專利名稱：：90k腫瘤相關(guān)抗原ir-95的遺傳序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬分子和細(xì)胞生物等領(lǐng)域，涉及90K腫瘤相關(guān)抗原(IR-95)的純化及鑒定、編碼90K抗原的遺傳序列、該抗原的克隆和表達(dá)以及其生產(chǎn)和應(yīng)用。在各種癌病患者的血清中已有腫瘤細(xì)胞排出或分泌的抗原的報(bào)道。對(duì)某些類分子的免疫檢測(cè)顯示，它們可用作診斷/預(yù)測(cè)指示劑，并可用于治療性監(jiān)視。部分已被鑒別的抗原包括用于卵巢癌的CA125(Bastdtal.N-Ergl.J.Med，309883-887(1983));用于卵巢癌的MOV2(Miottietal，CancerRes.45826-832(1985));用于乳腺癌的CA15-3(Hilkensetal.，Cancer.Res.462582-2587(1986));用于胃腸癌的CA19-9(Koprowskietal.，Scicnve21153-55(1981));用于胃腸癌的癌胚抗原(CEA)(Golpetal.，JAMA2341331-1334(1968));以及用于胃腸癌的CA50(Holmgrenetaal.，Br.Med.J.2881479-1492(1984))。但是，在所有這些腫瘤抗原血清檢測(cè)方法中沒有一種靈敏到足以對(duì)潛伏的癌癥進(jìn)行早期檢測(cè)，或者對(duì)其復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移進(jìn)行檢測(cè)。這類抗原大部分是表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的表面，但也有一些被分泌到患者的循環(huán)系統(tǒng)中。其中后一類抗原已被證明可用于對(duì)腫瘤負(fù)荷及癌癥的發(fā)展進(jìn)行血清檢測(cè)、預(yù)測(cè)和評(píng)估。檢測(cè)腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體(MAb)已有報(bào)道。例如，已獲得抗循環(huán)乳腺癌相關(guān)抗原的單克隆抗體。其中的sp-2能夠識(shí)別一種稱作90K抗原(a.k.aImmunoRegulin-95或IR-95)的細(xì)胞質(zhì)抗原。90K抗原在80%以上的乳腺癌中均有表達(dá)(Iacobellietal.，CancerRes.463005-3010(1986))。在約50%乳腺癌患者、40%胃腸癌患者及30%婦科癌癥患者的血清中，90K抗原的水平均有升高(Iacobellietal.，BreastCancerRes&Tneat.1119-30(1988))。更重要的是，本發(fā)明的檢測(cè)方法已顯示在患有轉(zhuǎn)移性疾病的個(gè)體中，顯示出血清水平提高的患者的百分?jǐn)?shù)更大，且90K血清變化與癌癥的發(fā)展?fàn)顩r相對(duì)應(yīng)(Iacobellietal.，BreastCancerRes&Tneat.1119-30(1988);Scanbiaetal.，AnticancerRes8761-764(1988);Beneketti-Panicietal.，Gynecol.Oncol.35286-289(1989))。由于90K抗原不同于其它循環(huán)抗原，如CA15-3、CEA和CA125(Jacobellietal.，BreastCancerRes&Tneat.1119-30(1988);BenedettiPanicietal.，Gynecol.Oncil.35286-289(1989))，它可以代表另一種有用診斷工具，用以對(duì)乳腺癌及其它癌癥進(jìn)行監(jiān)測(cè)。引用I型巨噬細(xì)胞清除劑受體(Kolanaetal.，Natwve343531(1990))、海膽Speract受體(Dangottetal，Proc.Natl.Acda.Sci.usA862128(1989))和人淋巴細(xì)胞糖蛋白T1/Leu-1(Jonesetal.，Nature323346(1986))，已發(fā)現(xiàn)了90K抗原中氨基酸35-80區(qū)域的同源性。90K抗原在歐洲專利申請(qǐng)91830153.2(1991年4月17日遞交，公開號(hào)為0453419A2)中有所涉及。具有相同的15氨基酸末端序列的抗原則在PCT申請(qǐng)PCT/US85/02132(1985年10月30日遞交，國際公開號(hào)為WO86/02735)中有所涉及。該P(yáng)CT申請(qǐng)要求了1984年11月2日和1985年10月7日遞交的美國專利申請(qǐng)667，521和785，177的優(yōu)先權(quán)。但是，迄今沒有一項(xiàng)研究具體闡明了該抗原的物理化學(xué)性質(zhì)和免疫化學(xué)性質(zhì)。因此，對(duì)sp-2反應(yīng)性90K抗原進(jìn)行純化和鑒定十分重要。本申請(qǐng)涉及的是以下來源的90K腫瘤相關(guān)抗原的純化和鑒定人乳腺癌細(xì)胞系的培養(yǎng)液、乳腺癌患者的血清以及卵巢癌患者的腹水液。所提供的純化方法產(chǎn)生了至少50，000倍純化的三種不同來源的90K腫瘤相關(guān)抗原。天然抗原是糖蛋白，表觀分子量約為95，000道爾頓，并且是以高分子量復(fù)合物形式存在，所有三種不同來源的抗原具有相似的電泳圖和免疫反應(yīng)性。本發(fā)明還涉及90K抗原的氨基酸序列以及編碼90K抗原的遺傳序列，也提供了90K抗原的診斷和治療用途。圖1顯示了90K蛋白的核苷酸和氨基酸序列(分別為SEQID-NO1和SEQIDNO2)。信號(hào)肽以方框顯示，SRCR同源區(qū)以陰影顯示，潛在的天冬酰胺連接的糖基化位點(diǎn)以圓圈顯示。圖2顯示了對(duì)以下來源的90K抗原進(jìn)行瓊脂糖CL-6B柱層析的結(jié)果CG-5組織培養(yǎng)液(-)、乳腺癌患者的血清(┄)以及卵巢癌患者的腹水液(┄)。通過免疫放射檢測(cè)法(IRMA)檢測(cè)各級(jí)分的90K活性，箭頭表示Dextranblue2000的洗脫體積。圖3顯示了對(duì)90K抗原進(jìn)行密度梯度離心的結(jié)果，將得自CG-5培養(yǎng)液(-)、乳腺癌患者血清(…)、卵巢癌患者腹水液(…)以及乳腺癌患者未分離血清的純化90K在氯化絕中進(jìn)行平衡超離心。通過IRMA檢測(cè)各級(jí)分的90K活性并通過稱量已知體積的各級(jí)分測(cè)定其密度。箭頭表示β-半乳糖苷酶的浮力密度。圖4是對(duì)90K抗原的分子量進(jìn)行測(cè)定。圖4A對(duì)來自人乳腺癌細(xì)胞的放射活性90K抗原進(jìn)行免疫沉淀。利用MAbsp-2(泳道a-e)或抗α-胎蛋白MAb(泳道f)免疫沉淀(200，000cpm三氯乙酸可沉淀的)(35S)甲硫氨酸標(biāo)記的培養(yǎng)液等份試樣，并在2-巰基乙醇存在(泳道a-c和e)式不存在(泳道d)的情況下通過SDSPAGE進(jìn)行分析，接著進(jìn)行熒光x線照相。泳道a含有CG-5細(xì)胞。泳道b含有MCF7細(xì)胞。泳道C含有T47D細(xì)胞。泳道d含有T47D細(xì)胞。泳道e含有得自與衣霉素接觸之后但在被(35S)甲硫氨酸標(biāo)記之前的CG-5細(xì)胞的組織培養(yǎng)液。(圖4B)對(duì)自CG-5培養(yǎng)液(泳道a，620單位)、乳腺癌患者血清(泳道b，920單位)和卵巢癌患者腹水液(泳道c，700單位)純化的90K抗原的SDSPAGE分析。凝膠用銀染色。分子量標(biāo)準(zhǔn)品為磷酸化酶b(Mr97，000)和BSA(Mr66，000)。圖5是對(duì)得自CG-5培養(yǎng)液(泳道a和d)、乳腺癌患者血清(泳道b和e)和卵巢癌患者腹水液(泳道c和f)的純化90K抗原的PAGE和Western吸印分析。在含0.1%NP-40的4-20%梯度凝膠上分析純化的90K抗原。泳道a-c用銀染色。泳道d-f蛋白電吸印到硝酸纖維素膜上，分子量標(biāo)準(zhǔn)品是β-半乳糖苷酶(Mr540，000)和BSA(Mr66000)。圖6顯示了90K抗原酶促消化的結(jié)果。圖6A用各種蛋白酶消化得自CG-5培養(yǎng)物的純化90K并在9%SDSPAGE上分析，接著用銀染色。圖6B相對(duì)于未處理的對(duì)照，顯示了(125I)標(biāo)記的SP-2與消化的90K的結(jié)合。對(duì)于圖6A和6B泳道a為純化的90K對(duì)照;泳道b為鏈霉蛋白酶處理的90K抗原;泳道c為木瓜蛋白酶處理的90K抗原;泳道d為胰蛋白酶處理的90K抗原;泳道e為胰凝乳蛋白酶處理的90K抗原。對(duì)于圖6B泳道f為神經(jīng)氨酸苷酶處理的90K抗原;泳道g為巖藻糖苷酶處理的90K抗原;泳道h為軟骨素酶ABC處理的90K抗原;泳道i為α-半乳糖苷酶處理的90K抗原;泳道l為β-半乳糖苷酶處理的90K抗原。圖7為CMV-IR95的質(zhì)粒圖譜。圖8為CMCNEO-IR95的質(zhì)粒圖譜。圖9為人乳房癌BT20細(xì)胞最初三個(gè)穩(wěn)定克隆的免疫沉淀物的放射自顯影圖。圖10為35S-甲硫氨酸標(biāo)記的在被PCMV-IR95質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)的IR-95的SDS-PAGE圖。圖11為細(xì)胞溶解百分?jǐn)?shù)與IR-95濃度的關(guān)系圖。本發(fā)明提供了一種基本上純的腫瘤相關(guān)抗原，其表現(xiàn)分子量約為95千道爾頓(K)并被命名為90K抗原(a.k.a.ImmunoRegulin-95或IR-95)。在乳腺癌、胃腸癌和婦科癌癥患者的血清中以及攜帶人免疫缺陷病毒(HIV)的患者的血清的血清中，該腫瘤相關(guān)抗原的濃度升高。90K抗原與MAbsp-2反應(yīng)，MAbsp-2是通過用被維持在其中的人MCF-7乳腺癌細(xì)胞釋放到組織培養(yǎng)液中的蛋白質(zhì)免疫小鼠而產(chǎn)生的。產(chǎn)生MAbsp-2的雜交瘤細(xì)胞系已按照歐洲專利公約第28條和第28a條的規(guī)定于1991年4月12日保藏于巴斯德研究所(CollectionNationaledeCulturedeMicrorganisms，28RuedeDoeteurRoux，75724ParisCedex15，F(xiàn)rance)。該保藏物的登記號(hào)為I-1083。1991年4月22日經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞存活。利用MAbsp-2檢測(cè)抗原發(fā)現(xiàn)，在正常個(gè)體中90K以低水平存在。而在50%乳腺癌患者中所檢測(cè)到的抗原水平高達(dá)正常水平的100倍。在非乳腺癌患者，包括卵巢癌、子宮癌和結(jié)腸癌患者的血清中也檢測(cè)到90K抗原。按照本發(fā)明，可從含有90K腫瘤相關(guān)抗原的樣品中分離出該抗原或其抗原決定簇。按照本發(fā)明的方法，任何含有該抗原的樣品均可作為起始原料。在乳腺癌和其它惡性腫瘤患者以及感染HIV患者的組織和血清中發(fā)現(xiàn)的本發(fā)明90K腫瘤相關(guān)抗原是一種糖蛋白。