專利名稱：干擾素水凝膠制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有干擾素的水凝膠藥物制劑，具體地說，本發(fā)明涉及干擾素-β水凝膠緩釋制劑及其制備方法和該制劑的用途。
背景技術(shù)：
已證明重組蛋白質(zhì)藥物對以前不能治療的幾種疾病可提供獨特的治療作用，眾多新的蛋白質(zhì)類藥物正在開發(fā)中。
蛋白質(zhì)通常非胃腸道給藥，這將導(dǎo)致蛋白質(zhì)從循環(huán)系統(tǒng)中被快速消除。為了保持治療有效的血藥水平，常常要大劑量或頻繁給藥。這種方法不方便并且具有潛在的不良副作用，采用能持續(xù)或控釋蛋白質(zhì)的系統(tǒng)有可能避免上述問題。
持續(xù)釋放系統(tǒng)與大劑量(bolus doses)給藥相比，能獲得更加恒定的蛋白質(zhì)治療劑的血藥水平，從而改善藥效并減少不良副作用。這種藥物釋放系統(tǒng)包括可注射的油、乳液、懸浮液、脂質(zhì)體、微粒(微膠囊或微球體)、植入或凝膠系統(tǒng)。
用于藥物輸送的凝膠系統(tǒng)中，泊洛沙姆(Poloxamer)凝膠以其獨特的性能而用作原位熱固形成凝膠的物質(zhì)。泊洛沙姆是聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷的嵌段共聚物，已知可作為隨溫度升高其經(jīng)歷從低粘度狀態(tài)向高粘度轉(zhuǎn)變形成水凝膠的非離子表面活性劑，稱為“熱凝膠化”。
此外，泊洛沙姆具有良好的濕潤、防泡和促溶性能，在藥學和醫(yī)學上常用作為藥物輸送的運載體。(Guzmán等.，1992，International Journal ofPharmaceutics，80，119-127；Gander等，1986，Drug Dev.and Indust.Pharmacy，12(11-13)，1613-1623)。
泊洛沙姆的商品名稱為Pluronics，是一種三嵌段共聚物，具有以下結(jié)構(gòu)式(I)
其中(a)和(c)統(tǒng)計學上相等，(b)等于或大于15，(a+c)形成分子量的20-90％。
兩條聚環(huán)氧乙烷鏈(PEO)是親水性的，而聚丙烯鏈(PPO)為疏水的，對此PEO-PPO-PEO嵌段共聚物的兩性特性可以通過改變單元(a)和(b)的數(shù)目來調(diào)節(jié)。
由于兩性特性，PEO-PPO-PEO嵌段共聚物能通過自身聚集而形成各種交聯(lián)結(jié)構(gòu)，如微膠束、液晶態(tài)及微乳液。
在Pluronics中，泊洛沙姆407(LutrolF127或PluronicF127)是式(I)中(a)＝(c)＝99和(b)＝65的泊洛沙姆；泊洛沙姆338(LutrolF108或PluronicF108)是式(I)中(a)＝(c)＝16和(b)＝46的泊洛沙姆；已知道其20-35％濃度的水溶液有熱凝膠化性能(Guzmán等，1992，同上)。尤其是22-25％(w/w)的泊洛沙姆407聚合物溶液在較低溫度，如4-10℃時為液態(tài)；而溫熱至溫度超過其特性轉(zhuǎn)變溫度，例如18-20℃時，迅速形成高粘度的硬凝膠。這些凝膠例如已用于皮下注射，局部施用，氣溶膠的液體水凝膠制劑中，當其溫熱至體溫時可形成凝膠(Guzmán et al.，1992，above)。
已發(fā)現(xiàn)Poloxamer407凝膠能增強凝膠基質(zhì)中負載的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性(Stratton等，1997，Journal of Pharmaceutical sciences，86，9，1006-1010)且已用于各種制劑，包括利多卡因(Chen-Chow等，1981，International Journal ofPharmaceutics，8，89-99)、茚甲新(indomethacin，一種用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎等的消炎鎮(zhèn)痛藥)(Miyazaki等，1986，Chem.Pharm.Bull.34(4)，1801-1808)和白介素-2(Johnston等，1992，Pharmaceutical Research，9(3)，425-434)。
干擾素是一類細胞因子，即能在細胞間傳輸信號的可溶性蛋白質(zhì)，在免疫系統(tǒng)中可通過幫助摧毀引起感染的微生物和修復(fù)感染所致?lián)p傷而發(fā)揮重要作用。干擾素由受感染細胞自然分泌，首次鑒定于1957年。其名稱源自它們能“干擾”病毒的復(fù)制和繁殖。
干擾素顯示出抗病毒和抗增殖活性。根據(jù)生化和免疫學性質(zhì)，可將自然產(chǎn)生的人干擾素主要分為三類α-干擾素(白細胞)、β-干擾素(成纖維細胞)和干擾素-γ(免疫細胞)。在美國和一些其它國家，α-干擾素現(xiàn)已批準用于治療毛細胞白血病，性病疣，卡波西氏肉瘤(一種常見于感染獲得性免疫缺陷病人的癌癥)，慢性非甲和非乙肝炎。
此外，干擾素還是機體對病毒感染反應(yīng)中產(chǎn)生的糖蛋白。它們能抑制被保護細胞中的病毒增殖。干擾素由低分子量蛋白構(gòu)成，其作用無明顯特異性，即一種病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的干擾素能抵抗其它的廣譜病毒。然而，干擾素有種族特異性，即一種動物產(chǎn)生的干擾素只能激活同種動物細胞或密切相關(guān)動物細胞的抗病毒活性。干擾素是首批經(jīng)檢測具有潛在抗腫瘤和抗病毒活性的細胞因子。
三類主要干擾素指IFN-α，IFN-β、IFN-γ，這些主要類型的干擾素最初是按細胞來源分類的(白細胞、成纖維細胞、T細胞)。然而現(xiàn)已清楚一種細胞可以產(chǎn)生多種類型的干擾素。因此，白細胞干擾素現(xiàn)稱為IFN-α、成纖維干擾素稱為IFN-β、T細胞干擾素稱為IFN-γ。另外，還有第四種干擾素，淋巴母細胞(lymphoblastoid)干擾素，由“Namalwa”細胞系產(chǎn)生(源于伯基特淋巴瘤)，此細胞系似乎能產(chǎn)生白細胞干擾素和成纖維細胞干擾素的混合物.
干擾素單位或干擾素的國際單位(U或IU(對于國際單位))據(jù)報告可衡量干擾素的活性，定義為能保護50％的細胞免受病毒損害的干擾素所必需的量。可用于檢測生物學活性的試驗是已有描述的細胞病理效應(yīng)抑制試驗(Rubinstein，等1.1981，J.Virol.，37，755-758；Familletti等，1981，Methods inEnzymology，78，Pestka Ed.，Academic press，New York，387-394)。在此干擾素抗病毒試驗中，1單位/ml的干擾素是產(chǎn)生50％細胞病理效應(yīng)所必須的量。此單位可用國立衛(wèi)生研究院提供的Hu-IFN-β國際參照標準品來測定(Pestka，1986，Methods in Enzymology，78，Pestka編.，Academic press，NewYork 119，14-23)。
每一類干擾素包括幾種不同的型。IFN-β和IFN-γ各自是一個單一基因的產(chǎn)物。
歸類于IFNs-α的蛋白質(zhì)是最多樣性的一類，含有約15個型。在第9染色體上有IFN-α基因簇，包含至少23個成員，其中15個成員有活性和被轉(zhuǎn)錄。成熟的IFNs-α是非糖基化的。
IFN-α和IFN-β長度相同(165或166氨基酸)，具有相似的生物學活性。IFN-γ長146個氨基酸，α和β類的類似性較不密切。只有IFN-γ能激活巨噬細胞或誘導(dǎo)T殺傷細胞成熟。這些新型的治療劑有時可稱為生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(BRMs)，因為它們在生物體對腫瘤的反應(yīng)中具有作用，可通過免疫調(diào)節(jié)影響識別。
人成纖維細胞干擾素(IFN-β)具有抗病毒活性，而且能刺激自然殺傷細胞抗腫瘤細胞。它是一種由病毒和雙鏈RNAs誘導(dǎo)產(chǎn)生的分子量約20,000Da的多肽。從用重組DNA技術(shù)克隆的成纖維細胞干擾素基因的核苷酸序列(Derynk等，1980，Nature，285，542-547)，推導(dǎo)出該蛋白質(zhì)的氨基酸全序列，它有166個氨基酸。
Shepard等，(1981，Nature，294，563-565)，描述了消除了干擾素的抗病毒活性的堿基842位的突變(141位Cys-＞Tyr)，和具有1119-1121位核苷酸缺失的變體克隆。
Mark等，(1984，Proc.Natl.，Acad.Sci.U.S.A.，81(18)，5662-5666)用(A)置換469位堿基(T)而插入人工突變，使第17位氨基酸從Cys轉(zhuǎn)變?yōu)镾er后，獲得的IFN-β?lián)蟾婢哂信c天然IFN-β一樣的活性，并且長期貯存(-70℃)時穩(wěn)定。
Rebif(Serono-重組干擾素-β)是哺乳動物細胞系產(chǎn)生的干擾素(IFN)-β-1a，是用于治療多發(fā)性硬化癥是干擾素治療領(lǐng)域中的最新進展，它的國際通用命名(International Non-proprietary Name(INN))為干擾素β-1a。
在過去的數(shù)十年中，已開發(fā)了含有共聚物的各種干擾素制劑。其中已報導(dǎo)的有包含聚氧乙烯-聚氧化丙二醇的IFN-α注射制劑(JP2003342193)，cyclaradine-IFNα組合制劑(EP0177153)， 局部給藥的干擾素-α室溫泊洛沙姆凝膠藥盒(US4,469,228)，微粒IFNβ制劑(WO01/58474)，含有與聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物化學偶聯(lián)的糖蛋白的組合物(EP 0098110)和用于黏膜，特別是鼻內(nèi)輸送的IFNβ制劑(WO2004/002404)。
