一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法，屬于天然產(chǎn)物及生物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域。以生漆過(guò)敏源漆酚為底物的生物轉(zhuǎn)化菌株的篩選及方法，通過(guò)底物誘導(dǎo)篩選出高效降解漆酚的灰色鏈霉菌誘色變種（Streptomyces griseus var. ferrugineus）菌株，對(duì)漆酚的轉(zhuǎn)換率達(dá)93.38%。該方法操作簡(jiǎn)便，對(duì)漆酚的轉(zhuǎn)化率高，可廣泛應(yīng)用于漆酚過(guò)敏去除及無(wú)致敏性漆樹(shù)活性提取物的開(kāi)發(fā)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法，屬于天然產(chǎn)物和生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]漆樹(shù)科(Anacadiaceae)的漆樹(shù)(RhusvernicifIua Stokes)韌皮部的分泌物，生漆，又稱(chēng)“土漆”、“國(guó)漆”或“大漆”，是漆樹(shù)中最具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)物，在我國(guó)已有七千余年的悠久歷史[I]。生漆為乳白色膠狀液體，一旦接觸空氣后轉(zhuǎn)為褐色，數(shù)小時(shí)后表面于涸硬化而生成漆皮。生漆主要應(yīng)用于涂料行業(yè)，具有極高的適用經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因其高光澤，高硬度，耐腐、耐磨、耐酸、耐溶劑、耐熱、隔水和絕緣性好、富有光澤等待性，抗化學(xué)腐蝕等特性，是軍工、工業(yè)設(shè)備、農(nóng)業(yè)、建設(shè)、和家具等的優(yōu)良涂料，而有“涂料之王”的美譽(yù)。
[0003]生漆是一種優(yōu)質(zhì)的天然涂料，但又具有十分強(qiáng)烈的致敏性。漆酚類(lèi)物質(zhì)具有強(qiáng)烈的致敏特征，調(diào)查顯示在中國(guó)約有2億人對(duì)漆酚過(guò)敏;而約40%以上人致敏量低于2yg;而有報(bào)道顯示，少數(shù)生漆漆酚過(guò)敏體質(zhì)有急性腎炎的癥狀;過(guò)敏患處腫脹，奇癢難忍，經(jīng)抓搔后會(huì)出現(xiàn)紅色小丘斑，嚴(yán)重者皮膚局部呈現(xiàn)水痘大小的水泡。由于生漆中有致敏性物質(zhì)，施工工過(guò)程中，很大一部分人員直接接觸或嗅到生漆的氣味，均會(huì)發(fā)生不同程度的過(guò)敏反應(yīng)，致使能夠使用生漆的技術(shù)人員越來(lái)越少，在化學(xué)涂料迅速發(fā)展的今天，在可供選擇而激烈競(jìng)爭(zhēng)的情況下，生漆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展必然處于劣勢(shì)。因此生漆過(guò)敏反應(yīng)問(wèn)題是漆樹(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展中迫切需要解決的一項(xiàng)工作。
[0004]生漆作為中國(guó)重要的林產(chǎn)品，也是漆樹(shù)產(chǎn)區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)來(lái)源之一。除生漆以外，漆樹(shù)中還包括漆油、漆蠟和漆樹(shù)活性物等產(chǎn)品，漆籽油在我國(guó)少數(shù)民族一直有食用和藥用的習(xí)慣，可以防止胃病和止血，野漆蠟在日本得到廣泛的應(yīng)用，韓國(guó)對(duì)漆樹(shù)活性物進(jìn)行了大量的研究，其黃酮提取物具有優(yōu)良的藥理活性，抗氧化、抑菌、抑制葡糖苷酶、抗誘變、抗血小板聚集作用和抗腫瘤等作用。但是漆樹(shù)的這些部位也同樣具有過(guò)敏性問(wèn)題，韓國(guó)當(dāng)?shù)厥称匪幤繁O(jiān)督管理局特別制定了漆樹(shù)黃酮提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，其中對(duì)致敏物漆酚進(jìn)行了嚴(yán)格限定，提取物中不得含有漆酚。因此致敏物的脫除技術(shù)是這些產(chǎn)品能夠有效廣泛使用的必要條件。利用微生物技術(shù)從原料進(jìn)行固態(tài)生物發(fā)酵降解致敏物，從而從源頭達(dá)到去除致敏物的目的，這對(duì)中國(guó)漆樹(shù)資源的合理高效開(kāi)發(fā)具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明了一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法，由以下步驟組成:
第一步，斜面培養(yǎng)
將菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基上，在28?30 °C條件下，靜置培養(yǎng)5天，獲得斜面菌種； 第二步，制備種子培養(yǎng)液