因此，有可能從以下各處分離出90K蛋白人或其它動(dòng)物的血漿或血清;得自天然產(chǎn)生90K蛋白的人或其它動(dòng)物的天然存在的腫瘤細(xì)胞系;得自本身不產(chǎn)生90K蛋白但在被90K表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后已能產(chǎn)生90K蛋白的人體其它動(dòng)物的永久細(xì)胞系;得自本身不產(chǎn)生90K蛋白但能夠在無血清添加劑情況下生長(如u937細(xì)胞)且已被90K基因轉(zhuǎn)染的人或其它動(dòng)物的細(xì)胞系。例如，打算用于本發(fā)明的任何抗原來源包括，但不限于人乳腺癌細(xì)胞系CG-5的培養(yǎng)液;乳腺癌患者的血清;卵巢癌患者的腹水液。這里僅簡(jiǎn)單地用“樣品”來表示含有抗原的樣品，它意指含有90K抗原的任何樣品。在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，一般是用四步法純化90K抗原。該方法包括硫酸銨沉淀，凝膠過濾層析，離子交換層析以及在MAbsp-2親和基質(zhì)上的吸附。但是，也已認(rèn)識(shí)到，對(duì)該方法進(jìn)行某些改動(dòng)仍能夠產(chǎn)生高純度的90K抗原。用于從樣品中分離90K抗原的純化方法總結(jié)于表1中。將樣品離心后，加入固體硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)，并將樣品在4℃放置過夜。離心收集蛋白質(zhì)沉淀物。在每一純化步驟測(cè)定總蛋白質(zhì)并通過IRMA對(duì)抗原進(jìn)行定量分析。在硫酸銨沉淀后幾乎所有90K活性均被回收，導(dǎo)致其約4倍富集。硫酸銨沉淀的抗原接著進(jìn)行大小排阻層析。90K抗原在大峰中穩(wěn)定發(fā)現(xiàn)，緊接在柱空隙容積后洗脫，它意味著該抗原是一大分子量復(fù)合物。與此不一致的是也觀察到低分子量的小反應(yīng)性峰，這可能是產(chǎn)物降解的結(jié)果。通過DEAG-纖維素層析進(jìn)一步純化高分子量峰。90K抗原在NaCl濃度約0.25M昌從柱中被洗脫。最后在偶聯(lián)到MAbsp-2上的瓊脂糖上通過免疫親和吸附進(jìn)行純化。偶聯(lián)按Schneider等人的方法(J.Biol.Cham，25710766-10769(1982))完成。所結(jié)合的90K抗原用緩沖液，優(yōu)選3MMgCl2洗脫。該純化方法產(chǎn)生基本上純的90K抗原?！盎旧霞兊摹敝高@里所述的對(duì)90K抗原的純化產(chǎn)生至少50，000倍，一般為約50，000-80，000倍純化的90K抗原。因此，本發(fā)明涉及基本上純的90K抗原，其表觀分子量約為95，000道爾頓，還涉及含有抗原決定簇的片段以及其它片段。本發(fā)明也涉及天然的90K抗原片段，并涉及90K抗原的非糖基化殘基。這里所用的含有免疫交叉反應(yīng)性抗原決定簇多肽意指具有特定抗體將與其反應(yīng)的共同抗原決定族的多肽。這類多肽包括90K抗原及其片段的糖基化和非糖基化殘基、合成的多肽或其片段以及抗針對(duì)于90K蛋白的活性抗原決定簇的個(gè)體基因型的抗體。現(xiàn)已證實(shí)抗個(gè)體基因型試劑可用于診斷工具，用以檢測(cè)具有與抗體上位點(diǎn)發(fā)生免疫交叉反應(yīng)的位點(diǎn)的抗原(Ppotocnjaketal.，Science2151637-1639(1982))。一旦抗原被純化，被可利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的普通技術(shù)產(chǎn)生抗該抗原的單克隆抗體和多克隆抗體(Klein，J.ImmunologyTheScienceofCell-NoncellDiscrimination，JohnWileyandSons，NewYork，NewYork，usA(1982);Kennethetal.MorwclonalAntibodcies，HybridomaANewDimensioninBiologcialAnalyses，PlenumPress，NewYork，NewYork，usA(1980);Compbell，A.，“MonoclonalAntibodyTechnology，“l(fā)nLaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBivlogy，Vol13(Burdonetal.，eds)，Elsevier，Amsterdem，TheNetherlands(1984);和Eisen，H.N.lnMicrobiology，3rd.Eaition(Davisetal.，eds)，Harper&Row，Philadetphia，PA，usA(1980)。本發(fā)明尤其是感興趣的是在人體內(nèi)產(chǎn)生的抗90K抗原或其衍生物的抗體，或者是通過重組DNA技術(shù)或其它技術(shù)“人格化”(即在人體中為非免疫原性)的抗體。通過例如用相應(yīng)的非免疫原性部分(即嵌合抗體)取代抗體的免疫原性部分可產(chǎn)生人格化抗體(見Robinson等，國際專利公開PCT/us86/02269;Akira等，歐洲專利申請(qǐng)184，187;Taniguchi，M，歐洲專利申請(qǐng)171，496;Morrison等，歐洲專利申請(qǐng)173，494;Newberger等，PCT申請(qǐng)WO86/01533;Cabilly等，Science2401041-1043(1988);Liu等，Proc.Natl.Aced.Sci.usA843439-3443(1987));Liu等，J.Immuvoloyy1393521-3526(1987));Sun等，Proc.Natl.Acad.Sei.usA84214-218(1987);和Shaw等，J.Natl.Cancerlnst.801553-1559(1988))。Norrison，S.L.(Science229.1202-1207(1985))和Oi等人(Biotchncques4214(1986))對(duì)人格化嵌合抗體進(jìn)行了綜述?？衫帽绢I(lǐng)域熟煉技術(shù)人員熟知的技術(shù)對(duì)純化90K蛋白進(jìn)行序列分析。對(duì)90K蛋白的末端氨基酸序列進(jìn)行初步分析后發(fā)現(xiàn)了如下的氨基酸序列(SEQIDNO3)ValAsnAspGlyAspMetArgLeuAlaAspGlyGlyAlaThrAsnGlnGlyArgValGluIlePhe.對(duì)90K抗原的氨基酸組成進(jìn)行分析的結(jié)果見表4。表2提供了對(duì)90K抗原作的進(jìn)一步特征鑒定，它給出了物理和化學(xué)處理對(duì)90K活性的影響?，F(xiàn)在普遍認(rèn)識(shí)到，有了蛋白質(zhì)的氨基酸序列就能夠制備出可用于鑒別該蛋白質(zhì)克隆的核苷酸探針。因此，與合適核酸探針雜交就可鑒別出含有編碼90K抗原的核苷酸序列的克隆。這里所用的術(shù)語“DNA構(gòu)建物”意指通過合成產(chǎn)生的或通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的任何DAN序列。“DNA構(gòu)建物”包括但不限于合成的寡核苷酸、載體和含有插入子的載體。根據(jù)所了解的90K蛋白的氨基酸序列可構(gòu)建出用于鑒別90K抗原基團(tuán)的特定核苷酸探針。氨基酸殘基和肽的序列在本文中是以通常使用的三字母或單字母表示法表示。這些三字母或單字母表示法的目錄可從例如以下教科書中找出Lehninger，A.，Biochemistry，WorthPublishers，lnc.，NewYork，NewYark，USA(1975)及其隨后的各卷。前22個(gè)氨基酸的N-末端序列保證了66個(gè)核苷酸長寡核苷酸的合成，用該寡核苷酸作為探針可從MCF-7細(xì)胞中篩選cDNA庫。利用這種方法，本發(fā)明人完成了分子克隆并測(cè)定出90K抗原的完整cDNA序列。本發(fā)明包括90K抗原的氨基酸序列、編碼該抗原的遺傳序列、含有該遺傳序列的載體、用它轉(zhuǎn)化的宿主、通過轉(zhuǎn)化宿言的表達(dá)生產(chǎn)90K蛋白、從樣品中純化90K蛋白以及90K抗原的應(yīng)用。90K蛋白的核苷酸和氨基酸序列示于圖1中(分別為SEQIDNO1和SEQIDNO2)。應(yīng)當(dāng)理解的是對(duì)特定氨基酸和核苷酸序列的修飾仍包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。這里所用的術(shù)語“修飾”意指任意取代、添加或缺失多肽片段的一個(gè)或多個(gè)氨基酸或核苷酸序列的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。這些修飾可通過操作氨基酸序列本身完成，或通過先改變核酸序列然后用該改變了的核酸序列合成肽的方法來完成。核酸序列的修飾可通過PNA突變，通常是通過定點(diǎn)誘變完成。位點(diǎn)特異性誘變的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的(例如見Adelmanetal.，DNA2183(1983);Smith，M.，Ann.Rev.Genetcis19423(1985))。突變包括，例如核苷酸的取代、添加或缺失，其條件是最終構(gòu)建物具有所需生物活性。核酸的修飾一定不能將序列置于讀碼架之外，且最好不應(yīng)產(chǎn)生能夠產(chǎn)生次級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)(見歐洲專利申請(qǐng)公開號(hào)75，444)。氨基酸和核苷酸的修飾方法是本領(lǐng)域已知的。氨基酸序列的插入包括將一個(gè)殘基的氨基和/或羧基末端融合到基本上未限制其長度的多肽上，以及單個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。序列內(nèi)插入的范圍一般為約1-10個(gè)殘基。更優(yōu)選的范圍是約1-5個(gè)殘基。氨基酸殘基可用合適的氨基或羧基保護(hù)基保護(hù)起來，或不保護(hù)。另外，所合成的肽可被糖基化或不被糖基化。為了表達(dá)90K抗原，需要有可被合適宿主識(shí)別的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯信號(hào)。被克隆的編碼90K蛋白的核酸序列(最好為雙鏈形式)可被可操縱地連接到在表達(dá)載體中控制轉(zhuǎn)錄性表達(dá)的序列上，并加到原核或真核宿主細(xì)胞中以產(chǎn)生重組90K蛋白或其變異體。根據(jù)可操縱地連接到控制轉(zhuǎn)錄性表達(dá)的序列上的90K蛋白編碼序列鏈的類型，也可能表達(dá)90K蛋白反義RNA或其變異體。這里所用的術(shù)語“表達(dá)載體”意指能夠指導(dǎo)可操縱連接的DNA序列的表達(dá)的DNA構(gòu)建物。表達(dá)載體包括，但不限于噬菌體和質(zhì)粒載體?！氨磉_(dá)載體”通常含有選自但不限于以下成分的一個(gè)或多個(gè)成分操縱基因、啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)譯起始信號(hào)和轉(zhuǎn)譯終子信號(hào)。