如所有的蛋白質(zhì)類藥物那樣，用干擾素作為治療藥物的主要挑戰(zhàn)是要將治療有效量的血液水平保持一定的時間，而無需增加注射劑量和沒有潛在的相關(guān)副作用。因此，需要能比液體制劑維持干擾素血漿水平時間更長，和/或能提供IFN更高血漿接觸從而維持或改善干擾素的生物活性的IFN藥物組合物。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及含有干擾素(IFN)，尤其是重組h-IFNβ1a的泊洛沙姆水凝膠或能在體內(nèi)形成泊洛沙姆凝膠的藥物組合物及其制備方法，這些藥物組合物是用泊洛沙姆，尤其是泊洛沙姆407制備的水凝膠。這些藥物組合物本文稱為IFN“水凝膠”，它們包含干擾素(IFN)或其同工型(isoform)、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物、其活性片段。
與大劑量IFN制劑相比，本發(fā)明的泊洛沙姆水凝膠干擾素制劑的優(yōu)點是能在體內(nèi)形成凝膠，這可使操作容易，和顯示出持續(xù)釋放特征和/或更高的生物利用率。
按照本發(fā)明的一具體實施方案，這種水凝膠包含至少一種穩(wěn)定劑。
按照本發(fā)明的另一種具體實施方案，這種水凝膠還包含至少一種賦形劑，作為溶液向凝膠轉(zhuǎn)變的溫度轉(zhuǎn)變修飾劑。
第一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其包含干擾素，或其同工型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物或活性片段，所述制劑是一種泊洛沙姆水凝膠。
第二方面，本發(fā)明提供制備本發(fā)明干擾素水凝膠制劑的方法，所述方法包括在能形成均勻聚合物溶液的溫度下將計算量的泊洛沙姆加入到緩沖液中，然后加入干擾素或其同工型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物、或活性片段。
第三方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的IFN-β水凝膠制劑在制備治療多發(fā)性硬化癥的藥物制劑中的應(yīng)用。
第四方面，本發(fā)明提供治療多發(fā)性硬化癥的方法，該方法包括給于需要的病人本發(fā)明的持續(xù)釋放IFN-β的制劑。
發(fā)明詳述除非另有特別說明此定義的更廣泛含義，以下段落將對構(gòu)成本發(fā)明化合物的不同化學成分進行定義，應(yīng)用于本說明書全文和權(quán)利要求書。
本文所用的“干擾素”或“IFN”意思包括如文獻中所定義的任何分子，包括例如在發(fā)明背景中所提到的任何類型的干擾素。具體說，IFN-α、IFN-β和IFN-γ包括在上述定義中。本發(fā)明的干擾素優(yōu)選IFN-β。適合本發(fā)明的IFN-β可通過商業(yè)化產(chǎn)品獲得，如Rebif(Serono)，Avonex(Biogen)或Betaferon(Schering)。
本文所用術(shù)語“干擾素-β(IFN-β)”指包括成纖維細胞干擾素，尤其指人源成纖維細胞干擾素，指分離獲自生物體液或通過DNA重組技術(shù)獲自真核或原核細胞宿主的干擾素、及其鹽、功能衍生物、變體、類似物和活性片段。優(yōu)選IFN-β意指重組干擾素β-1a.。
適合本發(fā)明的IFN-β可從商業(yè)上獲得，例如有Rebif(Serono)，、Avonex(Biogen)或Betaferon(Schering)。本發(fā)明也優(yōu)選采用人源干擾素。本文所用術(shù)語干擾素意指包括干擾素的鹽、功能衍生物、變體、類似物和其活性片段。
Rebif(重組干擾素-β)是在治療多發(fā)性硬化癥(MS)中的最新進展，在治療上取得了顯著的進步。Rebif是哺乳動物細胞系產(chǎn)生的干擾素(IFN)-β1a。已確定每周三次皮下注射干擾素(IFN)-β1a對復(fù)發(fā)好轉(zhuǎn)型多發(fā)性硬化癥(RRMS)治療有效。如核磁共振成像(MRI)所測定的那樣，干擾素-β1a對多發(fā)性硬化癥(MS)長期病程有正面作用，能減少復(fù)發(fā)次數(shù)和減輕復(fù)發(fā)程度，和減輕疾病負擔及疾病的活動性。
治療多發(fā)性硬化癥(MS)復(fù)發(fā)所用本發(fā)明IFN-β的劑量視IFN-β類型而不同。
當本發(fā)明的干擾素是大腸桿菌產(chǎn)生的重組IFN-β1b(其商品名為Betaseron)時，其優(yōu)選的給藥劑量為每人每隔兩天皮下注射一次約250-300μg或8-9.6MIU。
當本發(fā)明的干擾素是中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞)產(chǎn)生的重組IFN-β1a(商品名為Avonex)時，其優(yōu)選的給藥劑量為每人每周肌肉內(nèi)注射一次約30-33μg或6-6.6MIU。
當本發(fā)明的干擾素是中國倉鼠卵巢細胞產(chǎn)生的重組IFN-β1a(商品名為Rebif)時，其優(yōu)選給藥劑量為每人每周皮下注射三次(TIW)約22-44μg或6-12MIU。
本文所用術(shù)語“突變蛋白”指天然干擾素的一個或多個的氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基所取代，或缺失、或在IFN的天然序列中添加一個或多個氨基酸殘基后得到的產(chǎn)物活性與野生型干擾素相比沒有顯著改變的干擾素類似物。這些突變蛋白可通過已知的合成技術(shù)、和/或定點誘變技術(shù)或其它任何已知的合適技術(shù)制備。優(yōu)選的突變蛋白包括，例如Shepard等.，1981，同上，或Mark等，1984，同上等文獻所描述的那些。
這些突變蛋白的氨基酸序列宜與干擾素的序列充分重復(fù)，結(jié)果其與干擾素有基本相似或甚至更佳的活性。干擾素的生物學功能是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，它的生物標準品已經(jīng)建立并能夠購買到，例如可從國立生物學標準品和控制研究所(the National Institute for biological Standards andControl)(http://immunology.org/links/NIBSC)購買。
檢測干擾素活性的生物試驗已有報導(dǎo)。例如干擾素試驗可按照Rubinstein等所述進行(Rubinstein等，1981，同上)。因此，可用常規(guī)實驗測定某給定的突變蛋白是否具有與干擾素基本類似的甚至更佳的活性。
因此，用于本發(fā)明的干擾素的突變蛋白或為其編碼的核酸包括一組本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本文說明和指導(dǎo)可用常規(guī)技術(shù)無須過多實驗而獲得的基本上對應(yīng)的序列，例如替換的肽或多聚核苷酸。
本發(fā)明突變蛋白優(yōu)選的變化稱為“保守”的替換。本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)的保守性氨基酸替換包括組內(nèi)同義氨基酸的替換，它們具有充分相似的生物化學特性，同組成員之間的替換仍然能保留該分子的生物學功能。已知在以上定義的序列中也可進行氨基酸的插入或缺失而不改變其功能，尤其是該插入或缺失只涉及少數(shù)氨基酸，例如三十個以內(nèi)，優(yōu)選十個以內(nèi)，且不去除或替換對功能構(gòu)型關(guān)鍵的氨基酸，如半胱氨酸殘基。通過這種缺失和/或插入而產(chǎn)生的蛋白或突變蛋白都屬于本發(fā)明范圍內(nèi)。
優(yōu)選的同義氨基酸分組是表I中定義的那些；更加優(yōu)選的同義氨基酸分組是表II中定義的那些；最優(yōu)選的同義氨基酸分組是表III中定義的那些；表I
優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸同義氨基酸組Ser Ser，Thr，Gly，AsnArg Arg，Gln，Lys，Glu，HisLeu Ile，Phe，Tyr，Met，Val，LeuPro Gly，Ala，Thr，ProThr Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAla Gly，Thr，Pro，AlaVal Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGly Ala，Thr，Pro，Ser，GlyIle Met，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePhe Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyr Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCys Ser，Thr，CysHis Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGln Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsn Gln，Asp，Ser，AsnLys Glu，Gln，His，Arg，LysAsp Glu，Asn，AspGlu Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMet Phe，Ile，Val，Leu，MetTrp Trp表II更優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸同義氨基酸組Ser SerArg His，Lys，ArgLeu Leu，Ile，Phe，MetPro Ala，Pro
