一種過量表達(dá)atp酶的基因工程醋酸菌及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種過量表達(dá)ATP酶的基因工程醋酸菌及其 構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 食醋是全球消費(fèi)量最大的調(diào)味品之一，其主要成分是醋酸，而醋酸不僅是食品工 業(yè)最重要的輔料，而且是食品、醫(yī)藥、化工、紡織等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的化合物之一。醋酸菌 (Aceticacidbacteria)是一類能將乙醇氧化成醋酸等產(chǎn)物的細(xì)菌，有些還能氧化葡萄糖 為葡萄糖酸，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。醋酸菌是革蘭氏陰性菌，化能異養(yǎng)型，嚴(yán)格好 氧，最常見是醋桿菌屬（Acetobacter)葡萄糖桿菌屬（Gluconobacter)以及葡糖酸醋桿菌 屬（Gluconacetobacter)等，其中醋桿菌屬和葡萄糖桿菌屬由于具有較高的乙醇氧化和醋 酸耐受能力，常用于醋酸的發(fā)酵生產(chǎn)。
[0003] 醋酸的發(fā)酵是在醋酸菌脫氫酶系的作用下完成從乙醇到醋酸的氧化反應(yīng)，主要分 為二個(gè)階段：乙醇在乙醇脫氫酶（AlcoholDehydrogenase，ADH)的催化下氧化成乙醛，接 著由乙醛脫氫酶（AldehydeDehydrogenase,ALDH)氧化成醋酸。發(fā)酵過程中菌體濃度、乙 醇濃度、菌體內(nèi)催化酶的活性以及輔酶濃度，都是影響產(chǎn)酸速率的重要因素，而發(fā)酵過程中 醋酸的積累會(huì)對菌體活性產(chǎn)生較大影響。因此，提高醋酸菌的醋酸耐受性對于醋酸發(fā)酵工 業(yè)具有重大意義。近年來對于醋酸菌醋酸耐受性的研究中發(fā)現(xiàn)，各種耐酸機(jī)制大多需要消 耗ATP以實(shí)現(xiàn)對醋酸的耐受，因此高效快速的能量供應(yīng)是醋酸菌在高酸發(fā)酵環(huán)境中進(jìn)行正 常生理代謝的重要保障。其中，ATP酶（ATPase)在菌體能量代謝中起著重要的作用。
[0004] 三磷酸腺苷（Adenosinetriphosphate,ATP)是一種核苷酸（又叫腺苷三磷酸）， 是體內(nèi)組織細(xì)胞一切生命活動(dòng)所需能量的直接來源，被譽(yù)為細(xì)胞內(nèi)能量的"分子貨幣"，儲(chǔ) 存和傳遞化學(xué)能，蛋白質(zhì)、脂肪、糖和核苷酸的合成都需它參與，可促使機(jī)體各種細(xì)胞的修 復(fù)和再生，增強(qiáng)細(xì)胞代謝活性。ATP酶，又稱為三磷酸腺苷酶，是一類能將三磷酸腺苷（ATP) 催化水解為二磷酸腺苷（ADP)和磷酸根離子的酶，這是一個(gè)釋放能量的反應(yīng)。ATP酶可水 解ATP釋放能量，其活性可反映細(xì)胞能量水平。生物體內(nèi)大多反應(yīng)都需要能量，醋酸菌發(fā) 酵乙醇產(chǎn)醋酸并將其體內(nèi)的醋酸轉(zhuǎn)運(yùn)出體外都需要能量供應(yīng)。有研究表明醋酸菌對醋酸的 耐受性與能量相關(guān)，但ATP酶在生物體內(nèi)的濃度較低，制約了發(fā)酵的效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種能夠提升ATP酶表達(dá)量、減少能源消耗、提升生產(chǎn)效 率、降低生產(chǎn)成本的一種過量表達(dá)ATP酶的基因工程醋酸菌，本發(fā)明還提供該基因工程醋 酸菌的構(gòu)建方法和應(yīng)用。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種過量表達(dá)ATP酶的基因工程醋酸菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0008]a.將乙醛脫氫酶啟動(dòng)子、ATP酶基因以及可在醋酸菌中穩(wěn)定復(fù)制的質(zhì)粒依次連 接，得到重組質(zhì)粒；
[0009]b.將經(jīng)過a步驟得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入醋酸菌中，即得。
[0010] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述乙醛脫氫酶啟動(dòng)子來源于巴氏醋桿菌。
[0011] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述可在醋酸菌中穩(wěn)定復(fù)制的質(zhì)粒為pBBRRlMCS-4質(zhì) 粒；所述重組質(zhì)粒為pBBR-paldh-ATPase質(zhì)粒。
[0012] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述a步驟具體包括如下步驟：
[0013] I .以巴氏醋桿菌基因組為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到乙醛脫氫酶啟動(dòng)子序列，所 述乙醛脫氫酶啟動(dòng)子序列如序列SEQIDNo: 1所示；
[0014] 其中PCR反應(yīng)所用到的引物對為：
[0015] Daldh-Ι:5'-CGCGGATCCCGGAATCCTGAAAACGGG-3' ；
[0016] Daldh-2:5'-AGCACTAGTCATGACCAATACCTTTGTATGT-3' ；
[0017]PCR反應(yīng)的條件為：94-95°C預(yù)變性 5 分鐘，94-95°C30 秒s，50-60°C20 秒， 72°C20-40 秒，25-30 個(gè)循環(huán)后 72°C10 分鐘；
[0018]II.將質(zhì)粒pBBRlMCS-4和步驟I得到的SEQIDNo:l序列分別用限制性內(nèi)切酶 BamHI和SpeI處理，處理時(shí)間為2-12h、環(huán)境溫度為37°C;純化回收，將酶切純化后的質(zhì) 粒和SEQIDNo: 1序列按摩爾比1:0. 2-5混合，然后利用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng) 溫度為14_16°C，反應(yīng)時(shí)間為4-12小時(shí)；接著將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)中， 獲得重組質(zhì)粒pBBR-Paldh;
