專利名稱：調(diào)節(jié)t細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的方法
調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的方法
背景技術(shù)：
T淋巴細(xì)胞群包括數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞，其中每個(gè)細(xì)胞都在表面表達(dá)獨(dú)特的受體(TCR T細(xì)胞受體)。該異質(zhì)性允許不同的T細(xì)胞特異性識(shí)別源于不同病原體的抗原。通過自 身耐受的誘導(dǎo)避免自身抗原的識(shí)別。然而，在病理狀態(tài)下自身抗原的識(shí)別引起自身免疫和 自毀的炎性疾病。T淋巴細(xì)胞依賴性炎性疾病包括，例如哮喘、過敏癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀 屑病關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、內(nèi)毒素血癥、I型糖尿病、炎性腸道疾病(IBD)、結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化 癥、移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、脫髓鞘病、硬皮病、干燥綜合征、 Erdheim-Chester綜合征、克羅恩病綜合征、高安動(dòng)脈炎、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血、 Werlhof特發(fā)性血小板減少綜合征和皮膚病，比如銀屑病、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、皮膚移植物 抗宿主病、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、斑禿、白癜風(fēng)、藥物相關(guān)的疹、接觸性超敏反應(yīng)、 紅斑狼瘡、苔蘚痘疹樣糠疹、慢性苔蘚性糠疹、濕疹及扁平苔蘚。T細(xì)胞活化依賴于鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞溶質(zhì)鈣升高代表適應(yīng)性免疫應(yīng)答調(diào)控中 的必要線索。B細(xì)胞或T細(xì)胞受體的引發(fā)導(dǎo)致從ER中釋放鈣(Ca2+)，并進(jìn)而激活質(zhì)膜上 Ca2+釋放相關(guān)通道(CRAC)的開放，引起庫容性鈣進(jìn)入(CCE) (Putney and Bird, Cell 75 199-201 (1993))。磷酸酶鈣神經(jīng)素的活化是對T細(xì)胞成功活化關(guān)鍵的Ca2+依賴性事件的一 個(gè)例證，其能使轉(zhuǎn)錄因子NFAT去磷酸并因而決定其核易位(Goldsmith and Weiss, Science 240 :1029-1031(1988))。細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+的增加并行于活躍的線粒體Ca2+攝入。線粒體作為高容量的Ca2+庫， 幫助避免細(xì)胞Ca2+過載，并另外有助于在空間限制區(qū)域迅速清除Ca2+。線粒體的后一個(gè)功能 精密地調(diào)節(jié)Ca2+敏感蛋白的活性。例如，在ER上IP3受體附近的線粒體Ca2+緩沖被證明能增 加足于 CRAC 活化的 IP3 的動(dòng)態(tài)范圍(Gilabert et al. ,EMBO J 20 :2672_2679 (2001))，而 CRAC通道附近的Ca2+緩沖降低它們的Ca2+依賴性失活速率(Hoth et al. ,Proc Natl Acad Sci U S A 97 10607-10612 ；Hoth et al.，J CeU Biol 137 :633_648 (1997))。最終，線粒 體Ca2+攝入通過激活丙酮酸、α-酮戊二酸和異檸檬酸脫氫酶，刺激三磷酸腺苷(ATP)的有 氧合成(Jouaville et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 96 13807-13812 (1999) ；Hajnoczky et al. , Cell 82:415-424(1995))。Ca2+依賴的ATP的生產(chǎn)不僅滿足受激細(xì)胞的較高的能 量需求，也可能調(diào)節(jié)其它ATP調(diào)節(jié)的進(jìn)程。事實(shí)上，ATP也是一個(gè)廣泛存在的細(xì)胞外信使(Burnstock，Trends Pharmacol Sci 27 166-176(2006)) ；Burnstock, Novartis Found Symp 276 26-48 ；discussion 48-57,275-281 (2006))，或者通過分泌囊泡的胞吐作用或者通過間隙連接半通道釋放 到細(xì)胞外空間(Coco et al.，JBC 278 1354-1362 (2003) ；Cotrina et al.，PNAS 95: 15735-15740(1998) ；Bao et al.，F(xiàn)EBS Letters 572:65-68(2004))。ATP 激活細(xì)胞 外核苷酸的質(zhì)膜受體(稱為P2受體)，其中該受體幾乎由所有細(xì)胞以不同的組合表達(dá) (Burnstock, Novartis Found Symp 276 26-48 ；discussion 48—57，275—281 (2006))。P2 受體被分為兩亞類，稱為P2X和P2Y受體。P2X 1 7受體都結(jié)合ATP并無選擇性開放，常 常使離子通道迅速脫敏。P2Y1、2、4、6、11 14受體優(yōu)選結(jié)合ADP、UDP、UTP或UDP-葡萄糖，它們屬于G-蛋白偶聯(lián)的受體家族，并且它們的活化和CCE相關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，淋巴細(xì)胞上(具體在T細(xì)胞上)P2受體的活化，對TCR刺 激的結(jié)果最為關(guān)鍵(Scrivens and Dickenson, Br J Pharmacol 146:435-444(2005); Baricordi et al. , Blood 87 682-690 (1996) ；Loomis et al, . J Biol Chem 278 4590-4596(2003))。細(xì)胞外環(huán)境中ATP的半衰期相當(dāng)短，由于其被外切腺苷三磷酸雙磷酸 酶(⑶39)和外切_5’ -核苷酸酶(⑶73)的聯(lián)合作用輕易地降解為腺苷酸(Yegutkin et al. ,Biochem J 367 121-128 (2002))。有趣的是，已經(jīng)表明Treg細(xì)胞能通過這些表面酶活 性作用調(diào)節(jié)T細(xì)胞的抑制(Deaglio et al. ,J Exp Med 204 1257-1265(2007) ；Borsellino et al. , Blood 110 (4) 1225-1232 (2007))。盡管存在這些關(guān)于免疫應(yīng)答過程中ATP調(diào)控 作用的證據(jù)，但其來源還未被明確鑒定。已有人提出ATP釋放于死亡中的細(xì)胞或受損的血 小板以及機(jī)械性刺激(Cotrina et al.，PNAS 95 15735-15740 (1998) ；Bao et al.，F(xiàn)EBS Letters 572 :65_68(2004))。最近我們已經(jīng)報(bào)道了一個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停渲杏迷从阝}網(wǎng)蛋白(CRT)缺陷胚胎的胎兒 肝臟的造血祖細(xì)胞重建免疫缺陷小鼠。CRT是一種分子伴侶蛋白，并是ER中最重要的Ca2+ 緩沖物(Ellgaard and Helenius, Nat Rev Mol Cell Biol 4 181-191 (2003))；在基因 敲除小鼠中它的缺失在妊娠的12 13天是致死的(Mesaeli et al. , J Cell Biol 144 857-868(1999))。ER中Ca2+結(jié)合CRT的量可能顯著影響細(xì)胞命運(yùn)，例如，CRT的過表達(dá)導(dǎo)致 對凋亡刺激的易感性增強(qiáng)(Pinton et al.，EMBO J 20 :2690_2701 (2001))，而CRT缺陷的 細(xì)胞對凋亡更加耐受(Nakamura et al.，J Cell Biol 150 :731_740 (2000))。Crt+T 細(xì)胞 對抗原刺激有高反應(yīng)，并且其紊亂的T細(xì)胞反應(yīng)性決定Crt+胎兒肝臟嵌合體(FLC)嚴(yán)重 的免疫病理學(xué)狀況，這類似于移植物抗宿主病表型的某些方面。該嚴(yán)重的免疫病理學(xué)狀況 受對TCR的振蕩的Ca2+反應(yīng)的促進(jìn)，TCR引發(fā)MAPK通路的延長活化并拖延NFATl的核定位 (Porcellini et al. , J Exp Med 203 :461_471(2006))。本文我們表明Crt+T細(xì)胞特征描述為在CCE過程中有增加的線粒體Ca2+緩沖，導(dǎo) 致ATP高速率合成。該活化過程中T細(xì)胞釋放的ATP引起具有MAPK活化作用的P2X受體 的自分泌激活。這代表為必要的用于產(chǎn)生T細(xì)胞活化和擴(kuò)展的共刺激因子。我們表明誘導(dǎo) ATP合成和釋放的活性在T細(xì)胞依賴性炎癥的結(jié)果中起關(guān)鍵作用，并且表示為可能的T細(xì)胞 免疫抑制的藥理學(xué)靶點(diǎn)。P2X受體的活化受到ATP拮抗劑的抑制，比如氧化的ATP (oATP)。因此，oATP能通 過在涉及炎癥和組織損傷的免疫系統(tǒng)的各種細(xì)胞(如T細(xì)胞)中拮抗ATP的促炎癥作用來 發(fā)揮其抗炎癥效用。本文中我們也表明oATP結(jié)合抗CD3抗體和同基因的受照射的脾細(xì)胞偏向誘導(dǎo)具 有Foxp3高水平表達(dá)的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)。Treg細(xì)胞活躍抑制效應(yīng)子T細(xì)胞增殖 和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并且提供使效應(yīng)子T細(xì)胞脫離發(fā)育為無反應(yīng)狀態(tài)的T細(xì)胞耐受機(jī)制(T 細(xì)胞無反應(yīng)性)。Treg細(xì)胞的抑制作用可以是抗原特異的也可以是抗原非特異的。在具有 低量Treg的⑶4+幼稚細(xì)胞誘導(dǎo)的炎性腸道疾病中(IBD)，用oATP治療能顯著增加Treg中 Foxp3的表達(dá)，并完全阻止腸中的免疫病理。已經(jīng)表明Treg能抑制肥大細(xì)胞脫顆粒(Gri et al.，Immunity 29 :771_781 (2008))，并因而能在涉及肥大細(xì)胞脫顆粒相關(guān)情況(例如， 哮喘、過敏和過敏性休克)的免疫抑制反應(yīng)中起作用。在建立和維持T細(xì)胞耐受中Treg細(xì)胞的重要性已經(jīng)產(chǎn)生重要的興趣，該興趣在于旨在治療的體外擴(kuò)展Treg細(xì)胞的方法，例 如，繼承性Treg細(xì)胞治療。擴(kuò)展的Treg細(xì)胞灌輸可被用于，例如，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、誘導(dǎo)細(xì)胞 耐受、組織和器官移植和治療自身免疫疾病。然而，這些臨床應(yīng)用已經(jīng)被延遲，由于成功擴(kuò) 展沒有效應(yīng)子細(xì)胞(例如，Thl7，其出現(xiàn)于FoXp3+選擇)顯著污染的Treg亞群的挑戰(zhàn)。這 些污染細(xì)胞可能比Treg細(xì)胞生長更快。此外，Treg細(xì)胞可能在體外反復(fù)刺激后喪失抑制 活性。因此，關(guān)鍵在于起初Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展具有合適細(xì)胞產(chǎn)物，并且在體外選擇 性地支持Treg細(xì)胞而不是污染細(xì)胞的生成和擴(kuò)展。本文中我們表明用oATP治療抑制體外 Treg細(xì)胞向Thl7細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化，如通過ROR y T表達(dá)評分。如上所述，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ATP由活化的T細(xì)胞激活釋放，并且分泌的ATP和T細(xì)胞 表面的受體相互作用，用作延長τ細(xì)胞活化的自分泌及旁分泌刺激。用OATP阻斷該相互作 用導(dǎo)致接觸抗原時(shí)T細(xì)胞不能激活，并且生成T細(xì)胞“無應(yīng)答性”的狀態(tài)，這最終引起減少的 組織損傷。此外，如上所述，我們也發(fā)現(xiàn)包含oATP的組合物也能用于誘導(dǎo)免疫抑制性Treg 細(xì)胞的分化和顯著擴(kuò)展，維持Treg細(xì)胞表型，并增強(qiáng)Treg細(xì)胞免疫抑制活性，也能引起減 少的組織損傷。因此用oATP治療可以在器官移植前、期間或后有利于避免T細(xì)胞介導(dǎo)的排 斥，并且有利于患有在骨髓移植前、期間或后T細(xì)胞介導(dǎo)的移植物抗宿主病的患者。因此，所述本發(fā)明旨在治療免疫或炎性疾病，通過用至少一種調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴性 免疫應(yīng)答的制劑接觸T細(xì)胞，比如抑制ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化和/或誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化 和擴(kuò)展的制劑，例如，οΑΤΡ、ΡΧ10肽或生胃酮。這些效用可以有多種治療性應(yīng)用，例如，免疫 耐受、自身免疫、免疫抑制和免疫治療相關(guān)的治療。