ThrThrAlaPro，AlaValVal，Met，IleGlyGlyIleIle，Met，Phe，Val，LeuPheMet，Tyr，Ile，Leu，PheTyrPhe，TyrCysCys，SerHisHis，Gln，ArgGlnGlu，Gln，HisAsnAsp，AsnLysLys，ArgAspAsp，AsnGluGlu，GlnMetMet，Phe，Ile，Val，LeuTrpTrp表III最優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸同義氨基酸組Ser SerArg ArgLeu Leu，Ile，MetPro ProThr ThrAla AlaVal ValGly GlyIle Ile，Met，LeuPhe Phe
TyrTyrCysCys，SerHisHisGlnGlnAsnAsnLysLysAspAspGluGluMetMet，Ile，LeuTrpMet通過蛋白質(zhì)中產(chǎn)生氨基酸替換而獲得本發(fā)明所用IFN突變蛋白的例子包括已知的方法步驟，例如授予Mark等的美國專利4,959,314，4,588,585和4,737,46；授予Koths等的美國專利5,116,943；授予Namen等的4,965,195；授予Chong等的4,879,111；以及授予Lee等的5,017,691中所陳述的方法；授予Shaw等的美國專利No.4,904,584中所陳述的賴氨酸替換蛋白質(zhì)；已有報道的，例如上述Mark等人所提到的具體的干擾素-β突變蛋白。
術(shù)語“融合蛋白”指含有融合于另一種蛋白的干擾素或其突變蛋白的多肽，從而例如能在體液中延長存留時間?？蓪⒏蓴_素與另一種蛋白、多肽等，例如免疫球蛋白或其片段融合。
本文所用“功能性衍生物”涵蓋干擾素衍生物、其突變蛋白和融合蛋白。在本發(fā)明中，這種功能衍生物可通過本領(lǐng)域已知方法從殘基的側(cè)鏈功能基團或N-端或C-端基團制備，只要它們?nèi)詾樗帉W上可接受，即它們沒有破壞該蛋白質(zhì)的與干擾素充分相似的活性，也沒有賦予含有它的組合物毒性。這些衍生物，例如可包含聚乙二醇側(cè)鏈，它能屏蔽抗原位點并延長干擾素在體液中的存留時間。其它衍生物包括羧基的脂族酯、羧基與氨或與伯胺或仲胺反應(yīng)產(chǎn)生的酰胺，氨基酸殘基游離氨基與?；糠?例如烷?；蛱辑h(huán)芳基)形成的N-?；苌铮坞x羥基與?；糠中纬傻腛-?；苌铩?br> 在本發(fā)明中，干擾素的“活性片段”、突變蛋白和融合蛋白包括該蛋白多肽鏈的任何片段、或前體，或與這些片段與前體相連的結(jié)合分子或殘基，例如糖基或磷酸殘基，該蛋白分子的聚合物、或糖基本身，只要與相應(yīng)的干擾素相比所述組分的活性不顯著降低。
本發(fā)明中還特別優(yōu)選采用重組IFN-β1a和本發(fā)明的化合物。
近年已報道了一種特別類型的干擾素變體。這種稱為“共有序列干擾素(consensus interferons)”的物質(zhì)是非自然產(chǎn)生的干擾素變體(美國專利US6,013,253)。按照本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，本發(fā)明的化合物與共有序列干擾素聯(lián)合使用。
本文所用的人共有序列干擾素(IFN-con)指非自然產(chǎn)生的多肽，其主要包含代表大多數(shù)自然產(chǎn)生的人白細胞干擾素亞型序列的IFN-α亞組所共有的那些氨基酸殘基，并且這些位點的一個或多個不包含所有亞型的共同氨基酸、該位點占優(yōu)勢的氨基酸、如果不包含至少一種自然產(chǎn)生的亞型在該位點不存在的氨基酸殘基。IFN-con包括但不限于包括美國專利U.S.4,695,623，4,897,471和5,541,293所述命名為IFN-con1、IFN-con2和IFN-con3的氨基酸序列。編碼IFN-con的DNA序列可以按照上述專利所述方法或用其它的標準方法產(chǎn)生。
在另一優(yōu)選的實施方案中，所述融合蛋白包括Ig融合。這種融合可以直接或者通過短至長1-3個氨基酸殘基或者更長些，例如長13個氨基酸殘基的短接頭肽融合。所述接頭可以是三肽序列E-F-M(Glu-Phe-Met)，例如，或?qū)珿lu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13個氨基酸的接頭序列引入到干擾素序列和免疫球蛋白序列之間。獲得的融合蛋白可具有提高的性能，例如在體液中存留時間(半衰期)延長，比活性提高，表達水平提高，或者有助于該融合蛋白的純化。
在另一優(yōu)選實施方案中，干擾素與Ig分子的恒定區(qū)融合。優(yōu)選與重鏈區(qū)域，如IgG1的CH2和CH3區(qū)融合。Ig分子的其它同工型也適合于產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白，例如IgG2，IgG3或IgG4，或其它類的Ig，如IgM或IgA。融合蛋白可以是單體或多聚體，異質(zhì)多聚體或同質(zhì)多聚體。
在另一優(yōu)選實施方案中，所述功能衍生物包含至少一種結(jié)合于氨基酸殘基一個或多個側(cè)鏈上一個或多個功能基團的分子。優(yōu)選該分子是聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇化可以通過已知的方法實施，例如國際專利WO99/55377所述的方法。
給予個體的劑量因各種因素而不同，包括藥物動力學性能、給藥途徑、病人狀況和特征(性別，年齡，體重，健康和體型大小)，癥狀程度，同期治療，治療頻率和所需的效果。
人干擾素IFN-β1a給藥的標準劑量范圍為每天80000IU/kg到200000IU/kg，或者每人每天6MIU(百萬國際單位)到12MIU，或者每人22-44μg(微克)。按照本發(fā)明，IFN-β1a的優(yōu)選給藥量為1-500μg，更優(yōu)選給藥劑量為每人每周一次10-308μg或10-260μg或更少。
本發(fā)明活性成分的給藥可通過肌肉內(nèi)和皮下途徑。優(yōu)選干擾素的給藥途徑是皮下注射。
干擾素也可以每隔兩天或更短時間給藥。優(yōu)選干擾素給藥每周一次、兩次或三次。
優(yōu)選給藥途徑是皮下給藥，例如每周一次或更少。
該制劑中IFN-β1a的優(yōu)選濃度為約10到約800μg/ml，更優(yōu)選為約20μg/ml至約500μg/ml，更優(yōu)選為約30到約300μg/ml，最優(yōu)選為約44μg/ml、約88μg/ml或264μg/ml。
術(shù)語“水凝膠”指能自身組成含有大量水分的三維結(jié)構(gòu)的親水聚合物的交聯(lián)網(wǎng)狀物。泊洛沙姆是能在水溶液中形成膠束的聚合物。在較高濃度和/或提高溫度時，泊洛沙姆因膠束間的相互作用使膠束結(jié)合形成液晶狀態(tài)(凝膠)而經(jīng)歷膠凝(溶液向凝膠轉(zhuǎn)變)過程。然后在更高溫度時，凝膠再融化(Bromberg等，1998，Advanced Drug Delivery Reviews 31，197-221)。
相轉(zhuǎn)變的溫度取決于泊洛沙姆在水中的濃度。通常，當聚合物濃度范圍從20wt％變到30wt％時，在5-30℃溫度時發(fā)生溶液向凝膠轉(zhuǎn)變，而在溫度35-50℃時發(fā)生凝膠向溶液轉(zhuǎn)變。因此，本發(fā)明的術(shù)語“泊洛沙姆水凝膠”指在人體溫度下顯示有膠凝(溶液向凝膠轉(zhuǎn)變)性能的泊洛沙姆溶液。例如，本發(fā)明的泊洛沙姆水凝膠含有20-30wt％，通常為20-25wt％的泊洛沙姆。因此，術(shù)語“水凝膠”也指體內(nèi)形成凝膠。
術(shù)語“溶液轉(zhuǎn)變成凝膠(或“溶液-凝膠”)的溫度轉(zhuǎn)變修飾劑”指一種賦形劑，這種賦形劑能替代，優(yōu)選能提高含干擾素β的水凝膠從液體轉(zhuǎn)變?yōu)槟z的相變溫度的物質(zhì)。這種賦形劑例子有糖，例如海藻糖，聚乙二醇，甘油(如甘油30°)和環(huán)糊精，優(yōu)選羥丙基-β-環(huán)糊精。可采用的溶液-凝膠的溫度轉(zhuǎn)變修飾劑例如來提高室溫時水凝膠的溫度轉(zhuǎn)變以提高膠凝能力(seringeability)和/或貯藏溫度。本發(fā)明的水凝膠可含有約1-3％(w/w)的的溶液-凝膠的溫度轉(zhuǎn)變賦形劑，優(yōu)選含約2.6％(w/w)。
術(shù)語“表面活性劑”指能減少液體表面張力、或減少兩種液體之間(或液體與固體之間)的界面張力的可溶性化合物，表面張力是作用于液體表面，傾向使表面積最小化的力。表面活性劑有時應(yīng)用于藥物制劑中，包括輸送低分子量藥物和多肽，以修飾藥物的吸收，或?qū)⑺幬镙斶\送到靶組織。熟知的表活性劑飾物包括聚山梨醇酯(聚氧乙烯衍生物；吐溫)和Pluronics。
按照本發(fā)明一實施方案，用于制備本發(fā)明水凝膠的穩(wěn)定的IFN液體制劑優(yōu)選的表面活性劑為Pluronics。
按照本發(fā)明另一具體實施方案，用于制備本發(fā)明水凝膠的穩(wěn)定的干擾素液體制劑中存在有選自PluronicF77(Poloxamer 217)、PluronicF87(Poloxamer 237)、PluronicF88(Poloxamer 238)和PluronicF68(Poloxamer 188)的Pluronics，特別優(yōu)選PluronicF68(PluronicF68，BASF)。
在穩(wěn)定的干擾素液體制劑中存在的Pluronics優(yōu)選濃度應(yīng)足以使干擾素在所需的貯存時間(例如12到24個月)內(nèi)保持穩(wěn)定，并能充分預(yù)防因吸附于表面，如小瓶，安瓿，藥筒或注射器而導(dǎo)致的蛋白損失。通常Lutrol F68要超過干擾素25-200倍摩爾量，優(yōu)選超過50倍摩爾量(當干擾素載量為150μg/mL時，Lutrol F68大約為3mg/mL)。
干擾素液體穩(wěn)定制劑中Pluronics，具體是PluronicF68時的優(yōu)選濃度是約0.01-10mg/ml，更優(yōu)選約0.05-5mg/ml，還要特別優(yōu)選約0.1-2mg/ml，最優(yōu)選約1mg/ml。
