專利名稱：雙靶標(biāo)/多靶標(biāo)小核酸治療眼部疾病的組合物及應(yīng)用的制作方法
雙靶標(biāo)/多靶標(biāo)小核酸治療眼部疾病的組合物及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明主要涉及一種核苷酸藥物，特別涉及一種雙靶標(biāo)/多靶標(biāo)的小核酸雞尾酒藥物，應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)來治療眼部疾病如糖尿病視網(wǎng)膜病變等。
背景技術(shù)：
糖尿病視網(wǎng)膜病變是全球范圍內(nèi)引發(fā)勞動力人口失明最常見的原因。該疾病主要通過損害眼部光敏感的視網(wǎng)膜組織的小血管，引起視網(wǎng)膜中央附近即斑點(diǎn)部位的液體泄漏，引發(fā)黃斑水腫。斑點(diǎn)為一些如閱讀、駕駛和人臉識別等活動提供中央視覺，黃斑水腫病人視網(wǎng)膜組織膨脹，如不及時治療將導(dǎo)致失明。
除了糖尿病視網(wǎng)膜病變，其他大量的眼部疾病也是由于過量血管增生(NV)所致， NV是眼內(nèi)血管異常的增殖和生長。眼部NV本身就有許多副作用，也是許多嚴(yán)重眼病的早期病理學(xué)步驟，盡管有新的治療方法和制劑出現(xiàn)，但對于這些眼部NV病人幾乎沒有多少可供選擇的治療方法。
美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)下屬國立眼科研究所(NEI)估計(jì)，有40萬美國人患有不同種類的眼部皰疹，每年有5萬名新生或者復(fù)發(fā)病例，其中更嚴(yán)重的基質(zhì)角膜炎大約占了 25%。一項(xiàng)更大規(guī)模的研究表明，眼部皰疹的年復(fù)發(fā)率是10%，兩年復(fù)發(fā)率是23%，20年內(nèi)的復(fù)發(fā)率高達(dá)63%。雖然抗病毒藥物可以在一定程度上控制單純皰疹病毒(HSV)感染，但在治療HSV引起的基質(zhì)角膜炎和保護(hù)病人免遭失明方面沒有效果。
我國眼部疾病主要以眼部炎癥、白內(nèi)障、青光眼、干眼病視疲勞、近視眼為主，各疾病癥狀患病率絕對值均不高(在2. 5%。左右)。但隨著人口的增長和老齡化的發(fā)展，我國眼科疾病發(fā)病率呈上升態(tài)勢。據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)年鑒及對醫(yī)生的實(shí)地調(diào)查，患病率最高的眼科疾病依次為白內(nèi)障、青光眼、視網(wǎng)膜病、屈光不正、結(jié)膜病、眼外傷。而視網(wǎng)膜脫落與斷裂為患病率居第三的眼科疾病，該病患者占眼科患者比例接近15%。
眼部血管增生(NV)疾病可分為影響眼睛前部和影響眼睛后部(視網(wǎng)膜)兩種，不同部位的NV有不同的原因，但其生物化學(xué)和生理學(xué)特征幾乎是一樣的，與眼睛部位無關(guān)。因此，能有效干擾眼部NV生化過程的方式將可以有效治療任何NV為主要病因或潛在病因的眼部疾病，不管疾病損害的是眼睛前部還是眼睛后部。
眼部血管增牛的牛物化學(xué)和牛理學(xué)與其他組織類似，眼部組織需要持續(xù)的營養(yǎng)供給，因此需要新血管生成，這一過程通過促進(jìn)因子和抑制因子之間的平衡而保持平衡。然而，許多眼部血管增生疾病不能正確地維持平衡，導(dǎo)致?lián)p傷性新生血管過度生長。盡管病理學(xué)和失明的誘因差異很大，但這一過度增生過程幾乎是一致的，與眼睛或疾病的區(qū)域無關(guān)。病理學(xué)的共同特征給大量眼部疾病的治療提供了有效的干預(yù)方式。
正常眼角膜是無血管的，HSV本身也不表達(dá)任何血管新生蛋白，但是感染眼部組織后表達(dá)血管生長因子從而誘導(dǎo)角膜血管增生(NV)。血管生長因子最初由病毒感染的角膜表皮、非炎癥細(xì)胞產(chǎn)生，接著由基質(zhì)內(nèi)的炎癥細(xì)胞(中性粒細(xì)胞PMN和巨噬細(xì)胞)表達(dá)。通過植入純化的HSV病毒DNA片段(HSV DNA,富含CpG結(jié)構(gòu)域)或合成的CpG寡聚核苷酸(CpG 0DN)，建立HSV誘導(dǎo)的角膜血管增生模型。這一模型已成為角膜血管增生和單純皰疹病毒性基質(zhì)角膜炎疾病的臨床研究模型，有利于檢測抑制眼部血管增生疾病的的治療效果。
一種較好的干擾治療方式是抑制這些疾病共同的病理學(xué)因素。大量研究表明， VEGF介導(dǎo)的血管新生和血管再生是許多眼部血管增生疾病發(fā)生的最主要原因。VEGF介導(dǎo)的血管新生在所有NV相關(guān)的眼部疾病的血管增生中起到核心作用。VEGF家族包括五個結(jié)構(gòu)相關(guān)的生長因子VEGF-A、胎盤生長因子(PIGF )、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D。已知的受體包括三種結(jié)構(gòu)同源的酪氨酸激酶受體，VEGFR-1 (Flt-1 )、VEGFR-2 (KDR或Flk-1)和VEGFR-3 (Flt-4)，這些受體與不同的VEGF有不同的親和力，具有不同的功能。目前，對四種VEGF的功能和調(diào)控機(jī)制了解較少，僅知道VEGF-A和VEGFR-2結(jié)合誘導(dǎo)血管新生和血管再生，也增加血管通透性。
是正常血管形成和新生血管重塑過程中起重要作用的生長因子，某些疾病條件下，如腫瘤發(fā)生時，形成新血管用于傳輸氧和養(yǎng)分促進(jìn)非正常組織的快速生長，此時VEGF 新生血管途徑被激活。眼內(nèi)表達(dá)血管新生蛋白VEGF與人體血管增生紊亂及小鼠中缺血引起的視網(wǎng)膜血管增生密切相關(guān)。因此，由VEGF和VEGF受體組成的VEGF信號通路，是抑制視網(wǎng)膜血管新生的合理靶標(biāo)。
在理解了 VEGF血管新生信號通路中關(guān)鍵因子后，目前許多研究采用VEGF-A的抑制劑作為候選治療制劑，用于治療眼部血管增生疾病。單獨(dú)使用這類制劑或者與激光治療聯(lián)合，有明顯的臨床治療效果，能促進(jìn)視覺恢復(fù)。這些制劑包括Ranibizumab (Lucentis)> Pegaptanib sodium (Macugen)和 Bevacizumab (Avastin),所有這些 VEGF 抑制劑通過阻斷 VEGF蛋白功能而起作用。Macugen 是一種抑制VFGE與其受體結(jié)合的適體寡聚核苷酸。盡管這些眼部血管新生的研究，與其他如腫瘤生長之類的血管新生疾病證明了 VEGF通路的臨床治療價(jià)值，但目前的實(shí)驗(yàn)制劑對許多病人依然無效。很明顯，需要開發(fā)更好的VEGF通路抑制劑來治療這些眼部疾病。
在內(nèi)皮增殖中上調(diào)，這可能是對VEGF-A或缺氧的直接反應(yīng)。一般認(rèn)為VEGFR-2是血管生長的血管新生信號，在人體中名為激酶插入?yún)^(qū)受體(KDR)，小鼠中名為胎肝激酶-1 (Flk-1)，是受體酪氨酸激酶(RTK)家族ΠΙ的一員。VEGFR-2包含7個細(xì)胞外免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個包含激酶插入序列的細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域。VEGFR-2 的表達(dá)基本僅限于內(nèi)皮細(xì)胞，全長的VEGFR-2前體蛋白包含1356個氨基酸，其中有19個氨基酸為信號肽。VEGFR-2與VEGF高親和力結(jié)合，在腫瘤血管新生和其他包含病理性血管新生的疾病中發(fā)生重要作用。采用中和抗體或小分子酪氨酸激酶受體(TKR)抑制劑阻斷 VEGFR-2能破壞血管新生、阻止腫瘤侵襲。
大量研究證實(shí)VEGF在新血管形成中起到核心作用，但令人費(fèi)解的是，VEGF拮抗劑的治療效果卻有限。最近，研究表明轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-bl)與新血管形成有關(guān)，Smad-4 (mothers against decapentaplegic protein homo log 4,一種細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子)在 TGF-b信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起最重要的作用。一項(xiàng)研究顯示氧誘導(dǎo)的新生小鼠視網(wǎng)膜病與視網(wǎng)膜中 TGF-b和Smad-4的mRNA表達(dá)上升有關(guān)，也有研究發(fā)現(xiàn)TGF_b能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。例如，用TGF-bl刺激人二倍體成纖維細(xì)胞將引發(fā)出現(xiàn)SIPS的生物標(biāo)志物，如細(xì)胞衰老β -半乳糖苷酶(SA-β -Gal)的活性，同時衰老相關(guān)基因Apo J、纖粘連蛋白(fibronectin、FN)和平滑肌22 (SM22)的mRNA水平穩(wěn)定上升。不同細(xì)胞系的體外研究顯示TGF-bl受到氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)，因此，有假設(shè)認(rèn)為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的早衰是TGF-bl表達(dá)上升引起的。之前有研究顯示哺乳動物衰老過程中視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(RPE)發(fā)生衰老，而體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)人RPE細(xì)胞暴露在高濃度氧中將發(fā)生凋亡。老年黃斑變性(AMD)是否發(fā)生RPE細(xì)胞衰老還不清楚， 組織化學(xué)檢測表明AMD病人RPE細(xì)胞中的TGF-bl表達(dá)量增加。使用TGF-bl的中和抗體治療，能夠阻止氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的衰老生物標(biāo)志物的上升。另一方面，TGF-bl也是一種促炎癥因子，參與組織疤痕形成，被懷疑為抗血管增生治療中視網(wǎng)膜疤痕形成的一個原因。因此， 敲低VEGF通路的多種因子或在敲低VEGF通路因子的同時抑制(或沉默)TGF-bl將是治療眼部疾病如糖尿病視網(wǎng)膜病變和AMD的新手段。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用核酸干擾(RNAi)介導(dǎo)的抑制基因表達(dá)和生化途徑來獲得對眼病有效的治療。RNAi制劑包括雞尾酒小核酸寡聚核苷酸來抑制(I) VEGF和VEGFR-2、(2)促炎癥因子TGF-bl。