這里所用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”意指能夠被DNA構(gòu)建物或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的任何細(xì)胞。90K蛋白在不同宿主中的表達(dá)可導(dǎo)致轉(zhuǎn)譯后修飾的改變，而這種改變可能會(huì)變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。如果核酸分子如DNA含有具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)信息的表達(dá)控制序列，則認(rèn)為它“能夠表達(dá)”多肽。為了表達(dá)多肽，控制序列必須“可操縱地連接”到編碼多肽的核苷酸序列上。可操縱的連接是指這樣一種連接方式，即編碼多肽的核苷酸序列按一定方式連接到一個(gè)調(diào)節(jié)序列(或多個(gè)調(diào)節(jié)序列)上，使得多肽編碼序列的表達(dá)被置于調(diào)節(jié)序列的影響或控制之下。如果啟動(dòng)子的誘導(dǎo)作用導(dǎo)致了蛋白質(zhì)編碼序列的轉(zhuǎn)錄且如果兩種DNA序列之間連接的性質(zhì)沒有(1)導(dǎo)致產(chǎn)生讀碼移動(dòng)突變，(2)影響表達(dá)調(diào)節(jié)序列指導(dǎo)90KmRNA、反義RNA或蛋白質(zhì)表達(dá)的能力或(3)影響90K模板被啟動(dòng)子區(qū)序列轉(zhuǎn)錄的能力，則可將兩種DNA序列(如90K蛋白編碼序列和連接到編碼序列5′末端的啟動(dòng)子區(qū)序列)之間的連接稱為可操縱的連接。因此，如果啟動(dòng)子能夠影響DNA序列的轉(zhuǎn)錄，就可將該啟動(dòng)子區(qū)可操縱地連接到DNA序列上?；虮磉_(dá)所需的調(diào)節(jié)區(qū)的確切性質(zhì)在處與種之間或不同的細(xì)胞類型之間可能是不同的，但一般均包括與轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯的起始有關(guān)的5′非編碼序列(如TATA盒)、帶帽序列、CAAT序列等。該5′非編碼控制序列主要包括含有對(duì)可操縱連接基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制的啟動(dòng)子的區(qū)域。在真核宿主中表達(dá)90K蛋白需要使用在該宿主中具有功能的調(diào)節(jié)區(qū)。最好是真核的調(diào)節(jié)區(qū)。根據(jù)真核宿主的性質(zhì)，可使用各種轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)序列。也可從感染真核細(xì)胞的病毒的基因組序列中獲得轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯調(diào)節(jié)信號(hào)，這類病毒包括腺病毒、牛乳頭狀瘤病毒、猿猴病毒及皰疹病毒等。最好是將上述控制信號(hào)與能夠在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)的特定基因相連。使用編碼可被轉(zhuǎn)譯的mRNA產(chǎn)物的哺乳動(dòng)物基因的啟動(dòng)子較好，尤其是使用強(qiáng)啟動(dòng)子，如肌動(dòng)蛋白、膠原蛋白、肌漿球蛋白等的啟動(dòng)子，只要它們也能夠在宿主細(xì)胞中發(fā)揮啟動(dòng)子功能。關(guān)于真核啟動(dòng)子，一般參見Hamer等，H.Mal.Apppl.Gen.1273-288(1982);McKmights，S.，Cell31355-365(1982);Benoistt等，Nature(London)290304-310(1981);Jognston等，Proc.Natl.AcaadSciUSA796971-69675(1982);和Silver等，ProcNatl.AcadSciUSA815951-5955(1984)。分子克隆和表達(dá)的一般方法請(qǐng)看Sambrook等，MolecularCloningALaboratoryManual，2d.ed.，Volss.1-3，ColdSpingHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，USA(1989)?？蓪?duì)轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)信號(hào)進(jìn)行選擇以讓基因的表達(dá)被阻遏或激活，從而使得可操縱連接的基因的表達(dá)能夠被調(diào)節(jié)。本發(fā)明的載體還可包括其它可操縱連接的調(diào)節(jié)成分(如增強(qiáng)子序列)或賦予可操縱連接基因細(xì)胞類型的特異性表達(dá)的DNA成分。純化蛋白及其抗體以及其遺傳序列可用在診斷和治療方法中。具體地說，90K抗原的水平可用作乳腺癌、卵巢癌及其它癌癥、病毒(包括HIV)感染、炎癥、自體免疫疾病以及衰老等的診斷指示劑。90K抗原可用各種方法進(jìn)行檢測(cè)。血清中的90K抗原可利用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(ELISA)夾層法進(jìn)行檢測(cè)。按這種方法，MAbsp2既被用作免疫吸附劑，又被用作酶標(biāo)記探針。用以按夾層型ELISA檢測(cè)和定量分析90K抗原。參照CG-5細(xì)胞裂解物標(biāo)準(zhǔn)制品中存在的量，利用線性回歸計(jì)算機(jī)程序可計(jì)算出樣品中存在的90K的量。該檢測(cè)法已被Iacobelli等人所述(BreastCaruerRas.andTreatment1119-30(1988))，該文獻(xiàn)整個(gè)被加到本文中。90K抗原的過量表達(dá)將表明疾病的出現(xiàn)。通過測(cè)定RNA水平也可確定90K抗原的表達(dá)水平。按照該方法，可用核酸探針與樣品中的RNA雜交。雜交方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍知道的(如見NucleicAcidHybridication，APractiialApproach，IRLPress，Washington.D.C.，U.S.A(1985)及其中所引用的文獻(xiàn)。90K抗原或其遺傳序列也可用于治療。血清IR-95水平的升高不僅存在于癌病患者中，而且也存在于受不同病理生理?xiàng)l件(見表5)，如被HIV或其它病毒感染和自該免疫疾病等影響的患者中，所有這些的特征在于它們均具有不同程度的與免疫激活相關(guān)的免疫缺陷。體外實(shí)驗(yàn)也已證實(shí)90K抗原能夠增強(qiáng)外周血單核細(xì)胞的天然條傷細(xì)胞(NK)和淋巴因子激活殺傷細(xì)胞(LAK)細(xì)胞活性(圖11)。根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)，也可將90K抗原或其遺傳序列作為免疫調(diào)節(jié)劑用于治療。例如，通過輸入90K抗原可治療患有不誘導(dǎo)90K抗原過量表達(dá)的特定癌癥的患者。而且，可通過輸液給其血清中90K蛋白水平轉(zhuǎn)高的癌癥患者補(bǔ)充90K抗原。90K抗原或其遺傳序列也可用于基因治療(綜述在Miller，Nature357455-460(June1992)中)。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，是將含有IR-95編碼序列的表達(dá)載體插入到細(xì)胞，細(xì)胞在體外培養(yǎng)后大量輸給患者。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，含有所選擇啟動(dòng)子(如強(qiáng)啟動(dòng)子)的DNA片段以一定方式被轉(zhuǎn)移到含有內(nèi)源IR-95的細(xì)胞，使得啟動(dòng)子片段增強(qiáng)了內(nèi)源IR-95基因的表達(dá)(例如，將啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，使得它直接與內(nèi)源IR-95基因相連)。利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的普通技術(shù)及文獻(xiàn)，可制備出90K抗原或其拮抗劑(如見Remington′sPharmaceutcialSciencas，18th，ed，(A.R.Gennaro，Ed.)MackPrblishircgComp.Easton，PP.A.USA.18042(1990)，尤其是其中的第八章(PharmaceatcialPreparationsandTheirManrbacture)和第4章(TestingandAnalyssis)。這里所用的術(shù)語“拮抗劑”意指在體外或體內(nèi)降低90K抗原作用的任何化合物。合適及最佳給藥途徑也可由本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員按常規(guī)方法測(cè)定。前者包括口服給藥、靜脈給藥、肌內(nèi)給藥、皮下給藥、經(jīng)皮給藥和口腔給藥?？捎糜谥委煹?0K抗原及其拮抗劑的劑量為“治療有效”量，這里所用的術(shù)語“治療有效量”意指產(chǎn)生所需治療效果的抗原、其片段或其拮抗劑的量。該量可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按常規(guī)方法測(cè)出，它的變化取決于幾個(gè)因素，如患者所患的具體疾病及其程度以及患者的身高、體重、性別、年齡和病史。一般來說，本發(fā)明的90K抗原以約5-5000mg/劑/周/患者的劑量較好，更具體地說，一優(yōu)選劑量范圍為50-500mg/劑/周/患者。為了治療自體免疫疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、變態(tài)反應(yīng)、器官移植物的排斥反應(yīng)以及其它免疫系統(tǒng)被激活并需要被抑制的其它病理狀態(tài)，可服用90K抗原拮抗劑。如上所述，拮抗劑的合適劑量也可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按常規(guī)方法測(cè)定。一般來說，90K抗原的拮抗劑以5-5000mg/劑/周/患者的劑量提供較好。更具體地說，一優(yōu)選劑量范圍為50-500mg/劑/周/患者。這里所使用的且未具體定義的任何術(shù)語的用法與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員對(duì)它們的用法相同。以下實(shí)施例旨在說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例190K抗原的特征鑒定材料和方法細(xì)胞系和試劑。MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系的雌激素超敏變異細(xì)胞系CG-5(Natolietal.