發(fā)明概述本發(fā)明可體現(xiàn)為一種用于調(diào)節(jié)一種或多種T細(xì)胞依賴性的免疫應(yīng)答的方法。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于抑制至少一種T細(xì)胞活性的方法，包含步 驟為用抑制ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑接觸T細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述T細(xì)胞活 性選自活化、增殖、分化、存活、細(xì)胞裂解活性及細(xì)胞因子產(chǎn)生。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，用 于抑制至少一種T細(xì)胞活性的方法在體內(nèi)進(jìn)行。在一實(shí)施方式中，所述抑制ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑是Ρ2Χ受體拮抗劑，例 如，Ρ2Χ7受體拮抗劑。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述制劑是oATP。在另一實(shí)施方式中，所述 制劑是抑制parmexin hemichannels滲透性的制劑。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述制劑是 PXlO 肽(SEQ ID NO 1)或生胃酮。本發(fā)明也提供一種誘導(dǎo)T細(xì)胞無反應(yīng)性的方法，包含步驟為用ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞 活化的抑制劑接觸T細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述用于誘導(dǎo)T細(xì)胞無反應(yīng)性的方法在 體內(nèi)進(jìn)行。在一實(shí)施方式中，所述抑制ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑是P2X受體拮抗劑， 例如，T細(xì)胞P2X7受體拮抗劑。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述制劑是oATP。在另一實(shí)施方 式中，所述制劑是抑制parmexin hemicharmels滲透性的制劑。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所 述制劑是PXlO肽(SEQ ID NO 1)或生胃酮。在一實(shí)施方式中，所述接觸的T細(xì)胞是分泌IL-17的T細(xì)胞(即TH17細(xì)胞)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展的方法， 包含步驟為用誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展的制劑接觸Treg細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方式 中，該方法在體內(nèi)進(jìn)行。在一例示實(shí)施方式中，所述制劑是含有oATP的組合物。所述組合
8物也優(yōu)選包含(I)T細(xì)胞初次刺激物；和(2)細(xì)胞成分或可溶性介質(zhì)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于抑制Treg細(xì)胞向非Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變的方 法，包含步驟為用抑制Treg細(xì)胞向非Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變的制劑接觸Treg細(xì)胞。所述非Treg 細(xì)胞可是病原性T細(xì)胞，例如，Thl7細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述制劑是含有oATP的 組合物。所述方法可(例如)在體內(nèi)或體外進(jìn)行。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于將非Treg細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變的方法， 包含步驟為用增強(qiáng)非Treg細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變的制劑接觸非Treg細(xì)胞。所述非Treg細(xì) 胞可是幼稚的或病原性T細(xì)胞，例如，Thl7細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述制劑是含有 oATP的組合物。所述方法可(例如)在體內(nèi)或體外進(jìn)行。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于增強(qiáng)Treg細(xì)胞活性(例如，免疫抑制活 性)的方法，通過用增強(qiáng)Treg細(xì)胞活性的制劑接觸Treg細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所 述制劑是含有oATP的組合物。所述方法可(例如)在體內(nèi)或體外進(jìn)行。本發(fā)明也可體現(xiàn)為一種用于治療細(xì)胞死亡或組織損傷的方法，包含用調(diào)節(jié)一種或 多種T細(xì)胞-依賴性免疫應(yīng)答的制劑接觸T細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，所述方法可包含一個(gè) 或多個(gè)步驟(1)用抑制ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑接觸T細(xì)胞；(2)用抑制Treg細(xì)胞 轉(zhuǎn)變?yōu)榉荰reg細(xì)胞和/或增強(qiáng)其免疫抑制活性的制劑接觸Treg細(xì)胞；(3)用誘導(dǎo)Treg細(xì) 胞分化和/或擴(kuò)展的制劑接觸Treg細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(1)在體內(nèi)進(jìn)行。 在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(3)優(yōu)選在體外進(jìn)行，并且隨后在體內(nèi)施用分化和/或擴(kuò)展的 Treg細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述制劑或組合物包含oATP。本發(fā)明也可體現(xiàn)為一種用于治療自身免疫或炎性疾病的方法，包含步驟為用調(diào)節(jié) 一種或多種T細(xì)胞-依賴性免疫應(yīng)答的制劑接觸T細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，所述方法可包 含下列步驟中的一個(gè)或多個(gè)步驟(1)用抑制ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑接觸T細(xì)胞； (2)用抑制Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉荰reg細(xì)胞和/或增強(qiáng)其免疫抑制活性的制劑接觸Treg細(xì) 胞；(3)用誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展的制劑接觸Treg細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中， 步驟(1)在體內(nèi)進(jìn)行。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，步驟(3)優(yōu)選在體外進(jìn)行，并且隨后在體內(nèi) 施用分化和/或擴(kuò)展的Treg細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述制劑包含oATP。在一實(shí) 施方式中，所述自身免疫或炎性疾病是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的自身免疫或炎性疾病，例如，T淋 巴細(xì)胞依賴性炎性疾病。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述T淋巴細(xì)胞依賴性炎性疾病關(guān)于，例 如，哮喘、過敏癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、內(nèi)毒素血癥、I型糖尿病、炎性腸道 疾病(IBD)、結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化癥、移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、 脫髓鞘病、硬皮病、干燥綜合征、Erdheim-Chester綜合征、克羅恩病綜合征、高安動(dòng)脈炎、結(jié) 節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血及Werlhof特發(fā)性血小板減少綜合征。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施 方式中，所述T淋巴細(xì)胞依賴性炎性疾病關(guān)于皮膚病，比如，例如銀屑病、皮膚T細(xì)胞淋巴 瘤、皮膚移植物抗宿主病、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、斑禿、白癜風(fēng)、藥物相關(guān)的疹、接 觸性超敏反應(yīng)、紅斑狼瘡、苔蘚痘疹樣糠疹、慢性苔蘚性糠疹、濕疹及扁平苔蘚。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明體現(xiàn)為一種體內(nèi)治療受試者自身免疫或炎性疾病 的方法。所述方法可包含(例如)給受試者體內(nèi)施用下列中的至少一種(1)抑制ATP-介 導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑；(2)調(diào)節(jié)至少一種Treg細(xì)胞活性的制劑，例如Treg細(xì)胞分化和/ 或擴(kuò)展以及Treg細(xì)胞免疫抑制活性；和(3)通過體外接觸本發(fā)明的制劑而分化和/或擴(kuò)展
9的Treg細(xì)胞。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述步驟⑴和/或步驟⑵的制劑包含oATP。在一實(shí)施方式中，所述調(diào)節(jié)至少一種T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的制劑(例如，抑制 ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑和/或調(diào)節(jié)至少一種Treg細(xì)胞活性的制劑)是納米膠囊化 的，例如，形成納米顆粒。在另一實(shí)施方式中，已經(jīng)通過接觸本發(fā)明的制劑而分化和/或擴(kuò) 展的Treg細(xì)胞是納米膠囊化的，例如，形成納米顆粒。在一實(shí)施方式中，所述納米顆粒靶向 特異的細(xì)胞或組織。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述納米顆粒在體內(nèi)靶向特異的細(xì)胞或組織。本發(fā)明也提供一種方法，其給有需要的受試者施用調(diào)節(jié)T細(xì)胞_依賴性免疫應(yīng)答 的制劑。在一實(shí)施方式中，所述制劑結(jié)內(nèi)施用。在另一實(shí)施方式中，所述制劑局部施用。在 另一實(shí)施方式中，所述制劑通過靜脈內(nèi)或注射施用。本發(fā)明也提供一種方法，其調(diào)節(jié)受試者的T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答，比如自身免疫 疾病或過敏，通過施用用本發(fā)明的制劑誘導(dǎo)分化和/或擴(kuò)展產(chǎn)生的Treg細(xì)胞。本方法包含 (a)從受試者獲取幼稚的T細(xì)胞群(例如，幼稚的CD4+T細(xì)胞)；(b)通過分化和擴(kuò)展從幼稚 的T細(xì)胞中生成Treg細(xì)胞；和(c)將生成的Treg細(xì)胞導(dǎo)入受試者來調(diào)節(jié)，例如，抑制受試 者的T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答。通過查看下列更詳細(xì)的本發(fā)明的描述以及附圖，將更完整地理解和認(rèn)識(shí)這些以及 本發(fā)明的其它目標(biāo)和優(yōu)勢。