將第一步中的斜面菌種，在無(wú)菌條件下，取5環(huán)菌體，轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，在30?35°C條件下，180rpm搖床培養(yǎng)5-7天，制得種子培養(yǎng)液；
第三步，生物轉(zhuǎn)化
使用第二步中的種子培養(yǎng)液，以體積比4?6%加入0.4?1%的漆酚，接種底物培養(yǎng)基，在30?35°C條件下，ISOrpm搖床培養(yǎng)I?2天，發(fā)酵后的原液，過(guò)濾除去菌體，濾液加入體積比1:3?5的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，制備乙酸乙酯萃取物，得到降解物，稱(chēng)取重量，用乙醇定容至1mL容量瓶，然后用紫外檢測(cè)與薄層檢測(cè)相結(jié)合的方法鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，從中篩選優(yōu)選菌株；
第四步，生漆漆酚的去除
將第三步的優(yōu)選菌株，使用第二步中的種子培養(yǎng)液，以體積比4?6%加入0.4?I%的漆酚，接種底物培養(yǎng)基，在28?35°C條件下，180rpm搖床培養(yǎng)2?3天，通過(guò)紫外檢測(cè)發(fā)酵液中的漆酚含量，計(jì)算可得轉(zhuǎn)化率為63.75?93.38% ο
[0006]本專(zhuān)利第四步中的優(yōu)選菌株為野油菜黃單細(xì)胞Za/3 iAoff1/jas campestris ,NO CICC10258、灰色鏈霉菌鎊色變罕中g(shù) r i s e u s v a r.ferrugin eus ,NO CICC23624、雅致/J、克辛艮漢霉 _/a el egans , NOCICC40250、華根霉izopus chinensis ,m CICC3091和季也蒙假絲酵母季也蒙變種Candida gu i 11 i ermond i i var.g u i 11 i e rm o n d i i ,W) CICC1274 中的一矛中。
[0007]本專(zhuān)利第一步中的斜面培養(yǎng)基配方為，野油菜黃單細(xì)胞:蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g,NaCl5.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH7.0;灰色鏈霉菌銹色變種:馬鈴薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，自然pH;雅致小克銀漢霉:馬鈴薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，pH自然;華根霉:5° C麥芽汁1.0L，瓊脂15.0g，自然pH;季也蒙假絲酵母季也蒙變種:5°(:麥芽汁1.(^，瓊脂15.(^，自然?!1。
[0008]本專(zhuān)利第二步中的液體培養(yǎng)基的配方為，野油菜黃單細(xì)胞:蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaC15.0g，蒸餾水1.0L，pH7.0;灰色鏈霉菌銹色變種:馬鈴薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g, pH自然;雅致小克銀漢霉:馬鈴薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，pH自然;華根霉:5° C麥芽汁1.0L，自然pH;季也蒙假絲酵母季也蒙變種:5° C麥芽汁1.0L，自然pH。
[0009]本專(zhuān)利第三步中的紫外檢測(cè)條件為:樣品量2mL置于25的容量瓶?jī)?nèi)，加入1mL的體積比為I: I的1.6%三乙醇胺乙醇溶液和0.1%三氯化鐵乙醇溶液，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，放置15min，在625nm處測(cè)定吸光度。
[0010]本專(zhuān)利第三步中的薄層檢測(cè)的條件為:展開(kāi)劑為石油醚:乙酸乙酯=7.5:2.5，顯色劑:碘蒸氣。
[0011]本專(zhuān)利還可以用于無(wú)致敏性漆樹(shù)活性提取物的制備，將第二步的種子培養(yǎng)液加入到漆樹(shù)葉、籽、皮、木和枝的粉末原料中，種子培養(yǎng)液的添加量為5%?12%，在28?35 0C條件下，發(fā)酵4?5天，期間1h小時(shí)攪拌一次。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵后的原料與30%?100%甲醇水溶液或乙醇水溶液按質(zhì)量體積比I: 15-30 g/mL提取1-4次，提取溫度60_80°C，提取時(shí)間1_3h，提取后，過(guò)濾，合并濾液，真空濃縮得到漆樹(shù)活性提取物，通過(guò)HPLC和GC-MS檢測(cè)，檢測(cè)不到漆酚。
[0012]本專(zhuān)利漆酚檢測(cè)的HPLC條件為:150X 2.0 mm,5 μπι 的Agilent ZORBAX C-18柱，流速為0.3 mL/ min，流動(dòng)相為體積比8經(jīng)2的甲醇與水溶液，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為210nm，進(jìn)樣量為5 yLo