，BreastCaancerRes.Treat.323-32(1983))和其它人乳腺癌細(xì)胞系被維持在補(bǔ)充了10%胎牛血清(FCS)和抗生素的Dulbecco改性的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)上。通過硫酸銨沉淀及離子交換層析(Iacvbellietal.，BreastCancerRse.&Treat1119-30(1988)從腹水液中純化由培養(yǎng)在注入了姥鮫烷的Balb/C小鼠中雜交瘤產(chǎn)生的鼠MAb.sp-2(Iacobellietal.，CancerRes.463005-3010(1986)。如前所述，產(chǎn)生MAbsp-2的雜交瘤細(xì)胞已按歐洲專利公約的規(guī)定保藏于巴期德研究所，其保藏號(hào)為I-1083。通過乳過氧物酶用Na125I標(biāo)記純化MAbsp-2(Thorelletal.，Biochem.Biophys.Acta251363(1971))。蛋白酶和其它酶購自Sigma化學(xué)公司(St.ouis，MO，U.S.A.)。電泳試劑購自Bio-Rad實(shí)驗(yàn)室(sehrate，ltaly)，瓊脂糖CL-6B購自Pharmacin(Uppsala，Sueken)。所有其它試劑均具有商業(yè)上能夠獲得的最高純度。固相放射免疫檢測(cè)。已研究出一種測(cè)定90K活性的“兩步”夾層IRMA。通過蛋白質(zhì)-抗生物素蛋白-生物素捕獲系統(tǒng)(Suteretal.，Mol.Immunol.26221-230(1989)，用生物素化的MAbsp-2涂覆聚苯乙烯珠(6.5mm，PreeissionPlastciBalls，Chicago，Illinois，USA)。sp-2的生物素化按照Cuesdon等人的方法(J.HistochomCytochem27113-118(1979))進(jìn)行。涂覆之后，用0.9%NaCl溶液充分洗珠，并于室溫下與生物素化的MAbsp-2(5μg/ml)一起保溫18小時(shí)。涂覆過的珠用BSA封阻溶液(2mg/ml)于室溫下處理1小時(shí)，經(jīng)蒸餾水洗滌后于室溫下保存待用。按這種方法處理過的珠能穩(wěn)定至少6個(gè)月。對(duì)每一次檢測(cè)，將200ul適當(dāng)稀釋的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品與MAbsp-2涂覆的珠一起于37℃保溫1小時(shí)。用蒸餾水洗珠后加入100μl(125I)標(biāo)記的MAbsp-2(約50，000cpm;比活性10μci/μg)的PPBS溶液(pH7.4，含有5%BSA、0.1mg/ml正常小鼠IgG和0.1%NaN3)，于37℃再保濕1小時(shí)。用蒸餾水洗珠并在γ-計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)。通過與標(biāo)準(zhǔn)制品比較計(jì)算出90K的量，該標(biāo)準(zhǔn)品制劑是通過從乳腺癌患者中采用血清并滴定到含有40、20、10和5任意單位/ml而制得。利用IRMA和ELISA(Iacobellietal.，BreastCancerRes.&Tneat.1119-30(1988)對(duì)取自乳腺癌患者的120個(gè)血清同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)后得到校正系數(shù)0.91(KendallQ試驗(yàn))。與ELISA相比，IRMA的靈敏性約為ELISA的三倍，能更快地完成，僅需要下列3小時(shí)，并具有高度重復(fù)性，檢測(cè)內(nèi)和檢測(cè)間系數(shù)的變化為4%。PAGE和Western吸印。SDS-PAGE基本上是按照Laemmli的方法(Natare227680-685(1970))在垂直平板凝膠裝置上完成。用“樣品緩沖液液”處理樣品。該樣品緩沖由含1.25%SDS和5%2-巰基乙醇的63mMTris-HCl組成，或由63mMTris-HCl及0.25%NP-40(Nonidet-P40，SigmaChem.Corp.，stLouis，MO，USA)組成。在本項(xiàng)研究中使用的是9%SDS凝膠和含NP-40的4-20%梯度凝膠，凝膠電泳是以恒定的電壓在含有0.04%SDS或0.1NP-40的Tris-甘氨酸緩沖液(pH8.3)中進(jìn)行。利用考馬斯藍(lán)R250或銀染色盒(Bio-Redaboratories，Segrate，Italy)肉眼觀察蛋白質(zhì)帶，為了進(jìn)行免疫分析，基本按照Towbin等人所述的方法(Proc.Natl.AcadSci.USA764350-4354(1979)于50V電壓下在2小時(shí)內(nèi)將凝膠電吸印到硝酸纖維素膜上，所不同的是轉(zhuǎn)移緩沖液不含甲醇。用脫脂牛乳封阻膜，然后于室溫下與MAbsp-2(10μg/ml)一起保濕2小時(shí)。用PBS充分洗膜并按照制造商的說明用Extravidin生物素染色盒(SigmaChamicalCorp.，st.Louis，MO，U.S.A.)染色。細(xì)胞的放射標(biāo)記和免疫沉淀。為了進(jìn)行代謝標(biāo)記，將2×106細(xì)胞在含有250μci/ml(35S)甲硫氨酸(比活1500Ci/mmole;TheRachiochenicalCentre，Amershem，U.K.)的DMEM中于37℃保溫6小時(shí)。按照Iacobelli等人所述的方法(CancerRas.463005-3010(1986))預(yù)先澄清含有放射活性蛋白的培養(yǎng)液，然后將其與涂覆了MAbsp-2的聚苯乙烯珠一起于4℃保溫16小時(shí)。用蒸餾水洗珠后，于50℃用100μlSDS樣品緩沖液萃取30分鐘。萃取物進(jìn)行SDSPAGE，作為對(duì)照，將培養(yǎng)液等份試樣與已被抗α-胎蛋白的MAb(SorinBiomedia，Saluggia，Italy)涂覆的聚苯乙烯珠一起保溫。通過熒光x射線照相目測(cè)(35S)甲硫氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)帶。在某些實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞是在5μg/ml衣霉素(SigmaChemicalCorp.，St.Loris，MO，U.S.A)存在下被標(biāo)記。衣霉素是在加入(35S)甲硫氨酸之前2小時(shí)加到細(xì)胞中。90K純化。(a)CG5組織培養(yǎng)液。使用CellFactory塑料室(Nunc，Roskilde，Denmark)將CG-5細(xì)胞(Natolietal.，BreastCancerRas.Treat323-32(1983))培養(yǎng)于補(bǔ)充了3%FCS的DMEM中。當(dāng)細(xì)胞開始融合后(5-7天)收集培養(yǎng)液。然后加入新鮮培養(yǎng)基。并在隨后3-4天內(nèi)每隔24小時(shí)收集一次培養(yǎng)液。在該條件下產(chǎn)生的90K抗原的濃度范圍為100-400單位/ml。合并的培養(yǎng)上清液(10-20升)以4000xg(4℃)離心10分鐘，然后用Minitam裝置(MillipomCorpp.，Bedford，MA，USA)濃縮10倍，緩慢加入固體硫酸銨至43%飽和，然后于4℃靜置過夜，通過10，000xg離心(15分鐘，4℃)收集蛋白質(zhì)沉淀物。在90K活性至少能穩(wěn)定2個(gè)月的條件下于-20℃冷凍保存沉淀物。(b)人血清。通過以10，000xg離心20分鐘澄清采自晚期乳腺癌患者的全血，該全血已通過IRMA滴定至含有高濃度90K，在用PBS按1∶1稀釋后，按上面所述對(duì)組織培養(yǎng)液那樣用硫酸銨分級(jí)沉淀。(c)腹水液。該腹水液是通過穿刺術(shù)得自晚期卵巢癌患者。該腹水液象上面所述那樣通過10，000xg離心20分鐘澄清，并用硫酸銨沉淀。將硫酸銨沉淀物向PBS中充分透析，并加到瓊脂糖CL-6B柱(4.2×85cm)上。該主用流速為18ml/小時(shí)的PBS-0.5MNaCl(pH8.1)平衡和洗脫。收集5ml級(jí)分，通過IRMA檢測(cè)90K。通過Bradford的方法(Anal.Bvochem.72248-254(1976))定量分析蛋白質(zhì)。收集含90K活性的級(jí)分，向0.005M磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中透析后加到用同樣緩沖液平衡過的DEAE一纖維素柱(2×8cm)上。用緩沖液充分洗柱，并用漸進(jìn)的氯化鈉梯度(0.062-1.0M)洗脫吸附的蛋白質(zhì)。收集含90K活性的級(jí)分。并按8∶1(樣品∶樹脂)的體積比與MAbsp-2結(jié)合的瓊脂糖CL-4B(4mg抗體/ml樹脂)混合。MAbsp-2已按Schneider等人的方法(J.Biol.Chem25)10766-10769(1982))偶聯(lián)的瓊脂糖上。將混合物于4℃過夜旋轉(zhuǎn)。用3MMgcl2洗脫90K抗原。密度梯度離心分離自CG-5組織培養(yǎng)液的90K抗原、乳腺癌患者的血清、或卵巢癌患者的腹水在從親和基質(zhì)中解吸之后，在5mlCsCl密度梯度中進(jìn)行離心。將抗原溶于起始密度為1.4g/ml的CsCl的PBS溶液中，于4℃，在BeckmanSWSO.1轉(zhuǎn)子中以145，000xg的速度離心72小時(shí)形成梯度。收集級(jí)分(0.25ml)，用PBS稀釋成1∶10并用90KIRMA測(cè)定抗原活性。量出每個(gè)級(jí)分的已知體積來確定其密度?？乖纳碚鲗?duì)置于微量滴定板上的抗原直接進(jìn)行表征。微量板(Dynatecs)用50μl純化的90K(100ng/ml0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.0)包被并溫育過夜。(a)化學(xué)處理于4℃進(jìn)行30分鐘甲醇處理。于45℃用6M尿素和6M鹽酸胍或1%SDS進(jìn)行1小時(shí)變性。按照Stahl等人的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA734045-4049(1976)在暗處用10、20、30、40、50mMNaIO4在乙酸鹽緩沖液(50mm，pH4.5)中于室溫進(jìn)行1小時(shí)高碘酸氧化。于37℃用二硫蘇糖醇(10mm，在50mMTris中，pH8.1)或5%2-巰基乙醇進(jìn)行1小時(shí)還原。于30℃用20mM碘乙酸進(jìn)行30分鐘烷基化。(b)蛋白水解酶于37℃，使抗原包被的微量板暴露于50mMTris-2mMCaCl2(pH8.1)中的胰蛋白酶(2mg/ml)、胰凝乳蛋白酶(2mg/ml)或鏈霉蛋白酶(19mg/ml)下，或暴露于50mM鹽酸半脫氨酸(pH6.0)中的木瓜蛋白酶下90分鐘。在平行實(shí)驗(yàn)中，用相同的蛋白酶消化純化的90K的等分試樣，與相等體積的SDS樣品緩沖液混合，并經(jīng)SDSPAGE分離，隨后進(jìn)行銀染色。(c)外切糖苷酶使微量板暴露于50mM乙酸鹽緩沖液(pH5.0)中的神經(jīng)氨酸苷酶、巖藻糖苷酶、α-葡糖苷酶和β-葡糖苷酶，或250mMTris，176mMCH3COONa，250mMNaCl(pH8.0)中的軟骨素酶ABC下。