術(shù)語“抗氧化劑”指能防止氧或衍生自氧的自由基與其它物質(zhì)相互反應(yīng)的化合物?？寡趸瘎┦窃S多賦形劑之一，通常加入到藥物系統(tǒng)中以提高其物理和化學穩(wěn)定性。氧化劑的加入能使某些藥物或賦形劑接觸氧或自由基時最大程度減少氧化過程或延遲。光照，溫度，氫濃度，痕量金屬和過氧化物常能催化這些氧化過程。在藥物中常用亞硫酸鹽，亞硫酸氫鹽(bisulfite)，硫脲，甲硫氨酸，乙二胺四乙酸(EDTA)鹽、丁基羥基甲苯(BHT)和丁基羥基茴香醚(BHA)作為抗氧化劑。已發(fā)現(xiàn)EDTA鈉可通過螯合催化氧化反應(yīng)的金屬離子而增強抗氧化劑的活性，最優(yōu)選的抗氧化劑為甲硫氨酸。
用于制備本發(fā)明水凝膠的穩(wěn)定的干擾素液體制劑中存在的穩(wěn)定劑優(yōu)選抗氧化劑，特別是甲硫氨酸。具體地，甲硫氨酸通常用量超過IFN的100-800倍摩爾量，優(yōu)選超過400倍摩爾(當IFN載量約為150μg/mL時大約為0.4mg/mL)。
加入的甲硫氨酸是其游離堿基形式或其鹽形式。在本發(fā)明的方法或制劑中可以采用甲硫氨酸的任何立體異構(gòu)體(例如L，D，或DL異構(gòu)體)，只要加入的甲硫氨酸是其游離堿基形式或其鹽形式。優(yōu)選采用L-立體異構(gòu)體。在本發(fā)明的制劑中也可采用甲硫氨酸的類似物。術(shù)語“甲硫氨酸類似物”指自然產(chǎn)生的甲硫氨酸衍生物。本發(fā)明制劑中也可采用游離堿基形式或鹽形式的甲硫氨酸類似物。
通過添加抗氧化劑(如甲硫氨酸)以濃度依賴方式來增加和/或維持穩(wěn)定性。即增加抗氧化劑的濃度可導(dǎo)致提高和/或維持本發(fā)明含干擾素-β制劑的穩(wěn)定性，而無氧化劑時含干擾素β的該制劑通常顯示被氧化形成多聚合體/寡聚體。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員通常所知的方法無須過多實驗不難確定為減少氧化或多聚體/寡聚體的形成而用于本發(fā)明制劑中的抗氧化劑(如甲硫氨酸)的用量。
術(shù)語“抑菌劑”指加入制劑中作為抗菌劑的化合物或組合物。抑菌劑的例子包括苯酚、間-甲酚、對-甲酚、鄰-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、對羥基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、氯苯甲羥胺，苯索氯銨、脫氫醋酸鈉和硫柳汞。優(yōu)選的抑菌劑為苯甲醇。
本發(fā)明的水凝膠制劑可以是單劑量或多劑量。本發(fā)明的這些液體干擾素制劑傾于多劑量應(yīng)用，優(yōu)選含有抑菌劑，例如苯酚、間-甲酚、對-甲酚、鄰-甲酚、氯甲酚、苯甲醇、對羥基苯甲酸烷基酯(甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等)、氯苯甲羥胺、苯索氯銨，脫氫醋酸鈉和硫柳汞。特別優(yōu)選苯酚、苯甲醇和間-甲酚，更優(yōu)選苯甲醇。抑菌劑(適合于注射)的用量所產(chǎn)生的濃度應(yīng)能有效維持該制劑在多劑量注射期間基本上無菌，此期間可以是約12或24小時至約12天，優(yōu)選約6-12天。抑菌劑存在的優(yōu)選濃度是約0.1％(大量抑菌劑/大量溶劑)至約2.0％，更優(yōu)選約0.2％-約1.0％。苯甲醇特別優(yōu)選的濃度為0.2或0.3％。
然而所用的防腐劑，例如苯甲醇，不限于向多劑量制劑加入，也可將其加入到單劑量制劑中。本發(fā)明一具體實施方案是含有苯甲醇的單劑量制劑。
本發(fā)明的制劑pH值范圍優(yōu)選為約3.0到約5.0，更優(yōu)選約3.8-4.0。優(yōu)選的緩沖液為醋酸鹽緩沖液，反離子優(yōu)選鈉離子或鉀離子。醋酸鹽緩沖液是本領(lǐng)域熟知的?？?cè)芤褐械木彌_液濃度可在約5mM、9.5mM、10mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM和500mM之間變動。優(yōu)選的緩沖液濃度為約10mM。特別優(yōu)選的緩沖液為50mM、pH值為3.8的醋酸鹽緩沖液。
本文所用的“環(huán)糊精”是β糊精的羥丙基、羥乙基、葡萄糖基、麥芽糖基和麥芽三糖基衍生物及γ糊精的羥丙基、羥乙基、葡萄糖基、麥芽糖基和麥芽三糖基衍生物。羥烷基基團可包括一個或多個羥基，例如羥丙基(2-羥丙基，3-羥丙基)，二羥丙基等。葡萄糖基，麥芽糖基和麥芽三糖基衍生物可含有一個或多個糖基，例如葡萄糖基或葡二糖苷基、麥芽糖基或麥芽二糖基。也可采用環(huán)糊精衍生物的各種混合物，例如麥芽糖基和麥芽二糖基衍生物的混合物。本文所用的特定環(huán)糊精包括羥丙基-β-環(huán)糊精(HPCD或HPBCD)、羥乙基-β-環(huán)糊精(HEBCD)、羥丙基-γ-環(huán)糊精(HPGCD)、羥乙基-γ-環(huán)糊精(HEGCD)、二羥丙基-β-環(huán)糊精(2HPGCD)、葡萄糖基-β-環(huán)糊精(G1-β-CD或G1BCD)、葡萄二糖基-β-環(huán)糊精(2G G1-β-CD或2 G1BCD)，麥芽糖基-β-環(huán)糊精(G2-β-CD或G2BCD)、麥芽糖基-γ-環(huán)糊精(G2-γ-CD或G2GCD)、麥芽三糖基-β-環(huán)糊精(G3-β-CD或G3BCD)、麥芽三糖基-γ-環(huán)糊精(G3-γ-CD或G3GCD)和麥芽二糖基-β-環(huán)糊精(2 G2-β-CD或2 G2BCD)，和它們的混合物，例如麥芽糖基-β-環(huán)糊精/麥芽二糖基-β-環(huán)糊精。
本發(fā)明組合物中所用的羥丙基-β-環(huán)糊精可從商業(yè)上購得，是本發(fā)明的優(yōu)選環(huán)糊精。
本發(fā)明制劑中干擾素的濃度范圍為約1.0μg/ml到約50mg/ml。雖然更低的或更高的干擾素濃度也可以操作，但這取決于遞送載體或給藥途徑，例如溶液制劑不同于透粘膜凝膠(如用于頰部或鼻腔途徑的干擾素凝膠組合物)。干擾素的濃度優(yōu)選大約5.0μg/ml到約2mg/ml，更優(yōu)選約10μg/ml到約1mg/ml，最優(yōu)選約30μg/ml到約100μg/ml。
本發(fā)明的制劑優(yōu)選在包裝后超過24個月的時間內(nèi)。能保留干擾素活性的至少約60％，更優(yōu)選約70％，最優(yōu)選至少80％。
本發(fā)明的緩釋制劑是通過在泊洛沙姆均一溶液中添加經(jīng)計算量的干擾素溶液配制而成。所述干擾素溶液優(yōu)選干擾素穩(wěn)定的溶液，例如含有諸如穩(wěn)定劑L-甲硫氨酸、表面活性劑泊洛沙姆(如泊洛沙姆188)或它們的組合等賦形劑的干擾素溶液。
按照本發(fā)明的一具體實施方案，本發(fā)明的制劑還要經(jīng)過無菌條件下的過濾步驟，例如在將泊洛沙姆水凝膠維持在低粘性的溫度下(如4℃)用0.22微米膜進行除菌過濾。
為改進本發(fā)明制劑在室溫時的膠凝能力(seringeability)，可以加入能修飾泊洛沙姆水凝膠的溶液向凝膠轉(zhuǎn)變溫度的賦形劑，優(yōu)選在形成液體水凝膠溶液制劑之前(即在加入泊洛沙姆之前)在緩沖液中加入。能修飾泊洛沙姆水凝膠的液體-凝膠轉(zhuǎn)變溫度的賦形劑例子有聚乙二醇、甘油(如甘油30°)、糖如海藻糖、和環(huán)糊精如羥丙基-β-環(huán)糊精。
按照本發(fā)明的一具體實施方案，所述水凝膠制劑在4℃時的粘度介于水粘度和200mPas之間，優(yōu)選在100mPas-150mPas之間，從而可以裝在特定的裝置中，如自動注射器或預(yù)裝填注射針筒中，可在皮下注射后“原位”形成凝膠。
然后將獲到的溶液裝到小瓶、安瓿、藥筒或預(yù)裝填針筒中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道此方法的變化，例如諸組分的加入順序，是否采用額外的添加劑，制劑制備時的溫度和pH值等所有因素都可以按給藥的濃度和方法優(yōu)化。
提供給病人的本發(fā)明制劑是優(yōu)選在水凝膠的溶液-凝膠轉(zhuǎn)變溫度之下貯存的澄清溶液。
本文所述水凝膠制劑中的干擾素可通過不同遞送方法，包括皮下注射、透粘膜遞送、植入或本領(lǐng)域技術(shù)人員認為適合的，如本領(lǐng)域熟知的方法給予本發(fā)明的病人。
術(shù)語“小瓶”廣義上指適合維持本發(fā)明固體或液體形式的緩釋干擾素制劑于無菌狀態(tài)容器中的一種貯存器。本文所用的小瓶例子包括安瓿、藥筒、硬質(zhì)泡沫塑料襯墊包裝、或其它通過注射器或透黏膜噴霧向病人輸送干擾素的這類貯存器。
本發(fā)明的制劑也可作為預(yù)裝填注射器投放市場。
本發(fā)明的制劑可用熟知的注射裝置給藥，例子包括輸送液體的自動注射器或筆式注射裝置的那些單瓶系統(tǒng)傳，如Rebiject。
選擇的注射用針頭應(yīng)與本發(fā)明的水凝膠厚度相匹配。例如，本發(fā)明的水凝膠在注射時可以用不同規(guī)格的針頭，如18/23針頭(內(nèi)徑相當于18號針頭和21號針頭的最小外徑)或者21/26(內(nèi)徑相當于21號針頭和26號針頭的最小外徑)本發(fā)明的制劑優(yōu)選用熟知的水凝膠裝置給藥。例如可用一次性針頭注射器(標記為醫(yī)藥品)注射本發(fā)明水凝膠。
本

發(fā)明內(nèi)容
中的術(shù)語“治療作用”指對疾病發(fā)展的任何有利影響，包括疾病發(fā)作后病理發(fā)展的減弱、降低、減少或消除。
含有干擾素或同工型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物、活性片段或鹽的本發(fā)明藥物組合物可用于臨床上對此多肽有反應(yīng)的疾病的診斷，預(yù)防和治療(局部或全身)。這些臨床適應(yīng)癥，例如包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)，大腦和/或脊髓的失調(diào)或疾病，包括多發(fā)性硬化癥；自身免疫性疾病，包括類風濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，節(jié)段性回腸炎；癌癥，包括乳癌，前列腺癌，膀胱癌，腎癌和結(jié)腸癌。
本文所引用的所有參考文獻包括雜志文章或摘要，發(fā)表或未發(fā)表的美國及外國專利申請，已發(fā)布的美國及外國專利或其它任何參考文獻，其內(nèi)容都納入本文作參考，包括所有引用文獻的數(shù)據(jù)，表格，附圖和原文。此外，本文引用參考文獻中的整個參考內(nèi)容也都納入作為參考。