[0013]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明所提供一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法，還具有以下特點(diǎn):
(1)使用生漆過(guò)敏源漆酚為底物進(jìn)行菌株生物轉(zhuǎn)化，有效解決了生漆的致敏性問(wèn)題；
(2)將獲得的菌株應(yīng)用于漆樹(shù)葉、木、枝、皮、籽等活性提取物的預(yù)處理，可以獲得高效低毒的漆樹(shù)活性提取物；
(3)本發(fā)明工藝操作簡(jiǎn)單，易實(shí)施。
【具體實(shí)施方式】
[0014]
以下實(shí)施例為本發(fā)明的一些舉例，不應(yīng)被看做是對(duì)本發(fā)明的限定。
[0015]實(shí)施例1
第一步，斜面培養(yǎng)
將野油菜黃單細(xì)胞Za/3 th omonas campes tri s接種到固體斜面培養(yǎng)基上，固體培養(yǎng)基為:蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl5.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水I.0L，pH7.0;在28?30°C條件下，靜置培養(yǎng)5天，獲得斜面菌種；
第二步，制備種子培養(yǎng)液
將第一步中的斜面菌種，在無(wú)菌條件下，取5環(huán)菌體，轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基為:蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaC15.0g，蒸餾水1.0L，pH7.0;在30?35°C條件下，180rpm搖床培養(yǎng)5-7天，制得野油菜黃單細(xì)胞Za/3 thomonas campes tris種子培養(yǎng)液；第三步，生物轉(zhuǎn)化
使用第二步中的種子培養(yǎng)液，以體積比4-6%加入0.4-1%的漆酚，接種底物培養(yǎng)基，在30?35°C條件下，ISOrpm搖床培養(yǎng)1-2天，發(fā)酵后的原液，過(guò)濾除去菌體，濾液加入體積比1:3-5的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，制備乙酸乙酯萃取物，得到降解物，稱(chēng)取重量，用乙醇定容至1mL容量瓶，然后用紫外檢測(cè)與薄層檢測(cè)相結(jié)合的方法鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。
[0016]紫外檢測(cè)條件為:樣品量2mL置于25的容量瓶?jī)?nèi)，加入1mL的體積比為1:1的1.6%三乙醇胺乙醇溶液和0.1%三氯化鐵乙醇溶液，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，放置15min，在625nm處測(cè)定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確稱(chēng)取飽和漆酚0.lg，加入蒸餾水溶解并定容到25ml容量瓶中，稀釋至刻度，得到0.8mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別移取O、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8和Iml的
0.8mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液至25ml的容量瓶中，分別加入三乙醇胺-三氯化鐵10ml，用蒸餾水定容至刻度，放置15min后，在625nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。按照以上方法繪制漆酚測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)線性回歸分析，得到漆酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.1983x-0.0015 (R2=0.994)，表明兩變量線性相關(guān)性較好。
[0017]薄層檢測(cè)的條件為:展開(kāi)劑為石油醚:乙酸乙酯=7.5:2.5，顯色劑:碘蒸氣。
[0018]根據(jù)計(jì)算漆酚的轉(zhuǎn)化率為:78.01%，由薄層檢測(cè)可知，漆酚結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表現(xiàn)為斑點(diǎn)向上移動(dòng)，極性明顯變?nèi)酰卸ㄆ岱愚D(zhuǎn)化變?yōu)闃O性較小的化合物。
[0019]實(shí)施例2
第一步，斜面培養(yǎng)
將灰色鏈霉菌銹色變種Sirep1ffiyces griseus var.接種到固體斜面培養(yǎng)基上，斜面培養(yǎng)基為:馬鈴薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，自然pH;在28?30 0C條件下，靜置培養(yǎng)5天，獲得斜面菌種；