于37℃溫育90分鐘，選擇外切糖苷酶的濃度以確保低聚糖殘基的完全消化。在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)這種酶，其中發(fā)現(xiàn)合適的底物被完全水解，如通過薄層層析法所檢測(cè)到的。處理后，用1%的明膠的PBS溶液洗滌并封裝微量板。將50μl(125I)標(biāo)記的MAbsp-2(約為50，000cpm)加入到每個(gè)孔中并于37℃溫育1小時(shí)，用PBS洗3次之后，用γ計(jì)數(shù)器計(jì)算結(jié)合放射性。對(duì)照孔是在相同的條件下與稀釋緩沖液一起溫育。氨基酸分析在還原條件下用Minigel儀器對(duì)純化的90K進(jìn)行9%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白質(zhì)電吸到聚偏二氟乙烯膜(Immobilon;MilliporeCorp.，Bedford，MA，USA)上，用酰胺黑10B(SigmaChemCO.，St.Louis，MO)染色，并切下條帶。為了進(jìn)行氨基酸分析，總共大約50ug90K(由染色強(qiáng)度判斷)的3-4個(gè)條帶在真空下，在6NHCl中，于110℃水解22小時(shí)。水解后，在Beckman分析儀上，利用pH梯度系統(tǒng)分析氨基酸(Hirs，C.H.W.InMettwdsofEnzymol913-8，AcademicPress，NewYork，NewYork，USA(1983))。結(jié)果90K抗原的純化用于從CG-5組織培養(yǎng)液分離90K抗原，從乳腺癌患者分離血清，和從卵巢癌患者分離腹水的純化過程總結(jié)于表Ⅰ中。在純化的每一步，測(cè)定總蛋白質(zhì)，并通過IRMA確定抗原的數(shù)量，實(shí)際上在43%硫酸銨沉淀物中回收到90K的全部活性，結(jié)果大約濃縮4倍。這一步除去了存在于最初制品中的絕大多數(shù)白蛋白。接著用SepharoseCL-6B柱對(duì)硫酸銨沉淀的抗原進(jìn)行大小排阻色譜(圖2)。所有三種來源的90K均見于柱的空體積之后立刻洗脫出的大峰中，這意味著它是一個(gè)高分子量復(fù)合物?？赡苁怯捎诋a(chǎn)物的降解使觀察到與此不一致的低分子量的較小的反應(yīng)性峰。在洗脫結(jié)束時(shí)看到的低分子量蛋白質(zhì)是無反應(yīng)活性的。在進(jìn)行色譜之前用6M尿素或6M鹽酸胍處理樣品產(chǎn)生相同的洗脫分布圖(未示出)。高分子量峰(相應(yīng)于圖2的級(jí)分21-28)經(jīng)DEAE纖維素色譜法進(jìn)一步純化。得自三個(gè)不同來源的每一個(gè)的90K抗原在0.25M的NaCl濃度下從柱洗脫下來。通過在與MAbSP-2偶聯(lián)的SepharoseCL-4B上的免疫親和法完成最終的純化。用3MMgCl2洗脫結(jié)合活性，所用的其它洗脫緩沖液，如甘氨酸(pH2.4)，1MNaOH(pH11.2)，和3MKSCN在抗原洗脫中不太有效。基于比活性(單位/μg蛋白)得自CG-5組織培養(yǎng)液的90K抗原，得自乳腺癌患者的血清，和得自卵巢癌患者的腹水的純化分別是84，300，52，277和83，380倍。通過在3MMgCl2洗脫物(用IRMA從親和基質(zhì)中洗脫出來)中測(cè)定90K免疫反應(yīng)性并將SDSPAFE凝膠上90K條帶的銀染色強(qiáng)度與已知濃度的BSA標(biāo)準(zhǔn)品比較來確定蛋白質(zhì)的量計(jì)算這些比活性。經(jīng)密度梯度離心分析純化的90K對(duì)已從MAbSP-2親和基質(zhì)中解吸的抗原樣品進(jìn)行密度梯度離心。這一步?jīng)]有揭示得自三個(gè)不同來源的抗原的不同的平均浮力密度。浮力密度的變化范圍為1.28g/ml-1.31g/ml(圖3)。此外，來自乳腺癌患者的未分級(jí)分離的血清中的90K抗原產(chǎn)生基本相同的密度輪廓，這表明經(jīng)本發(fā)明的純化過程分離出的90K抗原不代表原始抗原的亞型。從不同來源分離的90K抗原的PAGE和免疫吸印分析與以前的數(shù)據(jù)(Iacobelleetal，CancerRes.463005-3010(1986))一致，如SDSPAGE所示(圖4A)釋放到(35S)蛋氨酸標(biāo)記的CG-5細(xì)胞和其它乳腺癌細(xì)胞系的組織培養(yǎng)液中的90K抗原以一個(gè)單一條帶遷移，其表觀分子量約為95，000道爾頓。(35S)蛋氨酸標(biāo)記的抗原遷移率在還原或非還原條件下(有或沒有2-巰基乙醇)是相同的(圖4A，泳道a對(duì)泳道d)，這表明該蛋白不含鏈間二硫鍵。再者，CG-5細(xì)胞在用(35S)蛋氨酸標(biāo)記前用衣霉素處理沒有改變細(xì)胞培養(yǎng)液中90K抗原的電泳遷移率(圖4A，泳道C)。圖4B比較了由CG-5組織培養(yǎng)液、乳腺癌患者的血清和卵巢癌患者的腹水純化的90K在SDSPAGE上的電泳遷移率。對(duì)蛋白質(zhì)的銀染色清楚地顯示出表觀分子量約為95，000道爾頓的主帶。90K條帶也被考馬斯藍(lán)而不被高碘酸-席夫碳水化合物染色劑染色(未示出數(shù)據(jù))。通過銀染色檢測(cè)到的純化的來自乳腺癌患者血清的95K抗原和通過熒光儀檢測(cè)到的來自CG-5培養(yǎng)液的(35S)蛋氨酸標(biāo)記的免疫沉淀物共同電泳顯示出可重疊的95K條帶(未示出數(shù)據(jù))。對(duì)從含有0.25%NP-40，但不含SDS的4-20%聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移的純化的90K抗原的Western吸印分析表明存在相似的免疫反應(yīng)性擴(kuò)散帶，全部三個(gè)來源的遷移率相似(圖5)，相比之下，從SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移的90K抗原的免疫吸印呈現(xiàn)很低的MAbSP-2免疫反應(yīng)性(未示出數(shù)據(jù))。這些數(shù)據(jù)與sepharoseCL-6B洗脫輪廓相關(guān)(圖2)且表明從不同來源分離的天然90K抗原以高分子量復(fù)合物存在，該復(fù)合物很可能由Mr95，000亞單位組成。90K的氨基酸分析表4從CG-5組織培養(yǎng)液、乳腺癌患者的血清、和卵巢癌患者的腹水中純化的90K抗原具有相似的氨基酸組成，該抗原富含谷氨酸/谷氨酰胺、絲氨酸、和亮氨酸。而且，頭20個(gè)氨基酸的NH2末端序列揭示從三個(gè)不同來源得到的抗原之間強(qiáng)烈的相似性。這一序列未見于幾個(gè)蛋白數(shù)據(jù)庫如Genebank和EM-BL。90K抗原決定簇的性質(zhì)利用幾種化學(xué)和酶促處理研究了90K抗原上所攜帶的抗原決定簇的生化性質(zhì)。如表2所示，暴露于甲醇中與暴露于6M鹽酸胍、6M尿素、1%SDS、凍干和加熱一樣大大降低了90K抗原決定簇的免疫反應(yīng)性。無論是用二硫蘇糖醇和2-巰基乙醇還原，還是用碘乙酰胺烷基化或者用非離子除垢劑NP-40，吐溫20，和TritonX-100(SigmaChem.CO.St.Louis，MO)處理都未明顯影響90K的免疫反應(yīng)性。暴露于偏高碘酸鈉中在高濃度(50mm)下只具有邊緣效應(yīng)。為了研究90K抗原對(duì)蛋白酶的敏感性，將純化的90K與胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、鏈霉蛋白酶，或木瓜蛋白酶一起溫育，然后用SDSPAGE進(jìn)行分析，接著進(jìn)行銀染色。如圖6A所示，所有受試蛋白酶看來都能完全消化90K。剩余SP-2抗體結(jié)合的分析進(jìn)一步證實(shí)了暴露于鏈霉蛋白酶或木瓜蛋白酶之后90K的初始活性喪失了80%以上，而用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化看來不太有效(圖6B)。用外切糖苷酶處理未影響90K的免疫反應(yīng)性(圖6B)。實(shí)際上，在用神經(jīng)氨酸苷酶和β-半乳糖苷酶處理之后固定化抗原結(jié)合(125I)標(biāo)記的MAbSP-2的能力有所增加。這表明末端碳水化合物部分的去除可增加MAbSP-2的能力有所增加。這表明末端碳水化合物部分的去除可增加MAbSP-2進(jìn)入90K抗原決定簇。討論MAbSP-2與抗原決定簇反應(yīng)，根據(jù)該抗原的表觀分子量為95，000道爾頓已將它命名為90K抗原(Iacobellietal.，CancerRes.46300-3010(1986))。這里，我們已經(jīng)描述了來自CG-5培養(yǎng)液、乳腺癌病人的血清，和卵巢癌患者的腹水的90K抗原的純化。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)得自這些不同來源的天然90K以高分子量復(fù)合物存在，經(jīng)SDSPAGE分析該復(fù)合物易于離解成一個(gè)單個(gè)的90，000道爾頓種類。這表明該天然蛋白質(zhì)代表一種由幾個(gè)90，000道爾頓的基本亞單位組成的低聚物。有趣的是，得自這三個(gè)不同來源的90K抗原在大小排阻和離子交換色譜，PAGE和Western吸印分析，以及浮力密度超速離心上表現(xiàn)出相似的特性。而且，從這三個(gè)來源的每一個(gè)分離出的抗原具有相似的氨基酸組成和NH2末端氨基酸序列。這表明從所建立的的長期癌細(xì)胞系和直接從癌癥患者的血清或腹水中得到的90K抗原具有非常相似的物理化學(xué)和免疫化學(xué)特性。為了進(jìn)一步搞清由MAbS-2所識(shí)別的決定簇的性質(zhì)對(duì)90K抗原進(jìn)行了化學(xué)和物理處理。用蛋白酶消化90K抗原顯著降低了抗體結(jié)合，從而證實(shí)了該抗原的肽部分包括在該決定簇中，而且，已知可使多數(shù)蛋白變性的處理也大大降低了抗體結(jié)合，從而進(jìn)一步證實(shí)了MAbSP-2與構(gòu)象肽決定簇結(jié)合。此外，經(jīng)SDSPAGE該抗原的低聚物結(jié)構(gòu)離解成亞單位導(dǎo)致SP-2結(jié)合活性幾乎全部喪失。這些結(jié)果有力地表明MAbSP-2限定的決定簇實(shí)際上是蛋白質(zhì)并且抗體結(jié)合取決于整個(gè)抗原分子構(gòu)象的完整性。然而，這不是90K抗原的唯一特性，因?yàn)槠渌[瘤相關(guān)抗原決定簇，如那些被MAbOC125所識(shí)別的決定簇(Davissetal.，CancerRes.466143-6148(1986))，B72.3(Johnsonetal.，CancerRes.46850-875(1986))，和C3(Zhangetal.，CancerRes.496628-6628(1989))，看來至少部分是由構(gòu)象依賴性肽所組成。以前曾報(bào)道過許多腫瘤相關(guān)抗原，這些抗原在乳腺癌患者的血清中濃度升高。它們包括一系列與人乳脂“球”膜家系有關(guān)的抗原(Burchelletal.，Int.J.Cancer34763-768(1984);Papsideroetal.，CancerRes.444653-4657(1984);Linsleyetal.，CancerRes.465444-5450(1986);Kufeetal.