圖1 :crt+T細(xì)胞中增加的線粒體Ca2+緩沖(a)用毒胡蘿卜內(nèi)酯耗盡ER Ca2+后，在crtv_和crtv+T細(xì)胞克隆中通過添加0. 5mM Ca2+到細(xì)胞外培養(yǎng)基中誘導(dǎo)CCE (參見實(shí)施例1)。在完全沖洗掉細(xì)胞外Ca2+后，所述線粒體 Ca2+緩沖通過添加離子霉素被可視化。(b)柱狀圖表示crt+和crtv+T細(xì)胞克隆中，在伴隨0. 5、1和2mM的細(xì)胞外Ca2+CCE 后，線粒體的Ca2+含量。(c) crt^T細(xì)胞中增加的線粒體的Ca2+緩沖減緩CRAC失活。用毒胡蘿卜內(nèi)酯治療 細(xì)胞，隨后兩次單獨(dú)地添加Ca2+到細(xì)胞外培養(yǎng)基(參見實(shí)施例1)(也見圖2C)。在第一次 和第二次添加Ca2+時(shí)計(jì)算細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+濃度升高的速度。在crt+A而不是crt+T細(xì)胞中 觀測到明顯降低。(d)在線粒體解偶聯(lián)劑存在(CCCP)下重復(fù)相同的實(shí)驗(yàn)，在crtv+和crt+T細(xì)胞中 CRAC 的失活相當(dāng)。(*，P < 0. 05，**，P < 0. 001，***，P < 0. 0001)圖2 :crt+T細(xì)胞中降低的ER中的Ca2+、未改變的線粒體膜電位和減少的CRAC失活。(a)負(fù)載Fura-2的D011. 10TCR轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞克隆的ER Ca2+含量通過添加SERCA 泵抑制劑毒胡蘿卜內(nèi)酯到無Ca2+的培養(yǎng)基中來評估(參見實(shí)施例1)。Ca2+從ER被動(dòng)滲透 到細(xì)胞溶質(zhì)被視為能緩慢地短暫地升高細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+濃度。和crtv+細(xì)胞相比，Crt^T細(xì) 胞有降低的ER的Ca2+含量，計(jì)為曲線下面積。(b)對分離自crt+和crtv+FLC的分選的幼稚的和效應(yīng)子/記憶(CD44+CD62L_) CD4細(xì)胞進(jìn)行TMRM染色，顯示CRT缺失不能改變線粒體的膜電位。(c)為了評分CRAC失活，T細(xì)胞被負(fù)載Fura-2，并被放在覆蓋多聚L-賴氨酸的蓋玻片上(參見實(shí)施例1)。通過在無Ca2+的培養(yǎng)基中添加毒胡蘿卜內(nèi)酯耗盡ER鈣儲(chǔ)存。ER 鈣儲(chǔ)存完全耗盡后添加兩次Ca2+IOO秒鐘。兩次添加Ca2+都導(dǎo)致Ca2+流入CRAC。由于這些 通道受到Ca2+抑制，所以第二次Ca2+升高具有較慢的速度和幅度。crt+細(xì)胞顯示減弱的 CRAC失活。圖3 在T細(xì)胞活化期間線粒體的Ca2+攝入引起ATP合成和釋放(a)在crt+和crtv+分選的幼稚的⑶4+T細(xì)胞中，用⑶3抗體激活T細(xì)胞后，在 不同時(shí)刻的ATP合成(參見實(shí)施例2)。(b)在ATP合成酶抑制劑寡霉素的缺失(控制)或存在下，T細(xì)胞活化后產(chǎn)生ATP。(c)在結(jié)合⑶3和⑶28抗體的平板上活化38小時(shí)后，分選的幼稚的⑶4crt+和 crt+/+T細(xì)胞表面上⑶62L表達(dá)的FACS圖譜。在oATP存在下進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。(d)用核苷酸結(jié)合化合物奎納克林對幼稚的CD4+T細(xì)胞染色(參見實(shí)施例2)。同 類的細(xì)胞溶質(zhì)染色指示含有ATP的分泌囊泡的缺失。(e)非刺激的和激活的幼稚T細(xì)胞在連續(xù)蔗糖梯度中的亞細(xì)胞分級分離(參見實(shí) 施例2)。ATP只在包含細(xì)胞溶質(zhì)蛋白Zap-70的級分中檢出，而在那些以小囊泡標(biāo)記物細(xì)胞 短蛋白聚糖為特征的級分中沒有檢出。圖4 在D011. 10TCR轉(zhuǎn)基因的T細(xì)胞克隆中，通過選擇性激動(dòng)劑的P2受體轉(zhuǎn)錄和 Ca2+反應(yīng)(a)P2受體的RT-PCR表明在T細(xì)胞克隆中，P2X1、4、7和P2Y1、12、13、14共表達(dá) (參見實(shí)施例3)。(b)在正常培養(yǎng)基(第一個(gè)圖)或無Ca2+的培養(yǎng)基(第二個(gè)圖)中的Ca2+成像實(shí) 驗(yàn)證實(shí)CD4T細(xì)胞克隆上存在離子型和促代謝型P2受體。(c)優(yōu)選的 P2X 受體激動(dòng)劑(α β MeATP :P2X1，MeSATP 全部 Ρ2Χ, BzATP :Ρ2Χ7)更 具體證實(shí)了這些受體的功能能力。(d)有功能的P2Y受體存在于T細(xì)胞克隆上，通過對優(yōu)選的激動(dòng)劑(MeSADP :P2Y1、 12、13和UDP-葡萄糖:Ρ2Υ14)的反應(yīng)所顯示。圖5 =TCR刺激后延長的MAPK活化中細(xì)胞周圍ATP的作用(a)用生物素化的CD3抗體刺激OVA特異的crt+T細(xì)胞克隆，之后用親和素交聯(lián) (參見實(shí)施例3)。刺激30分鐘后，細(xì)胞或者保持未處理(左邊第一個(gè)圖)，或者用src-類 激酶抑制劑PP2單獨(dú)(第二個(gè)圖)或組合oATP (第三個(gè)圖)或ARL(第四個(gè)圖)處理。PP2 有效抑制TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如Zap-70的脫磷酸作用所顯示，而延長的Erk活化很少被影響。 PP2和oATP聯(lián)用幾乎完全摧毀Erk磷酸化作用，而PP2和外切核酸酶抑制劑ARL聯(lián)用在往 后時(shí)刻增強(qiáng)Erk活化。(b)用交聯(lián)的⑶3抗體刺激crt+T細(xì)胞克隆16小時(shí)(參見實(shí)施例3)。左邊第一 個(gè)圖表示典型的延長的P38 MAPK和Erk磷酸化作用。這些延長的活化作用被作為線粒體 ATP合成抑制劑的寡霉素和兩個(gè)P2受體拮抗劑oATP及PPADS摧毀。圖6 :P2受體的藥理學(xué)抑制損害T細(xì)胞增殖以及IL-2分泌和試劑無反應(yīng)性(a)FACS圖譜顯示在分選的幼稚的⑶4+細(xì)胞中CFSE熒光的稀釋，這些⑶4+細(xì)胞用 平板結(jié)合的CD3和CD28 (見方法部分)在oATP缺失(上圖)或存在(下圖)下刺激(參 見實(shí)施例4)。在IL-2(中圖)或PMA(右圖)存在下進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)。在一定時(shí)間內(nèi)獲得
11的具有檢測標(biāo)記物的細(xì)胞(增殖的細(xì)胞)數(shù)量被指示。(b) 一個(gè)顯示IL-2濃度的典型性實(shí)驗(yàn)是在幼稚的⑶4+細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中，以及 在oATP或PPADS存在下通過ELISA測量，其中⑶4+細(xì)胞用平板結(jié)合的⑶3和⑶28抗體刺 激48小時(shí)?；疑硎驹跇颖局刑砑覲MA時(shí)的IL-2濃度。(c)在oATP缺失或存在下，分別在用結(jié)合平板的CD3和CD28抗體刺激分選的幼稚 的⑶4+細(xì)胞后2小時(shí)和16小時(shí)，通過實(shí)時(shí)RT-PCR定量Egr2和Egr3轉(zhuǎn)錄物(參見實(shí)施例 4)。*，P < 0. 05。(d)單獨(dú)使用離子霉素、CD3和CD28抗體或聯(lián)用oATP或oATP和PMA，對OVA-特 異的T細(xì)胞克隆預(yù)培養(yǎng)16小時(shí)的CD3刺激后的細(xì)胞溶質(zhì)的Ca2+圖譜(參見實(shí)施例4)。圖7 在INS-HA轉(zhuǎn)基因的RAG-2+小鼠中通過oATP治療預(yù)防糖尿病(a)在TCR 6. 5抗-HA轉(zhuǎn)基因的⑶4+T細(xì)胞繼承轉(zhuǎn)移后12天，表達(dá)受鼠胰島素啟 動(dòng)子控制的HA的RAG-2+小鼠中的血糖水平(參見實(shí)施例5)。小鼠或者保持未處理，或者 在轉(zhuǎn)移后1到10天每天靜脈內(nèi)和腹腔內(nèi)注射兩次劑量的PBS或oATP。(b)蘇木素_伊紅染色切片的組織學(xué)檢測(100X)顯示用PBS-治療小鼠的胰腺中 有嚴(yán)重有害的胰島炎，而在oATP-治療動(dòng)物的胰腺?zèng)]有觀測到相關(guān)病理檢查所見。(c)和(d)柱狀圖表示獲得于PBS-治療和oATP-治療的動(dòng)物的脾(c)和胰腺(d) 中的轉(zhuǎn)基因的TCR6. 5+細(xì)胞的數(shù)量。右邊柱狀圖表示獲得于指示(n. d.，表示沒有可檢測 的)的小鼠的胰腺的CD69+ TCR 6. 5+細(xì)胞的百分率。(e)在體外用HA肽刺激源于PBS-和oATP-治療的小鼠的脾細(xì)胞，并通過流式細(xì)胞 儀珠陣列測量指示的細(xì)胞因子(參見實(shí)施例5)。柱狀圖顯示上清中TNF-α ,IFN-y和IL_6 的濃度，用每IO4 TCR6. 5+細(xì)胞pg/ml表示。(平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差，η = 5) *，P < 0. 05 ;**， P < 0. 001 ；_，P < 0. 0001。圖8 通過oATP治療改善炎性腸病(a)源于繼承性轉(zhuǎn)移⑶47⑶25+和⑶4+細(xì)胞的cd3 ε ‘小鼠的典型的腸系膜淋巴 結(jié)、脾、結(jié)腸照片(參見實(shí)施例5)。下圖顯示源于用CD4細(xì)胞重建和用oATP治療的小鼠的 器官。標(biāo)尺=Icm(b)柱狀圖表示按照指示(見方法部分)治療的動(dòng)物的炎性評分。(平均值士標(biāo) 準(zhǔn)偏差；η = 5，⑶47⑶25+健康的對照組；η = 7，⑶4+未治療組；η = 8，⑶4+οΑΤΡ治療組)。(c)所述指示動(dòng)物的結(jié)腸的蘇木素/伊紅和Alcian/PAS染色切片(所有方框中 的顯微圖片都具有相同的放大率，比例尺=50 μ m)。在用⑶47⑶25+細(xì)胞重建的小鼠中， 沒有明顯的炎癥變化并且大量具有很多Alcian-PAS-陽性微滴的杯狀細(xì)胞排列于結(jié)腸隱 窩(箭頭)；在繼承性轉(zhuǎn)移CD4+細(xì)胞的小鼠和注射oATP的小鼠中，通過炎性細(xì)胞浸潤固 有層被局部擴(kuò)展(箭)，并且結(jié)腸隱窩上皮細(xì)胞顯示適度增生。部分杯狀細(xì)胞消失，并且 Alcian-PAS-陽性微滴的減少也是明顯的(箭頭)；在用⑶4細(xì)胞重建的小鼠和PBS治療的 小鼠中，通過炎性細(xì)胞浸潤固有層被顯著擴(kuò)展，具有隱窩化膿病灶發(fā)現(xiàn)。結(jié)腸隱窩也嚴(yán)重發(fā) 育不良，杯狀細(xì)胞幾乎完全消失。(d)獲得于所述指示動(dòng)物的腸系膜淋巴結(jié)和脾的細(xì)胞。(e)所述指示動(dòng)物的腸系膜淋巴結(jié)中的⑶4+T細(xì)胞生成的IL-2、TNFa、IFN γ、 IL-17的絕對數(shù)。(平均值士標(biāo)準(zhǔn)偏差；η = 5，⑶47⑶25+健康組；η = 7，⑶4+未治療組；
12η = 8，CD4+oATP 治療組)* :Ρ < 0. 05 ；** :Ρ < 0. 001 ；*** :Ρ < 0. 0001。(f)所述指示動(dòng)物組的腸系膜淋巴結(jié)和脾中的⑶44+CD62L_效應(yīng)子/記憶細(xì)胞和 CD69+CD4細(xì)胞的絕對數(shù)(柱表示平均值)。圖9 :pannexin hemichannel組裝抑制劑抑制T細(xì)胞活化和增殖(a)用結(jié)合平板的抗-⑶3/28抗體刺激負(fù)載CFSE的人類T細(xì)胞，并用FACS分析測 量其增殖(參見實(shí)施例6)。注意類似于oATP，阻斷parmexin的PXlO肽抑制T細(xì)胞增殖。(b)源于CD3728+刺激的鼠T細(xì)胞分泌IL_2到培養(yǎng)基被PXlO和oATP強(qiáng)烈抑制。圖10 阻斷parmexin的PXlO肽在TCR引發(fā)期間增加細(xì)胞內(nèi)ATP濃度TCR引發(fā)期間，阻斷parmexin的PXlO肽的存在增加細(xì)胞內(nèi)ATP濃度(參見實(shí)施例 6)，表明pannexin hemi channels是T細(xì)胞活化過程中ATP分泌的一個(gè)重要路徑。圖11 :oATP誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化和擴(kuò)展(a)在oATP存在下，幼稚的CD4+T細(xì)胞的刺激顯著增加CD4+CD25高Foxp3+Treg細(xì) 胞的百分比。二(b)在oATP存在下，包含天然Treg細(xì)胞的分選的⑶4+⑶25s細(xì)胞的刺激誘導(dǎo)具有 較高Foxp3表達(dá)水平的Treg細(xì)胞的擴(kuò)展。(c)在抗CD3抗體刺激后第6天，用定量RT-PCR分析Thl (T-bet)、Thl7 (R0R γ Τ) 給和Treg(FoXp3)細(xì)胞系的主要轉(zhuǎn)錄因子，揭示在oATP存在下，存在Foxp3的連續(xù)上調(diào)，相 反，在未治療的培養(yǎng)物中存在T-bet的連續(xù)上調(diào)。圖12 :oATP治療抑制Th 17分化并促進(jìn)Foxp3表達(dá)(a)在偏向Thl7的條件(TGF β和IL-6條件培養(yǎng)基)下用抗⑶3抗體刺激的T細(xì) 胞中，oATP逐漸增加Foxp3的表達(dá)而抑制ROR y T的表達(dá)。(b)通過FACS分析，在偏向Thl7的條件下，oATP存在下，表達(dá)Foxp3的CD4+CD25 S細(xì)胞的絕對數(shù)是增加的。二(c)分選的CD4+CD25高天然Treg細(xì)胞向Thl7細(xì)胞系的去分化被oATP阻礙。圖13 在動(dòng)物中通過oATP治療改善炎性腸病，其中向所述動(dòng)物繼承性轉(zhuǎn)移不足量 的Treg細(xì)胞(a)在IBD的小鼠模型中，每日用100 μ 1 3mM oATP靜脈內(nèi)施用治療增強(qiáng)Treg細(xì) 胞中Foxp3的表達(dá)，其中不足以控制炎癥數(shù)量的Treg細(xì)胞被繼承性轉(zhuǎn)移給動(dòng)物。(b)oATP治療的動(dòng)物沒有顯示腸炎的跡象，并且脾和腸系膜淋巴結(jié)大小沒有增加。(c)oATP治療的動(dòng)物在腸系膜淋巴結(jié)中表現(xiàn)出效應(yīng)子/記憶T細(xì)胞數(shù)量減少。(d)腸系膜淋巴結(jié)中Treg/EM細(xì)胞的比例沒有通過oATP治療顯著改變。圖14 在炎性腸病的老鼠模型中生成Treg的實(shí)驗(yàn)方法Cd3 ε +小鼠分別被繼承性轉(zhuǎn)移2 X IO5幼稚的⑶4+Τ細(xì)胞；2 X IO5幼稚的⑶4+Τ細(xì) 胞和oATP ；2 X IO5在繼承性轉(zhuǎn)移16小時(shí)后用oATP施用的幼稚的⑶4+Τ細(xì)胞；2 X IO5幼稚的 ⑶4+Τ細(xì)胞和IO5天然的Treg細(xì)胞。在第2 5天和8 12天oATP治療的動(dòng)物每日接受 oATP靜脈內(nèi)施用，而在第6和第7天沒有oATP施用。在第28天檢測小鼠的CD4+細(xì)胞亞群 (參見實(shí)施例12)。圖15 在炎性腸病的老鼠模型中用oATP治療生成Treg細(xì)胞(a)在最后一次注射oATP后14天檢測動(dòng)物結(jié)腸、脾和腸系膜淋巴結(jié)的炎癥(參見實(shí)施例12)。(b)FACS檢測鑒定的CD4+CD25髙Foxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。(c) FACS 檢測鑒定的效應(yīng)子記憶 T 細(xì)胞是 CD4+CD44+CD62I7 或 CD4+CD25+CD69+。Treg 細(xì)胞和效應(yīng)子記憶T細(xì)胞的比例被顯示。圖16 在NZB/NZW F1小鼠中通過oATP治療改善蛋白尿癥圖表表示用PBS(對照)或oATP治療的NZB/NZW F1小鼠的尿的蛋白濃度。對25 周齡的雌性NZB/NZW F1小鼠靜脈內(nèi)施用PBS或oATP (100 μ 1 3mM,治療5天，中斷2天)6 周(參見實(shí)施例14)。10只動(dòng)物接受PBS，10只動(dòng)物接受oATP。圖17 在NZB/NZW F1小鼠中通過oATP治療改善SLE對25周齡的雌性NZB/NZW F1小鼠靜脈內(nèi)施用PBS或oATP (100 μ 1 3mM，治療5天， 中斷2天)6周，并檢測其蛋白尿(上圖)或其它指示參數(shù)(下圖)(參見實(shí)施例14)。