第二步，制備種子培養(yǎng)液
將第一步中的斜面菌種，在無(wú)菌條件下，取5環(huán)菌體，轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基為馬鈴薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，pH自然;在30?35°C條件下，180rpm搖床培養(yǎng)5_7天，制得灰色鏈霉菌銹色變種Sirep1ffiyces griseus var.種子培養(yǎng)液；
第三步，生物轉(zhuǎn)化
使用第二步中的種子培養(yǎng)液，以體積比4-6%加入0.4-1%的漆酚，接種底物培養(yǎng)基，在30?35°C條件下，ISOrpm搖床培養(yǎng)1-2天，發(fā)酵后的原液，過(guò)濾除去菌體，濾液加入體積比1:3-5的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，制備乙酸乙酯萃取物，得到降解物，稱(chēng)取重量，用乙醇定容至1mL容量瓶，然后用紫外檢測(cè)與薄層檢測(cè)相結(jié)合的方法鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。根據(jù)計(jì)算漆酚的轉(zhuǎn)化率為:93.38%，由薄層檢測(cè)可知，漆酚結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表現(xiàn)為斑點(diǎn)向上移動(dòng)，極性明顯變?nèi)?，判定漆酚轉(zhuǎn)化變?yōu)闃O性較小的化合物。
[0020]實(shí)施例3
第一步，斜面培養(yǎng)
將雅致小克銀漢霉22 a eiega/js菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基上，斜面培養(yǎng)基為:馬鈴薯提取液I.0L，葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，pH自然;在28?30 °C條件下，靜置培養(yǎng)5天，獲得斜面菌種；
第二步，制備種子培養(yǎng)液
將第一步中的斜面菌種，在無(wú)菌條件下，取5環(huán)菌體，轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基為:馬鈴薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，pH自然;在30?35 °C條件下，180rpm搖床培養(yǎng)5_7天，制得雅致小克銀漢霉Cunninghamella e Iegans種子培養(yǎng)液；
第三步，生物轉(zhuǎn)化
使用第二步中的種子培養(yǎng)液，以體積比4-6%加入0.4-1%的漆酚，接種底物培養(yǎng)基，在30?35°C條件下，ISOrpm搖床培養(yǎng)1-2天，發(fā)酵后的原液，過(guò)濾除去菌體，濾液加入體積比1:3-5的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，制備乙酸乙酯萃取物，得到降解物，稱(chēng)取重量，用乙醇定容至1mL容量瓶，然后用紫外檢測(cè)與薄層檢測(cè)相結(jié)合的方法鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。根據(jù)計(jì)算漆酚的轉(zhuǎn)化率為:67.27%，由薄層檢測(cè)可知，漆酚結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表現(xiàn)為斑點(diǎn)向下移動(dòng)，極性明顯變強(qiáng)，判定漆酚轉(zhuǎn)化變?yōu)闃O性較大的化合物。
[0021 ] 實(shí)施例4
第一步，斜面培養(yǎng)
將華根霉仙izopus chinensis菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基上，斜面培養(yǎng)基為:5°C麥芽汁1.0L，瓊脂15.0g，自然pH;在28?30°C條件下，靜置培養(yǎng)5天，獲得斜面菌種；
第二步，制備種子培養(yǎng)液
將第一步中的斜面菌種，在無(wú)菌條件下，取5環(huán)菌體，轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基為:5° C麥芽汁1.0L，自然pH;在30?35°C條件下，180rpm搖床培養(yǎng)5_7天，制得華根霉Rhizopus罕中子培養(yǎng)'液；
第三步，生物轉(zhuǎn)化
使用第二步中的種子培養(yǎng)液，以體積比4-6%加入0.4-1%的漆酚，接種底物培養(yǎng)基，在30?35°C條件下，ISOrpm搖床培養(yǎng)1-2天，發(fā)酵后的原液，過(guò)濾除去菌體，濾液加入體積比1:3-5的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，制備乙酸乙酯萃取物，得到降解物，稱(chēng)取重量，用乙醇定容至1mL容量瓶，然后用紫外檢測(cè)與薄層檢測(cè)相結(jié)合的方法鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。根據(jù)計(jì)算漆酚的轉(zhuǎn)化率為:68.27%，由薄層檢測(cè)可知，漆酚結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表現(xiàn)為斑點(diǎn)向下移動(dòng)，極性明顯變強(qiáng)，判定漆酚轉(zhuǎn)化變?yōu)闃O性較大的化合物。