，Hybridoma＃223-232(1984);Hilkensetal.，InProtidesoftheBiologicalFlrids，(Peeters，H.，(ed.))，pp.651-653，PergamonPress，Oxford，U.K.(1984);Brayetal.，CancerRes.475853-5860(1987);Hilkensetal.，InMonoclonalAntibodiesandBreastCancer，(Ceriani，R.L.(ed.))，pp.28-42，MartinusNijhoff，BostonMA，U.S.A.(1985);Linsleyetal.，CancerRes.482138-2148(1988))，TAG72whichisrecognizedbyMAbB72.3(Geroetal.，J.Chin.Lab.Anal.3360-369(1989))，andMCAwhichisrecognizedbyMAb12(Bombardierietal.，Cancer63490-495(1989))。這些抗原的生化表征已表明所有這些抗原都是大量糖基化的、高分子量的糖蛋白，它們具有類似粘蛋白的特性，在腫瘤細(xì)胞的表面得以表達(dá)并由腫瘤細(xì)胞分泌出來。這些抗原與90K比較顯示出90K抗原是與前述抗原完全不同的。這一結(jié)論得到這樣一個(gè)事實(shí)的支持，即它的電泳遷移率不受神經(jīng)氨酸苷酶消化的影響，這表明它是一種缺乏粘蛋白所持有的O-配糖鍵連接的低聚糖(未示出數(shù)據(jù))(Gahmbergetal.，Eur.I.Bilchem122581-586(1982)的非唾液酸化分子。已經(jīng)描述了其它腫瘤相關(guān)抗原，它們?cè)赟DSPAGE中以Mr90，000道爾頓的分子遷移。我們已將這些抗原與90K抗原區(qū)別開。由MAbB6.2所識(shí)別的抗原(Kufeatal.，CancerRes.43851-857(1983));Schlonetal.，Cancer542777-2794(1984))是一種細(xì)胞表面糖蛋白并且與90K不同，它被高度限于乳腺癌細(xì)胞中。被稱為p97，gp87，或gp95的黑素瘤相關(guān)抗原(Brownetal.，J.Immunol127539-546(1981)，Dippoldetal.，ProcNatlAcadSci.USA776114-6118(1980);Liaoetal.，J.Cell.Biochem27303-316(1985)是一種結(jié)構(gòu)上與轉(zhuǎn)鐵蛋白相關(guān)的膜蛋白(Brownetal.，Nature296171-173(1982))。另一種黑素瘤抗原，F(xiàn)D也是一種其表達(dá)僅限于極少數(shù)細(xì)胞中的表面糖蛋白(Mattesetal.，CancerRes.476614-6619(1987))。最后，被MAb3G2-C6所限定的抗原(Zhangetal.，CancerRes496621-6628(1989))是一種可在大量膀胱癌中，且僅在乳腺癌的邊緣被表達(dá)的表面組分(Youngetal.，CancrerRes454439-4446(1985))。實(shí)施例290K基因的克隆90K抗原的末端序列分析表明了下列氨基酸序列(SEDIDNO3)ValAsnAspGlyAspMetArgLeuAlaAspGlyGlyAlaThrAsnGlnGlyArgValGluIlephe?；谶@一氨基酸序列，根據(jù)密碼子使用頻率(Lathe，J.Mol.Biol.1831-12(1985))，利用氨基末端序列VNDGDM(S)LADGGATNQGRVEIF(SEQIDNO4)設(shè)計(jì)了66個(gè)核苷酸的“推測(cè)物(guessmer)”。所用的核苷酸序列(SEQNO5)如下5＇GTGAATGATGGCGACATGTCCCTGGCTGATGGCGGCGCCACCAACCAGGGCCGGGTGGAGATCTTC3＇推測(cè)物或核酸探針末編被32P標(biāo)記，用于篩選由MCF7polyA+RNA制備的λgt10庫(復(fù)雜性5×105)。在克隆鑒定中的核酸雜交技術(shù)可參見Maniatisetal.，和Sambrooketal的文章(bothentitledMolecrlarCloning，ALaboratoryManral，ColdSpringMarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork(1982and1989，respectively))以及Hamesetal.的文章(NucleicAridHybriclization，APracticalApproach，IRLPress，Washington，D.C.(1985))，這些參考文獻(xiàn)合并于本文中。分離出包括約1，200bp和約900bp兩個(gè)EcoRI插入子的陽性菌體。然后，利用EcoRI部分插入子克隆完整的插入子。將該DNA片段克隆到BluescriptR質(zhì)粒(Stratagene，LaJolla，(A)中。插入子大小約為2，206個(gè)核苷酸。按照Sanger等人的方法(Proc.Natl.AcadSciUSA745463(1977))和Maxam等人的方法(Proc.Natl.AcadSciUSSA74560(1977)進(jìn)行原始克隆和亞克隆的序列分析。分析結(jié)果表明該蛋白質(zhì)序列是585個(gè)氨基酸，1，755個(gè)核苷酸。發(fā)現(xiàn)了131個(gè)核苷酸的前導(dǎo)序列和320個(gè)核苷酸的3′尾部序列。圖1中給出了完整的核苷酸和設(shè)計(jì)的氨基酸序列(分別為SEQIDNO1和SEQIDNO2)。來自腫瘤和正常組織的RNA的North-ern吸印分析結(jié)果列于表3中。實(shí)施例390K抗原的細(xì)胞培養(yǎng)和穩(wěn)定表達(dá)材料和方法IR-95表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建利用標(biāo)準(zhǔn)方法，將2147bpClaI/xhoIcDNA片段亞克隆到真核、依靠細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子的表達(dá)載體(pCMVNEO-IR95)中(圖8)，該表達(dá)載體分別含有用于擴(kuò)增和選擇的小鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)CDNA的表達(dá)單位和細(xì)菌新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo)基因的表達(dá)單位。細(xì)胞培養(yǎng)在CO2增濕溫育器內(nèi)，在添加有3%FCS，2mML-谷氨酰胺和抗生素的RPMI1640(GIBCO，Gaithersburg，MD)中培養(yǎng)人BT-20乳腺癌細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD，USA，保藏號(hào)HTB19)。在電擊pCMVNEO-IR95質(zhì)粒之后，在相同的培養(yǎng)基中進(jìn)行新霉素抗性的選擇。電擊呈指數(shù)生長的BT20細(xì)胞用PBS洗兩次，經(jīng)胰酶消化收集并使之沉淀。沉淀物用PBS洗三次。將細(xì)胞以約5×106細(xì)胞/ml的濃度重新懸浮于PBS中。用基因脈沖發(fā)生器轉(zhuǎn)染裝置(Bio-RadLaboratories，Segrate，Italy)進(jìn)行電擊。為了穩(wěn)定表達(dá)，在電擊容器中將0.8ml細(xì)胞懸浮液與20μg線性化質(zhì)粒DNA和50μg剪切的鮭精子DNA混合。在室溫下，從500μF電容器中釋放出遞增場(chǎng)強(qiáng)度(240-270V)的單脈沖。在該脈沖和于冰上溫育10分鐘之后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到如上的非選擇性培養(yǎng)基中。在模擬電擊過程中用錐蟲藍(lán)排阻試驗(yàn)檢測(cè)在電擊后10分鐘時(shí)細(xì)胞的存活率。選擇和擴(kuò)增電擊后兩天，將細(xì)胞移到含有400μg/mlGeneticin(G418，GIBCO，Gaithersburg，MD)的選擇性培養(yǎng)基中，用凡士林密封底部的金屬克隆圓筒挑選克隆。在含有3%FCS，谷氨酰胺(2mM)和抗生素及氨甲蝶呤(SigmaChemicalCO.，St.LouisMO，USA)rα-MEW(GIBCO，Cat.＃072-019OOA)中，以10和50μM的濃度在12孔集簇板(Costar，Canbridge，MA)中擴(kuò)充和培養(yǎng)這些克隆。在氨甲蝶呤選擇之后，在添加有3%FCS，2mM谷氨酰胺，50μg/ml慶大霉素和1μM氨甲蝶呤的DMEW高葡萄糖(GIBCO，Gaithersburg，MD)中培養(yǎng)細(xì)胞。(35S)蛋氨酸標(biāo)記和免疫沉淀在6孔集簇板(Nunc)中接近融合的細(xì)胞用1mlPBS洗兩次并在1ml無蛋氨酸的DMEM/含50μCi(1Ci＝37GBq)(35S)蛋氨酸的0.5%ULTROSOR-G中培養(yǎng)過夜。為進(jìn)行免疫沉淀，將條件培養(yǎng)基短暫旋轉(zhuǎn)并與1μg/ml抑肽酶和1μg/mlleupepptin混合。蛋白A-Sephharose(pharmacia，Upppsala，Sweden)用PBS洗三次，將30μl(1∶1)懸浮液與2μg的MAbSP-2混合并在室溫下溫育30分鐘。蛋白A-Sepharose-SP-2復(fù)合物用HNTG緩沖液(20mMHEPES，pH7.5/150mMNaCl/10%甘油/0.1%TritonX-100)洗三次并于4℃與條件培養(yǎng)基一起溫育2小時(shí)。蛋白A-Sepharose珠粒用HNTG緩沖液洗三次。將濕珠粒懸浮于30μl1×SDS凝膠填充緩沖液中，于100℃煮沸3分鐘并在冰上立即冷卻。在10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離蛋白質(zhì)并用放射自顯影進(jìn)行分析。結(jié)果為了表達(dá)該蛋白質(zhì)，將編碼整個(gè)585個(gè)氨基酸多肽的cDNA置于細(xì)胞肥大病毒早期啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制之下。此外，表達(dá)載體含有neo抗性基因，該基因賦予對(duì)氨基葡糖苷抗生素G418的細(xì)胞抗性，因此便于初級(jí)轉(zhuǎn)染體的選擇。該載體還含有氨甲蝶呤抗性DHFR基因，利用該基因選擇含有擴(kuò)增的轉(zhuǎn)染DNA序列的細(xì)胞。包括復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因的細(xì)菌質(zhì)粒序列允許整個(gè)表達(dá)質(zhì)粒在大腸桿菌中復(fù)制。圖9示出了前三個(gè)穩(wěn)定的克隆的免疫沉淀物的放射自顯影照片。實(shí)施例490K抗原的瞬時(shí)表達(dá)材料和方法表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建利用標(biāo)準(zhǔn)方法(Sambrooketal.