P < 0. 01 ；*** :P < 0. 001。圖18 通過oATP治療抑制全身性紅斑狼瘡中的T細(xì)胞效應(yīng)功能用PBS或oATP (上圖)治療獲得于25周齡的雌性NZB/NZW F1小鼠的效應(yīng)子/記憶 (⑶44+CD62L_)⑶4+細(xì)胞，用結(jié)合平板的抗⑶3和抗⑶28抗體刺激⑶4+效應(yīng)子/記憶T細(xì)胞 48小時(shí)，其分泌的IFN-Y和IL-4用ELISA檢測(下圖)(參見實(shí)施例14)。** :P < 0. 01 ； *** :P < 0. 001。圖19 在膠原蛋白誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型中臨床評分的偏差圖表表示起初疾病嚴(yán)重程度臨床評分的平均偏差，在膠原蛋白誘導(dǎo)的RA小鼠中 評估，該小鼠靜脈內(nèi)接受οΑΤΡ(100μ1 3mM)或?qū)φ盏腜BS 12天，用藥方案為治療5天，中 斷2天，再治療5天，從第0天開始(參見實(shí)施例15)。圖20 通過oATP治療降低膠原特異的抗體在膠原蛋白誘導(dǎo)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型中，對源于oATP治療和對照小鼠的樣品進(jìn) 行二型膠原蛋白ELISA (參見實(shí)施例15)。圖21 用crt+和crtv+胎兒肝臟祖細(xì)胞重建重組酶缺陷的小鼠測定源于Crt"_和Crt"_雜交的E13胚胎的基因型，選擇crt+和crt+A胚胎，并 將肝臟的造血祖細(xì)胞注射到重建重組酶缺陷的小鼠中(參見，例如，Porcellini et al., J. Exp. Med. 203 461-471 (2006)(參見實(shí)施例 16)。圖22 鈣網(wǎng)蛋白缺陷的胎兒肝臟嵌合體小鼠的移植物抗宿主病類表型轉(zhuǎn)移造血祖細(xì)胞后第12周crtv+胎兒肝臟嵌合體(FLC)的表型和第8、10、12周 產(chǎn)生的crt+FLC的表型。crt+FLC中發(fā)現(xiàn)脫發(fā)、瞼炎、姿勢蜷縮和衰竭綜合征的逐漸惡化 (參見實(shí)施例16)。圖23 在crt-缺陷的胎兒肝臟嵌合體中具有病灶浸潤的表面真皮中有表皮增生 和豐富的粒細(xì)胞皮膚的蘇木精-伊紅染色顯示在crt+FLC中有嚴(yán)重的真皮粒細(xì)胞炎性滲透，和 crt+AFLC相反，其中炎癥細(xì)胞幾乎是缺失的。(左圖標(biāo)尺=50μπι，右圖標(biāo)尺=10 μ m)(參 見實(shí)施例16)。圖24 注射oATP改善crt+小鼠的瞼炎crt+FLC治療前和用PBS或6mM oATP (IOOyL)每天靜脈內(nèi)治療兩周后的表型(參
14見實(shí)施例16)。圖25 在crt+胎兒肝臟嵌合體中注射oATP兩周，瞼炎的組織學(xué)改善以盲試法進(jìn)行皮膚活體組織檢查的組織病理學(xué)評估。該圖表顯示為選擇的用oATP 治療的有顯著結(jié)果的例示(參見實(shí)施例16)。發(fā)明詳述定義和一般技術(shù)本發(fā)明總體涉及調(diào)節(jié)至少一種T細(xì)胞活性的方法，具有用于相關(guān)各種治療的多種 治療應(yīng)用，例如用于免疫耐受、自身免疫、免疫抑制、和免疫治療。除非本文另有定義，使用的與本發(fā)明相關(guān)的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語是本領(lǐng)域內(nèi)那些技術(shù) 人員普遍理解的含義。此外，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語將包括復(fù)數(shù)含義，并且復(fù)述術(shù) 語將包括單數(shù)含義。通常所用術(shù)語和技術(shù)涉及本文報(bào)道的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免 疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)和雜交，這些術(shù)語在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知并且普 遍使用。本文一般使用的術(shù)語“T細(xì)胞”或“T淋巴細(xì)胞”可以指，例如，輔助性T細(xì)胞(如 Thl、Th2細(xì)胞、Tti9和Thl7細(xì)胞)、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞、調(diào)節(jié)/抑制性T細(xì)胞(Treg 細(xì)胞)、自然殺傷T細(xì)胞、γ δΤ細(xì)胞、和/或自身攻擊T細(xì)胞(例如，ΤΗ40細(xì)胞)，除非上下 文另有指示。在某些實(shí)施方式中，所述術(shù)語“Τ細(xì)胞”具體是指輔助性T細(xì)胞。在某些實(shí)施 方式中，所述術(shù)語“Τ細(xì)胞”更具體是指Thl7細(xì)胞(如分泌IL-17的T細(xì)胞)。在某些實(shí)施 方式中，所述術(shù)語“T細(xì)胞”是指Treg細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“Treg細(xì)胞”指CD4+ CD25+ FoXp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(如CD25+亮T 細(xì)胞)。在本發(fā)明的方法中也預(yù)期使用具有調(diào)控能力的其它T細(xì)胞(如Trl細(xì)胞和Th3細(xì) 胞)。本文使用的“T細(xì)胞活性”指一個(gè)或多個(gè)免疫學(xué)進(jìn)程，比如T細(xì)胞活化、增殖、分化 和存活，以及相關(guān)的免疫效應(yīng)功能，包括溶解細(xì)胞活性(Tc細(xì)胞)和細(xì)胞因子生成(Th細(xì) 胞)。在一實(shí)施方式中，本文公開的組合物和方法能用于降低輔助性T細(xì)胞(Th)反應(yīng)，例 如Thl7細(xì)胞反應(yīng)。在另一實(shí)施方式中，本文公開的組合物和方法能用于降低細(xì)胞毒性T 細(xì)胞(Tc)反應(yīng)。在另一實(shí)施方式中，本文公開的組合物和方法能用于誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T(Treg) 細(xì)胞的分化、擴(kuò)展、和/或免疫抑制活性。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，至少一種T細(xì)胞 活性被降低至少 30 %、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 % 或 100 %。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，至少一種Treg細(xì)胞活性增加了至少5 %、10 %、15 %、 20 % ,30 % ,40 % ,50 % ,60 % ,70 % ,80 % ,90 % UOO % ,200 % ,300 % ,400 % ,500 % ,600 %, 700%、800%、900%或1000%。Foxp3作為一個(gè)Treg抑制功能的定量調(diào)節(jié)劑，而不是一個(gè) 簡單的分子開關(guān)，它能以劑量依賴的方式抑制反應(yīng)細(xì)胞的效應(yīng)子作用(Allan et al. Eur. J. Immunol. 38 =3282-3289 (2008)) 0用于檢測和/或監(jiān)視上述活性的試驗(yàn)有很多并且在本 領(lǐng)域內(nèi)眾所周知，例如，用于免疫細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子釋放、細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)、細(xì)胞毒性 等的試驗(yàn)。所述術(shù)語“ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化”指ATP結(jié)合T細(xì)胞上的P2受體，引起T細(xì)胞 活化和/或擴(kuò)展。例如，如果使用特異性阻斷ATP結(jié)合T細(xì)胞上P2受體的制劑(如，oATP)， T細(xì)胞活化和/或擴(kuò)展被阻斷至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97 %、98 %、99 %或100 %，則T細(xì)胞活化是ATP-介導(dǎo)的。ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化可以被檢 測，例如，通過分析ATP-刺激的T細(xì)胞群的MAPK活化、ERK磷酸化和/或IL-2表達(dá)(例如， 參見實(shí)施例3和4)。在某些實(shí)施方式中，經(jīng)過抑制ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑處理的T 細(xì)胞群中，MAPK活化、ERK磷酸化和/或IL-2表達(dá)降低10% ,20% ,30% ,40% ,50% ,60%, 70 %、80 %、90 %或100 %。ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化也可以被檢測，例如，通過監(jiān)視ATP-介 導(dǎo)的離子通道的打開，例如，通過電生理學(xué)試驗(yàn)來測量鉀流出T細(xì)胞和鈉或鈣流入T細(xì)胞。 在一實(shí)施方式中，ATP釋放于出于活化過程中的T細(xì)胞，并且引起P2受體的自分泌和/或 旁分泌活化。所述術(shù)語“ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化”被理解為包括ATP結(jié)合T細(xì)胞上的P2X受體， 引起T細(xì)胞活化和/或擴(kuò)展。這可以被稱為“ATP通過P2X受體介導(dǎo)的T細(xì)胞活化”。所述術(shù) 語“ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化”被理解為包括ATP結(jié)合T細(xì)胞上的P2X7受體(S卩，“ATP通過 T細(xì)胞上的P2X7受體介導(dǎo)的T細(xì)胞活化。例如，如果使用特異性阻斷ATP結(jié)合T細(xì)胞上P2X 受體的制劑(如，oATP), T細(xì)胞活化和/或擴(kuò)展被阻斷至少30%、40%、50%、60%、70%、 80 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 % 或 100 %，則通過 P2X 受體的 T 細(xì)胞活化是 ATP-介 導(dǎo)的。通過P2X受體ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化可以被檢測，例如，通過分析ATP-刺激的T細(xì) 胞群的MAPK活化、ERK磷酸化和/或IL-2表達(dá)(例如，參見實(shí)施例3和4)。在某些實(shí)施 方式中，經(jīng)過抑制通過P2X受體ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑處理的T細(xì)胞群中，MAPK活 化、ERK磷酸化和 / 或 IL-2 表達(dá)降低 10%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100%。通過P2X受體ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化也可以被檢測，例如，通過監(jiān)視ATP-介導(dǎo)的 離子通道的打開，例如，通過電生理學(xué)試驗(yàn)來測量鉀流出T細(xì)胞和鈉或鈣流入T細(xì)胞。如技 術(shù)人員所理解，類似的試驗(yàn)可用于監(jiān)視其它P2受體亞型的活化，例如P2Y受體。在一實(shí)施 方式中，ATP釋放于處于活化過程中的T細(xì)胞，并且引起P2X受體的自分泌和/或旁分泌活 化。所述術(shù)語“T細(xì)胞無反應(yīng)性”指T細(xì)胞活性降低的狀態(tài)，例如，T細(xì)胞接觸抗原無活 性的狀態(tài)。τ細(xì)胞無反應(yīng)性可能源于，例如，缺乏共刺激信號(hào)和伴隨的IL-2產(chǎn)物不足、T細(xì) 胞增殖阻礙。本文使用的關(guān)于T細(xì)胞的所述術(shù)語“分化”指較少特化細(xì)胞類型變成更多特化細(xì) 胞類型的進(jìn)程。本文使用的關(guān)于T細(xì)胞的所述術(shù)語“擴(kuò)展”指細(xì)胞數(shù)量的增加。本文使用的所述術(shù)語“抑制”或“ 的抑制”意為降低可測量的量。抑制可以是部 分或完全的。本文使用的所述術(shù)語“誘導(dǎo)”或“ 的誘導(dǎo)”意為增加可測量的量。本領(lǐng)域內(nèi)那些技術(shù)人員理解的所述術(shù)語“免疫疾病”包括任何有免疫成分與之相 關(guān)的疾病，和/或特征為免疫或自身免疫應(yīng)答的任何疾病。本領(lǐng)域內(nèi)那些技術(shù)人員理解的 所述術(shù)語“適應(yīng)性免疫疾病”包括任何有適應(yīng)性免疫系統(tǒng)成分與之相關(guān)的疾病。本領(lǐng)域內(nèi)那些技術(shù)人員理解的所述術(shù)語“炎癥”包括任何以局部或全身保護(hù)性反 應(yīng)為特征的疾病，這些反應(yīng)可能由身體創(chuàng)傷、感染、慢性疾病(比如上文所提到的)和/或 對外在刺激的化學(xué)和/或物理反應(yīng)(例如，部分過敏反應(yīng))引起。任何這些反應(yīng)，可作用為 破壞、稀釋或隔離有害的制劑和組織損傷，可以顯示為，例如熱、腫脹、疼痛、紅腫、血管擴(kuò)張