[0022]實(shí)施例5
第一步，斜面培養(yǎng)
各季也蒙絲酉孝母季也蒙變孝中Ca/3c/ic/a guilliermondii var.貧^^〗￡^/?0/3^〗菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基上，斜面培養(yǎng)基為:5°(:麥芽汁1.(^，瓊脂15.0g，自然pH;在28?30°C條件下，靜置培養(yǎng)5天，獲得斜面菌種；
第二步，制備種子培養(yǎng)液
將第一步中的斜面菌種，在無(wú)菌條件下，取5環(huán)菌體，轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基為:5° C麥芽汁1.0L，自然pH;在30?35°C條件下，180rpm搖床培養(yǎng)5_7天，制得季也蒙假絲酵母季也蒙變種 Ca/3 c/i c/a guilliermondii var.guilliermondi i 種子培養(yǎng)液；
第三步，生物轉(zhuǎn)化
使用第二步中的種子培養(yǎng)液，以體積比4-6%加入0.4-1%的漆酚，接種底物培養(yǎng)基，在30?35°C條件下，ISOrpm搖床培養(yǎng)1-2天，發(fā)酵后的原液，過(guò)濾除去菌體，濾液加入體積比1:3-5的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，制備乙酸乙酯萃取物，得到降解物，稱(chēng)取重量，用乙醇定容至1mL容量瓶，然后用紫外檢測(cè)與薄層檢測(cè)相結(jié)合的方法鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。根據(jù)計(jì)算漆酚的轉(zhuǎn)化率為:64.75%，由薄層檢測(cè)可知，漆酚結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，表現(xiàn)為斑點(diǎn)向上移動(dòng)，極性明顯變?nèi)?，判定漆酚轉(zhuǎn)化變?yōu)闃O性較小的化合物。
[0023]實(shí)施例6
將野油菜黃單細(xì)胞Za/3 thomonas ca_ffljOesi_ris，灰色鏈霉菌鎊色變種Streptomyces griseus var.ferrugineus,難激?、克銀漢霉Cunn inghameI Iaelegans,華被霉Rh i zopus cAi/3e/3sis和季也蒙假絲酵母季也蒙變種Ca/3c/ic/aguilli ermon cl 11 var.guilli ermon c/i i中的一種菌種的種子培養(yǎng)液加入到漆樹(shù)葉、籽、皮、木和枝的粉末原料中，種子培養(yǎng)液的添加量為5%?12%，在28?35 °C條件下，發(fā)酵4?5天，期間1h小時(shí)攪拌一次。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵后的原料與30%?100%甲醇水溶液或乙醇水溶液按質(zhì)量體積比1:15-30 g/mL提取1-4次，提取溫度60-80°C，提取時(shí)間1-3 h，提取后，過(guò)濾，合并濾液，真空濃縮得到漆樹(shù)活性提取物，通過(guò)HPLC和GC-MS檢測(cè)，檢測(cè)不到漆酚。
[0024]HPLC條件為:150X2.0 mm,5 μπι 的Agilent ZORBAX C-18柱，流速為0.3 mL/min，流動(dòng)相為體積比8經(jīng)2的甲醇與水溶液，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量為5 yL。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法，由以下步驟組成: 第一步，斜面培養(yǎng) 將菌株接種到固體斜面培養(yǎng)基上，在28?30 °C條件下，靜置培養(yǎng)5天，獲得斜面菌種； 第二步，制備種子培養(yǎng)液 將第一步中的斜面菌種，在無(wú)菌條件下，取5環(huán)菌體，轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中，在30?350C條件下，180rpm搖床培養(yǎng)5-7天，制得種子培養(yǎng)液； 第三步，生物轉(zhuǎn)化 使用第二步中的種子培養(yǎng)液，以體積比4?6%加入0.4?1%的漆酚，接種底物培養(yǎng)基，在30?35°C條件下，ISOrpm搖床培養(yǎng)I?2天，發(fā)酵后的原液，過(guò)濾除去菌體，濾液加入體積比1:3?5的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，制備乙酸乙酯萃取物，得到降解物，稱(chēng)取重量，用乙醇定容至1mL容量瓶，然后用紫外檢測(cè)與薄層檢測(cè)相結(jié)合的方法鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，從中篩選優(yōu)選菌株； 第四步，生漆漆酚的去除 將第三步的優(yōu)選菌株，使用第二步中的種子培養(yǎng)液，以體積比4?6%加入0.4?1%的漆酚，接種底物培養(yǎng)基，在28?35°C條件下，180rpm搖床培養(yǎng)2?3天，通過(guò)紫外檢測(cè)發(fā)酵液中的漆酚含量，計(jì)算可得轉(zhuǎn)化率為63.75?93.38% ο2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法，其特征在于第四步中的優(yōu)選菌株為野油菜黃單細(xì)胞Za/3 i A ο?