參考已知的方法步驟，常規(guī)方法步驟，已知方法或常規(guī)方法不以任何方式在相關(guān)領(lǐng)域承認公開了、說明了或提出了本發(fā)明的任何方面、描述和實施方案。
以上具體實施方案的描述全面揭示了本發(fā)明的綜合性質(zhì)，使其他人可以應(yīng)用本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(包括本文引用的文獻內(nèi)容)，無須過多實驗，不難對各種應(yīng)用，如具體實施方案進行修飾和/或修改，但這不背離本發(fā)明的總體概念。因此，根據(jù)本文提供的說明和指南作出的這類改變和修飾仍等同于本發(fā)明公開的實施方案范圍內(nèi)。應(yīng)理解本文所用的措辭和術(shù)語目的是為了描述，而非限制本發(fā)明。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員可借助本文提供的說明和指南結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識來解釋本說明書的術(shù)語或措辭。
按照一具體實施方案，本明提供一種藥物組合物，其中所述制劑是含有干擾素-β的泊洛沙姆水凝膠。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中所述組合物是一種含有重組干擾素-β(例如重組干擾素-β1a)的泊洛沙姆水凝膠。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中所述組合物還包含緩沖液和抗氧化劑。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中所述組合物還包括緩沖液和表面活性劑。
按另一實施方案，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中所述組合物還包含溶液-凝膠溫度轉(zhuǎn)變修飾劑。
按照另一實施方案，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中所述組合物還包含選自海藻糖和環(huán)糊精的溶液-凝膠溫度轉(zhuǎn)變修飾劑。
按照一實施方案，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中所述制劑是泊洛沙姆407水凝膠。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中所述組合物是泊洛沙姆407水凝膠，其中泊洛沙姆407的含量為約20-25％w/w。
按照一優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中所述制劑含有重組干擾素-β(例如重組干擾素-β1a)、乙酸酸鹽緩沖液和抗氧化劑，如L-甲硫氨酸。
按另一優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中所述制劑是含有重組干擾素-β(例如重組干擾素-β1a)、醋酸鹽緩沖液和抗氧化劑L-甲硫氨酸，表面活性劑泊洛沙姆188的泊洛沙姆407水凝膠。
在另一種優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中所述制劑是包含重組干擾素-β(例如重組干擾素-β1a)，醋酸鹽緩沖液和抗氧化劑L-甲硫氨酸、表面活性劑泊洛沙姆188、溶液-凝膠溫度轉(zhuǎn)變修飾劑海藻糖的泊洛沙姆407水凝膠。
根據(jù)另一優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其中所述制劑是含有重組干擾素-β(例如重組干擾素-β1a)、醋酸鹽緩沖液和抗氧化劑L-甲硫氨酸、和溶液-凝膠溫度轉(zhuǎn)變修飾劑環(huán)糊精(優(yōu)選羥丙基-β-環(huán)糊精)的泊洛沙姆407水凝膠。
根據(jù)另一種優(yōu)選的具體實施，本發(fā)明提供選自以下的藥物組合物泊洛沙姆407-25％w/w醋酸鹽緩沖液50mM/pH 3.8-74.7％w/w重組人干擾素-β-1a-0.012％w/wL-甲硫氨酸-0.03％w/w泊洛沙姆188-0.24％w/w；泊洛沙姆407-25％w/w醋酸鹽緩沖液50mM/pH 3.8-72.04％w/w重組人干擾素-β-1a-0.012％w/wL-甲硫氨酸-0.03％w/w泊洛沙姆188-0.24％w/w海藻糖-2.6％w/w；泊洛沙姆407-20％w/w醋酸鹽緩沖液50mM/pH 3.8-77.34％w/w重組人干擾素-β-1a-0.015％w/wL-甲硫氨酸-0.04％w/w羥丙基-β-環(huán)糊精-2.6％w/w；泊洛沙姆407-25％w/w醋酸鹽緩沖液50mM/pH 3.8-72.04％w/w重組人干擾素-β-1a-0.012％w/wL-甲硫氨酸-0.03％w/w
泊洛沙姆188-0.24％w/w甘油30°Bé-2.6％w/w；和泊洛沙姆407-25％w/w醋酸鹽緩沖液50mM/pH 3.8-72.04％w/w重組人干擾素-β-1a-0.012％w/wL-甲硫氨酸-0.03％w/w泊洛沙姆188-0.24％w/w聚乙二醇(LutrolE400)-2.6％w/w.
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明干擾素水凝膠藥物組合物的方法，所述方法包括在能形成均一聚合物溶液的溫度下加入計算量的泊洛沙姆到緩沖液中，然后加入干擾素或其同工型、突變蛋白、融合蛋白、功能衍生物、或活性片段。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明干擾素水凝膠藥物組合物的方法，其中的緩沖液含有選自海藻糖和環(huán)糊精的溶液-凝膠溫度轉(zhuǎn)變修飾劑，優(yōu)選羥丙基-β環(huán)糊精。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種制備本發(fā)明干擾素-β水凝膠藥物組合物的方法，其中加入干擾素的溶液中含有優(yōu)選自L-甲硫氨酸、泊洛沙姆188和它們的混合物的穩(wěn)定劑。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明干擾素-β水凝膠在制備治療多發(fā)性硬化癥的藥物組合物中的應(yīng)用。
在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種治療多發(fā)性硬化癥方法，包括給予需要的病人本發(fā)明的IFN-β水凝膠。
現(xiàn)通過以下實施例來闡述本發(fā)明，這些實施例不應(yīng)以任何方式限制本發(fā)明。實施例參考以下具體附圖。
附圖簡述

圖1顯示在PBS pH為7.4溫度37℃時，注射PBS水凝膠后用SE-HPLC/熒光檢測儀(菱形)和ELISA試驗(實心方塊)檢測隨時間推移從r-hIFNb 1a泊洛沙姆水凝膠(I)釋放的r-hIFNb 1a百分率(實施例1)。
圖2代表兩小時后從r-hIFN β 1a泊洛沙姆水凝膠(空心菱形)釋放的r-hIFN β 1a與r-hIFN β 1a液體(空心方塊)；r-hIFN β 1a溶液與無r-hIFN β1a(安慰劑)的泊洛沙姆凝膠共同混合(實心三角形)相比釋放的r-hlFN β 1a的抗病毒活性?？共《净钚员硎緸樽鳛閞-hIFN β 1a濃度函數(shù)的皰疹性口炎病毒(VSV)感染后細胞(WISH細胞)的存活百分比(實施例2)。
圖3代表幼稚型食蟹猴皮下單次注射3.6μg/kg r-hIFN β 1a泊洛沙姆水凝膠(I)(實心方塊)單次注射3.6μg/kg r-hIFN β液體(對照1空心三角)，或在一周內(nèi)每隔48小時注射1.223βμg/kg(共三次，時間為0、48、96小時)(對照3空心菱形)后不同時間的r-hIFN β 1a血濃度變化(實施例3)。
圖4代表幼稚型食蟹猴( cynomolgus monkeys)皮下單次注射3.6μg/kg r-hIFN β 1a GMS lipogel(對照2點)或一周內(nèi)每隔48小時注射1.223βμg/kg(共三次，時間為O、48、96小時)(對照3空心菱形)的r-hIFNβ1a血濃度隨時間的變化(實施例3)。
圖5代表Lutrol水凝膠制劑(1)—-點與含2.6％w/w海藻糖Lutrol水凝膠制劑(2)-實心方塊)、含2.6％w/w HP β CD的Lutrol水凝膠制劑(3)-實心三角)的粘度概況圖6代表用SE-HPLC/熒光檢測儀檢測37℃時從用PBS(pH7.4)配制的r-hIFN β 1a泊洛沙姆水凝膠制劑(3)(泊洛沙姆407-20％w/w、醋酸鹽緩沖液50mM/pH3.8-77.34％w/w、 r-hIFN β 1a.0.015％w/w、L.甲硫氨酸-0.04％w/w和羥丙基-β-環(huán)糊精-2.6％w/w)釋放的r-hIFN β 1a的百分率。
實施例以下縮寫詞分別指以下定義cm(厘米)，cps(厘泊)，Da(道爾頓)，g(克)，μg(微克)，min(分鐘)，mg(毫克)，mL(毫升)，mm(毫米)，mM(毫摩爾)，mPas(毫帕斯卡秒)，rpm(每分鐘轉(zhuǎn)數(shù))，nm(納米)，CHO(中國倉鼠卵巢)，IFN(干擾素)，IU(國際單位)，i.V.(靜脈內(nèi))，EMEM(帶有Earle鹽的最小必需介質(zhì)Eagle，(Minimum EssentialMedium Eagle with Earle’s salts))，F(xiàn)BS(胎牛血清)，GMS(單硬脂酸甘油酯)，MTT(N-2-二羥乙基哌嗪-N′-2-乙烷磺酸)，MS(多發(fā)性硬化)，MW(分子量)，PBS(磷酸鹽緩沖液)，PES(聚醚砜)，PP(聚丙烯)，PVDF(聚偏二氟乙烯)，r-IFN β(重組干擾素β)，r-hIFNb 1a(中國倉鼠卵巢細胞產(chǎn)生的重組干擾素β1a)，RIA(放射性免疫試驗)，s.c.(皮下)，TIW(每周三次)，UI(國際單位)，VSV(皰疹口腔炎病毒).