16和/或血流量增加、白細(xì)胞侵入受影響區(qū)域、喪失功能和/或任何已知的和炎性疾病相關(guān)的 其他癥狀。因而所述術(shù)語“炎癥”也被理解為包括任何炎性疾病、紊亂或疾病本身、任何炎性 成分與之相關(guān)的疾病、和/或任何以炎癥為癥狀特征的疾病，尤其包括急性、慢性、潰瘍性、 特異性、過敏性和壞死性炎癥、和已知的其他炎癥形式。因此，根據(jù)本發(fā)明的目的，該術(shù)語還 包括炎性痛和/或發(fā)炎引起的發(fā)燒。所述術(shù)語“P2受體”指一種細(xì)胞外核苷酸的受體，包括，例如P2X和P2Y受體。所 述術(shù)語“P2X受體”指一個(gè)存在于多種細(xì)胞類型上的ATP-門控的陽離子通道。P2X 1-7受 體都結(jié)合ATP并且無選擇性打開，通常使離子通道迅速脫敏。例如，所述P2X 7受體主要存 在于涉及炎癥/免疫進(jìn)程的細(xì)胞類型；特別是巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞(T和B)。P2X 7受體通過細(xì)胞外核苷酸(特別是三磷酸腺苷(ATP))活化，在其它事件中，已知該活化引起 白介素(IL-Ιβ)的成熟和釋放。本文使用的所述術(shù)語“Ρ2Χ受體拮抗劑”是一個(gè)化合物或其他物質(zhì)，能夠阻礙，無 論完全還是部分，Ρ2Χ受體(Ρ2Χ1 7)的活化，用任何合適的試驗(yàn)測量，比如那些下文報(bào)道 和參考的試驗(yàn)。例如，一個(gè)Ρ2Χ受體拮抗劑可以是和ATP競爭結(jié)合Ρ2Χ受體的制劑，例如 οΑΤΡ。例如，一個(gè)Ρ2Χ 7受體拮抗劑可以是和ATP競爭結(jié)合Ρ2Χ7受體的制劑。例如，一個(gè) T細(xì)胞Ρ2Χ7受體拮抗劑可以是和ATP競爭結(jié)合T細(xì)胞上Ρ2Χ7受體的制劑。檢驗(yàn)Ρ2Χ受體拮抗作用的方法為本領(lǐng)域內(nèi)所知。例如，美國專利No. 6，720，452報(bào) 道了一個(gè)基于觀測的試驗(yàn)，當(dāng)Ρ2Χ7受體活化時(shí)，在溴化乙錠(一個(gè)DNA熒光探針)存在下 使用受體激動(dòng)劑，觀測到細(xì)胞內(nèi)DNA-結(jié)合的溴化乙錠的熒光增強(qiáng)。因此，熒光增強(qiáng)可用作 Ρ2Χ7受體活化的尺度，并且因此定量化合物或物質(zhì)對Ρ2Χ7受體的抑制效應(yīng)。Ρ2Χ7受體拮抗劑的實(shí)施例包括但不限于，美國專利No. 6，492，355 ；6, 720，452 ； 6，881，754和7，129，246報(bào)道的化合物，全部內(nèi)容通過引用并入本文。本文使用的所述術(shù)語“parmexin”指形成和無脊椎動(dòng)物irmexin蛋白家族同源的 蛋白的hemichannel。已知在紅細(xì)胞和味覺感受器細(xì)胞中Pannexin hemichannels允許ATP 通過，并在巨噬細(xì)胞中決定ILl-β的分泌。除非明確指示，“parmexin”或者指parmexin-1 或者指pannexin-2。在某些實(shí)施方式中，所述術(shù)語“pannexin”指pannexin-Ι。本文使用的所述術(shù)語“οΑΤΡ”指氧化的ATP，其可能源于在核糖2、3位羥基氧化 生成二醛的ATP。該氧化物可用高碘酸鹽生成，報(bào)道于P. N. Lowe et al. , "Preparation and chemical properties of periodate-oxidized adenosine triphosphate and some related compounds，，，Biochemical Society Transactions 7:1131-1133(1979)。 oATP 被認(rèn)為用作 P2z/P2X7 嘌呤受體拮抗劑(Ferrari et al.，J Exp Med 185 (3) 579-582(1997))。本文使用的所述術(shù)語“pannexin抑制劑”指抑制Pannexin hemi channels功 能的制劑。例如，parmexin抑制劑可以是小分子、抗體、肽、或任何其他干擾Parmexin hemicharmels功能的物質(zhì)。在一實(shí)施方式中，所述parmexin抑制劑是肽。在一優(yōu)選的實(shí)施 方式中，所述pannexin抑制劑是PXlO肽，或者是至少60 %、70 %、80 %、90 %、95 %、96 %、 97%、98%或99%等同于PXlO肽的肽，PXlO肽的序列是WRQAAFVDSY(SEQ ID N0:1)，其中 在某些實(shí)施方式中，N-端和C-端是游離的且無修飾。
本文使用的20種常規(guī)氨基酸和它們的縮寫遵循慣例。參見Immimology-A Synthesis(2nd Edition, Ε. S. Golub and D. R. Gren, Eds. , Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))，通過引用并入本文。20種常規(guī)氨基酸的立體異構(gòu)體(例如， D-氨基酸)、非天然的氨基酸，比如α，α - 二取代氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其它非常 規(guī)氨基酸也可是本發(fā)明的肽的合適成分。非常規(guī)氨基酸的實(shí)施例包括4-羥脯氨酸、Y -羧 基谷氨酸、ε "N, N, N-三甲基賴氨酸、ε -N-乙酰賴氨酸、0_磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、 N-甲酰蛋氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥賴氨酸、σ -N-甲基精氨酸和其他類似的氨基酸及亞氨 基酸(如4-羥脯氨酸)。本文使用的肽符號(hào)，左邊方向是氨基端方向，右邊方向是羧基端方 向，符合標(biāo)準(zhǔn)的使用和慣例。應(yīng)用于肽的術(shù)語“實(shí)質(zhì)等同”意為當(dāng)最優(yōu)比對時(shí)，比如使用具有默認(rèn)空位權(quán)重的程 序GAP或BESTFIT，兩個(gè)肽序列共享至少80%的序列同一性，優(yōu)選至少90%的序列同一性， 更優(yōu)選至少95 %的序列同一性，最好優(yōu)選至少99 %的序列同一性。不相同的殘基位置優(yōu)選 氨基酸保守性置換。氨基酸保守性置換指具有相似側(cè)鏈殘基的互換性。例如，一組具有脂肪 族側(cè)鏈的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；一組具有脂肪族羥基側(cè)鏈的 氨基酸是絲氨酸和蘇氨酸；一組具有包含氨基側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一組 具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；一組具有堿基側(cè)鏈的氨基酸是賴氨 酸、精氨酸和組氨酸；一組具有含硫側(cè)鏈的氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。優(yōu)選的氨基酸保守 性置換組是纈氨酸_亮氨酸_異亮氨酸、苯丙氨酸_酪氨酸、賴氨酸_精氨酸、丙氨酸_纈 氨酸、谷氨酸-天門冬氨酸和天冬酰胺_谷氨酰胺。如本文所述，肽氨基酸序列的小變異被預(yù)期包含在本發(fā)明中，只要氨基酸序列的 變異維持至少75 %，更優(yōu)選至少80 %、90 %或95 %，最優(yōu)選96 %、97 %、98 %或99 %的無變 異序列。保守性氨基酸的置換也具體被考慮。保守性置換是那些具有相關(guān)側(cè)鏈的氨基酸 家族內(nèi)發(fā)生的置換。遺傳上編碼的氨基酸通常分為幾個(gè)家族(1)酸性=天門冬氨酸、谷氨 酸；(2)堿性=賴氨酸、精氨酸、組氨酸(3)非極性=丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯 氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸(4)不帶電荷的極性=甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱 氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。更優(yōu)選的家族是絲氨酸和蘇氨酸的脂肪族羥基家族；天門 冬酰胺和谷氨酰胺含氨基的家族；丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的脂肪族家族；苯丙 氨酸、色氨酸、酪氨酸的芳香族家族。例如，對于單獨(dú)的亮氨酸和異亮氨酸或纈氨酸、谷氨酸 和天門冬氨酸、蘇氨酸和絲氨酸的置換，或類似的具有相關(guān)氨基酸結(jié)構(gòu)的氨基酸置換，有理 由預(yù)期這些置換不會(huì)對結(jié)果分子的結(jié)合或性能有重要影響，尤其在如果所述置換不涉及框 架位點(diǎn)內(nèi)的氨基酸時(shí)。一個(gè)氨基酸的改變是否會(huì)產(chǎn)生功能肽可以容易地通過檢測所述肽衍 生物的特異活性(例如，抑制至少一種T細(xì)胞活性)來測定。優(yōu)選的氨基酸置換是這些(1)降低蛋白酶解的敏感性，(2)降低氧化的敏感性， (3)改變形成蛋白復(fù)合體的結(jié)合能力，(4)改變結(jié)合親和力，和(5)給予或修改這些類似物 的其它理化或功能屬性。類似物包括各種突變蛋白序列，而不僅是天然存在的肽序列。例 如，天然存在的肽序列(優(yōu)選在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域之外的肽部分)上可能發(fā)生單 個(gè)或多個(gè)氨基酸置換(優(yōu)選氨基酸保守性置換)。一個(gè)氨基酸保守性置換不應(yīng)該實(shí)質(zhì)改 變親代序列的結(jié)構(gòu)特征(例如，一個(gè)取代的氨基酸不應(yīng)易于打破親代序列中的螺旋，或者 破壞親代序列的其他二級結(jié)構(gòu)特征的類型。人工_識(shí)別的肽二級和三級結(jié)構(gòu)的實(shí)施例報(bào)
18道于 Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed. , W. H. Freeman and Company, New York(1984)) ；Introduction to Protein Structure(C. Branden and J. Tooze, eds. , Garland Publishing, New York, N. Y. (1991))；禾口 Thornton et at. Nature 354 105 (1991)，每個(gè)都通過引用并入本文。在制藥業(yè)中肽類似物通常用作具有類似于那些模版肽的屬性的非肽藥物。這些類 型的非肽化合物稱為“肽模擬物”或“類肽物”。Fauchere, J Adv Drug Res 15:29(1986)； Veber and Freidinger，TINS p.392(1985)；和Evans et al.，J Med Chem 30 1229 (1987), 通過引用并入本文。這些化合物通常用計(jì)算機(jī)化的分子模型輔助研發(fā)。結(jié)構(gòu)類似于有用 治療肽的肽模擬物可用于產(chǎn)生相同的治療或預(yù)防效應(yīng)。類肽物通常結(jié)構(gòu)類似于范例肽(例 如，具有生物化學(xué)性質(zhì)或藥理學(xué)活性的肽)，比如人類抗體，但有一個(gè)或多個(gè)肽鍵被這些連 接選擇性取代，這些連接選自一CH2NH—、-CH2S-, -CH2-CH2-, -CH = CH—(順式和反 式)、--C0CH2--、一CH(OH)CH2-和--CH2SO--,所用方法在本領(lǐng)內(nèi)眾所周知。用相同類型的 D-氨基酸對共有序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸系統(tǒng)性置換(例如，D-賴氨酸取代L-賴氨酸) 可用于生成更穩(wěn)定的肽。此外，含有一個(gè)共有序列或?qū)嵸|(zhì)等同的共有序列變異體的約束肽 可用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法生成(Rizo and Gierasch, Ann Rev Biochem 61 :387(1992)，通 過引用并入本文)；例如，通過添加能形成使肽環(huán)化的分子內(nèi)二硫鍵的半胱氨酸殘基。本文使用的所述術(shù)語“受試者”指治療處理的受體，包括所有動(dòng)物。在一例示實(shí)施 方式中，所述受試者是人。本文使用的所述術(shù)語“治療”(“treat”、“treating”和“treatment”)通常指降 低、減輕或改善病癥或疾病，或其中至少一種臨床癥狀。當(dāng)在這些癥狀或病癥是可測量的之 前施用，治療可被認(rèn)為是“預(yù)防”。本文提及的所述術(shù)語“制劑”指分子、化合物或組合物。在某些實(shí)施方式中，“制劑” 可含有細(xì)胞，如Treg細(xì)胞。本文提及的所述術(shù)語“治療性制劑”指遞送治療效應(yīng)的分子、化合物或組合物。所述術(shù)語“有效量”指治療性制劑在對患者單獨(dú)施用或和其他治療性制劑聯(lián)用時(shí) 起到治療效應(yīng)的劑量。所述效應(yīng)可以是客觀的(即，通過一些試驗(yàn)或標(biāo)記物測量)或者是 主觀的(即，主觀給出的對效應(yīng)的指示或感覺)。