ο/3 a s campe s tri s ,W CICC10258、灰色鏈霉IMI ^ ft S' trep tomyces griseus var.f errug in e us ,NO CICC23624、雅致/J、克銀漢霉 Cunninghainella el e g a n s ,NO CI CC40 2 50、華f艮霉i z op t/schinensis，NO 01(^3091和季也蒙假絲酵母季也蒙變種(^/3 0^0^ gui 11 i ermon di ivar.guiIliermondii,W) CICC1274中的一種。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法，其特征在于第一步中的斜面培養(yǎng)基配方為，野油菜黃單細(xì)胞:蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaC15.0g，瓊脂15.0g,蒸餾水1.0L，pH7.0;灰色鏈霉菌銹色變種:馬鈴薯提取液I.0L，葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，自然pH;雅致小克銀漢霉:馬鈴薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，pH自然;華根霉:5° C麥芽汁1.0L，瓊脂15.0g，自然pH;季也蒙假絲酵母季也蒙變種:5° C麥芽汁1.0L，瓊脂15.0g，自然pH。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法，其特征在于第二步中的液體培養(yǎng)基的配方為，野油菜黃單細(xì)胞:蛋白胨5.0g，牛肉浸取物3.0g，NaCl 5.0g，蒸餾水1.0L，pH7.0;灰色鏈霉菌銹色變種:馬鈴薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，pH自然;雅致小克銀漢霉:馬鈴薯提取液I.0L，葡萄糖20.0g，pH自然;華根霉:5。C麥芽汁I.0L，自然pH;季也蒙假絲酵母季也蒙變種:5° C麥芽汁1.0L，自然pH。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法，其特征在于第三步中的紫外檢測(cè)條件為:樣品量2mL置于25的容量瓶?jī)?nèi)，加入1mL的體積比為1:1的1.6%三乙醇胺乙醇溶液和0.1%三氯化鐵乙醇溶液，用無(wú)水乙醇稀釋至刻度，放置15min，在625nm處測(cè)定吸光度。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法，其特征在于第三步中的薄層檢測(cè)的條件為:展開(kāi)劑為石油醚:乙酸乙酯=7.5:2.5，顯色劑:碘蒸氣。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法，其特征在于第三步優(yōu)選菌株可應(yīng)用于無(wú)致敏性漆樹(shù)活性提取物的制備，將第二步的種子培養(yǎng)液加入到漆樹(shù)葉、籽、皮、木和枝的粉末原料中，種子培養(yǎng)液的添加量為5%?12%，在28?35 °C條件下，發(fā)酵4?5天，期間1h小時(shí)攪拌一次。8.發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵后的原料與30%?100%甲醇水溶液或乙醇水溶液按質(zhì)量體積比1:15-30 g/mL提取1-4次，提取溫度60-80 °C，提取時(shí)間1_3 h，提取后，過(guò)濾，合并濾液，真空濃縮得到漆樹(shù)活性提取物，通過(guò)HPLC和GC-MS檢測(cè)，檢測(cè)不到漆酚。9.根據(jù)權(quán)利要求7所述一種生物法除去漆樹(shù)漆酚過(guò)敏性的方法，其特征在于HPLC條件為:150X2.0 mm,5 μπι 的Agilent ZORBAX 018柱，流速為0.3 mL/ min，流動(dòng)相為體積比8經(jīng)2的甲醇與水溶液，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量為5 yL。
【文檔編號(hào)】C12R1/845GK106075795SQ201610481535
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】王成章, 陳虹霞
【申請(qǐng)人】中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所