，MolecularCloning，ALaboratoryManual，andEdition，ColdSringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，USA(1989)Vols.1-3)，通過將2147bpCla(在BluescriptIIKS的726位)-xho(在圖1中2118位)限制片段引入到真核、依靠細(xì)胞肥大病毒啟動(dòng)子的表達(dá)載體pCMV中來構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒(圖7)。瞬時(shí)表達(dá)在含有10%FCS和抗生素的DMEM中培養(yǎng)人胚腎293成纖維細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville，MD，USA，保藏號(hào)CRL1573)。在轉(zhuǎn)染前一天，將2×105細(xì)胞置于6孔平皿的每一孔中。按照ChenandOkayamaMolCellBiol72745-2752(1987)的方案進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每孔總共含4μgCsCl梯度純化的質(zhì)粒DNA。加入沉淀物16小時(shí)后，用DMEM洗滌細(xì)胞一次，并加入新鮮的生長培養(yǎng)基。代謝標(biāo)記為進(jìn)行代謝標(biāo)記，在含有1%經(jīng)透析的FCS的無蛋氨酸DMEM(0.5ml/孔)中將細(xì)胞與(35S)蛋氨酸(50μci/ml)一起培養(yǎng)過夜。衣霉素處理為阻斷蛋白質(zhì)N-配糖鍵的形成，將衣霉素加到培養(yǎng)基中，歷時(shí)16小時(shí)，其終濃度為0.1-1.0μg/ml。細(xì)胞溶解和免疫沉淀用含有50mMHEPES，pH7.5，150mMNaCl，1.5mMMgCl2，1mMEGTA，10%甘油，1%TritonX-100，2mM苯甲磺酰氟(PMSF)，200單位/ml抑肽酶，10mM焦磷酸鈉，和10μg/mlleupeptin的0.3ml溶解緩沖液在冰上使細(xì)胞溶解。將溶胞產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到微量離心管中，渦動(dòng)10秒鐘，通過在4℃下以12，500rpm的速度離心15分鐘進(jìn)行預(yù)純化。為進(jìn)行免疫沉淀，將10μl蛋白A-Sepharose(在20mMHEPES，pH7.5中溶脹和預(yù)洗)和1μgMAbSP-2加入到經(jīng)純化的溶胞產(chǎn)物中并于4℃溫育3小時(shí)。在加入抑肽酶(200單位/ml)和PMSF(2mM終濃度)并經(jīng)離心預(yù)純化之后用條件培養(yǎng)基進(jìn)行免疫沉淀。沉淀物用1ml洗滌緩沖液(含有0.1%TritonX-100的溶解緩沖液)洗三次。加入SDS樣品緩沖液，煮沸樣品并將其載于SDS-PAGE上以分離沉淀的蛋白質(zhì)。結(jié)果將轉(zhuǎn)化的293細(xì)胞系的細(xì)胞置于6孔平皿上并用如上所述的CMV-表達(dá)構(gòu)建物轉(zhuǎn)染(圖10，泳道1-8)。用無插入子的質(zhì)粒pCMV轉(zhuǎn)染對(duì)照細(xì)胞(圖10，泳道7和8)。在細(xì)胞溶解前16小時(shí)，用含有50μCi/ml(35S)蛋氨酸的標(biāo)記培養(yǎng)基更換生長培養(yǎng)基。在同樣的溫育時(shí)間內(nèi)加入衣霉素，終濃度為0.1μg/ml(圖10，泳道3和4)或1.0μg/ml(圖10泳道5和6)。溶胞產(chǎn)物(L)和條件培養(yǎng)基(M)均用于用MAbSP-2進(jìn)行的免疫沉淀。在8.5%SDS-PAGE上分離沉淀的蛋白質(zhì)。圖10示出了干燥的凝膠暴露20小時(shí)后的放射自顯影照片。用MAbSP-2從條件培養(yǎng)基免疫沉淀5型腺病毒-(Ad5)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系293在95Kd時(shí)呈現(xiàn)單個(gè)條帶(泳道8)。相應(yīng)的信號(hào)在溶胞產(chǎn)物的免疫沉淀物中是不可檢測(cè)的。使用條件培養(yǎng)基，瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞(用攜帶cDNA插入子的CMV表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)使得95K條帶的信號(hào)強(qiáng)度增加幾倍(圖10泳道2)同時(shí)，約77kd的蛋白質(zhì)可在相應(yīng)的溶胞產(chǎn)物的免疫沉淀物中檢測(cè)到(圖10泳道1)用衣霉素處理瞬時(shí)表達(dá)細(xì)胞降低了95Kd蛋白質(zhì)(泳道4和6)及77kd蛋白質(zhì)(泳道3和5)二者的信號(hào)強(qiáng)度。衣霉素效應(yīng)是劑量依賴性的。實(shí)施例5IR-95的純化用下述親硫瓊脂糖色譜法純化IR-95。材料親硫Sepharose(AFFI-T)金屬螯合Sepharose蛋白A-Sepharose硫酸銨硫酸鈉硫酸銅甘氨酸無水磷酸二氫鈉，氯化鉀氯化鈉Hank氏平衡鹽溶液(GIBCO)緩沖液1.緩沖液A1升;氯化鈉13克，氯化鉀0.2克，無水磷酸二氫鈉1.6克，硫酸鈉0.5M和EDTA1mM，將緩沖液的pH滴定到8.2。2.緩沖液B1升;氯化鈉13克，氯化鉀0.2克，無水磷酸二氫鈉1.6克，硫酸鈉0.3M和EDTA1mM，將緩沖液的pH滴定到8.2。3.緩沖液C1升;氯化鈉13克，氯化鉀0.2克，無水磷酸二氫鈉1.6克，和EDTA1mM，將緩沖液的pH滴定到8.2。4.緩沖液D1升;無水磷酸二氫鈉7.098克和氯化鈉5.8g，將緩沖液的pH滴定到8。5.緩沖液E1升;無水磷酸二氫鈉7.098克，甘氨酸100mM和氯化鈉5.8克，將緩沖液的pH滴定到8。步驟1親硫Sepharose色譜法親硫Sepharose色譜法由以下步驟所組成A.硫酸銨沉淀在空心纖維超濾柱體(40KDNunc)上使預(yù)澄清的條件培養(yǎng)基濃縮10倍。用固體硫酸銨沉淀濃縮的培養(yǎng)基至42%飽和度(假定在533克/升時(shí)達(dá)最大飽和度)。緩慢加入硫酸銨并用稀氫氧化銨將pH滴回到大約8.0。攪拌溶液過夜。若不濃縮條件培養(yǎng)基，則應(yīng)用固體硫酸銨進(jìn)行沉淀達(dá)42%飽和度。B.離心在GS3轉(zhuǎn)子(Sorvall)中以8000rpm的速度離心硫酸銨沉淀物。棄去上清液并以10緩體積將沉淀物溶于緩沖液A中。C.親硫Sepharose分批洗脫利用輕度抽吸在燒結(jié)玻璃板漏斗上用水徹底洗滌所需體積的親硫Sepharose(Kem-En-Tec，Copenhagen，Denmark)(除去疊氮化鈉)。吸出基質(zhì)中的空氣直到在床中出現(xiàn)裂紋。然后使5床體積的緩沖液A通過柱同時(shí)用玻璃棒輕度攪拌以消除基質(zhì)中的殘存空氣。在輕度抽吸條件下使得自前一步驟的蛋白溶液通過基質(zhì)而不使之干燥。使該蛋白溶液再循環(huán)三次。在不是攪拌條件下用50-100床體積的緩沖液A洗滌基質(zhì)。然后在不時(shí)攪拌下用50-100床體積的緩沖液B洗滌基質(zhì)而使之不干燥，用10床體積的緩沖液C洗脫親硫Seharose，每次加1床體積，最后用無菌水洗。加入最后床體積之后，抽吸基質(zhì)至干。收集洗脫物，用70%硫酸銨沉淀并在冷室內(nèi)攪拌至少4小時(shí)。以10000rpm離心收集沉淀物，并將沉淀物溶于緩沖液D中。D.透析在冷室內(nèi)將蛋白溶液對(duì)緩沖液D透析至少4小時(shí)，更換兩次緩沖液。步驟2金屬螯合色譜法金屬螯合色譜法如下所述進(jìn)行平衡和柱洗脫在重力下將金屬螯合Sepharose(pharmacia)填入玻璃柱中至4ml的填充體積。用水徹底洗滌基質(zhì)以除去乙醇。使硫酸銅溶液(10mg/ml)流經(jīng)基質(zhì)。在正常情況下10ml硫酸銅溶液足夠裝載基質(zhì)用。用10-20柱體積的水再次洗滌基質(zhì)以除去過量的硫酸銅。然后用10柱體積的緩沖液E洗滌并用20柱體積的緩沖液D平衡基質(zhì)。以10000rpm離心透析過的蛋白溶液以除去凝固蛋白。用平衡緩沖液將蛋白溶液稀釋5倍并使之流經(jīng)基質(zhì)兩次。用50柱體積的平衡緩沖液洗滌基質(zhì)并利用緩沖液D和緩沖液E各20柱體積的線性梯度以1ml/分鐘的流速洗脫蛋白質(zhì)。在正常情況下，該蛋白在第二個(gè)峰中從柱上洗脫下來。收集活性級(jí)分并在Centricon-30上濃縮。經(jīng)免疫沉淀檢驗(yàn)純化蛋白質(zhì)的活性。步驟3免疫沉淀檢驗(yàn)純化蛋白質(zhì)被SP-2單克隆抗體免疫沉淀的能力。通過短暫旋轉(zhuǎn)和抽氣，用1ml緩沖液C洗滌50μl蛋白A-Sepharose的1∶1懸浮液三次。在冷室中將2μgSP-2MAb加蛋白質(zhì)樣品旋轉(zhuǎn)2小時(shí)。通過反復(fù)離心和抽氣，用1ml緩沖液C洗滌珠粒三次。最后，吸出珠粒中的空氣且將濕珠粒溶解在1倍Laemeli緩沖液中并進(jìn)行電泳。步驟4儲(chǔ)藏緩沖交換純化的蛋白質(zhì)，用Centricon-30與Hank氏平衡鹽溶液一起縮至2-3mg/ml且與1體積2M葡萄糖混合，然后在-20℃下冷凍。實(shí)施例6天然殺傷(NK)和淋巴激活素活化的殺傷(LAK)細(xì)胞活性的增強(qiáng)在通過使單核細(xì)胞粘附于塑料表面(45分鐘，37℃)而使之部分減少之后，通過Ficoll-Hypaque梯度離心從新鮮肝素化血中分離外周血單核細(xì)胞(PBL)。在添加有10%熱失活胎牛血清和抗生素的RMPI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)PBL，濃度為2×106細(xì)胞/ml。以不同的濃度(50ng/ml-2000ng/ml)加入純化的IR-95，用時(shí)16小時(shí)。作為對(duì)照，在沒有IR-95的情況下，在同樣的培養(yǎng)條件下將PBL溫育同樣長的時(shí)間。溫育結(jié)束時(shí)，洗滌細(xì)胞并在短期(4小時(shí))41Cr-釋放細(xì)胞毒性測(cè)定中(Coligan，J.E.etal.，CurrentProtocolsinImmunology，GreenPublishingAsssociatesandWileyInterscience，NewYork(1992))作為對(duì)抗靶細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)試即在效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之比為1∶40時(shí)測(cè)試K562細(xì)胞的NK活性和Daudi細(xì)胞的LAK活性。數(shù)據(jù)點(diǎn)是一式五份進(jìn)行的5個(gè)不同實(shí)驗(yàn)的平均值。自發(fā)的51Cr-釋放在所有情況下總計(jì)15%。以500-2000ng/ml的濃度加入IR-9516小時(shí)可顯著提高NK和LAK細(xì)胞毒性活性(圖11)。在本說明書中提及的所有出版物和專利申請(qǐng)表明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)水平。