所述術(shù)語“調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的制劑”指(例如)ATP_介導(dǎo)的T細(xì)胞活 化的抑制劑和至少一種Treg細(xì)胞活性(例如，T細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展及T細(xì)胞免疫抑制活 性)的調(diào)節(jié)劑。在某些實(shí)施方式中，“調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的制劑”是含有具有T細(xì) 胞免疫抑制活性的Treg細(xì)胞的組合物。ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制本發(fā)明提供方法通過使用ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制劑抑制至少一種輔助性T 細(xì)胞活性，例如，T細(xì)胞活化、增殖和/或效應(yīng)功能。在一實(shí)施方式中，這些抑制劑包含是P2X 受體拮抗劑的制劑，例如，T細(xì)胞P2X7受體拮抗劑。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抑制劑是 oATP。在另一實(shí)施方式中，這些抑制劑包含抑制pannexin hemichannel通透性的制劑。在 另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抑制劑是PXlO肽(包括其類似物或化學(xué)修飾衍生物)或生胃 酮。在一例示實(shí)施方式中，所述本發(fā)明的方法在體內(nèi)進(jìn)行。在一實(shí)施方式中，提供治療以ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化為特征的免疫疾病的方法。在一實(shí)施方式中，這些方法包含對哺乳動(dòng)物受試者施用至少一種本文所公開的ATP介導(dǎo)的 T細(xì)胞活化的抑制劑，或者單獨(dú)施用或者和另一個(gè)免疫治療或免疫抑制方案聯(lián)用。在一優(yōu) 選的實(shí)施方式中，給受試者施用至少一種ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制劑，其中所述抑制劑 能干擾ATP和P2受體(如P2X受體，如T細(xì)胞P2X7受體)的相互作用，并抑制ATP信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)。在一例示實(shí)施方式中，所述ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制劑是oATP。Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展的誘導(dǎo)本發(fā)明提供用于治療受益于Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展的治療免疫疾病的方法。在 一實(shí)施方式中，這些方法包含對哺乳動(dòng)物受試者施用Treg細(xì)胞，這些Treg細(xì)胞通過接觸至 少一種本文所公開的制劑而已分化和/或擴(kuò)展，或者單獨(dú)使用或者和另一個(gè)免疫治療或免 疫抑制方案聯(lián)用。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述Treg細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明的方法在體外分化和 /或擴(kuò)展，并隨后施用給受試者。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展的制劑是包含oATP 的組合物。所述組合物也優(yōu)選包含(I)T細(xì)胞初次刺激物；和(2)細(xì)胞成分及可溶性介質(zhì)。在某些實(shí)施方式中，所述T細(xì)胞初次刺激物是結(jié)合T細(xì)胞受體(TCR)的配體(例 如，CD3或抗-CD3)，并且起始初刺激信號(hào)。T細(xì)胞初次刺激物包括其他天然和合成的配體。 一個(gè)天然的配體可包括具有或沒有遞呈肽的MHC。其他配體可包括但不限于肽、多肽、生 長因子、細(xì)胞因子、趨化因子、糖肽、可溶性受體、類固醇、激素、如PHA的促細(xì)胞分裂劑、其 他超抗原、肽-MHC復(fù)合體和可溶性MHC復(fù)合體。在其他實(shí)施方式中，所述T細(xì)胞刺激物通過 另一個(gè)機(jī)制起作用。這些刺激物包括，例如蛋白激酶C激活劑，比如佛波酯(例如，佛波酯 乙酸鹽)、和親離子鈣(例如，離子霉素，其能升高細(xì)胞溶質(zhì)鈣濃度)。這些制劑的繞過TCR/ CD3復(fù)合體但能遞送刺激信號(hào)給T細(xì)胞。在某些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞成分或可溶性介質(zhì)包含一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞產(chǎn)物，這些 產(chǎn)物選自，例如抗原遞呈細(xì)胞(例如，自體、同系、同種異體、異種照射的脾細(xì)胞)、移動(dòng)的細(xì) 胞產(chǎn)物，包括但不限于白細(xì)胞去除術(shù)的細(xì)胞產(chǎn)物和/或骨髓細(xì)胞產(chǎn)物，比如，例如，髂嵴細(xì) 胞產(chǎn)物和/或椎體，以及其他淋巴組織來源(比如淋巴結(jié)和脾)的細(xì)胞產(chǎn)物。在其他實(shí)施方 式中，所述細(xì)胞成分或可溶性介質(zhì)包含一個(gè)或多個(gè)可溶性制劑，這些制劑選自視黃酸(參 見，例如，Hill et al.，Immunity 29 :758_770 (2008))、雷帕霉素、DNA 甲基化抑制劑(例 如，5-氮胞苷；參見，例如，Kim and Leonard, J. Exp. Med. 204(7) :1543_1551 (2007))、細(xì)胞 因子(例如，TGF-β和白介素(IL)-2)、組蛋白脫乙酰酶抑制劑HDAC)(比如，曲古抑菌素 A(Taoet al. ,Nature Medicine 13 1299 (2007)))禾Π α 1_抗胰蛋白酶(Lewis et al，PNAS 105 16236 (2008))。所述組合物也可包含其他制劑，包括但不限于⑶80、4_1BB、⑶52激動(dòng)劑、⑶28抗 體、淋巴細(xì)胞功能相關(guān)的抗原 _3 (LFA-3)、CD2、CD40、CD80/B7-1、CD86/B7-2、0X_2、CD70 和 CD82。在一例示實(shí)施方式中，所述組合物包含oATP、抗-⑶3抗體、同基因受照射的脾細(xì) 胞。所述組合物還可包含IL-2。在一實(shí)施方式中，所述組合物比包含oATP、抗-⑶3抗體、抗-⑶28抗體的組合物更 有效地誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展。分化和/或擴(kuò)展的T細(xì)胞獲得于，例如，哺乳動(dòng)物來源，比如人、狗、貓、小鼠、大鼠
20或它們的轉(zhuǎn)基因品種。T細(xì)胞，例如幼稚的T細(xì)胞或Treg細(xì)胞，能分離自，例如，外周血單核 細(xì)胞、骨髓、淋巴結(jié)組織、臍血、胸腺組織、感染部位組織、脾組織、腫瘤或T細(xì)胞系。能分化為Treg細(xì)胞的細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞祖細(xì)胞，比如幼稚的T細(xì)胞，例如，幼 稚的CD4+T細(xì)胞。本發(fā)明也預(yù)期使用本發(fā)明的制劑和方法來逆轉(zhuǎn)其他T細(xì)胞類型(例如， Thl7細(xì)胞)為Treg細(xì)胞系。因此提供使用本發(fā)明的制劑逆轉(zhuǎn)病原性T細(xì)胞表型為保護(hù)性 T細(xì)胞表型的方法。本發(fā)明也提供使用本發(fā)明的制劑維持Treg細(xì)胞表型的方法，例如，通過 抑制Treg細(xì)胞向非Treg細(xì)胞類型(例如，諸如Thl7細(xì)胞的病原性T細(xì)胞類型)的轉(zhuǎn)變。從上述來源獲取T細(xì)胞的方法在本領(lǐng)內(nèi)是已知的。例如，T細(xì)胞能通過FIC0LL 分離從血中提取獲得?；蛘?，T細(xì)胞能通過血漿分離置換術(shù)或白細(xì)胞去除術(shù)從循環(huán)的血液 中獲得。特化的τ細(xì)胞亞群(例如幼稚的CD4+細(xì)胞和/或Treg細(xì)胞)的富集和/或分離 可用本領(lǐng)域內(nèi)已知的陽性和陰性選擇技術(shù)進(jìn)行，這些技術(shù)包括但不限于熒光激活的細(xì)胞 分選(流式細(xì)胞儀)、使用抗體覆蓋的磁珠的磁性分離、親和層析、細(xì)胞毒性制劑連接到單 克隆抗體或和單克隆抗體聯(lián)用，例如補(bǔ)充和細(xì)胞毒素，具有附著于固體基質(zhì)的抗體的“淘 洗”(例如平板)，或其他傳統(tǒng)技術(shù)。陽性選擇可以和針對于包含非期望的T細(xì)胞類型特異 的表面標(biāo)記物的T細(xì)胞的陰性選擇聯(lián)用。在一些實(shí)施方式中，幼稚的⑶4+細(xì)胞被純化，用于隨后向Treg細(xì)胞分化。例如， 幼稚的⑶4+細(xì)胞能用陰性選擇以去除⑶8+T細(xì)胞和效應(yīng)子記憶T細(xì)胞(⑶54R0)、B細(xì)胞 (CD19)、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和中性粒細(xì)胞而分離出來。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，源于上 述選擇技術(shù)的組合物的細(xì)胞中至少有55%、65%、75%、85%、90%、95%、98%或100%的 細(xì)胞是幼稚的CD4+細(xì)胞。Treg細(xì)胞含有是⑶4+CD25+的細(xì)胞，并且也特征表達(dá)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞抗原 (CTLA) _4、糖皮質(zhì)激素-誘導(dǎo)的TNF受體(GITR)和叉頭/翼-螺旋轉(zhuǎn)錄因子Foxp3。能使 用本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法，根據(jù)⑶25、GITR、CTLA-4和Foxp3的表達(dá)將Treg細(xì)胞從混合的細(xì) 胞群(例如，從包含外周血單核細(xì)胞群，或從包含分化的Treg細(xì)胞和幼稚的⑶4+細(xì)胞群) 中分離出來。在一些實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞將通過去除表達(dá)CD127 (其在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 中下調(diào))的細(xì)胞而從其他細(xì)胞中分離出來。在一實(shí)施方式中，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可被從死 細(xì)胞中挑選出來，通過使用和死細(xì)胞特異相關(guān)的染料(例如，碘化丙錠、單跌氮化乙錠)。在 其他實(shí)施方式中，所述調(diào)節(jié)性T細(xì)胞用本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他方法獲得，例如，美國專利公開 No. 20060063256, 20060233751, 20060240024 和 20080279834 報(bào)道的方法，都通過引用整體 并入本文。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，源于上述選擇和分離技術(shù)的組合物的細(xì)胞中至少有55 %、 65%,75%,85%,90%,95%,98%^； 100%的細(xì)胞是調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，⑶4+⑶25+ Foxp3+ Treg細(xì)胞用兩步法直接分離自外周血樣 本。第一步涉及使用RosetteSi5P 技術(shù)非期望的細(xì)胞的陰性選擇來富集⑶4+T細(xì)胞，其中 在樣本中紅細(xì)胞和非期望的細(xì)胞交聯(lián)。然后交聯(lián)的細(xì)胞通過中等密度離心形成顆粒并丟 棄。第二步涉及從所述富集的⑶4+T細(xì)胞群中通過無柱(column-free)免疫磁性選擇進(jìn)行 CD25+S細(xì)胞的陽性選擇。該步驟可以是自動(dòng)化的，例如使用RoboS印t ,—個(gè)具有準(zhǔn)確走離 (walk-away)能力的移液機(jī)器人。該兩步處理法顯著縮短從全血中獲得高純度的Treg樣本 所需要的時(shí)間。該方法詳細(xì)報(bào)道于美國專利No. 7，135，335，通過引用整體并入本文。本領(lǐng) 域內(nèi)已知的任何能分離高純度的Treg細(xì)胞群的許多其他方法可根據(jù)本發(fā)明使用。