本發(fā)明提供的組合物，有包含二種小核酸分子和藥物載體的，該二種小核酸分子靶向的基因選自VEGF基因、VEGFR2基因、TGF-b I基因中的二種；也有包含三種小核酸分子和藥物載體的，該三種小核酸分子靶向的基因分別為VEGF基因、VEGFR2基因、TGF_b I基因。
干擾(RNA interference, RNAi),是由雙鏈RNA寡聚核苷酸促進(jìn)的序列特異性的信使R NA (mRNA)降解的過程，經(jīng)常被稱為“基因沉默”。這一強(qiáng)有力的方法已經(jīng)被證實(shí)是基因功能發(fā)現(xiàn)和確證的重要工具，也有巨大的潛力成為新的基因特異性藥物。在我們的抑制眼部血管增生的抗血管新生RNAi設(shè)計(jì)中，選擇了 VEGF-A、VEGFR_2和TGF-bl。根據(jù)Tuchl 研究團(tuán)隊(duì)提出的通用規(guī)則設(shè)計(jì)小干擾RNA (小核酸)，為21個核苷酸長度的雙鏈RNA，3’末端有2個懸浮的堿基突出，其中的負(fù)鏈與靶向的mRNA序列互補(bǔ)。敲低這些基因中的一個或多個的表達(dá)，對阻斷血管新生通路抑制NV有重要作用，可減輕基質(zhì)角膜炎的癥狀。同樣的方法也適用于NV相關(guān)的其他眼部疾病。
過量而有害的眼部血管增生是一個復(fù)雜的過程，通常涉及多個生化信號通路，因此，干擾一個靶點(diǎn)或一條通路還不足以完全控制疾病的病理學(xué)(血管增生)。本發(fā)明提供的是聯(lián)合干擾方式，即同時干擾一條生化信號通路的多個靶標(biāo)，或者干擾多個信號通路，或者兩種方式同時采用(干擾多個信號通路，每個信號通路的多個靶標(biāo))。例如，本發(fā)明提供了干擾VEGF通路的多個靶標(biāo)，包括聯(lián)合VEGF-A和VEGFR-2的小核酸，甚至更進(jìn)一步提出了干擾包括VEGF信號通路的多個信號通路。本發(fā)明也提供了這些聯(lián)合的組合治療方式，例如 VEGF通路和TGF-b通路的小核酸的聯(lián)合。這種聯(lián)合具有抗血管新生和抗疤痕形成的效果， 疤痕是糖尿病視網(wǎng)膜病變病人的常見問題，因?yàn)榭寡苄律委熞鸬膫坛３?dǎo)致視覺損害，而外科手術(shù)去除這些傷疤非常麻煩還不一定有效。
截至目前，沒有報(bào)道過用于將RNAi制劑導(dǎo)入眼血管增生部位的合適的技術(shù)，包括我們在本發(fā)明中采用的HKP也沒有報(bào)道過。因此，對能夠用作RNAi制劑導(dǎo)入眼部血管增生部位的專有核酸導(dǎo)入系統(tǒng)存在巨大需求。對RNAi機(jī)制的理解及其快速擴(kuò)展的應(yīng)用是過去十年生物醫(yī)藥領(lǐng)域一項(xiàng)最主要的突破。使用小核酸干擾特定基因的表達(dá)需要將小核酸送至靶位點(diǎn)，但正是因?yàn)槿鄙儆行У膶⑿『怂徇\(yùn)輸至眼部NV疾病部位的載體系統(tǒng)而限制了小核酸的應(yīng)用。隨著小核酸作為基因功能研究工具的高速發(fā)展，越來越多的研究將小核酸作為一種新的治療方式。時至今日，已經(jīng)有二十多個小核酸藥物正在進(jìn)行臨床評估。但將小核酸作為治療藥物依賴于有效的局部和系統(tǒng)導(dǎo)入方法。小核酸作為治療藥物的優(yōu)勢是具有特異性、穩(wěn)定性、高效性等特點(diǎn)，作用機(jī)理也是天然的，還有因?yàn)榘邢虿煌虻男『怂岫际呛塑账嵝蛄卸哂谢瘜W(xué)性質(zhì)的均一性。
我們采用一種基于多肽的組氨酸-賴氨酸聚合物(HKP)作為體內(nèi)外導(dǎo)入小核酸的載體。這一技術(shù)(參見專利WO 0147496，內(nèi)容以引文的方式并入本發(fā)明中)能夠大幅降低小鼠中CpG和單純皰疹病毒感染引起的角膜血管增生及缺氧引起的視網(wǎng)膜血管增生。為評估眼部組織分布情況，采用了大白耳兔模型。我們在小核酸設(shè)計(jì)及其實(shí)驗(yàn)的成功顯示了 RNAi 方法在治療如糖尿病黃斑水腫、老年黃斑病變、單純皰疹性基質(zhì)角膜炎和其他血管新生疾病等糖尿病視網(wǎng)膜病變上具有很好的療效。
除了采用HKP作為藥物載體外，本發(fā)明還能采用其他陽離子多肽。一類多肽是第五個氨基酸殘基連接有組氨酸或咪唑單體的多聚線性賴氨酸。另一類多肽是分枝狀的多聚賴氨酸和第五個氨基酸殘基連接有組氨酸或咪唑單體的多聚分枝狀賴氨酸。還有一類多肽是含組氨酸-組氨酸-賴氨酸(HHK)三肽或組氨酸-組氨酸-賴氨酸-賴氨酸(HHKK)四肽的聚合物，聚合物可以是線狀或分枝狀，分枝狀聚合物的單體可以與另一個單體的第一個或第五個氨基結(jié)合，或者同時與兩個氨基結(jié)合。優(yōu)選那些30%-70%賴氨酸單體的伯胺基上結(jié)合有組氨酸或咪唑的多聚賴氨酸。多聚賴氨酸聚合物優(yōu)選分子量在5000-100000，更優(yōu)選分子量為10000-30000。帶2-10倍的過量正電荷的多肽，能與帶負(fù)電的核苷酸治療制劑自動形成復(fù)合物。
在藥物載體中，一類接枝聚合物是連接有親水性聚合物的多肽，親水性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、聚卩惡唑啉(polyoxazoline)、聚縮醒(polyacetal,某些情形下也稱為柔性水泥Fleximer)、甲基丙烯酸輕基丙基酯(HPMA)和聚丙三醇(polyglycero l)。另一類接枝聚合物是連接的親水性聚合物上還含有配體的接枝聚合物，配體包括多肽、糖類、維生素、營養(yǎng)素和抗體，或者這些物質(zhì)的組分。帶2-10倍的過量正電荷的陽離子接枝聚合物能自動與帶負(fù)電的核苷酸治療制劑形成復(fù)合物，優(yōu)選攜帶2-6倍正電荷的接枝聚合物。
藥物載體中的非天然的合成的陽離子聚合物含有乙烯亞氨基(-C-C-N-)，包括聚 [I惡唑啉(polyoxazoline)和聚乙烯亞胺(PEI)。線性或分枝狀聚卩惡唑啉或PEI含衍生的組氨酸或咪唑單體，優(yōu)選連接的組氨酸或咪唑單體中30%_70%的殘基(basic moiety)是咪唑的聚合物，優(yōu)選分子量在5000-100000的聚合物，更優(yōu)選分子量為10000-30000的聚合物。 帶2-10倍的過量正電荷的陽離子非天然合成聚合物和帶負(fù)電的核苷酸治療制劑能自動形成復(fù)合物，優(yōu)選攜帶2-6倍正電荷的非天然合成聚合物。
藥物載體中還包括含有聚縮醛骨架結(jié)構(gòu)的陽離子聚合物，線性聚縮醛、分枝狀聚縮醛均含衍生殘基，殘基包括賴氨酸、伯胺基、組氨酸和咪唑單體的混合物。優(yōu)選連接的賴氨酸、伯胺基、組氨酸和咪唑單體中30%-70%的殘基是咪唑的聚合物，優(yōu)選分子量在 5000-100000的聚合物，更優(yōu)選分子量為10000-30000的聚合物。帶2_10倍的過量正電荷的陽離子聚縮醛和帶負(fù)電的核苷酸治療制劑能自動形成復(fù)合物，優(yōu)選攜帶2-6倍正電荷的聚縮醛。
藥物載體中的陽離子膠團(tuán)是嵌段聚合物，一段是親水聚合物，另一段是疏水聚合物，包括聚環(huán)氧丙烯，疏水的聚噁唑啉，疏水聚合物衍生的伯胺基或咪唑或伯胺基和咪唑， 疏水聚合物衍生的殘基(該殘基與治療制劑形成可被酶切的連接鍵，如_■硫鍵的疏基)， Schiff堿的醛基，酯中的酸或醇類。優(yōu)選的，膠團(tuán)是親水聚合物上連接有配體的嵌段聚合物，·體包括多肽、糖類、維生素、營養(yǎng)素和抗體，或者這些物質(zhì)的組分。帶2-50倍的過量正電荷的陽離子膠團(tuán)和帶負(fù)電的核苷酸治療制劑能自動形成復(fù)合物，優(yōu)選攜帶4-20倍正電荷的膠團(tuán)。
本發(fā)明提供的組合物，能夠制備成治療眼部疾病的藥物。該眼部疾病，包括增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病性黃斑水腫、單純皰疹病毒性基質(zhì)角膜炎、老年黃斑變性、葡萄膜炎、虹膜紅變、結(jié)膜炎、角膜炎、瞼緣炎、瞼腺炎、瞼板腺囊腫、虹膜炎、黃斑退化和視網(wǎng)膜病。該組合物的給藥位點(diǎn)為結(jié)膜下、玻璃體內(nèi)或皮下組織，給藥方式為局部給藥或注射給藥。組合物中小核酸介導(dǎo)的抗血管新生效果作用于眼部組織和血管增生疾病組織，抑制那些誘導(dǎo)有害的眼部血管增生的多個因子和生化途徑。
為了評估新型開發(fā)的抗血管增生制劑用于治療眼部血管增生(NV)疾病的效果，可以利用已發(fā)表的臨床相關(guān)的動物模型，如通過氧誘導(dǎo)過量視網(wǎng)膜血管生成的動物模型，或者是利用激光灼傷視網(wǎng)膜誘導(dǎo)血管新生的動物模型。臨床常用的角膜NV模型可以采用將前述的CpG植入角膜基質(zhì)的微袋或者用HSV感染獲得，在這些模型中檢測新生血管被抑制的效果也非常容易。候選制劑的效果可以先通過體外細(xì)胞培養(yǎng)檢測，接著用臨床相關(guān)的疾病動物模型選擇。
本發(fā)明組合物中的小核酸制劑，包括雙鏈的RNA (dsRNA)寡聚核苷酸(可以有末端突出堿基，也可以無末端突出堿基，可以是粘性末端，也可以是平末端)、小的頸環(huán)結(jié)構(gòu)的 RNA (shRNA)及DNA來源的RNA CddRNA)0小核酸是一種可用于敲低基因表達(dá)、以序列特異性方式毀壞mRNA的強(qiáng)有力工具，是一種快速持續(xù)地研究生物學(xué)功能的工具。小核酸制劑設(shè)計(jì)時，要保證核苷酸序列與靶基因的部分序列匹配(互補(bǔ)結(jié)合)，選定的小核酸序列可以與基因表達(dá)過程中的mRNA的任何部位匹配。小核酸包含的“反義鏈”序列能與靶基因的mRNA 雜交(互補(bǔ)結(jié)合)，同時還包含與反義鏈結(jié)合的“正義鏈”。選定的針對靶基因的小核酸序列不能與細(xì)胞內(nèi)任何除靶基因外的mRNA序列同源(即不能與任何其他mRNA互補(bǔ)結(jié)合)，小核酸所針對的序列也不能是那種無法轉(zhuǎn)錄成mRNA的序列。目前有大量的設(shè)計(jì)原則用于篩選 20到27個堿基對的靶向mRNA的小核酸序列，其中包含一些商業(yè)化的方法。這些設(shè)計(jì)方法不斷改善，使得最新的方法隨時可用。利用這些方法中可以設(shè)計(jì)出一系列首選的小核酸序列。本發(fā)明首先制備至少6種首選的小核酸序列，然后在培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測基因被抑制的程度，一般都可以選出至少兩種活性的小核酸序列。如果沒有篩選到活性小核酸，則進(jìn)行第二輪的設(shè)計(jì)和篩選。
