè)藥品試劑，上海瑞齊科技有限公司，型號(hào)為Rsm-1625M)，加入pH＝6.5的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖溶液,,使體系的pH＝6.5，60℃下反應(yīng)4小時(shí)，得到殼聚糖-前列腺特異性抗體復(fù)合物；

2)將40重量份八氟丙烷、5重量份殼聚糖-前列腺特異性抗體復(fù)合物和25重量份蒸餾水，混合均勻后，反應(yīng)1.5h，形成初乳；

3)在40重量份蓖麻油中加入10重量份吐溫60并滴加10重量份正丁醇作為有機(jī)相，60rpm攪拌均勻，然后加入初乳，10000r/min轉(zhuǎn)速下攪拌lh后，加入5重量份戊二醛作為交聯(lián)劑，固化3h，得到固化產(chǎn)物；

4)向固化產(chǎn)物中加入10重量份異丙醇，10000r/min攪拌0.5h，靜置沉降，除去沉淀的大顆粒，再分別用異丙醇、蒸餾水洗滌3次，然后14000rpm高速離心，棄去上清液，收集固體顆粒，-20℃真空冷凍干燥三天，得到粉末狀殼聚糖超聲微泡即靶向前列腺癌細(xì)胞的納米超聲微泡。

該微泡的包封率為80.3％，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，該微泡具有靶向前列腺癌細(xì)胞作用，粒徑為550-800nm，超聲影像中，明顯增強(qiáng)顯影。

實(shí)施例4

1)將40重量份殼聚糖、30重量份甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨、30重量份3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸羥基琥珀酰亞胺酯進(jìn)行混合，60℃下反應(yīng)6小時(shí)，得到季銨化的改性殼聚糖；向改性殼聚糖中加入30重量份前列腺特異性抗體PSMA抗體(上海瑞齊科技有限公司，型號(hào)為Rsm-1625M)，加入pH＝6.5的磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖溶液,,使體系的pH＝6.5，60℃下反應(yīng)4小時(shí)，得到殼聚糖-前列腺特異性抗體復(fù)合物；

2)將30重量份六氟化硫、10重量份殼聚糖-前列腺特異性抗體復(fù)合物和20重量份蒸餾水，混合均勻后，反應(yīng)1.5h，形成初乳；

3)在40重量份蓖麻油中，加入10重量份吐溫60并滴加10重量份正丁醇作為有機(jī)相，60rpm攪拌均勻，然后加入初乳，10000r/min轉(zhuǎn)速下攪拌lh后，加入5重量份戊二醛作為交聯(lián)劑，固化3h，得到固化產(chǎn)物；

4)向固化產(chǎn)物中加入10重量份異丙醇，10000r/min攪拌0.5h，靜置沉降，除去沉淀的大顆粒，再分別用異丙醇、蒸餾水洗滌/3次，然后14000rpm高速離心，棄去上清液，收集固體顆粒，-20℃真空冷凍干燥三天，得到粉末狀殼聚糖超聲微泡即靶向前列腺癌細(xì)胞的納米超聲微泡。

該微泡的包封率為86.7％，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，該微泡具有靶向前列腺癌細(xì)胞作用，粒徑為500-780nm，超聲影像中，明顯增強(qiáng)顯影。