在一實(shí)施方式中，使用具有高劑量IL-2和雷帕霉素的CD3/CD28擴(kuò)展磁珠來擴(kuò)展 Treg細(xì)胞。該擴(kuò)展方案詳細(xì)報(bào)道于(例如)美國專利公開No. 20050196386，通過引用整體 并入本文。本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何擴(kuò)展Treg細(xì)胞的許多其他方法可根據(jù)本發(fā)明使用。Treg細(xì)胞的刺激和擴(kuò)展能在任何細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中完成，例如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)袋，或 任何容納細(xì)胞的容器(如，生物反應(yīng)器)，優(yōu)選在無菌環(huán)境中。誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化和/或 擴(kuò)展的制劑的一個(gè)或多個(gè)成分可以是溶解形式或固定在固體支持物(比如磁珠(例如， 順磁性磁珠))、或組織培養(yǎng)皿上。所述固相表面可以是塑料、玻璃、或任何其他合適的物 質(zhì)。所述刺激和擴(kuò)展能在細(xì)胞培養(yǎng)的一個(gè)或多個(gè)階段發(fā)生(參見，例如，美國專利公開 No. 20060286067)。所述Treg細(xì)胞優(yōu)選擴(kuò)展至少2倍，更優(yōu)選擴(kuò)展至少10、50、100、200、300、 500、800、或 1000 倍。一旦分離、分化和/或擴(kuò)展，Treg細(xì)胞可被特征描述，基于Foxp3的表達(dá)及TGF- β 產(chǎn)物，并且不能生成IL-2、IL-10、IL-4、IL-5和IFN- γ。所述分離的Treg細(xì)胞的抑制活 性可以被檢測，例如通過和應(yīng)答性T細(xì)胞共培養(yǎng)。本發(fā)明也直接使用所述擴(kuò)展的細(xì)胞，例如 在給受試者施用之前，通過細(xì)胞因子刺激或通過添加目的基因，比如治療性基因或基因敲 除。例如，Treg細(xì)胞可作為“特洛伊木馬”來遞送抑制性或其他生物因子到炎癥位點(diǎn)，例如 IL-4、干細(xì)胞生長因子、血管生成調(diào)節(jié)劑，遺傳缺陷物等，此外，已顯示的Foxp3過表達(dá)能使 病原性T細(xì)胞逆轉(zhuǎn)為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，并且能將編碼抗原特異的TCRFoXp3+的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)多 克隆擴(kuò)展的T細(xì)胞，以很高的數(shù)量生成蛋白抗原特異的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。這些抗原-特異的 方法降低了高初始細(xì)胞數(shù)目的需求，而使調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性和功能最大化。調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴件免疫應(yīng)答的方法本發(fā)明總體涉及調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的方法和組合物。對免疫耐受、自身免疫、免疫抑 制、免疫治療有多種治療性應(yīng)用。本發(fā)明具體提供方法(1)抑制至少一種T細(xì)胞活性，包括 用抑制ATP-介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑接觸T細(xì)胞的步驟；和(2)調(diào)節(jié)至少一種Treg細(xì)胞 活性，例如Treg細(xì)胞分化、擴(kuò)展和/或免疫抑制活性，包含用調(diào)節(jié)至少一種Treg細(xì)胞活性 的制劑接觸Treg細(xì)胞的步驟。在某些實(shí)施方式中，方法(1)在體內(nèi)進(jìn)行；方法(2)在體外 進(jìn)行，并且隨后在體內(nèi)施用具有調(diào)節(jié)活性的Treg細(xì)胞(例如，分化和/或擴(kuò)展的Treg細(xì)胞， 或具有增強(qiáng)的免疫抑制活性的Treg細(xì)胞)。作為本文首次公開，活化過程中T細(xì)胞釋放的ATP引起具有MAPK活性的P2X受體 的自分泌活化。這是一個(gè)用于產(chǎn)生T細(xì)胞活化和擴(kuò)展的必要的共刺激因子。同樣作為本文首次公開，parmexin在T細(xì)胞上表達(dá)并作為T細(xì)胞活性的正調(diào)價(jià)劑， 其中ATP介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)引起parmexin hemichannel形成，導(dǎo)致T細(xì)胞活化。因此，ATP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)責(zé)促進(jìn)T細(xì)胞反應(yīng)，比如細(xì)胞周期進(jìn)程、分化、存活、細(xì)胞因 子生成和細(xì)胞溶解激活。這些發(fā)現(xiàn)確保使用能干擾ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑(例如 P2X受體拮抗劑或阻礙parmexin hemi channel形成的制劑，或阻礙和ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活 化相關(guān)通道的制劑)，來調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性(例如輔助性T細(xì)胞活性)，旨在治療(連同其他 疾病)、自身免疫病和移植相關(guān)的免疫應(yīng)答。作為本文首次公開，所述Thl7細(xì)胞(分泌IL-17的T細(xì)胞)的分化受制于oATP。 現(xiàn)在該T細(xì)胞亞型被認(rèn)作是T淋巴細(xì)胞-依賴性炎癥反應(yīng)的一個(gè)主要成分。因此，本發(fā)明提 供方法通過用至少一種ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制劑接觸Thl7細(xì)胞來抑制Thl7細(xì)胞的
22活化和/或IL-17的分泌。本發(fā)明也提供方法用于抑制保護(hù)性T細(xì)胞(例如，Treg細(xì)胞) 向Thl7細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，并用于促進(jìn)Thl7細(xì)胞向保護(hù)性T細(xì)胞(例如，Treg細(xì)胞)的轉(zhuǎn)化。所 述本發(fā)明的方法可(例如)在體外或體內(nèi)進(jìn)行。此外，作為本文首次公開，oATP結(jié)合抗⑶3抗體、IL-2和同基因受照射的脾細(xì)胞使 用能誘導(dǎo)分化和活化的具有Foxp3高表達(dá)水平的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)顯著擴(kuò)展。因 此，oATP,具體是包含某些其他制劑的組合物中的oATP，能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展。 這些發(fā)現(xiàn)確保使用包含oATP的組合物來調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性(例如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞活性)，旨在 治療(連同其他疾病)自身免疫病和移植相關(guān)的免疫應(yīng)答(例如，移植物抗宿主病)。本發(fā)明提供ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制劑的新用途，并提供Treg細(xì)胞分化和 /或擴(kuò)展的誘導(dǎo)物，用于治療炎癥和自身免疫病。所述本發(fā)明的抑制劑和誘導(dǎo)物能在特定 的疾病治療中用于調(diào)節(jié)、擾亂、阻礙、增加、抑制、減少、拮抗或中和T細(xì)胞活性，這些疾病比 如，哮喘、過敏癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、內(nèi)毒素血癥、I型糖尿病、炎性腸道 疾病(IBD)、結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化癥、移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、 脫髓鞘病、硬皮病、干燥綜合征、Erdheim-Chester綜合征、克羅恩病綜合征、大動(dòng)脈炎、結(jié)節(jié) 病、自身免疫性溶血性貧血、Werlhof特發(fā)性血小板減少綜合征、銀屑病、皮膚T細(xì)胞淋巴 瘤、皮膚移植物抗宿主病、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、斑禿、白癜風(fēng)、藥物相關(guān)的疹、接 觸性超敏反應(yīng)、紅斑狼瘡、苔蘚痘疹樣糠疹、慢性苔蘚性糠疹、濕疹及扁平苔蘚，以及任何本 文公開或本領(lǐng)域內(nèi)已知的其他免疫疾病。這些抑制劑和誘導(dǎo)物將有利于現(xiàn)在已知的或后面 公開的任何T細(xì)胞-介導(dǎo)的免疫疾病。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抑制劑和誘導(dǎo)物包含 oATP。在一實(shí)施方式中，所述本發(fā)明的方法用于治療炎性疾病其中所述炎性疾病不是天 然免疫系統(tǒng)的炎性疾病，或者其中所述炎性疾病不完全是天然免疫系統(tǒng)的炎性疾病。在某 些實(shí)施方式中，所述本發(fā)明的方法用于治療炎性疾病其中所述炎性疾病部分或完全是適應(yīng) 性免疫系統(tǒng)的炎性疾病。天然免疫系統(tǒng)包含以非特異性方式應(yīng)答病原體的細(xì)胞和機(jī)制。由 天然免疫系統(tǒng)的細(xì)胞引起的炎癥生成使疼痛受體敏感的介質(zhì)(例如，組胺、緩激肽、血清 素、白三烯及前列腺素)，引起血管舒張和攻擊性吞噬細(xì)胞。這些反應(yīng)不直接涉及自身免疫 病的致病反應(yīng)。相反，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，包含T淋巴細(xì)胞-依賴性炎癥反應(yīng)，以抗原特異的 方式應(yīng)答病原體，并且能直接涉及自身免疫病的調(diào)節(jié)。天然免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和進(jìn)程不同于 適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的細(xì)胞和進(jìn)程。在某些實(shí)施方式中，所述本發(fā)明的方法用于治療適應(yīng)性免 疫系統(tǒng)炎癥和/或自身免疫病。在一實(shí)施方式中，所述本發(fā)明的方法用于治療炎癥和/或 自身免疫進(jìn)程的T細(xì)胞活化相關(guān)的起始階段。在一例示實(shí)施方式中，所述本發(fā)明的方法在 體內(nèi)進(jìn)行。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供用于抑制宿主對抗原刺激的免疫應(yīng)答的方法，包含 給宿主施用至少一種上述ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制劑、一種誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化和/或 擴(kuò)展的上述制劑、和/或通過接觸上述制劑而分化和/或擴(kuò)展的Treg細(xì)胞。例如，抗原刺 激在自身免疫病中來自自身抗原，在器官和組織移植中來自供體抗原。在一例示實(shí)施方式 中，所述方法在體內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明也提供用于治療炎癥或免疫疾病的方法，使用的藥物組合物包含藥學(xué)可接 受載體和至少一種ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制劑和/或一種Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展
23的誘導(dǎo)物。在某些實(shí)施方式中，所述藥物組合物包含用上述誘導(dǎo)物分化和/或擴(kuò)展的Treg 細(xì)胞。在一例示實(shí)施方式中，所述治療方法在體內(nèi)進(jìn)行。本發(fā)明的方法可用于治療，例如炎性疾病(如克羅恩病和乳糜瀉)、腸易激綜合 征、偏頭痛、頭痛、腰背疼痛、纖維肌痛、肌筋膜疾病、病毒感染(如丙型肝炎、特別是流感、 普通感冒、帶狀皰疹、艾滋病)、自身免疫性肝炎、細(xì)菌感染、真菌感染、痛經(jīng)、燒傷、外科或 牙科手術(shù)、惡性腫瘤(如乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌)、動(dòng)脈粥樣硬化、腸源性脊柱關(guān)節(jié)病、痛 風(fēng)、關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、幼年性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎、發(fā)熱(如風(fēng)濕熱)、強(qiáng) 直性脊柱炎sodalities、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、血管炎、胰腺炎、腎炎、滑囊炎、結(jié)膜炎、虹 膜炎、鞏膜炎、葡萄膜炎、傷口愈合、皮膚病(例如銀屑病、皮膚性T細(xì)胞淋巴瘤、皮膚移植 物抗宿主病、過敏性皮炎、過敏性接觸性皮炎、斑禿、白癜風(fēng)、與藥物有關(guān)的出疹、接觸過敏、 紅斑狼瘡、苔蘚痘狀糠疹、慢性苔蘚糠疹、濕疹、扁平苔癬)、中風(fēng)、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、 如阿爾茨海默氏癥和多發(fā)性硬化癥、自身免疫病(如肌萎縮性側(cè)索硬化癥、脫髓鞘病、硬皮 病、干燥綜合征、Erdheim-切斯特綜合征、克羅恩病綜合征、大動(dòng)脈炎、自身免疫性溶血性貧 血和Werlhof特發(fā)性血小板減少綜合征)、骨質(zhì)疏松癥、哮喘、慢性阻斷性肺病、肺纖維化、 過敏性疾病、鼻炎、潰瘍、冠心病、結(jié)節(jié)病、移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病，以及任何具有免 疫或炎癥成分的其他疾病。在某些實(shí)施方式中，所述本發(fā)明的方法用于治療具有適應(yīng)性免 疫成分的疾病。另一方面，提供治療T淋巴細(xì)胞依賴性炎性或免疫疾病的方法。