除了鑒別活性的小核酸序列，設(shè)計(jì)過程中還要確保選定的小核酸只與靶標(biāo)的mRNA 序列同源。與靶基因mRNA序列之外的基因組序列同源性低的小核酸序列能在mRNA水平或基因水平降低脫靶效應(yīng)，小核酸中“正義鏈”與其他序列的同源性低也有利于減少脫靶效應(yīng)。通過Clone Manager Suite軟件的DNA比對和在線的BLAST (序列比對)搜索分析， 選定基因的靶序列應(yīng)該與包括人同源基因在內(nèi)的任何其它基因缺少同源性。例如，與小鼠mVEGF-A的mRNA匹配的序列應(yīng)該是獨(dú)特的只針對mVEGF-A的，而不能與其他mVEGF-B、 mVEGF-C、mVEGF-D匹配，也不能與人體中同源的hVEGF165_a(AF486837)相匹配。然而，匹配序列可以針對 mVEGF-A 的多個亞型(isoform)，例如 mVEGF (M95200)、mVEGF115 (U502791 )、 mVEGF-2 (S38100)和 mVEGF-A (NM_192823)，這些同形物分別編碼 190 個氨基酸(aa)、141 個aa、146個aa和148個aa的mVEGF-A。所有已發(fā)表的mVEGF-A亞型的cDNA序列，除了 mVEGF-A (NM_192823，成熟的蛋白形式)外，在N末端均有一個26個氨基酸(aa)的信號肽。 因此，靶向mVEGF的mRNA的小核酸序列不能選在信號肽區(qū)域，而應(yīng)該選擇所有mVEGF-A亞型共有的編碼成熟蛋白的區(qū)域。靶向mVEGFR-2的小核酸序列也經(jīng)過相同的方法確定。本發(fā)明包含不同形式的干擾RNA分子，例如，根據(jù)抑制的規(guī)則設(shè)計(jì)的針對上述靶基因序列的小核酸序列是25個堿基對的平末端寡聚核苷酸序列，參見表1-3。
制劑針對基因序列的特異性依賴于預(yù)期要靶向的機(jī)體(動物)種類。多數(shù)哺乳動物基因都含有大量的同源序列，使得RNAi制劑可以抑制多個物種的同源基因的表達(dá)。我們優(yōu)先采用同源性的小核酸抑制劑，既可以抑制人基因的mRNA，也可以抑制實(shí)驗(yàn)動物的mRNA。 用來檢測的動物模型是眼部患病動物，并且應(yīng)該是經(jīng)常用于藥效學(xué)和毒理學(xué)研究的動物， 如小鼠、兔或猴。
序列依賴性的脫靶效應(yīng)至少需要17個核苷酸(nt)與其它非靶基因序列同源，對于25個堿基對的小核酸來說，分別需要對8種17 nt的的核苷酸序列進(jìn)行比對(Blast)，看是否存在序列依賴性的脫靶效應(yīng)，并將這一信息作為最終選擇小核酸治療制劑中的小核酸藥物中間體(API)的一項(xiàng)重要參數(shù)。
我們盡量在小核酸候選藥物中排除那些能在體內(nèi)外通過Toll樣受體(TLR)通路激活干擾素反應(yīng)的免疫刺激結(jié)構(gòu)域(富含⑶的結(jié)構(gòu)域，5’-UGUGU-3’或5’-GUCCUUCAA-3’)。 最終，我們描繪出每種小核酸針對的mRNA的靶向區(qū)域，這對于理解小核酸候選藥物是否能準(zhǔn)確靶向靶標(biāo)mRNA及其替代轉(zhuǎn)錄本非常重要。
本發(fā)明提供的組合物用于治療眼睛前部或者后部的血管增生疾病，眼部的任何組織都能通過新生血管靶向的導(dǎo)入制劑治療，本發(fā)明中的給藥方式包括局部給藥、眼睛局部給藥和末梢位點(diǎn)的靜脈注射給藥。本發(fā)明中，眼睛前部的治療，可以采用結(jié)膜下注射的局部給藥方式治療，或者眼睛局部給藥治療，或者眼周注射治療，或者眼內(nèi)注射治療，或者末梢位點(diǎn)的靜脈注射治療。本發(fā)明的組合物包括I)通過靜電相互作用與核酸結(jié)合的陽離子制劑，包括非天然的合成的聚合物、接枝聚合物、嵌段共聚物、多肽、脂質(zhì)體和膠團(tuán)， 2)減少組織和細(xì)胞非特異性吸附的親水制劑，包括非天然的合成的聚合物、多肽和糖類，3)組織和細(xì)胞滲透劑，包括表面活性劑、多肽、非天然的合成的聚合物和糖類，4)磷硫酰 (Phosphorothioate)、硼燒憐酸酯(Boranophosphate)、甲基勝酸酯(Methylphosphonate) 和磷酸二酯(Phosphodiester)修飾的小核酸寡聚核苷酸。
本發(fā)明提供了成熟的將包括小核酸在內(nèi)的治療制劑送至細(xì)胞和組織的導(dǎo)入載體， 該載體可以保護(hù)核酸免遭降解及促進(jìn)組織和細(xì)胞對治療制劑的吸收。將RNAi或其他帶負(fù)電荷的制劑與本發(fā)明中的導(dǎo)入載體聯(lián)合，細(xì)胞能大量吸收治療制劑，內(nèi)源靶基因的表達(dá)也被抑制。本發(fā)明使用局部給藥的方式，將小核酸和其它治療制劑導(dǎo)入眼部治療眼部疾病，包括基質(zhì)感染、角膜血管新生、基質(zhì)角膜炎和葡萄膜炎等。盡管局部給藥比系統(tǒng)給藥的擴(kuò)散性強(qiáng)，也有因感染或刺激導(dǎo)致炎癥的風(fēng)險(xiǎn)，局部導(dǎo)入給藥依然是臨床上優(yōu)選的方式，例如，在治療嚴(yán)重血管增生(NV)或快速生長的腫瘤時都是如此。本發(fā)明也整合了增加組織吸附和通過角膜內(nèi)皮的滲透性的制劑，這一組合制劑通過滴眼液的形式局部給藥。
本發(fā)明的組合物中，小核酸或其他治療制劑可以通過局部給藥、局部注射或靜脈注射(1. V.)給藥來治療眼部血管增生疾病。


圖1顯示了 25個堿基對的平末端小核酸與21個堿基對粘末端小核酸對VEGF基因抑制的效果比較。(A)首先分別從6條小核酸中擇最有效的21和25個堿基對的小核酸， 然后利用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen, CA)體外轉(zhuǎn)染表達(dá)人VEGF的兩株細(xì)胞系 (DLD-1結(jié)腸癌細(xì)胞和MBA-MD-435乳腺癌細(xì)胞)，RT-PCR技術(shù)檢測。O. 3yg或2. Oyg劑量下，25個堿基對小核酸比21個堿基對小核酸表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制活性，特別是2. 0μ g劑量差別更明顯。(B)在MCF-7/VEGF165細(xì)胞中比較25個堿基對的平末端小核酸與21個堿基對粘末端小核酸抑制基因表達(dá)的效果。轉(zhuǎn)染后5天檢測VEGF的表達(dá)水平，25個堿基對的平末端小核酸確實(shí)比21個堿基對的粘末端小核酸更有效。
圖2為選擇靶向VEGF的最有效的小核酸。八條針對VEGF的25堿基對的小核酸及對照小核酸轉(zhuǎn)染人293細(xì)胞和小鼠F3細(xì)胞，分別用小核酸轉(zhuǎn)染相應(yīng)的細(xì)胞，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)基因標(biāo)靶對照，接著進(jìn)行Q -RT-PCR分析。體外研究表明選定的最有效的小核酸(hmVEGFc)具有高效敲低人和小鼠細(xì)胞中靶基因的巨大活性。
圖3為鑒別靶向VEGFR-2的最有效的小核酸。用Invitrogen公司的基于網(wǎng)頁的小核酸設(shè)計(jì)工具BLOCK-1T RNAi Designer來設(shè)計(jì)25個堿基對的平末端小核酸?；诮换ナ降乃惴?，用戶可以選擇系統(tǒng)設(shè)定參數(shù)或用戶自定義參數(shù)來選擇小核酸序列。將靶標(biāo)mRNA 序列或靶標(biāo)基因在基因庫(GenBank)中的編號輸入程序中，每個靶基因mRNA能夠得到10 條以上一星級到五星級的25堿基對的小核酸候選序列。星級越高的候選小核酸,理論上敲低革El基因的效果更好。通過BLOCK-1T RNAi Designer或我們自己的算法,我們選擇了八條 25個堿基對的平末端小核酸。接著，將這些小核酸轉(zhuǎn)染小鼠SVR細(xì)胞后進(jìn)行Q-RT-PCR分析 (A)，或者轉(zhuǎn)染人HUVEC細(xì)胞后進(jìn)行ELISA分析(B)。通過電轉(zhuǎn)方式將八條VEGFR-2的小核酸及對照的針對綠色熒光蛋白的25堿基對的Luc-小核酸(7 μ g小核酸/I ' IO6個細(xì)胞) 轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48小時，收集HUVEC細(xì)胞開展hVEGFR-2的ELISA實(shí)驗(yàn)，檢測細(xì)胞裂解液中VEGFR-2的濃度(每孔加入的裂解蛋白量為3 mg)。數(shù)據(jù)均以“平均值土標(biāo)準(zhǔn)差”(Mean 土 STD)的方式列出。ELISA方法選定的有效的25個堿基對的小核酸將進(jìn)一步用于后期的腫瘤動物模型研究。選定的VEGFR-2特異性的最有效的小核酸是VEGFR2-h。
圖4為設(shè)計(jì)和選擇靶向TGF- β I的最有效的小核酸。選擇25個堿基對的平末端小核酸是基于其活性和效力的持久性，每種小核酸序列能靶向人和小鼠的同源基因。在用相應(yīng)的細(xì)胞檢測這些小核酸(由Qiagen合成)之前，先簡單的用人PC-3細(xì)胞測試，因?yàn)樵摷?xì)胞能表達(dá)(預(yù)期要通過小核酸來敲低的)三個靶標(biāo)基因(Α)，同時也在小鼠C166細(xì)胞中測定 TGF-β I的表達(dá)(B)。為篩選每個靶基因的八條小核酸，首先將小核酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，接著提取總RNA進(jìn)行Q-RT-PCR分析，選擇抑制TGF- β I表達(dá)的最有效的小核酸。以持家基因核糖體蛋白S15 (rig/S15)擴(kuò)增的361 bp的片段來校正樣品濃度，選定的hmTF25f序列如表3所/Jn ο