[0019] III.以巴氏醋桿菌基因組為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到ATP酶基因序列，所述ATP 酶基因序列如序列SEQIDNo:2所示；
[0020] 其中PCR反應(yīng)所用到的引物對為：
[0021] ATPase-Ι:5'-AGCACTAGTATGTGGTCTAAACCGATCACA-3' ；
[0022] ATPase-2 :5'-TGCTCTAGATCACGCTCTAGAGAGGCTG-3' ；
[0023]PCR反應(yīng)條件為：94-95°C預(yù)變性 5 分鐘，94-95°C30 秒，50-60°C20 秒，72°C1-2 分 鐘，25-30個(gè)循環(huán)后72°C10分鐘；
[0024]IV.將步驟II得到的重組質(zhì)粒pBBR-Paldh、步驟III得到的ATP酶基因序列分別用 限制性內(nèi)切酶SpeI和XbaI處理，處理時(shí)間為2-12h、環(huán)境溫度為37°C;純化回收，將酶切 純化后的質(zhì)粒和ATP酶基因序列按摩爾比1:0. 2-5混合，然后利用T4DNA連接酶進(jìn)行連接 反應(yīng)，反應(yīng)溫度為14-16°C，反應(yīng)時(shí)間為4-12小時(shí)；然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α 感受態(tài)中，獲得重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase。
[0025] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述b步驟中采用電激轉(zhuǎn)化法將a步驟得到的重組質(zhì)粒 轉(zhuǎn)入醋酸菌中。
[0026] 本發(fā)明中，優(yōu)選的方案為所述b步驟中的醋酸菌選自葡糖桿菌、醋桿菌和葡糖酸 醋桿菌。
[0027] 本發(fā)明還提供由上述構(gòu)建方法得到的過量表達(dá)ATP酶的基因工程醋酸菌。
[0028] 本發(fā)明還提供該過量表達(dá)ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸發(fā)酵中應(yīng)用，所述醋酸 發(fā)酵以乙醇或含有乙醇的酒醪為原料。
[0029]本發(fā)明中，所述的過量表達(dá)ATP酶的基因工程醋酸菌在醋酸發(fā)酵中應(yīng)用，具體包 括如下步驟：將過量表達(dá)ATP酶的基因工程醋酸菌在培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，然后將擴(kuò)繁 培養(yǎng)后的過量表達(dá)ATP酶的基因工程醋酸菌和原料一起置于發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵；具體的， 所述醋酸發(fā)酵的方式可以為分批發(fā)酵、補(bǔ)料分批發(fā)酵或分割發(fā)酵。
[0030] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0031] (1)本發(fā)明通過構(gòu)建含有ATPase的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入醋酸菌中，獲得過量表達(dá)ATP 酶的基因工程醋酸菌，從而提高醋酸菌體內(nèi)乙醇轉(zhuǎn)化為醋酸過程和生長代謝所需要的能 量。
[0032] (2)本發(fā)明利用乙醛脫氫酶啟動(dòng)子控制重組質(zhì)粒中ATP酶的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了乙醛脫 氫酶和ATP酶的同時(shí)合成，具有協(xié)同效果。當(dāng)培養(yǎng)基中不含有乙醇時(shí)，該啟動(dòng)子不進(jìn)行ATP 酶的重組表達(dá)，提高了菌體的穩(wěn)定性，并且，通過比較原始菌株和基因工程菌株生長曲線， 發(fā)現(xiàn)基因工程質(zhì)粒對菌體生長沒有影響。
[0033] (3)利用該基因工程醋酸菌以乙醇為主要原料進(jìn)行醋酸發(fā)酵具有發(fā)酵延遲期短， 發(fā)酵速率尚等優(yōu)點(diǎn)，從而減少能源消耗、提尚生廣效率、提尚企業(yè)效益。
[0034] 下面結(jié)合附圖及【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0035]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1的基因工程醋酸菌和原始菌株在第一組發(fā)酵培養(yǎng)基中的醋 酸發(fā)酵比較數(shù)據(jù)圖；
[0036]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1的基因工程醋酸菌和原始菌株在第二組發(fā)酵培養(yǎng)基中的醋 酸發(fā)酵比較數(shù)據(jù)圖；
[0037]圖3本發(fā)明實(shí)施例2的基因工程醋酸菌和原始菌株以含乙醇8%、醋酸濃度10g/L 的培養(yǎng)基中的醋酸發(fā)酵比較數(shù)據(jù)圖；
[0038]圖4本發(fā)明實(shí)施例3的基因工程醋酸菌和原始菌株以蘋果酒為原料的醋酸發(fā)酵比 較數(shù)據(jù)圖；
[0039] 其中，圖1-圖2中，基因工程醋酸菌為含有重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase 的Acetobacter pasteur ianus CGMCC 3089基因工程菌，原始菌株為Acetobacter pasteurianus CGMCC 3089菌株；
[0040] 圖3中，基因工程醋酸菌為含有重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase的Acetobacter acetiCGMCCl. 1809基因工程菌，原始菌株為Acetobacter acetiCGMCCl. 1809菌株；
[0041] 圖4中，基因工程醋酸菌為含有重組質(zhì)粒pBBR-Paldh-ATPase的Gluconobacter oxydans