合成泊洛沙姆可按Schmolka 1977所述(American Oil Chemist’sSociety 54，110-116)進行和可從市場上購得。
實施例1泊洛沙姆407-r-hIFN-β 1a-水凝膠(1)1、通用的制備方法在置于冰浴的聚丙烯管中(低蛋白吸附)，將稱量的LutrolF127緩慢加入到冷卻的(2-8℃)醋酸鹽緩沖液[50mM，pH3.8]，磁力攪拌[500-800rpm]直到聚合物完全溶解。
在另一容器內(nèi)，將含有穩(wěn)定劑(例如LutrolF68和L-甲硫氨酸)的少量醋酸鹽緩沖液加入到r-IFN-β濃縮液(2mg/mL)中。將此配制的緩沖液加入到聚合物溶液中，減慢攪拌速度至100-200rpm，以最大程度降低蛋白質(zhì)的機械應(yīng)力。在2-8℃下將最終的制劑裝在聚丙烯注射器中。
r-IFN-β溶液是醋酸鹽緩沖液，通過超濾離心從0.348mg/mL濃縮到2mg/mL (Sartorius VivaSpin 20mL，MW截取值5000Da，2500rpm)。如以下實施例1§5中所述，通常采用當前的SEC-HPLC試驗方法分析濃縮的本體溶液和純度(單體百分比％)。
2.r-hIFN-β按以上1的通用方法采用Rebif溶液0.348mg/mL，加入組合的穩(wěn)定劑(如LutrolF68/L-甲硫氨酸)制備r-hIFN-β的穩(wěn)定溶液。
3賦形劑3.1 Lutrol F127(泊洛沙姆，Pluronic，Synperonic)Lutrol F127(聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物)，BASF是聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷的一種嵌段共聚物。包括在FDA的無活性成分指南中(靜脈注射，吸入，眼科制劑，口服粉末，溶液，懸液和糖漿以及局部外用制劑)。包括在英國授權(quán)的非腸胃道給藥的藥物中。歐洲藥典4，p.1777；USP24NF19p2492-2493.
在PluronicF127中聚氧乙烯(親水)百分比為73％(式(I)中(a)＝(c)＝67和(b)＝98)的泊洛沙姆)。
PluronicF127的典型性能列于以下平均分子量12600g/摩爾溶點56℃20℃下的物理形態(tài)固體77℃下的粘度3100cps25℃ 0.1％濃度時的表面張力41達因/cm德拉夫斯?jié)櫇駮r間(Draves Wetting)(3gm hook，0.1％濃度 25℃下＞360s泡沫高度(Ross Miles，0.1％，含水的，在50℃下40mm水溶液的霧點，1％濃度＞100℃25℃水中HLB(親水親脂平衡)18-2325℃水溶解度＞10％3.2冰醋酸，Sigma3.3 LutrolF68(泊洛沙姆，Pluronic，Synperonic)Lutrol F68(聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物)，BASF是聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷的一種嵌段共聚物。包括在FDA的無活性成分指南中(靜脈注射，吸入，眼科制劑，口服粉末，溶液，懸液和糖漿以及局部外用制劑)。包括在英國授權(quán)的腸胃道外藥物中。歐洲藥典4，p.1777；USP 24 NF19p 2492-2493。
在PluronicF68中聚氧乙烯(親水)百分比為80％，聚氧丙烯(疏水)的分子量約為1,967 Da(是式(I)中(a)＝(c)＝79和(b)＝28)的帕洛沙姆)。
PluronicF68的典型性能列于以下平均分子量8400溶點52℃20℃下的物理形態(tài)固體粘度(Brookfield)cps1000[25℃為液體，60℃為糊狀，和77℃時為固體]；表面張力，dynes/cm，25℃下0.1％濃度 50.30.01％濃度51.2
0.001％濃度53.6界面張力dynes/cm，25℃下與Nujol(醫(yī)用潤滑油)相比；0.1％濃度19.80.01％濃度24.00.01％濃度26.0德拉夫斯?jié)櫇駮r間，秒25℃1.0％濃度＞3600.1％濃度＞360泡沫高度Ross Miles，0.1％，mm@50℃35Ross Miles，0.1％，mm@26℃40動態(tài)，0.1％，mm@400 ml/min＞600水溶液的霧點，0℃1％濃度＞10010％濃度＞100HLB(親水親脂平衡)29。
3.4.L-甲硫氨酸，Sigma含有0.03％水平的L-甲硫氨酸(L-Met)的制劑可以限制氧化，因此IFN-β溶液穩(wěn)定。
4、水凝膠(1)組合物含120μg/ml的r-hIFN-β的水凝膠(1)按以下組成制備LutrolF127 25.0％w/w醋酸鹽緩沖液[50mM/pH 3.8] 74.7％w/wr-hIFN β 1a 0.012％w/wL-甲硫氨酸 0.03％w/wLutrolF-68 0.24％w/w按照實施例1的通用程序制備水凝膠(1)，其中采用25g的LutrolF127溶液和3mg的r-hIFN-β 1a。
5、物理化學特性-粘度進行了動態(tài)粘度研究來特征鑒定水凝膠的特性并提供合適的注射力方案；用粘度之星(viscoStar)L真菌實驗室(viscoStar L Fungilab)的旋轉(zhuǎn)粘度計可直接讀出粘度的mPas(百分之一泊)。粘度分析時制備了50g一批水凝膠(1)加入到聚丙烯管中保持在冰浴(T＝5±2℃)上。報告的粘度值范圍在100-140mPas之間(軸n°2，100rpm轉(zhuǎn)速和3min平衡時間).
-蛋白質(zhì)釋放為模仿皮下生理學狀態(tài)，在PBS中研究了水凝膠(I)釋放IFN-β。在37±2℃用1g制劑(1)(用預(yù)填充注射器分散)進行藥物釋放到pH為7.4的4mlPBS中(水浴轉(zhuǎn)動速度＝100rpm)。在時間為5，15，30分，1和2小時收集樣品。
各樣品用配有熒光檢測器(Trp熒光)的SE-HPLC進行分析，并用ELISA方法(Toray試劑盒)驗證。這些方法細節(jié)如下。
介質(zhì)中檢測到的IFN-β量表示為總蛋白釋放的百分比。兩種方法獲得的釋放概況表明兩階段釋放模式，快速的起始階段后藥物釋放速度放緩(圖1)。
提取方法和SE-HPLC分析進行了實驗以優(yōu)化抽提摻入到水凝膠系統(tǒng)中的IFN-β方法和測定藥物回收率。
根據(jù)水和丙酮構(gòu)成的水/有機溶劑混合物建立如下抽提程序·將500mg的水凝膠制劑(1)溶于離心管中的1.0mL丙酮，在低于10℃的超聲池中超聲降解2分鐘·加水至終體積為3mL·離心獲得的樣品(5min，10.000rpm +4℃)·收集水相并分析在抽提程序后，樣品按以下操作條件用SE-HPLC分析·HPLC柱TSK G2000 SWxLcod.08540(7.8mm ID x30cm，5μ)·注射體積100μL·柱溫，室溫·樣品溫度，室溫·流速0.5 mL/min.(平衡)·流動相70％v/v純水(MILLIQ-Millipore)-30％v/v乙腈-0，2％v/v TFA
·運行時間27min·平衡時間3min·熒光檢測波長激發(fā)280nm，發(fā)射348nm.
ELISA檢測用ELISA免疫試驗(Toray試劑盒)評價IFN水凝膠(1)釋放的IFN-β濃度。該試驗采用包被r-hIFN-β多克隆抗體的96孔板，使用一步夾心法。將r-hIFN-β特異性酶聯(lián)單克隆抗體加入到各孔中，然后將標準品和樣品加入到各孔中，任何存在的r-hIFN-β被固定的抗體結(jié)合。洗滌除去所有未結(jié)合的抗體-酶試劑后，各孔加入底物液，產(chǎn)生的顏色與第一步結(jié)合的r-hIFN-β量成正比。終止顏色發(fā)展并檢測顏色強度。
按上述進行該試驗，不同處是樣品+4℃孵育過夜。
用400μL洗滌液洗滌抗體包被板并用紙吸干。然后，在先前加入100μL從水凝膠藥品釋放實驗得到的樣品的微孔板中每孔加入50μL酶標抗體或利用r-hIFN-β參考品(溶液)的濃度曲線(0-200 IU/mL)。蓋好微孔板充分搖動室溫孵育120分鐘。孵育完畢后除去樣品，洗滌板三次并用紙吸干。每孔加入100微升顯色液，孵育30分鐘后加入100微升反應(yīng)終止液，在雙波長450nm和650nm處讀取吸光度(圖1)-初步測定穩(wěn)定性監(jiān)測0、24h、一星期、一個和兩個月時IFN水凝膠(1)在4℃條件下的穩(wěn)定性。如下進行分析肉眼觀察加載的藥物和粘度(旋轉(zhuǎn)n°2，100rpm，T＝6±2℃).
水凝膠(I)制劑至少穩(wěn)定2個月。
實施例2泊洛沙姆407-r-hIFN-β 1a水凝膠(1)的生物活性通過將水凝膠(I)制劑釋放的r-hIFN-β 1a的抗病毒活性與用IFN-β溶液觀察到的抗病毒活性相比較，測定了水凝膠(1)的生物學活性。
皰疹性口炎病毒是一種導(dǎo)致家畜口蹄疫的病毒，本研究中選擇使用這種病毒是因為它對干擾素敏感。
所用的抗病毒試驗基于IFN-β能誘導(dǎo)對WISH細胞系病毒細胞病變作用的抑制，
在預(yù)先加入連續(xù)稀釋(1∶1.5稀釋)的r-hIFN-β水凝膠樣品或r-hIFN-β 1a參比品(液體)的)的96孔板中，將WISH細胞按4×104細胞/每孔(50μL/孔)接種在含5％FBS的EMEM中。細胞在37℃ 5％CO2下培養(yǎng)18-22小時，然后加入用含5％ FBS的EMEM制備的皰疹性口炎病毒(VSV)懸液，每孔50微升，對照細胞孔只加入培養(yǎng)液不加病毒懸液，而對照病毒孔只加入VSV懸液。在37℃5％CO2下再培養(yǎng)感染細胞20-24小時，然后用5％MTT溶液染色2小時．實驗結(jié)束時，棄去上清液每孔加入96％乙醇200微升溶解甲 ，在分光光度計平板讀數(shù)儀上讀取平板的595nm值。結(jié)果表示為相對于對照細胞的病變抑制作用百分數(shù)。
在兩組不同的實驗中用上述WISH-試驗評價了2小時后水凝膠(1)制劑釋放的r-hIFN-β1a的體外生物學活性。r-hIFN-β 1a的濃度為37.7μg/mL。用于制備該水凝膠的不含r-hIFN-β 1a的Lutrol水凝膠(安慰劑)的可能干擾，也可在該安慰劑中加入r-hIFN-β 1a溶液來驗證。
與安慰劑中驗證加入r-hlFN-β 1a溶液相比，兩批制劑在2小時后釋放的r-hlFN-β 1a顯示完全保持和恢復(fù)了生物學活性(圖2)。因此，看來泊洛沙姆水凝膠在藥物釋放上能夠完全保持r-hlFN-β 1a的生物學活性。
實施例3泊洛沙姆407r-hIFN-β 1a水凝膠(1)的藥物動力學概況為了檢驗本發(fā)明IFN泊洛沙姆水凝膠的緩釋特性，可比較水凝膠、緩沖液制劑和其它凝膠制劑的藥物動力學概況。
在幼稚型食蟹猴(每組中兩只雌性兩只雄性)中研究了IFN-β水凝膠制劑(1)的藥代動力學概況并與IFN-β脂質(zhì)凝膠制劑的藥代動力學作比較樣品裝在配有19G針頭的預(yù)填裝注射器中，該研究設(shè)計用來比較每周一次皮下注射IFN-β水凝膠制劑(1)(120μg/ml)和每周一次注射IFN-β液體緩沖制劑(pH 3.8)(對照1)或每周一次皮下注射IFN-β脂質(zhì)凝膠制劑(對照2)。
所用另一對照組中猴子以一周三次方式給藥(3次皮下注射間隔48小時時間=0、48、96小時)，模擬多發(fā)性硬化癥當前的Rebif劑量方案(對照3)。
對照1干擾素溶液(組2)由含40μg/mLIFN的50mM醋酸鹽緩沖液組成。
對照2(組3)IFN-β脂質(zhì)凝膠構(gòu)成如下單硬脂酸甘油酯(GMS)， 22.37％w/w(RYLOTMMG20 PHARMA，Danisco Cultor)PEG400 63.09％w/w(Lutrol E400，BASF)乙酸 4.03％w/w醋酸鹽緩沖液[50mM/pH3.8] 9.94％w/wr-hIFNβ1a 0.01％w/wL-甲硫氨酸(Sigma) 0.03％w/w羥甲基-β-環(huán)糊精 0.03％w/w.