圖5顯示了用于小核酸導(dǎo)入的組氨酸-賴氨酸分枝狀聚合物。經(jīng)過優(yōu)化的分枝狀組氨酸-賴氨酸聚合物(HKP)已經(jīng)被廣泛用于體外和體內(nèi)導(dǎo)入小核酸,其中的H3K4b具有一個賴氨酸骨架結(jié)構(gòu)，有四個包含重復(fù)的組氨酸和賴氨酸的分支結(jié)構(gòu)。以N/P (氮磷比)質(zhì)量比為4:1的比例，H3K4b用于小核酸的包裹。用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察自動形成的納米顆粒(平均直徑為150 nm)。
圖6顯示HKP-小核酸納米顆粒的表征。采用90Plus Nanoparticle Size Distribution Analyser (納米顆粒粒徑分布分析儀,Brookheaven Instruments Limited, NY)檢測HKP-小核酸，結(jié)果表明制備的HKP-小核酸納米顆粒平均直徑是159. 9 nm CA), Zeta電位為38 (B)，這些結(jié)果與SEM分析的結(jié)果一致。
圖7顯示HKP包裹有利于促進(jìn)結(jié)膜下小核酸的導(dǎo)入。在結(jié)膜下注射小鼠眼睛評估小核酸導(dǎo)入效率之前，F(xiàn)ITC標(biāo)記的小核酸與HKP自動形成納米顆粒。標(biāo)記的小核酸經(jīng)眼睛結(jié)膜下(SCJ)給藥后24小時能在角膜切片中觀察到(A)，而同樣給要的不含HKP的FITC標(biāo)記SiClab信號微弱(B)。箭頭所指為FITC標(biāo)記的小核酸的位置。
圖8顯示系統(tǒng)和局部導(dǎo)入的抗血管新生活性比較。給藥后第4天，比較HKP介導(dǎo)的靶向VEGF、VEGFRl和VEGFR2的小核酸雞尾酒的局部導(dǎo)入和不同的納米顆粒載體(配體導(dǎo)向聚合物，LDP)介導(dǎo)的系統(tǒng)導(dǎo)入效果。對照組、裸露的小核酸和包裹的小核酸均使用HKP或 LDP 檢測。N=6, * 表示 ρ〈0· 05, ** 表示 ρ〈0· 01。
圖9顯示玻璃體內(nèi)注射后小核酸的分布。在兔眼部模型中通過玻璃體內(nèi)注射H3標(biāo)記的小核酸來評估小核酸的分布情況。注射后24小時和72小時，處死動物收集組織，解剖左眼收集房水、虹膜、玻璃體液、視網(wǎng)膜和鞏膜(包括脈絡(luò)膜)。用液體閃爍波譜分析每個樣品的放射性活性。注射裸露的小核酸(2 mg)和HKP-小核酸(250 μ8)，72小時后，HKP-小核酸組中水晶體和視網(wǎng)膜中小核酸的濃度明顯高于裸露小核酸組。
圖10顯示玻璃體內(nèi)注射HKP-小核酸后的控釋和視網(wǎng)膜聚集。(A)注射后24小時和72小時，從所有組織樣品中回收小核酸，黃色為裸露的小核酸，藍(lán)色代表HKP-小核酸，兩個時間點(diǎn)后者的回收率都明顯高于前者。(B)視網(wǎng)膜中的小核酸的定量，紅色為裸露的小核酸，綠色代表HKP-小核酸，后者明顯更多聚集于視網(wǎng)膜內(nèi)。
圖11顯示用小鼠ROP模型分析小核酸雞尾酒治療后FITC灌注的視網(wǎng)膜。缺氧誘導(dǎo)的眼部血管增生模型第17天后典型的FITC灌注視網(wǎng)膜。第I組為不接受治療組，第2 組為玻璃體內(nèi)注射的HKP-小核酸_tMl對照組，第4組為結(jié)膜下注射的HKP-小核酸_tMl 對照組，第5組為正常對照組，第6組為玻璃體內(nèi)注射的HKP-小核酸雞尾酒治療組，第8組為結(jié)膜下注射的HKP-小核酸雞尾酒治療組，其中第6組通過視網(wǎng)膜分離觀察可以看到明顯的抗新血管生成作用。
圖12顯示用小鼠ROP模型分析比較小核酸雞尾酒治療后的典型的組織切片。缺氧誘導(dǎo)的眼部血管增生模型第17天后典型的組織切片圖。第I組為不接受治療組，第2組為玻璃體內(nèi)注射的HKP-小核酸_tMl對照組，第4組為結(jié)膜下注射的HKP-小核酸_tMl對照組，第5組為正常對照組，第6組為玻璃體內(nèi)注射的HKP-小核酸雞尾酒治療組，第8組為結(jié)膜下注射的HKP-小核酸雞尾酒治療組，其中第6組的切片血管染色更少，表明具有更好的抗新血管生成的治療效果。
圖13顯示mRNA水平的靶基因敲低。HKP包裹的小核酸雞尾酒通過玻璃體內(nèi)注射缺氧誘導(dǎo)的眼部血管增生模型，通過Q-RT-PCR檢測每個靶基因的mRNA水平。從結(jié)果可以看出，使用相應(yīng)小核酸處理后的VEGF和VEGFR2的mRNA水平明顯低于對照組。
圖14顯示蛋白水平的靶基因敲低。HKP包裹的小核酸雞尾酒通過玻璃體內(nèi)注射到缺氧誘導(dǎo)的眼部血管增生模型，通過ELISA檢測每個靶基因的蛋白水平。從結(jié)果可以看出， 使用相應(yīng)小核酸處理后的VEGF和VEGFR2的蛋白水平明顯低于對照組。
圖15顯示HKP介導(dǎo)的TGF- β I小核酸導(dǎo)入導(dǎo)致快速的傷口愈合。HKP-TGF- β I 小核酸治療組傷口愈合速率明顯提高，快速的傷口愈合是靶標(biāo)基因的沉默所致。
圖16顯示HKP-TGF-β I小核酸治療后疤痕形成更少。組織學(xué)分析表明，與不治療的傷口皮膚相比，HKP-TGF-β I小核酸治療后的傷口表皮結(jié)構(gòu)與正常皮膚結(jié)構(gòu)十分接近。 箭頭所指為皮膚傷口區(qū)域的疤痕大小。
圖17顯示用于小核酸導(dǎo)入的第一代納米顆粒。我們已經(jīng)開發(fā)和獲得了一系列用于促進(jìn)小核酸導(dǎo)入的臨床可用納米顆粒材料，并取名為Snano系列載體。Snano-1是基于 HKP的系統(tǒng)，Snano-2是樹枝狀大分子(Dendrimer)系統(tǒng)，Snano-3是基于聚(乳酸-輕基乙酸)共聚物PLGA的系統(tǒng)，Snano-4是小分子量的聚乙二醇-聚乙酰亞胺(PEG-PEI)共聚物， Snano-5是陽離子脂質(zhì)體S-DOTAP, Snano-6是基于亞精胺(spermidine)的系統(tǒng)。
圖18顯示小核酸寡聚體的化學(xué)修飾。為了提高小核酸的穩(wěn)定性，盡量降低其副作用(如脫靶效應(yīng))，采用了如圖中所示的各種化學(xué)修飾硫磷酰、硼烷、甲基膦酸酯、磷酸二酯。修飾位置可以是2-0-甲基化或2-0-甲氧乙烷基(2-0-M0E)，這些修飾的結(jié)構(gòu)如圖所/Jn ο
圖19為新藥臨床試驗(yàn)申請(IND)的設(shè)計(jì)與流程。我們已經(jīng)針對HKP-小核酸制劑治療眼部疾病設(shè)計(jì)了流程 圖，包括新藥臨床試驗(yàn)申請所需的主要任務(wù)和流程。三個方面的任務(wù)包括(DHKP-小核酸的劑型工藝確認(rèn)；(2)藥理學(xué)和毒理學(xué)研究；(3)活性藥物中間體(API)和輔料的化學(xué)、制備與控制(CMC)。
具體實(shí)施方式
具體實(shí)施例1 :25個堿基對長度的小核酸比21個堿基對的小核酸效果更好盡管最初的研究主要是利用化學(xué)合成的19和21個堿基對的小核酸雙鏈，但有證據(jù)表明23、25、27個堿基對的小核酸雙鏈都比19和21個堿基對的寡核苷酸雙鏈表現(xiàn)出了更好的抑制活性。更長的小核酸(23個堿基對或更長)所具有的潛在激活干擾素效應(yīng)是一種依賴于細(xì)胞類型的現(xiàn)象。我們發(fā)現(xiàn)，在MBA-MD-435或DLD-1細(xì)胞系及攜帶腫瘤的動物模型中， 25個堿基對的帶有平末端的小核酸雙鏈具有最好的抑制效果。我們針對人VEGF基因?yàn)榘袠?biāo)的25個堿基對的小核酸hVEGF-25c (正義鏈鏈5’ -UUGGUCUGCAUUCACAUUUGUUGUG-3’)進(jìn)行了檢測，并與已被測試過很多次的、被認(rèn)為最有效的 21 個堿基對的 VEGF 序列 hVEGF-21a (正義鏈5’ -UCGAGACCCUGGUGGACAUTT-3’ ；反義鏈5’ -AUGUCCACCAGG⑶CUCGATT-3’ )進(jìn)行了比較，前者顯示比后者更強(qiáng)的抑制效果。在培養(yǎng)細(xì)胞模型中，用Q-RT-PCR技術(shù)(圖1A)檢測顯示25個堿基對的帶有平末端的小核酸雙鏈比21個堿基對粘末端小核酸更有效。而ELISA分析蛋白表達(dá)水平(圖1B)也表明，兩種長度的小核酸對VEGF表達(dá)抑制具有顯著的差異。
具體實(shí)施例2 :詵擇特異件針對人和小鼠VEGF mRNA的小核酸依據(jù)專有的以計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的算法，我們針對VEGF設(shè)計(jì)了小核酸(表1)，它們具有如下特征a.最佳熱力學(xué)特征；b.增強(qiáng)與RISC的結(jié)合能力；c.消除免疫激活結(jié)構(gòu)域；d. 具有人鼠同源性；e.通過已有知識產(chǎn)權(quán)搜索序列；f.使用blast盡量避免“脫靶效應(yīng)”;g. 能作為小核酸雞尾酒藥物。通過Q-RT-PCR (MyiQ，Bio-Rad)檢測選擇針對每個基因的最有效的小核酸。用于體外細(xì)胞培養(yǎng)研究的25個堿基對小核酸由Qiagen (Germantown,MD)合成，更大量的用于動物疾病模型體內(nèi)研究的小核酸由Dharmacon (Bolder, CO)合成。用于篩選最有效小核酸的細(xì)胞系應(yīng)該是能夠表達(dá)靶基因的細(xì)胞系，例如，人293細(xì)胞和小鼠F3 細(xì)胞用于選擇VEGF特異性的小核酸(圖2)。經(jīng)過試驗(yàn)，選擇了靶向VEGF的最有效小核酸， 即 hmVEGFc (正義鏈5’ -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’ )作為活性藥物中間體(API)用于VEGF基因的沉默。