如同每一單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被特別分別指明作為參考文獻(xiàn)一樣，所有出版物和專利申請(qǐng)均作為參考文獻(xiàn)合并于此。雖然前面已通過說明和實(shí)施例較為詳細(xì)地描述了本發(fā)明以便于清楚地理解，但顯然在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)可進(jìn)行某些變化和改進(jìn)。為實(shí)施本發(fā)明做出上述方式的對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的改進(jìn)，如在藥物、免疫學(xué)、雜交瘤技術(shù)、藥理學(xué)領(lǐng)域和/或相關(guān)的領(lǐng)域中的改進(jìn)均包括在下列權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。表190K抗原的純化表2化學(xué)和物理處理對(duì)90K活性的影響表3腫瘤和正常組織中的ENA的Northern吸印分析<p>表490K抗原的氨基酸組成</tables>通過用mAbSP-2作為涂層抗體的固相酶聯(lián)免疫吸附方法確定循環(huán)血清IR-95濃度(單位/ml)。大于1.75單位/ml(正常均值+/-2SD)被確定為陽性。IR-95的血清水平不受性別和血型影響。從Chieti大學(xué)醫(yī)院中患下列疾病的患者中得到總共241個(gè)血清樣品乙型肝炎病毒感染(69例)，E-B病毒感染(21例)，自身免疫病(15例類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，7例系統(tǒng)性紅斑狼瘡，6例自身免疫眼色素層炎)，血液透析(19例)，唐氏先天愚(12例)。此外，從18位處于不同妊娠期的婦女和29位年齡在85歲以上外表健康的受試者中獲得血清樣品。血清IR-95的截止值為1.7單位/ml(均值+/-2SD)。不同組受試者的所有均值都明顯大于健康對(duì)照的均值(p＝0.0001，方差分析)。序列一覽表(1)一般性信息(ⅰ)申請(qǐng)人Ullrich，AxelSures，IrmingardAzam，Mohammad(ⅱ)發(fā)明名稱90K腫瘤相關(guān)抗原IR-95的基因序列(ⅲ)序列數(shù)目5(ⅳ)通訊地址(A)地址Sterne，Kessler，Goldstein&Fox(B)街道1225ConnecticutAvenue(C)城市Washington(D)州D.C.(E)國家U.S.A.(F)郵政編碼20036(ⅴ)計(jì)算機(jī)上可讀出的表格(A)介質(zhì)類型Floppy軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容制的(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRelease＃1.0，Version＃1.25(ⅵ)本申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朥S(被轉(zhuǎn)讓)(B)申請(qǐng)日(C)分類(ⅶ)以前申請(qǐng)的數(shù)據(jù)(A)申請(qǐng)?zhí)朓TRM92A000100(B)申請(qǐng)日17-FEB-1992(ⅸ)電信信息(A)電話(202)466-0800(B)傳真(202)833-8716(2)SEQIDNO1的信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長度2206堿基對(duì)(B)類型核酸(C)成股性單股(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅸ)特征(A)名稱/符號(hào)CDS(B)定位132..1886(ⅹⅰ)序列描述(2)SEQIDNo2的信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長度585個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNo2(2)SEQIDNO3的信息(ⅰ)序列特點(diǎn)(A)長度22個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(B)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅹⅰ)序列描述SEOIDNO權(quán)利要求1.一種基本純化的90K抗原或其含有抗原決定簇的片段，該抗原或片段能夠與單克隆抗體SP-2結(jié)合，SP-2保藏于法國巴黎巴斯德研究所(CollectionNarionaledeCulturesdeMi-croganismes，InstitutPasteur，Paris，F(xiàn)rance)，其保藏號(hào)為I-1083。2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗原，其中該抗原具有SEQID.NO2中所述的氨基酸序列。3.根據(jù)權(quán)利要求1的抗原或其片段，其中該抗原具有SEQID.NO3中所述的末端氨基酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求1的抗原或其片段，其中該抗原或片段未被糖基化。5.一種從含有權(quán)利要求1所述90K抗原或其片段的樣品中回收基本純化的該抗原或其片段的方法，該方法包括(a)從含有該抗原或片段的樣品中回收抗原或其片段粗品;(b)沉淀得自(a)的抗原或其片段粗品;(c)層析得自步驟(b)的沉淀物以獲得部分純化的抗原或其片段;(d)層析得自步驟(c)的部分純化的抗原或其片段;(e)通過免疫親和結(jié)合純化抗原或其片段。6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中樣品系選自CG-5組織培養(yǎng)液、癌癥患者的血清和癌癥患者的腹水液。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中癌癥為乳腺癌或卵巢癌。8.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中步驟(b)的沉淀為硫酸銨沉淀。9.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中步驟(c)的層析為大小排阻層析。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中大小排阻層析用SepharoseCL-6B柱完成。11.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中步驟(d)的層析為DEAE-纖維素層析。12.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中步驟(e)的免疫親和結(jié)合是通過偶聯(lián)到單克隆抗體SP-2的Sepharose進(jìn)行。13.一種基本純化的90K抗原或其含有抗原決定簇的片段，該抗原或片段能夠與保藏于法國巴黎巴斯德研究所(CollectionNarionaledeCulturesdeMicroganismes，InstitutPasteur，Paris，F(xiàn)rancce)的單克隆抗體SP-2(保藏號(hào)為I-1083)結(jié)合，其中該抗原或片段已通過權(quán)利要求5的方法被純化。14.根據(jù)權(quán)利要求13的抗原，其中該抗原具有SEQIDNo2中所述的氨基酸組成。15.根據(jù)權(quán)利要求13的抗原，其中該抗原具有SEQIDNo3中所述的末端氨基酸序列。16.一種治療患者疾病的方法，它包括給患者服用治療有效量的權(quán)利要求1的90K抗原或其片段。17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該90K抗原具有SEQIDNo2中所述的氨基酸組成。18.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中該抗原具有SEQIDNo3中所述的末端氨基酸序列。19.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所說疾病選自癌癥、病毒感染、炎癥、自體免疫疾病、關(guān)節(jié)炎和衰老。20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中癌癥為乳腺癌或卵巢癌。21.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其中所說病毒感染由人免疫缺陷病毒引起。22.一種診斷疾病的方法，它包括從患者獲得樣品;和檢測(cè)樣品中權(quán)利要求1所述90K抗原或其片段的水平。23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中疾病選自癌癥、病毒感染、炎癥、自體免疫和關(guān)節(jié)炎。24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中癌癥為乳腺癌或卵巢癌。25.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所說病毒感染由人免疫缺陷病毒引起。26.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述檢測(cè)步驟包括將樣品與該90K抗原或其片段的特異性抗體接觸;和測(cè)定與該抗體結(jié)合的90K抗原或其片段的量。27.根據(jù)權(quán)利要求26的方法，其中抗體為單克隆抗體。28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所說單克隆抗體(MAb)為MAbSP-2，它保藏于巴斯德研究所(CollectionNarionaledeCulturesdeMicroganismes，InstitutPasteur，Paris，F(xiàn)rance)且其保藏號(hào)為I-1083。29.一種治療疾病的方法，它包括給患者服用治療有效量的90K抗原的拮抗劑。全文摘要本發(fā)明提供了基本純化的腫瘤相關(guān)90K抗原，或其片段，特別是來自人乳腺癌細(xì)胞系CG-5的培養(yǎng)液；乳腺癌患者的血清；或卵巢癌患者的腹水。分子量約為95,000道爾頓的天然抗原以高分子量復(fù)合物存在。本發(fā)明還提供了該抗原的純化和表征以及它們的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了編碼90K抗原或其片段的核苷酸序列，含有該基因序列的載體，以此轉(zhuǎn)化的宿主，和由轉(zhuǎn)化的宿主生產(chǎn)該抗原或其片段的方法。文檔編號(hào)A61K38/00GK1076629SQ93101808公開日1993年9月29日申請(qǐng)日期1993年2月17日優(yōu)先權(quán)日1992年2月17日發(fā)明者S·亞科貝利,C·納托利,J·施萊辛格申請(qǐng)人:紐約大學(xué),G·D·阿農(nóng)齊奧·基耶蒂研究院