(Cavasol W7HP，Wacker)對照3(組4)的IFN溶液由含16μg/mL IFN的50mM醋酸鹽緩沖液組成。
血樣品包括預(yù)定劑量的和設(shè)計的組1和組3注射后14天(336h)；組2注射后兩天。組4樣品設(shè)計為在第一次和最后一次r-hIFNβ注射后取樣作PK概況測定，和新蝶呤(neopterin)全貌概況測定。
r-hIFN β 1a采用上述酶聯(lián)免疫試驗ELISA(Fujirebio)定量測定。新喋呤水平用RIA試驗(ICN Biomedical)定量測定。
表IV

β-IFN釋放結(jié)果表明單次皮下注射后，泊洛沙姆水凝膠(1)(組1)以可控模式釋放r-hIFN β1a，維持血漿水平高于5UI/ml一周或者更長時間(圖3)。
蛋白質(zhì)的生物生物度顯著高于(下表V)緩沖液體制劑(皮下單劑和TIW注射二者)和用作對照的脂質(zhì)凝膠。
如圖3和圖4所示，與用GMS脂質(zhì)凝膠(組3)獲得的r-hIFN β1a釋放概況相比，泊洛沙姆水凝膠(1)的r-hIFN β1a釋放顯示為真正顯著的可控模式。脂質(zhì)凝膠(對照2)的r-hIFN β1a釋放特征是更低的“爆發(fā)式”釋放和低的、延長的穩(wěn)態(tài)釋放。
這些結(jié)果表明用作對照2的脂質(zhì)凝膠不適合于r-hIFN β1a的持續(xù)釋放。
表V

血清新喋呤水平升高增加藥效動力學結(jié)果證實了凝膠釋放的r-hIFN β1a生物學活性。與對照(對照1)相比注射水凝膠(1)的新喋呤水平升高最長時間Tmax大約24小時。r-hIFN β 1a重復(fù)劑量(TIW)產(chǎn)生較低但延長的釋放(對照3)。脂質(zhì)凝膠制劑產(chǎn)生較低的藥效動力學模式(對照2)。
對照脂質(zhì)凝膠制劑的配制在聚丙烯管(低蛋白吸附)中，將稱量的GMS和PEG在醋酸鹽緩沖液[50mM，pH4-5]中混合，40℃水浴中維持數(shù)分鐘后獲得溶融和均一的脂質(zhì)基質(zhì)。
在另一個容器中，將少量包含穩(wěn)定劑和賦形劑(例如環(huán)糊精和L-甲硫氨酸)的醋酸鹽緩沖液[50mM，pH4-5]加入到濃縮的r-hIFN β 1a溶液中(2mg/mL)。將如此配制的緩沖液先放在40℃水浴中約1.5分鐘，然后加入到脂質(zhì)混合物中。
隨后，在聚丙烯棒柔和攪拌下，將該混合物置于水浴中約5-10分鐘后再冷卻到室溫。
這些結(jié)果顯示水凝膠(1)與r-hIFN β 1a對照液體制劑具有相似的生物學活性，r-hIFN β 1a的血漿水平至少維持一周，生物利用度改善。
實施例4泊洛沙姆407 r-hIFN β 1a水凝膠(I)的除菌過濾可除菌過濾處理含IFN-β的均相水凝膠溶液。如實施例(1)所述制備IFN-水凝膠(1)。
在保持溶液低黏度的溫度下(例如4℃)，采用PALL公司的兩種不同膜(PVDF聚偏氟乙烯和PES聚醚砜)，膜直徑為47mm和0.2mm。
測定用流變儀(ViscoStar L Fungilab)過濾前后的粘度聚丙烯管中加入50ml水凝膠(1)，冰浴(T＝5±2℃)，軸度n°2，，轉(zhuǎn)速100rpm.。過濾過程中沒有觀察到明顯的流變變化。
通過SEC HPLC/熒光檢測儀(PBS(pH7.4)，37℃，100rpm/1g水凝膠(1)溶于4mL PBS)分析過濾前后載有IFN的水凝膠(1)的干擾素單體含量和釋放動力學。過濾后獲得的釋放情況與過濾前非常相似，因此，過濾過程不會改變水凝膠的干擾素釋放特性。
實施例5泊洛沙姆407 r-hIFN β 1a水凝膠(2)按實施例(1)所述制備IFN水凝膠(2)并在形成泊洛沙姆水凝膠溶液之前，即在加入泊洛沙姆407之前，在緩沖液中加入2.6％w/w海藻糖(Sigma)。
水凝膠(2)組成泊洛沙姆407 25％w/w醋酸鹽緩沖液50mM/pH 3.8 72.04％w/wr-hIFNβ1a 0.012％w/w
L-甲硫氨酸 0.03％w/w泊洛沙姆188 0.24％w/w海藻糖 2.6％w/w粘度進行動態(tài)粘度研究來特征分析水凝膠(2)的特性及其可注射性能。用ViscoStar L旋轉(zhuǎn)粘度計獲得粘度的mPas(百分之一泊)直接讀數(shù)。將水凝膠(2)加入到聚丙烯小管中進行粘度測定(SPL4，速度范圍200-300rpm)，同時改變溫度和在黏度計顯示屏上連續(xù)讀取數(shù)值。
結(jié)果表明水凝膠(2)與水凝膠(1)相比，流變學行為有所不同。采用本發(fā)明含2.6％w/w海藻糖的水凝膠(2)導(dǎo)致溶液-凝膠轉(zhuǎn)變溫度升高(圖5)從而改進了該基質(zhì)的制備條件和處理。
實施例6泊洛沙姆407 r-hIFN β 1a水凝膠(3)按實施例(1)所述制備IFN水凝膠(3)，但在磁力攪拌(500-700rpm)下在緩沖液中加入2.6％w/w羥丙基-β-環(huán)糊精(Cavasol W7HP，Wacker)然后加入泊洛沙姆407。隨后，如實施例1所述，在磁力攪拌下將泊洛沙姆407加入到羥丙基-β-環(huán)糊精/緩沖液中。
水凝膠(3)組成泊洛沙姆407 20％w/w醋酸鹽緩沖液50mM/pH3.877.34％w/wr-hIFN β 1a 0.015％w/wL-甲硫氨酸0.04％w/w泊洛沙姆188 0.24％w/wCavasol W7HP 2.6％w/w.