具體實(shí)施例3 :詵擇特異件針對人和小鼠VEGFR-2 mRNA的小核酸依據(jù)專有的電子計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的算法，我們針對VEGFR-2設(shè)計(jì)了小核酸(表2)，它們具有如下特征a.最佳熱力學(xué)特征；b.增強(qiáng)與RISC的結(jié)合能力；c.消除免疫激活結(jié)構(gòu)域；d.具有人鼠同源性；e.通過已有知識產(chǎn)權(quán)搜索序列；f.使用blast盡量避免“脫靶效應(yīng)”;g.能作為小核酸雞尾酒藥物。通過Q-RT-PCR (MyiQ，Bio-Rad)檢測選擇針對每個基因的最有效的小核酸。用于體外細(xì)胞培養(yǎng)研究的25個堿基對小核酸由Qiagen(Germantown, MD)合成,更大量的用于動物疾病模型體內(nèi)研究的小核酸由Dharmacon (Bolder, CO)合成。 用于篩選最有效小核酸的細(xì)胞系應(yīng)該是能夠表達(dá)靶基因的細(xì)胞系，小鼠SVR細(xì)胞轉(zhuǎn)染小核酸后，提取總RNA進(jìn)行Q-RT-PCR分析(圖3A)，人HUVEC細(xì)胞轉(zhuǎn)染小核酸后，分離蛋白進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)(圖3B)。經(jīng)過試驗(yàn)，選擇了靶向VEGFR-2的最有效小核酸，SP hmVR2h (正義鏈5 ’ -GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA-3 ’)作為活性藥物中間體(API)用于 VEGFR-2基因的沉默。
具體實(shí)施例4 :詵擇特異件針對人和小鼠TGF- β I mRNA的小核酸依據(jù)專有的電子計(jì)算機(jī)為基礎(chǔ)的算法，我們針對TGF-β I設(shè)計(jì)了小核酸(表3)，它們具有如下特征a.最佳熱力學(xué)特征；b.增強(qiáng)與RISC的結(jié)合能力；c.消除免疫激活結(jié)構(gòu)域；d.具有人鼠同源性；e.通過已有知識產(chǎn)權(quán)搜索序列；f.使用blast盡量避免“脫靶效應(yīng)”;g.能作為小核酸雞尾酒藥物。通過Q-RT-PCR(MyiQ，Bio-Rad)檢測選擇針對每個基因的最有效的小核酸。用于體外細(xì)胞培養(yǎng)研究的25個堿基對小核酸由Qiagen(Germantown, MD)合成,更大量的用于動物疾病模型體內(nèi)研究的小核酸由Dharmacon (Bolder, CO)合成。 用于篩選最有效小核酸的細(xì)胞系應(yīng)該是能夠表達(dá)靶基因的細(xì)胞系，例如，人PC3細(xì)胞(圖 4A-B)和小鼠C166細(xì)胞(圖4B)用于選擇TGF-β I特異性的小核酸。經(jīng)過試驗(yàn)，選擇了靶向 TGF-β I 的最有效小核酸，即 hmVEGFc (正義鏈5’ -GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG-3’)作為活性藥物中間體(API)用于TGF-β I基因的沉默。
具體實(shí)施例5 :詵擇小核酸組合物作為候詵藥物為了充分利用本發(fā)明中新型的聯(lián)合兩種小核酸或三種小核酸的藥物制劑模式，提高小核酸治療的效果，我們制定了如下的組合藥物(I)組合 I VEGF-VEGFR-2 小核酸VEGF 特異性的小核酸 hmVEGFc :5’ -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’(正義鏈)與VEGFR-2 特異性的小核酸 hmVR2h :5’-GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA-3’(正義鏈)組合的雙靶標(biāo)小核酸作為活性藥物中間體(API)。
(2)組合 2 :VEGF-TGF-β I 小核酸VEGF 特異性的小核酸 hmVEGFc :5’ -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’(正義鏈)與 TGF-β I 特異性的小核酸 hmTF25f :5’ -GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG-3’(正義鏈)組合的雙靶標(biāo)小核酸作為活性藥物中間體(API)。
(3)組合 3 VEGF-VEGFR-2-TGF-^ I 小核酸VEGF 特異性的小核酸 hmVEGFc :5’ -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’(正義鏈)、 VEGFR-2 特異性的小核酸 hmVR2h :5’-GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA_3’(正義鏈)與 TGF-β I 特異性的小核酸hmTF25f :5’ -GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG-3’(正義鏈)組合的三靶標(biāo)小核酸作為活性藥物中間體(API)。
具體實(shí)施例6 HKP~小核酸能自動形成納米顆粒經(jīng)過優(yōu)化的分枝狀組氨酸-賴氨酸聚合物(HKP)已經(jīng)被廣泛用于體外和體內(nèi)導(dǎo)入小核酸，其中兩種HK聚合物，H3K4b和H3K (+H) 4b，具有一個賴氨酸骨架結(jié)構(gòu)，有四個包含重復(fù)的組氨酸、賴氨酸和天冬酰胺的分支。當(dāng)這種HKP水溶液與小核酸以N/P (氮磷比)質(zhì)量比為 4 :1混合時,將自動組裝形成平均直徑為100-200 nm的納米顆粒(圖5)。在Ranin Voyager 合成器上(PTI，Tucson，AZ)合成具有理想分支的組 氨酸-賴氨酸聚合物HKP。研究中使用的兩類HKP粒子為具有(R)K(R) -K(R) -(R)K(X)結(jié)構(gòu)的H3K4b和PT73，其中H3K4b粒子中 R=KHHHKHHHKHHHKHHHK，而 PT73 粒子的 R= KHHHKHHHNHHHNHHHN, X=C (0)NH2, K=賴氨酸，H= 組氨酸，N=天冬酰胺。HKP水溶液與小核酸水溶液以4 1質(zhì)量比進(jìn)行混合，形成平均直徑為150-200nm的粒子。HKP-小核酸水溶液為半透明的，具有明顯的沉淀聚集現(xiàn)象，并且可以在4 °C的條件下儲存至少三個月。測定表征后的HKP-小核酸納米顆粒的直徑和Zeta電位 (圖6)，我們同時使用H3K4b和H3K(+H)4來對眼部和其它組織實(shí)施高效的小核酸導(dǎo)入。
具體實(shí)施例7 =HKP-小核酸能增強(qiáng)小鼠眼部小核酸的局部導(dǎo)入角膜血管新生模型此模型通過純化的HSV DNA (富含CpG)和/或合成的CpG寡聚核苷酸(CpG-ODN)誘導(dǎo)小鼠角膜表達(dá)VEGF，此模型具有典型的炎癥誘導(dǎo)型血管新生和淋巴管新生癥狀，這與臨床常見的角膜血管新生相似。隨時誘導(dǎo)并檢測新血管的形成，監(jiān)測新生血管區(qū)域和HSK疾病評分是評估小核酸的抗眼睛前部的血管新生的活性最有效的方法。本發(fā)明用這一方法檢測干擾RNA，并收集RNAi治療CpG誘導(dǎo)的基質(zhì)角膜炎(SK)的數(shù)據(jù)，提供定量數(shù)據(jù)，制造與人體HSV感染引起的SK相似的環(huán)境。
將CpG-ODN植入小鼠得到單純皰疹性基質(zhì)角膜炎模型，這是與臨床角膜血管增生相似的模型，具有典型的炎癥誘導(dǎo)的血管新生和淋巴管新生的特征。為了在CpG-ODN誘導(dǎo)的角膜炎癥模型中評估HKP納米顆粒導(dǎo)入小核酸的效果，通過結(jié)膜下注射(SCJ)FITC (異硫氰酸熒光素)標(biāo)記的小核酸，給藥24小時后觀察角膜切片的血管新生情況。觀察處理各組的組織切片，HKP-FITC標(biāo)記的小核酸主要聚集在角膜組織，而同樣給藥的不含HKP的處理組信號十分微弱(圖7)。這些結(jié)果是HKP有利于通過結(jié)膜下給藥促進(jìn)小核酸導(dǎo)入角膜的直接證據(jù)，大量的HKP-小核酸停留在注射位點(diǎn)，HKP-小核酸導(dǎo)入其它類型的組織也觀察到了同樣的現(xiàn)象。
具體實(shí)施例8 :小核酸雞尾酒顯示較強(qiáng)的抗新生血管活性將CpG-ODN植入小鼠和HSV感染得到單純皰疹性基質(zhì)角膜炎的方法如前所述，這是與臨床角膜血管增生相似的模型，具有典型的炎癥誘導(dǎo)的血管新生和淋巴管新生的特征。測定新生血管區(qū)域面積和HSK疾病評分是評估小核酸的抗眼睛前部的血管新生的活性最有效的方法。我們發(fā)現(xiàn)，分別敲低VEGF、VEGFRl和VEGFR2具有類似的抗血管新生作用，而將三種小核酸聯(lián)合起來同時敲低三個基因具有更強(qiáng)的抗血管新生活性。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在 CpG誘導(dǎo)的血管新生模型中HKP-小核酸雞尾酒比裸露的小核酸雞尾酒更有效果(圖8)。
具體實(shí)施例9 :玻璃體內(nèi)注射HKP-小核酸劑型導(dǎo)入兔子眼部大耳白兔模型這一模型用于小核酸玻璃體內(nèi)注射后的組織分布研究。給藥前，肌肉注射氯胺酮(ketamine)和賽拉嗪(xylazine)的混合鎮(zhèn)靜劑。接著用O. 9%的注射用氯化鈉(美國藥典，Baxter)配制的1:10000的苯扎氯銨溶液/殺藻胺50% NF (Spectrum Lab Products, Inc.，New Brunswick, NJ)溶液(相當(dāng)于0.1 mg/mL)沖洗結(jié)膜。對每只眼睛進(jìn)行局部麻醉(Alcain，0. 5%)，每次注射都用新的胰島素注射器(含預(yù)裝好的針頭)。兩只眼睛每次給藥的溶液體積是50 μ I/眼，用雙目間接檢眼鏡確認(rèn)針頭位置。分離左眼收集房水、 虹膜、玻璃體液、視網(wǎng)膜和鞏膜(包括脈絡(luò)膜)。
3標(biāo)記的小核酸用于兔子(大耳白兔)的給藥，O. 5 mg的H3標(biāo)記的小核酸以50 μ I 體積注射每只眼睛，雙目間接檢眼鏡確認(rèn)注射位置。治療后眼科醫(yī)師迅速檢測眼睛(間接檢眼鏡和裂隙燈檢查)，記錄任何可能有劑量流程引起的異常情況。檢查后，用硫酸慶大霉素滴眼液處理每只眼睛，如果眼科醫(yī)師認(rèn)為需要，則進(jìn)一步用眼部潤滑劑淚然點(diǎn)眼液(Tears Naturale , Alcon，F(xiàn)ort Worth, TX)處理。在預(yù)定的時間節(jié)點(diǎn)(注射后24小時和72小時) 通過注身寸 Euthanyl (Bimeda-MTC Animal Health Inc. , Cambridge, Ontario, Canada,劑量約為200 mg/kg)對動物實(shí)施安樂死,每個時間節(jié)點(diǎn)處死四只動物,收集組織樣品,完整摘除八只眼睛。解剖左眼收集房水、虹膜、玻璃體液、視網(wǎng)膜和鞏膜(包括脈絡(luò)膜)。所有樣品儲存于-80 °C。
放射性活性檢測記錄所有八個組織樣品，將樣品溶于四乙基氫氧化銨(TEAH) 中，溶解的樣品，或者取其中 一半，與液相閃爍溶液混合后，采用液體閃爍波譜分析檢測放射活性。每份樣品檢測5分鐘,任一樣品都首先觀察到了 0. 1%的偏差(two-sigma error)。 通過基于外部標(biāo)準(zhǔn)的自動淬滅校正，將所有計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)化為絕對的放射性活性(dpm)。將放射性活性小于或等于2倍背景值的樣品定義為零，所有放射性檢測都輸入標(biāo)準(zhǔn)的電腦數(shù)據(jù)庫程序(Debra Version 5. 2),計(jì)算放射性物質(zhì)的濃度(dpm/g和質(zhì)量單位eq/g)和每個樣品中放射性活性。放射性樣品活性首先表示為dpm/g，接著根據(jù)測定的給藥溶液中放射標(biāo)記物的特定活性(dpm/mg或合適的質(zhì)量單位)將其轉(zhuǎn)化為質(zhì)量eq/g (假定小核酸保持完整)。根據(jù)組織的總重量計(jì)算總組織含量。用SAS Version 8.1統(tǒng)計(jì)軟件估測非房室藥代動力學(xué)參數(shù)等眼部數(shù)據(jù)，包括濃度時間曲線下面積(AUC)、終末半衰期(tl/2el)、終末速度常數(shù)(kel)、 血藥峰濃度(Cmax)和達(dá)峰時間(Tmax)。其中Cmax根據(jù)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得,用梯形法計(jì)算AUC， 在濃度時間曲線末期選擇時間點(diǎn)進(jìn)行線性回歸分析計(jì)算kel。終末半衰期(tl/2el)的計(jì)算為tl/2el=ln2/kel。對于偏離超過10%的時間偏差，以實(shí)際的時間點(diǎn)來計(jì)算參數(shù)。圖9顯示了每個樣品在小核酸給藥后24小時和72小時的放射性活性。很明顯，盡管裸露小核酸注射量(2mg/眼)顯著高于HKP-小核酸(250μ8/眼)，給藥后72小時，HKP-小核酸組的小核酸回收量顯著高于裸露小核酸組。
具體實(shí)施例10 :HKP-小核酸納米顆粒增強(qiáng)小核酸的視網(wǎng)膜導(dǎo)入從H3標(biāo)記的小核酸兔眼部樣品發(fā)現(xiàn)，HKP-小核酸納米顆粒比裸露的小核酸更穩(wěn)定，不但HKP-小核酸的總回收率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于裸露的小核酸，H3標(biāo)記的HKP-小核酸在視網(wǎng)膜中的絕對數(shù)量也明顯高于H3標(biāo)記的裸露的小核酸。這些結(jié)果表明玻璃體內(nèi)注射HKP-小核酸能夠提高小核酸的穩(wěn)定性，使小核酸停留在視網(wǎng)膜組織中并富集(圖10)。注射后的第一天和第三天，小核酸在眼內(nèi)的組織分布顯著不同注射第I天小核酸主要集中于玻璃體內(nèi)，第3天轉(zhuǎn)移到水晶體和視網(wǎng)膜內(nèi)。而用HKP包裹小核酸后，轉(zhuǎn)移到水晶體和視網(wǎng)膜內(nèi)的小核酸更明顯。因此，我們推斷HKP-小核酸納米顆粒通過一種暫時未知的作用機(jī)制靶向進(jìn)入視網(wǎng)膜，非常有利于眼部疾病的治療。
具體實(shí)施例11 :在缺氧i秀導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型中觀察治療效果缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變(OIR)模型這一模型具有典型的病理性缺血和退行性的視網(wǎng)膜NV特性，如增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變和老年黃斑變性。通過熒光標(biāo)記的葡聚糖的心肌血流灌注檢測血管新生區(qū)域，接著采用視網(wǎng)膜分離，凍干切片，檢測mRNA和蛋白表達(dá)水平等來評估抗眼睛后部的血管新生活性。
缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變(OIR) C57BL/6小鼠模型購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)廣州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心。簡單地說，出生后第7天到第12天，高氧環(huán)境下(75% + 2氧氣)飼養(yǎng)新生小動物，然后轉(zhuǎn)入室內(nèi)空氣(正常氧氣濃度)，然后用通過不同途徑導(dǎo)入的HKP-小核酸納米顆粒處理。通過熒光素灌注/視網(wǎng)膜分離、組織切片染色評估OIR眼部血管增生模型，通過 RT-PCR分析mRNA水平，ELISA檢測蛋白含量。所有實(shí)驗(yàn)遵循中國的實(shí)驗(yàn)動物資源保護(hù)委員會、生命科學(xué)委員會和國家研究委員會的指導(dǎo)原則。
由于缺氧誘導(dǎo)的血管新生模型代表了一種缺血性和退行性脈絡(luò)膜血管增生(CNV) 癥狀，我 們用這一模型同時檢測局部(玻璃體內(nèi)注射)和系統(tǒng)(腹腔注射)給藥HKP-小核酸納米顆粒劑型的情況，以探索對早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病和老年黃斑變性的治療效果。結(jié)膜下和玻璃體內(nèi)注射作為HKP-小核酸雞尾酒劑型的局部給藥途徑，而因?yàn)橛仔游镂察o脈注射的劑量受到限制，故系統(tǒng)給藥途徑則從靜脈注射調(diào)整為腹腔注射。所有三種給藥途徑都以兩種方案給藥方案A :在出生后第12天和第13天分別給藥兩次；方案B :在第12天、第14天和第16天分別給藥三次。在第17天收集樣品，接著用熒光素標(biāo)記的葡聚糖進(jìn)行心肌血流灌注。比較分離的視網(wǎng)膜，發(fā)現(xiàn)方案A和方案B的玻璃體內(nèi)注射和腹腔注射給藥效果均很好，能減少50%的血管新生(圖11)。
具體實(shí)施例12 :通過HIR樽型的超薄組織切片樣品觀察療效上述缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變(HIR) C57BL/6小鼠，在第17天摘除眼球并冷凍于合適溫度的包埋化合物(Miles Diagnostics, PA，USA)中用于組織切片分析，眼部冰凍切片(10 Mm)用生物素化的牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行組織化學(xué)染色。將切片放入乙醇/雙氧水在 4°C放置10分鐘，用O. 05 M、pH為7. 6的Tris鹽緩沖液(TBS)清洗，接著在10%的正常牛血清中孵育30分鐘。切片孵育在生物素標(biāo)記的BSA中，接著加入親和素(Avidin)標(biāo)記的堿性磷酸酶(Vector Laboratories)和3，3’- 二氨基聯(lián)苯胺(DAB),然后用伊紅復(fù)染,并用 Cytoseal封片。為了進(jìn)行定量評估，用顯微鏡觀察15份BSA染色組織切片，并用數(shù)碼相機(jī)拍照。用 Image-Pro Plus 軟件(Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA)描繪視網(wǎng)膜表面的BSA染色的細(xì)胞，并測定區(qū)域面積。局部導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)中，每只眼的檢測作為單一實(shí)驗(yàn)值；系統(tǒng)導(dǎo)入中，兩只眼睛檢測的平均值作為單一實(shí)驗(yàn)值。
經(jīng)組織切片分析，檢測內(nèi)界膜(ILM)前部的BSA陽性細(xì)胞，從組織學(xué)上評估視網(wǎng)膜血管增生情況。兩種給藥方案中，玻璃體內(nèi)注射和腹腔注射給藥的樣品都取得了明顯的減少血管新生的效果(圖12)。這一有趣的現(xiàn)象從另一方面證實(shí)了腹腔注射HKP-小核酸雞尾酒，確實(shí)能夠通過血液循環(huán)到達(dá)視網(wǎng)膜，而結(jié)膜下注射導(dǎo)入HKP-小核酸雞尾酒不能有效穿過血視網(wǎng)膜屏障(BRB)而不能有效到達(dá)脈絡(luò)膜血管新生部位。
具體實(shí)施例13 :在mRNA水平證明RNAi作用機(jī)制有報(bào)道稱，有些小核酸會通過TLR3途徑引起序列和靶標(biāo)非依賴性的血管新生抑制， 然而我們在小鼠血管新生模型中，使用納米顆粒增強(qiáng)的小核酸導(dǎo)入，用mRNA特異性PCR (RS-PCR)和逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)檢測，并未觀察到這類現(xiàn)象。用RNAwiz (Ambion, #9736) 抽提細(xì)胞中的總RNA,在第14天和17天處死的小鼠用TRIzo試劑(Invitrogen, USA)提取總RNA。細(xì)胞質(zhì)RNA樣品用前述的mRNA特異性PCR (RS-PCR)檢測。每種mRNA的引物包含一個47個核苷酸的用于逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RTP)的引物、一個5’端基因特異性引物(GP)和一個3 ’端通用引物(5 ’ -GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATA-3 ’ )。每個基因擴(kuò)增所用引物如下 mVEGF : (RTP) 5’ -GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATAcaagctgcctcgccttg-3’，(GP)5’ -GATGTCTACCAGCGAAGCTACTGCCGTCCG-3,mVEGFR2 : (RTP) 5，-GAACATCGATGACAAGCTTAGGTATCGATaggtcactgacagaggcg-3，，(GP)5’ -GGCGCTGCTAGCTGT CGCTCTGTG GTTCTG-3’，字母小寫代表的序列為逆轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)特異性的序列。同時，通過甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)和β -肌動蛋白(β -actin)來定量mRNA樣品的含量，所有PCR產(chǎn)物用凝膠電泳進(jìn)行定量分析。