粘度進行動態(tài)粘度研究特征水凝膠(3)的特性及其可注射性能。用ViscoStarL旋轉(zhuǎn)粘度計獲得粘度的mPas(百分之一泊)直接讀數(shù)。將水凝膠(3)加入到聚丙烯小管進行粘度(SPL4，速度范圍200-300rpm)測定，同時改變溫度和在黏度計顯示屏上連續(xù)讀取數(shù)值。
結(jié)果如圖5所示，表明水凝膠(3)與水凝膠(1)相比流變學行為有所不同。水凝膠(3)的溶液-凝膠轉(zhuǎn)變溫度從約11℃上升到23℃。
令人驚訝的是，盡管使用了較低濃度的基質(zhì)形成泊洛沙姆407(20％w/w)(圖5)，但水凝膠(3)的溶液-凝膠轉(zhuǎn)變溫度的改變與含有海藻糖的水凝膠(2)相比增加更為顯著，從而顯著改進了該基質(zhì)的制備條件和處理。
-蛋白釋放為了模仿生理性的皮下環(huán)境，如上文所述研究了用PBS配的水凝膠(3)的干擾素-β的釋放。在37±2℃水浴中實施藥物釋放實驗，采用1g水凝膠(3)(用預(yù)填裝注射器分散)溶于pH＝7.4，4mLPBS中(搖動速率＝100rpm)。于5、15、30分鐘，1小時和2小時時收集樣品。
用帶熒光檢測儀(Trp熒光)的SE-HPLC分析每個樣品。盡管溶液-凝膠轉(zhuǎn)變溫度有所改變，但含有環(huán)糊精的水凝膠(3)的持續(xù)釋放性能(干擾素-β的釋放情況)與不含溶液-凝膠溫度轉(zhuǎn)變修飾劑的水凝膠，即水凝膠(1)相當。如實施例(2)所述從抗病毒試驗觀察到，與安慰劑中的r-hIFNβ1a液體峰相比，含環(huán)糊精的水凝膠(3)2小時后釋放的r-hIFN β 1a保留了生物學活性并且回收完全。因此，看起來含環(huán)糊精的水凝膠(3)在藥物釋放上能完全保持r-hIFN β 1a的生物學活性。
實施例7泊洛沙姆407r-hIFN β 1a水凝膠(4)按實施例(1)所述制備IFN水凝膠(4)，將甘油30°Bé(Carlo Erba)2.6％w/w加入到緩沖液中然后形成泊洛沙姆水凝膠溶液，即然后加入泊洛沙姆407之前。
水凝膠(4)組成泊洛沙姆407 25％w/w醋酸鹽緩沖液50mM/pH3.872.04％w/wr-hIFN β 1a 0.012％w/wL-甲硫氨酸0.03％w/w泊洛沙姆188 0.24％w/w甘油30°Bé 2.6％w/w實施例8泊洛沙姆407 r-hIFN β1a水凝膠(5)
按實施例(1)所述制備IFN水凝膠(5)，將PEG(LutrolE400，Basf)2.6％w/w加入到緩沖液中，然后形成泊洛沙姆水凝膠溶液，即然后加入泊洛沙姆407。
水凝膠(5)組成泊洛沙姆407 25％w/w醋酸鹽緩沖液50mM/pH3.872.04％w/wr-hIFN β 1a 0.012％w/wL-甲硫氨酸0.03％w/w泊洛沙姆188 0.24％w/wPEG(LutrolE400) 2.6％w/w實施例9注射器檢測為測試干擾素泊洛沙姆水凝膠的皮下可注射性，采用不同型號針頭進行注射器試驗。
具體說，采用稱為Depot one(Imprint Pharmaceuticals)的新型注射技術(shù)進行此注射測試驗。
選出的Depot one針頭如下-18/23(內(nèi)徑等于18號針頭和21號針頭的最小外徑)-21/26(內(nèi)徑等于21號針頭和26號針頭的最小外徑)將裝有0.5 mL水凝膠(1)或水凝膠(3)(保持在4℃)的3mL聚丙烯注射器放在室溫15分鐘后，背地(水凝膠)注射到聚苯乙烯小瓶中。
“針頭性能”根據(jù)注射器注射水凝膠所需力來評價。
室溫注射器測試顯示水凝膠(3)在室溫時注射性能非常好。
實施例10泊洛沙姆407r-hIFN-β1a水凝膠(3)藥物動力學概況在先前沒接受過r-hIFN-β和其它研究藥物治療的幼稚型雌性食蟹猴中，評估了泊洛沙姆407r-hIFN-β1a水凝膠(3)的藥物動力學性質(zhì)。
動物體重范圍在研究開始時為2-4kg年齡范圍約5歲每組動物數(shù)4
動物禁食過夜(即約16h)后給予諸制劑。治療4個小時后進食，隨意飲水。
將320mg407r-hIFN-β1a水凝膠制劑(3)以每克174μg r-hIFNβ1a強度預(yù)裝填在帶21G針頭的注射器中。由于該凝膠制劑的熱可逆特性，預(yù)填裝注射器應(yīng)于4℃貯藏，只有在需要給藥時才維持于室溫。
以每只動物44μg r-hIFNβ的單次劑量注射于一只腿的皮下。組1中(動物1-4)每只猴子(每只猴子一個注射器)給予的預(yù)填裝注射器含200-250mg r-hIFN β 1a水凝膠制劑(3)。給藥前后稱重玻璃預(yù)填裝注射器以便精確評估給藥劑量。
按下表中的詳細方案從頭靜脈中采血裝在小管中

讓血樣在室溫下60分鐘凝結(jié)。4℃2500g(3350rPm)離心沉淀凝血15分鐘。
收集0.5mL血的血清分成兩份時，第一份至少有0.125mL血清，剩下血清為第二份。
收集1.0mL血的血清分成兩份時，第一份至少有0.250mL血清，剩下血清為第二份。
收集1.5mL血的血清分成三份時，第一、二份至少有0.250mL血清，剩下血清為第三份。
將分析r-hIFN-β1a所用血清樣品貯藏于-80℃。
將分析新蝶呤所用血清樣品貯藏于-20℃。
每次給藥后相應(yīng)時間(小時)獲得r-hIFN β1a各血清濃度(IU/mL)的以下藥物動力學參數(shù)。
直接觀察Cmax血清中檢測出的最高濃度值Tmax給藥后檢測出最高濃度值的時間Tz 最后樣品檢測時間可定量的濃度Cz樣品檢測時間Tz獲得的濃度值按WinNonlin的程序AUCz曲線相關(guān)血清濃度與時間曲線直到取樣時間Tz下的面積，按線性對數(shù)梯形規(guī)則計算(線性直到Cmax，Cmax后的對數(shù)).
Tlin認為是確定消除半衰期的第一時間點λz消除速率常數(shù)，通過擬合終末濃度值與時間(從Tlin到Tz)的自然對數(shù)獲得的線性回歸曲線斜率計算t1/2消除半衰期，按以下方程式計算t1/2＝(ln 2)/λzAUC血清濃度與時間曲線下的面積，按下列方程式計算AUC＝ AUCz+Cz/λz％AUCext外推AUC的百分比，(即通過外推法獲得)，按下列方程式計算％AUCext＝(AUC-AUCz)/AUC.100此實驗可與組2動物平行進行，用市售IFNβ制劑作為參比品(例如Rebif濃度為44μgr-hIFN β 1a(12MIU)的含人血清蛋白(HSA)、賦形劑甘露醇和乙酸鈉的液體制劑，裝在帶有21G針頭0.5mL注射容積的預(yù)填裝注射器中)。此例中，組2(第5-8只猴子)每只猴子給予一只Rebif預(yù)填裝注射器的全部0.5ml內(nèi)容物。
分析物干擾素-β(r-hIFN β 1a)

這些結(jié)果表明r-hIFN β1a水凝膠制劑(3)具有有高的生物利用度。
序列表<110>阿雷斯貿(mào)易股份有限公司(ARES TRADING S.A.)<120>干擾素水凝膠制劑<130>WO/840<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>3<212>PRT<213>未知<220>
<223>人工合成<400>1Glu Phe Met1<210>2<211>13<212>PRT<213>未知<220>
<223>人工合成<400>2Glu Phe Gly Ala Gly Leu Val Leu Gly Gly Gln Phe Met1 5 10
權(quán)利要求
1.一種含有干擾素(IFN)的藥物組合物，其特征在于，所述組合物為泊洛沙姆水凝膠。
2.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中所述干擾素是IFN-β。
3.如權(quán)利要求1或2所述的藥物組合物，其中所述干擾素是重組IFN-β。
4.如以上任何一項權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中所述干擾素是重組IFN-βla。
5.如以上任何一項權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中該組合物還包含緩沖液和抗氧化劑。
6.如以上任何一項權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中該組合物還包含緩沖液和表面活性劑。
7.如以上任何一項權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中該組合物還包含固體-凝膠溫度轉(zhuǎn)變修飾劑。
8.如以上任何一項權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中該組合物還包含選自海藻糖和環(huán)糊精的固體-膠凝溫度轉(zhuǎn)變修飾劑。
9.如以上任何一項權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆407。
10.如以上任何一項權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中該組合物含有20-25％w/w泊洛沙姆407。
11.如權(quán)利要求1所述的藥物組合物，其中該組合物是含有重組IFN-βla的泊洛沙姆水凝膠和還含有緩沖液和L-甲硫氨酸。
12.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中該組合物還包含泊洛沙姆188。
13.如權(quán)利要求12所述的藥物組合物，其中該組合物還包含海藻糖。
14.如權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中該組合物還包含羥丙基-β-環(huán)糊精。
15.如以上任何一項權(quán)利要求所述的藥物組合物，其中該組合物選自泊洛沙姆407-25％w/w醋酸鹽緩沖液50 mM/pH 3.8-74.7％w/wr-hIFNβla-0.0 12％w/wL-甲硫氨酸-0.03％w/w泊洛沙姆188-0.24％w/w；泊洛沙姆407 -25％w/w醋酸鹽緩沖液50 mM/pH 3.8 -72.04％w/wr-hIFNβla-0.012％w/wL-甲硫氨酸-0.03％w/w泊洛沙姆188-0.24％w/w甘油30°Bé-2.6％w/w；泊洛沙姆407-25％w/w醋酸鹽緩沖液50 mM/pH 3.8 -72.04％w/wr-hIFNβla-0.012％w/wL-甲硫氨酸-0.03％w/w泊洛沙姆188-0.24％w/w聚乙二醇(LutrolE400)-2.6％w/w；泊洛沙姆407-25％w/w醋酸鹽緩沖液50 mM/pH 3.8-72.04％w/wr-h-IFNβla-0.012％w/wL-甲硫氨酸-0.03％w/w泊洛沙姆188-0.24％w/w海藻糖-2.6％w/w；和泊洛沙姆407-20％w/w醋酸鹽緩沖液50 mM/pH 3.8-77.34％w/wr-h-IFNβla-0.015％w/wL-甲硫氨酸-0.04％w/w羥丙基-β-環(huán)糊精-2.6％w/w。
16.一種制備權(quán)利要求1-15所述IFN水凝膠組合物的方法，其特征在于，該方法包括在形成均一聚合物溶液的溫度下將計算量的泊洛沙姆加入到緩沖液中，然后加入干擾素。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述緩沖液含有溶液-凝膠溫度轉(zhuǎn)變修飾劑。
18.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述緩沖液含有選自海藻糖和環(huán)糊精的溶液-凝膠溫度轉(zhuǎn)變修飾劑。
19.如權(quán)利要求16-18所述的方法，其中加入干擾素的溶液含有選自L-甲硫氨酸和泊洛沙姆188及它們的混合物的穩(wěn)定劑。
20.如權(quán)利要求1-15所述干擾素水凝膠組合物在制備治療多發(fā)性硬化癥的藥物制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有干擾素的泊洛沙姆水凝膠藥物制劑。具體地說，本發(fā)明涉及含有干擾素－β的持續(xù)釋放水凝膠制劑及其制備方法和該制劑的用途。
文檔編號A61K47/34GK1984673SQ200580023707
公開日2007年6月20日 申請日期2005年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月17日
發(fā)明者M·D·德爾克托, I·贊巴蒂, S·波姆比利, P·艾斯波斯托 申請人:阿雷斯貿(mào)易股份有限公司