小鼠眼部血管增生模型切實(shí)地表明，通過局部或系統(tǒng)給藥，HKP-小核酸雞尾酒具有顯著的抗血管新生效果，接著我們也探討這一抗血管新生效果是否為小核酸介導(dǎo)的基因沉默引起。首先是查看是否有mRNA水平的序列和靶標(biāo)依賴性的基因沉默。用Q-RT-PCR分析HIR模型眼部組織的mRNA樣品，發(fā)現(xiàn)VEGF和VEGFR2的mRNA表達(dá)水平顯著降低(圖13)， 這是序列和靶標(biāo)依賴性的，與局部或系統(tǒng)給藥無關(guān)。另一有趣發(fā)現(xiàn)時HIR眼睛中VEGF表達(dá)量非常高，而VEGFR2表達(dá)量正常。而且，內(nèi)源性的VEGFR2的表達(dá)能夠通過納米顆粒-小核酸雞尾酒的作用在mRNA水平被抑制。
具體實(shí)施例14 :在蛋白水平證明RNAi作用機(jī)制我們也同時通過ELISA分析VEGF和VEGFR2在蛋白水平被敲低的程度。第14天和第17天處死小鼠收集視網(wǎng)膜，在細(xì)胞裂解液(哺乳動物細(xì)胞裂解試劑盒，Biotechnology Department Bio Basid Inc. , Canada)中勻衆(zhòng)化,上清經(jīng)BCA試劑盒(申能博彩生物科技有限公司，中國)定量后進(jìn)行ELISA分析。分別用針對VEGF和VEGFR2的鼠科Quantikine M 免疫試劑盒(R&D Systems Inc. , Minneapolis, MN)確定 VEGF 和 VEGFR2 的水平，每一組每個時間點(diǎn)分析6-12份樣品。
在小鼠眼部血管增生模型中觀察到局部或系統(tǒng)給藥的納米顆粒-simVmix (VEGF 小核酸和VEGFR2小核酸的混合)劑型的顯著的抗血管新生效果，接著我們也探討這一抗血管新生效果是否為小核酸介導(dǎo)的基因沉默引起。除了評估m(xù)RNA，我們也檢測蛋白水平的序列和靶標(biāo)特異性基因沉默情況。通過對HIR小鼠模型的眼部組織蛋白樣品進(jìn)行ELISA分析，發(fā)現(xiàn)靶標(biāo)基因的蛋白表達(dá)水平顯著降低(圖14)，這是序列和靶標(biāo)依賴性的，與局部給藥或系統(tǒng)給藥無關(guān)。兩種給藥方案中，在第14天和第17天兩個時間點(diǎn)分別檢測，表明HKP包裹的小核酸雞尾酒能有效抑制VEGF和VEGFR2的表達(dá)。在CpG誘導(dǎo)和單純皰疹病毒感染引起的小鼠血管增生模型中也觀察到了序列和靶標(biāo)依賴性的基因沉默。在我們整個研究過程中，無論是靶向單個基因還是多個基因，是局部局部給藥還是系統(tǒng)給藥，是視網(wǎng)膜血管增生模型還是角膜血管新生模型，都沒有觀察到其它報(bào)道中所說的序列非依賴性的抗血管新生活性。
具體實(shí)施例15 :小鼠模型中TGF-β I小核酸導(dǎo)致的傷口無疤痕愈合使用Avastin或Lucentis拮抗劑藥物進(jìn)行抗血管增生治療的缺點(diǎn)是視網(wǎng)膜組織會形成疤痕，這將嚴(yán)重影響藥物治療的效果，并導(dǎo)致視覺損害。為了在抗血管增生治療后的愈合過程中盡量減少疤痕形成，我們開發(fā)了用TGF-β I小核酸抑制促炎癥因子的方法。我們已經(jīng)證明，將TGF-β I小核酸用于小鼠表皮切割傷口模型治療時，能有效促進(jìn)傷口愈合并減少疤痕形成。靶向TGF-βΙ的HKP-小核酸，以甲基纖維素為輔料用于皮膚切割傷口的治療，與HKP-對照小核酸治療組和不含小核酸的HKP對照組相比，能明顯快速促進(jìn)傷口愈合(圖15)。取治療組和非治療組的皮膚樣品進(jìn)行三色染色 (Trichrome staining)和組織學(xué)分析,進(jìn)一步證實(shí)了促進(jìn)傷口愈合的作用(圖16)。與非治療組相比，HKP-TGF-β I小核酸治療后的組織結(jié)構(gòu)更接近正常皮膚組織?；诖罅课墨I(xiàn)報(bào)道和上述的實(shí)驗(yàn)證據(jù)，我們提出聯(lián)合靶向血管新生信號途徑的VEGF和VEGFR2 及TGF-β I信號途徑的多個小核酸來治療，這是一種全新的治療眼部血管增生疾病的方式。我們期望這樣的治療方式還包括HKP包裹的VEGF-TGF-β I小核酸組合VEGF 特異性小核酸 hmVEGFc :5’ -CUGUAGACACACCCACCCACAUACA-3’(正義鏈)與 hmTF25f 5’ -GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG-3’(正義鏈)聯(lián)合的雙靶標(biāo)小核酸作為活性藥物中間體 (API )，這不但能減少新生血管發(fā)生，還能使疤痕最小化，進(jìn)而保護(hù)和促進(jìn)病人視力。
具體實(shí)施例16 :用于眼部小核酸治療的第一代納米顆粒在核酸藥物開發(fā)過程中，有多種不同的多肽、聚合物、脂質(zhì)體和其它材料可用作小核酸的導(dǎo)入載體。我們將能夠與小核酸通過靜電相互作用自動形成納米顆粒的陽離子聚合物或脂質(zhì)體稱為第一代小核酸導(dǎo)入載體(圖17)。
即為Snano-1，是典型的第一代小核酸導(dǎo)入載體，帶正電荷的分枝狀組氨酸-賴氨酸多肽和帶負(fù)電荷的小核酸能夠形成非常均一的納米顆粒，實(shí)現(xiàn)高效的體內(nèi)導(dǎo)入。
聚乙二胺樹枝狀聚合物(PAMAM)，Snano_2，是一種定性清楚的高分枝的合成大分子，具有良好的生物相容性和非免疫原性，成為為各種治療制劑、成像制劑和小核酸這樣的寡聚核苷酸的獨(dú)特導(dǎo)入系統(tǒng)。G5 PAMAM樹枝狀聚合物在我們的小核酸的體內(nèi)外導(dǎo)入中非常有用。
是聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其它們的聚合物(PLGA)，因?yàn)槠渖锵嗳菪院蜕锟山到庑远饦O大關(guān)注。這類材料已經(jīng)成為一些如抗癌制劑、抗高血壓藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、激素等藥物和一些如核酸、蛋白、多肽、抗體等大分子的潛在載體。隨著傳統(tǒng)方法的進(jìn)步，選擇性也更多，一些新的用于裝在藥物的納米顆粒的制備技術(shù)也獲得開發(fā)和完善。我們已經(jīng)建立了制備直徑約200 nm的PLGA-小核酸納米顆粒的方法，實(shí)現(xiàn)了高效的小核酸體內(nèi)導(dǎo)入。
是聚乙二醇-聚乙酰亞胺(PEG-PEI)共聚物納米顆粒，已經(jīng)被用于體內(nèi)運(yùn)輸核苷酸和寡聚多肽。小分子量的PEI帶有正電荷，這是能與帶負(fù)電的小核酸形成納米顆粒的關(guān)鍵，小核酸中和了納米顆粒的正電荷，有利于降低毒性，因?yàn)轶w內(nèi)導(dǎo)入后過量的正電荷會導(dǎo)致凝集和非特異性吸附。聚乙二醇化后能進(jìn)一步提升PEG-PEI納米顆粒在血液中的循環(huán)時間。
使用DOTAP鏡像異構(gòu)體(enantiomer)來導(dǎo)入包括小核酸在內(nèi)的核酸具有不同的效果，我們發(fā)現(xiàn)用S-DOTAP (兩種DOTAP鏡像異構(gòu)體的一種)，更有利于小核酸在體外的轉(zhuǎn)染和在體內(nèi)(呼吸道追蹤)的導(dǎo)入。因此，我們設(shè)計(jì)用S-DOTAP作為Snano-5來將小核酸導(dǎo)入眼部。
我們在多種細(xì)胞和小鼠組織中測試了精胺和亞精胺為基礎(chǔ)的材料的體內(nèi)外導(dǎo)入效果，其中一種基于精胺的系統(tǒng)非常有利于小核酸轉(zhuǎn)染人A549細(xì)胞和呼吸道導(dǎo)入小核酸， 我們將其命名為Snano-6。
具體實(shí)施例17 :用于眼部治療的小核酸的化學(xué)修飾單鏈的核苷酸在血清或細(xì)胞內(nèi)將被快速降解，雙鏈核苷酸，包括小核酸，比對應(yīng)的單鏈核苷酸更穩(wěn)定，但是依然會被酶解，因此在藥物必須接觸血液的情況下，需要保護(hù)藥物免遭核酸酶的酶解作用。這些保護(hù)措施可以來自于外部的合適的導(dǎo)入載體(如我們在實(shí)施例16 中描述的，包含納米顆?；蛑|(zhì)體膠囊的復(fù)合物)，或者是來自于內(nèi)部的對核苷酸自身進(jìn)行抗核酸酶降解的修飾。最簡單的方法是直接修飾核苷酸間的磷酸連接增加穩(wěn)定性，采用硫 (PS)、硼(硼燒，boranophosphate)、氮(氨基磷酸酯，phosphoramidate)或甲基(甲基膦酸酯，methyIphosphonate)代替非橋鍵氧已經(jīng)用于穩(wěn)定反義的單鏈寡聚核苷酸。
圖18顯示了可提高小核酸核酸酶穩(wěn)定性的各種修飾方法，氨基磷酸酯和甲基膦酸酯的衍生物廣泛 用于反義核苷酸，可以顯著改變核苷酸與細(xì)胞內(nèi)酶如RNase H的相互作用。還沒有系統(tǒng)的研究將這些應(yīng)用拓展到RNAi領(lǐng)域。硼烷修飾的DNA或RNA有利于抵抗核酸酶的降解，硼修飾也不影響小核酸的功能，但是硼烷的化學(xué)合成相對困難。PS修飾更容易因此獲得廣泛應(yīng)用，可以提升反義單鏈核苷酸和小核酸的核酸酶穩(wěn)定性。
硫磷酰(Phosphorothioate)修飾的核酸是具有“粘性”的硫酸聚陰離子，能非特異性地與大量細(xì)胞內(nèi)蛋白結(jié)合，可能引起有害的副作用。盡管如此，這一修飾依然可安全用于小核酸的修飾。只在寡聚核苷酸的末端用最小程度的PS修飾，這有利于減少有害的副作用。鑒于反義核苷酸已經(jīng)有很長的使用PS修飾的歷史，對這一修飾的潛在毒性有很好的理解，PS修飾化合物的安全性也在可控范圍內(nèi)。
在核酸2號位上修飾能間接提升核苷酸間的磷酸鍵對核酸酶的抗性，同時能增加雙鏈的穩(wěn)定性(Tm)，甚至有利于避免遭受激活的免疫系統(tǒng)的攻擊。2-0-甲基化RNA(2-0Me) 是在哺乳動物核糖體RNA (rRNA)和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (tRNA)中發(fā)現(xiàn)的天然RNA變體，這種結(jié)構(gòu)沒有毒性，可用于修飾小核酸中的正義鏈或反義鏈。
氟修飾(2-F)不影響小核酸的功能，有利于雙鏈穩(wěn)定抵抗核酸酶的降解，在嘧啶上連接2-F能維持小核酸在體內(nèi)外的活性。甚至可以在Ago-2 (Argonaute,將長的雙鏈RNA 切割成小核酸的蛋白)切割的位點(diǎn)進(jìn)行2-F修飾。2-F修飾嘧啶和2-OMe修飾嘌呤同時使用將極大提高RNA雙鏈在血清中的穩(wěn)定性，提高在體內(nèi)的作用效果。
核酸鎖(LNA)包含一個亞甲基橋，將2-0與核糖的4_C連接起來，亞甲基橋“鎖住”3’內(nèi)向構(gòu)象中的糖，可顯著提高Tm和對核酸酶的抗性。大量的LNA修飾會導(dǎo)致小核酸活性下降(甚至比2-OMe修飾下降更多)，然而，少量的LNA修飾能保持小核酸的功能，并且明顯增強(qiáng)對核酸酶的穩(wěn)定性。
是天然發(fā)生的RNA變體，用在合成的小核酸中不會有明顯毒性，而其他種類的 2_修飾是非天然的，它們的毒副作用需要進(jìn)一步探討。已有大量研究將2-F修飾作為合成寡聚核苷酸的安全組分。
上述的修飾策略能夠保持21個堿基對小核酸雙鏈與RISC (RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)結(jié)合的能力，維持Ago2引導(dǎo)鏈的功能。我們用于治療眼部疾病的小核酸是25個堿基對的平末端小核酸，我們將聯(lián)合采用納米顆粒載體和一定程度上的化學(xué)修飾這兩種策略，以提升治療效果，盡量降低毒性及后期產(chǎn)品制備階段的復(fù)雜性。
具體實(shí)施例18 :小核酸治療與其它治療方法的聯(lián)合使用已經(jīng)有若干個治療藥物用于臨床，包括單克隆抗體藥物(Avastin和Lucentis)、可溶性受體制劑(VEGF trap)和其他藥物。由于我們的小核酸藥物采用不同的作用機(jī)理，即是通過抑制VEGF和VEGFR2蛋白的產(chǎn)生而不是等蛋白生成之后再阻斷其功能，因此理論上兩種不同作用機(jī)理的藥物聯(lián)合會有更好的效果。我們嘗試在同一給藥方案中將小核酸與單克隆抗體聯(lián)合使用，觀察到療效顯著提升。因此，在我們用小核酸治療眼部血管增生時，將考慮同時用小核酸和其它抑制劑聯(lián)合治療。最新研究發(fā)現(xiàn)了許多micro RNA (miRNA)參與血管增生疾病的血管新生過程，例如miR-132能作為抗miR或小核酸抑制劑的靶標(biāo)，使病理學(xué)逆轉(zhuǎn)。小核酸與抗miR制劑聯(lián)合也是治療眼部適應(yīng)癥的新方法。
具體實(shí)施例19 =HKP-小核酸藥物的開發(fā)過程小核酸治療藥物的開發(fā)與小分子和蛋白藥物等其他制劑的開發(fā)過程有一定差異，我們已經(jīng)建立了 HKP-小核酸制劑的生產(chǎn)制備流程(圖19)，進(jìn)行一系列藥理學(xué)和毒理學(xué)研究，以符合監(jiān)管機(jī)構(gòu)對藥品注冊審批的要求。
權(quán)利要求
1.包含二種小核酸分子和藥物載體的組合物，所述二種小核酸分子能與兩個靶基因的mRNA分子結(jié)合，所說的mRNA至少能編碼一部分多肽或蛋白質(zhì)，或者為5_’或3_’端的非翻譯序列，所述兩個靶基因選自VEGF基因、VEGFR2基因、TGF_bl基因中的二種。
2.包含三種小核酸分子和藥物載體的組合物，所述三種小核酸分子能與三個靶基因的mRNA分子結(jié)合，所說的mRNA至少能編碼一部分多肽或蛋白質(zhì)，或者為5_’或3_’端的非翻譯序列，所述三個靶基因分別為VEGF基因、VEGFR2基因、TGF-b I基因。
3.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中靶向VEGF基因的小核酸分子選自表I中的序列。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中靶向VEGF基因的小核酸分子為hmVEGFc,正義鏈5’ _r (CUGUAGACACACCCACCCACAUACA) -3’。
5.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中靶向VEGFR2基因的小核酸分子選自表2中的序列。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中靶向VEGFR2基因的小核酸分子為hmVR2h,正義鏈5’ _r (GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA) -3’。
7.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中靶向TGF-bl基因的小核酸分子選自表3中的序列。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中靶向TGF-bl基因的小核酸分子為hmTF25f，正義鏈5，-r(GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG)-3，。
9.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中小核酸的靶mRNA分子能編碼的基因來自VEGF信號通路，TGF-b信號通路，或者同時來自VEGF和TGF-b兩個信號通路。
10.如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述mRNA分子編碼VEGF、VEGFR2、TGF-bl蛋白，或5_’或3_’端的非翻譯序列。
11.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述藥物載體包括聚陽離子結(jié)合劑、陽離子脂質(zhì)體、陽離子膠團(tuán)、陽離子多肽、接枝狀親水聚合物、非天然陽離子聚合物、陽離子聚縮醛、親水性接枝狀聚縮醛、配體功能化的陽離子聚合物和配體功能化的親水性接枝狀聚合物。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中所述藥物載體為分枝狀組氨酸-賴氨酸聚合物HKP。
13.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述小核酸分子，包括小干擾核苷酸(smallinterfering RNA, siRNA)、微核苷酸(microRNA,miRNA)和雙鏈RNA( double stranded RNA,dsRNA)。
14.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述小核酸分子，具有粘性末端或平末端，該小核酸分子是未經(jīng)修飾的小核酸分子或者是經(jīng)過化學(xué)修飾的小核酸分子。
15.如權(quán)利要求14所述的組合物，其中所述小核酸分子具有19，或20，或21，或22，或23，或24，或25，或26，或27個核苷酸。
16.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，其中所述小核酸分子能抑制特定mRNA的表達(dá)，所述mRNA編碼的基因選自促炎癥途徑基因、促血管生成基因、促細(xì)胞增殖途徑基因、病毒感染性介質(zhì)基因組RNA或病毒感染性介質(zhì)基因。
17.如權(quán)利要求1或2所述的組合物，在制備成治療眼部疾病的藥物中的應(yīng)用。
18.如權(quán)利要求17所述的組合物，給藥位點(diǎn)為結(jié)膜下、玻璃體內(nèi)或皮下組織，給藥方式為局部給藥或注射給藥。
19.如權(quán)利要求17所述的組合物，其中所述眼部疾病，包括但不限于增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病性黃斑水腫、單純皰疹病毒性基質(zhì)角膜炎、老年黃斑變性、葡萄膜炎、虹膜紅變、結(jié)膜炎、角膜炎、瞼緣炎、瞼腺炎、瞼板腺囊腫、虹膜炎、黃斑退化和視網(wǎng)膜病。
20.如權(quán)利要求1所述的組合物，包括小核酸序列的組合:hmVEGFc，正義鏈5’-r(CUGUAGACACACCCACCCACAUACA) -3，和 hmVR2h,正義鏈5 ’ _r (GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA) -3，。
21.如權(quán)利要求1所述的組合物，包括小核酸序列的組合:hmVEGFc，正義鏈5’-r(CUGUAGACACACCCACCCACAUACA) -3，和 hmTF25f,正義鏈5 ’ _r (GAGGUCACCCGCGUGCUMUGGUGG) -3，。
22.如權(quán)利要求2所述的組合物，包括小核酸序列的組合hmVEGFc，正義鏈5’_r(CUGUAGACACACCCACCCACAUACA) -3’，hmVR2h,正義鏈5’ _r (GACUUCCUGACCUUGGAGCAUCUCA) -3’，和hmTF25f,正義鏈5’ _r (GAGGUCACCCGCGUGCUAAUGGUGG) -3’。
23.如權(quán)利要求12所述的組合物，其中所述藥物載體和所述小核酸分子的N:P比例在2:1 3:1，或 2 :1 4 :1，或 2 :1 5 :1，或 2:1 6:1 之間。
全文摘要
本發(fā)明公開了雙靶標(biāo)/多靶標(biāo)小核酸治療眼部疾病的組合物及應(yīng)用，該組合物，有包含二種小核酸分子和藥物載體的，該二種小核酸分子靶向的基因選自VEGF基因、VEGFR2基因、TGF-b1基因中的二種；也有包含三種小核酸分子和藥物載體的，該三種小核酸分子靶向的基因分別為VEGF基因、VEGFR2基因、TGF-b1基因。該組合物，通過用核酸干擾(RNAi)介導(dǎo)的抑制基因表達(dá)和生化途徑來獲得對眼病有效的治療，能夠制備成治療眼部疾病的藥物。該眼部疾病，包括增生性糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病性黃斑水腫、單純皰疹病毒性基質(zhì)角膜炎、老年黃斑變性、葡萄膜炎等。
文檔編號A61K31/7105GK103007291SQ20111028775
公開日2013年4月3日 申請日期2011年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月26日
發(fā)明者陸陽, 徐軍, 路陽, 唐盛高, 龍超峰, 陳小新, 謝稱石 申請人:蘇州圣諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司, 廣東眾生藥業(yè)股份有限公司