在一優(yōu)選的實(shí)施 方式中，所述T淋巴細(xì)胞依賴性炎性或免疫疾病選自，例如哮喘、過敏癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、 銀屑病關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)炎、內(nèi)毒素血癥、I型糖尿病、炎性腸道疾病(IBD)、結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化 癥、移植排斥反應(yīng)、移植物抗宿主病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、脫髓鞘病、硬皮病、干燥綜合征、 Erdheim-Chester綜合征、克羅恩病綜合征、高安動(dòng)脈炎、結(jié)節(jié)病、自身免疫性溶血性貧血、 Werlhof特發(fā)性血小板減少綜合征和皮膚病、(比如銀屑病、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、皮膚移植物 抗宿主病、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、斑禿、白癜風(fēng)、藥物相關(guān)的疹、接觸性超敏反應(yīng)、 紅斑狼瘡、苔蘚痘疹樣糠疹、慢性苔蘚性糠疹、濕疹及扁平苔蘚)。在某些實(shí)施方式中，所述 炎癥或免疫疾病和肥大細(xì)胞的脫顆粒作用有關(guān)。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述方式在體內(nèi) 進(jìn)行。在一實(shí)施方式中，所述方法包含給受試者(例如，哺乳動(dòng)物受試者)施用至少一種上 述ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制劑、一種誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展的上述制劑、和/ 或通過接觸上述制劑而分化和/或擴(kuò)展的Treg細(xì)胞，或者單獨(dú)使用或者結(jié)合另一個(gè)免疫治 療和/或免疫抑制制劑和/或方案使用。在一實(shí)施方式中，提供改善器官和組織移植結(jié)果和延長移植存活的方法。在一實(shí) 施方式中，這些方法包含給移植受體施用至少一種上述ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制劑、一 種誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展的上述制劑、和/或通過接觸上述制劑而分化和/或擴(kuò)展 的Treg細(xì)胞，或者單獨(dú)使用或者結(jié)合另一個(gè)免疫治療和/或免疫抑制制劑和/或方案使 用。在一優(yōu)選的實(shí)施方式中，給移植受體施用至少一種ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制劑，其 中所述抑制劑的施用能有效降低受體的免疫應(yīng)答，例如，T細(xì)胞活性，移植中針對供體抗原 的遞呈。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，給移植受體施用至少一種誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò) 展的制劑，其中所述Treg細(xì)胞的施用能有效抑制移植中針對供體抗原遞呈的受體免疫應(yīng) 答。參見，例如，Taylor et al. ,Blood 99:3493-3499(2002)。在一實(shí)施方式中，所述移植是同種異體移植。在另一實(shí)施方式中，所述移植是異種移植。在一具體優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述本發(fā)明的方法可用于延長移植組織的存活。用 于預(yù)防急性和/或慢性移植排斥的優(yōu)選的組合物包括ATP拮抗劑(例如oATP)和/或阻斷 pannexin hemicharmel組裝的制劑(例如PX10)。特別優(yōu)選的制劑包括模擬ATP和ATP受 體天然相互作用的小分子化學(xué)組合物。誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化和/或擴(kuò)展的組合物也優(yōu)選包 含(I)T細(xì)胞初刺激物；和(2)細(xì)胞成分或可溶性介質(zhì)。所述本發(fā)明的方法可在體內(nèi)或體外 進(jìn)行。在一實(shí)施方式中，至少一種調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的制劑被施用給包含容納 于一個(gè)裝置中的生物材料的移植物受體，來降低受體免疫應(yīng)答和/或延長移植的組織的存 活。所述裝置可以是任何用于在患者中移植生物材料的裝置，例如所述裝置報(bào)道于美國專 利公開 No. 2006/0024276，美國專利 No. 6，716，246 或 PCT 專利公開 No. WO 08/097498，每個(gè) 都通過引用整體并入本文。在一實(shí)施方式中，至少一種調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的制劑 被施用給所述局部裝置的受體，即在裝置移植位點(diǎn)或其附近。本文所述的制劑在位點(diǎn)“附 近”施用指施用制劑給和所述位點(diǎn)有細(xì)胞通訊的細(xì)胞或組織。在一實(shí)施方式中，至少一種調(diào) 節(jié)T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的制劑，在一個(gè)或多個(gè)淋巴節(jié)附近或裝置移植位點(diǎn)周圍，被施用 給所述裝置的受體。在一實(shí)施方式中，至少一種調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的制劑被施用給(包 含用于物質(zhì)施用的裝置的)移植物受體(例如)來降低受體免疫或炎癥反應(yīng)。所述裝 置可以是任何用于在患者中移植生物材料的裝置，例如所述裝置報(bào)道于美國專利公開 No. 2006/0024276，美國專利 No. 5，324，518，美國專利 No. 6，716，246 或 PCT 專利公開 No. WO 08/097498，每個(gè)都通過引用整體并入本文。在一實(shí)施方式中，至少一種調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴性 免疫應(yīng)答的制劑被施用給所述局部裝置的受體，即穿過裝置或在裝置移植位點(diǎn)或其附近。 在一實(shí)施方式中，至少一種調(diào)節(jié)T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的制劑，在一個(gè)或多個(gè)淋巴節(jié)附近 或裝置移植位點(diǎn)周圍，被施用給所述裝置的受體。也提供抑制T細(xì)胞活性(例如T細(xì)胞活化、增殖和效應(yīng)功能)的方法，使用包含 ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制劑和至少一種其他免疫抑制或抗炎癥制劑的藥物組合物。在 一例示實(shí)施方式中，所述本發(fā)明的方法在體內(nèi)進(jìn)行。也提供增強(qiáng)Treg細(xì)胞免疫抑制活性的方法，使用包含oATP和至少一種其他免疫 抑制或抗炎癥制劑的的藥物組合物。在一些實(shí)施方式中，所述藥物組合物也包含包含(I)T 細(xì)胞初刺激物；和(2)細(xì)胞成分或可溶性介質(zhì)。在一例示實(shí)施方式中，T細(xì)胞(如，幼稚的 T細(xì)胞)通過體外接觸上述組合物而分化，并且產(chǎn)生的Treg細(xì)胞擴(kuò)展為Treg細(xì)胞群，然后 在藥物組合物中施用，該組合物可包含至少一種其他免疫抑制劑或消炎藥、或至少一種以 抗原特異的方式利于促進(jìn)和維持Treg細(xì)胞表型的制劑，用于在需要時(shí)體內(nèi)施用給受試者。 在另一實(shí)施方式中，在需要時(shí)oATP(單獨(dú)或結(jié)合其他制劑)被施用給受試者以增強(qiáng)體內(nèi)的 Treg細(xì)胞免疫抑制活性。免疫抑制劑可包含一個(gè)或多個(gè)，例如環(huán)孢素、雷帕霉素、Campath-1H、ATG、普樂可 復(fù)、抗IL-2R、MMF, FTY、LEA、干擾素、白細(xì)胞介素_2、環(huán)孢素A、diftitox、地尼白介素、左旋 咪唑、硫唑嘌呤、布喹那、胍立莫司、6-巰嘌呤、咪唑立賓、雷帕霉素、他克莫司(Π(-506)、葉 酸類似物(如二甲葉酸、依達(dá)曲沙、甲氨蝶呤、吡曲克辛、蝶羅呤、Tomudex 和三甲曲沙)、
25嘌呤類似物(如克拉屈濱、氟達(dá)拉濱、6_巰嘌呤、硫咪嘌呤和硫鳥嘌呤)嘧啶類似物(如安 西他濱、阿扎胞苷、6_氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、氟尿苷、乙嘧替氟、依諾他濱、氟尿苷、氟尿 嘧啶、吉西他濱、喃氟啶)氟輕松、氟羥氫化潑尼松、醋酸阿奈可他、氟米龍、甲羥松、強(qiáng)的松等。消炎藥可包含一個(gè)或多個(gè)，例如NSAIDs、白細(xì)胞介素1拮抗劑、二氫乳清酸合酶 抑制劑、p38 MAP激酶抑制劑、腫瘤壞死因子-α抑制劑、腫瘤壞死因子-α隔離劑和甲氨 蝶呤。消炎藥可更具體包含一個(gè)或多個(gè)，例如抗TNF-α、lysophylline, α 1_抗胰蛋白 酶(AAT)、白細(xì)胞介素-IO(IL-IO)、己酮可可堿、C0X-2抑制劑、21-乙酰氧孕烯醇酮、阿氯 米松、阿爾孕酮、安西奈德、氯地米松、倍他米松、布地奈德、氯潑尼松、氯倍他索、丁酸氯氟 美松酮、氯可托龍、氯潑尼醇、皮質(zhì)酮、可的松、可的伐唑、地夫可特、羥潑尼縮松、去羥米松、 地塞米松、雙氟拉松、雙氟米松、雙氟潑尼酯、甘草次酸、氟扎可特、氟氯奈德、氟米松、氟尼 縮松、氟輕松安奈德、氟輕松醋酸酯、氟可丁丁酯、氟可龍、氟米龍、氟培龍醋酸鹽、氟潑尼 定醋酸鹽、氟潑尼龍、氟氫縮松、丙酸氟替卡松、福莫可他、哈西縮松、鹵倍他索丙酸酯、鹵 米松、鹵潑尼松醋酸、氫可他酯、氫化可的松、氯替潑諾、馬潑尼酮、甲羥松、甲潑尼松、甲潑 尼龍、糠酸莫米松、帕拉米松、潑尼卡酯、類固醇、類固醇25-二乙氨基乙酸、潑尼松龍磷酸 鈉、潑尼松、潑尼松龍戊酸酯、潑尼立定、利美索龍、替可的松、曲安奈德、去炎舒松、苯曲安 縮松、己酸丙炎松、氨基芳基羧酸衍生物(如苯乙氨茴酸、依托芬那酯、氟芬那酸、異尼辛、 甲氯芬那酸、甲芬那酸、尼氟滅酸、他尼氟酯、特羅芬那酯、托芬那酸)、芳基乙酸衍生物(如 醋氯芬酸、阿西美辛、阿氯芬酸、氨芬酸、呱氨托美丁、溴芬、丁苯羥酸、桂美辛、氯吡酸、雙氯 芬酸鈉、依托度酸、聯(lián)苯乙酸、芬克洛酸、芬替酸、葡美辛、異丁芬酸、消炎痛、三苯唑酸、伊索 克酸、氯那唑酸、甲嗪酸、莫苯唑酸、奧沙美辛、吡拉唑酸、丙谷美辛、舒林酸、噻拉米特、托美 丁、tropesin、佐美酸)、芳基丁酸衍生物(如布馬地宗、異丁苯丁酸、芬布芬、聯(lián)苯丁酸)、芳 基羧酸(如環(huán)氯茚酸、酮咯酸、替諾立定)、芳基丙酸衍生物(如阿明洛芬、苯惡洛芬、柏莫洛 芬、布氯酸、卡洛芬、非諾洛芬、氟諾洛芬、氟比洛芬、布洛芬、異丁普生、吲哚洛芬、酮洛芬、 洛索洛芬、萘普生、奧沙普秦、吡酮洛芬、吡咯洛、普拉洛芬、丙替嗪酸、舒洛芬、噻洛芬酸、希 莫洛芬、扎托洛芬)、吡唑(如二苯米唑、依匹唑)、吡唑酮(如阿扎丙宗、芐哌立隆、非普拉 宗、莫非保松、嗎拉宗、羥基得泰松、苯、哌保松、異丙安替比林、雷米那酮、琥保松、噻唑丁炎 酮)、水楊酸衍生物(如醋氨沙洛、阿司匹林、撲炎痛、溴水楊醇、鈣乙酰水楊酸、二氟尼柳、 依特柳酯、芬度柳、龍膽酸、乙二醇水楊酸、水楊酸咪唑、賴氨酸乙酰水楊酸、美沙拉嗪、嗎 啉、水楊酸1-萘基水楊酸、奧沙拉嗪、帕沙米特、苯基乙酰水楊酸、水楊酸苯、醋水楊胺、水 楊酰胺鄰乙酸、水楊基硫酸、雙水楊酯、柳氮磺胺吡啶)、噻嗪羰酰胺(如安吡昔康、屈惡昔 康、伊索昔康、氯諾昔康、吡羅昔康、替諾昔康)、ε _乙酰胺基己酸、S-腺苷甲硫氨酸、3-氨 基-4-羥丁酸、阿米西群、芐達(dá)、芐達(dá)明、α-紅沒藥醇、布可隆、聯(lián)苯吡胺、地他唑、依莫法 宗、非普地醇、愈創(chuàng)木奧、萘丁美酮、尼美舒利、奧沙西羅、瑞尼托林、哌立索唑、普羅喹宗、超 氧化物歧化酶、替尼達(dá)普、齊留通、小燭樹蠟、α沒藥醇、蘆薈、Manjistha、穆庫爾、科拉提取 物、甘菊、海鞭提取物、甘草次酸、甘草酸、油溶性甘草提取物、甘草酸單銨、磷酸二氫鉀甘草 酸、甘草酸二鉀、1- β “甘草次酸、甘草酸硬脂酯、和3-硬脂酰氧基-甘草次酸、3-琥珀酰氧 基-β-甘草亭酸二鈉等。利于促進(jìn)和維持Treg表型的試劑可包含一個(gè)或多個(gè)，例如oATP、TGF-β、視黃酸、雷帕霉素、5氮胞苷和曲古菌素A。還預(yù)計(jì)所述受試組合物和方法可協(xié)同結(jié)合基于調(diào)節(jié)其他T細(xì)胞共刺激通路的免 疫治療，比如，例如CD28、IC0S、PD-1、CTLA-4和/或BTLA的調(diào)節(jié)。藥物制劑本發(fā)明的方法可包含單獨(dú)施用治療性制劑，但優(yōu)選包含施用已知的藥物配方，包 括口服片劑、膠囊或酏劑、直腸給藥的栓劑、腸胃外或肌肉注射的無菌溶液或懸浮液、脂質(zhì) 體制劑或膠囊化制劑，其中所述治療性制劑的配置成分是單獨(dú)的或結(jié)合遞送制劑或媒介寸。這些制劑可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)和/或公認(rèn)的藥物實(shí)踐制備。認(rèn)為本發(fā)明的治療實(shí)體能結(jié)合合適的載體、賦形劑、和/或其他試劑施用，這些 試劑被并入到制劑中以提供改善的轉(zhuǎn)移、遞送、耐受等。所有藥物化學(xué)家所知的配方中有 多禾中合適的制劑Remington’ s Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton，PA (1975))，具體是其中Blaug、Seymour的第87章。例如，這些制劑包 括粉劑、糊劑、藥膏、凝膠劑、蠟、油類、脂類、含有囊泡的脂類(陽離子或陰離子)(比如 Lipofectin )、DNA軛合物、無水吸收膏、油包水和水包油型乳劑、聚乙二醇乳劑(不同分子 量的聚乙二醇)、半固態(tài)凝膠、含聚乙二醇的半固態(tài)混合物。根據(jù)本發(fā)明任何上述混合物在 處理和治療中是合適的，只要所述制劑的有效成分在制備中不是失活的，并且所述制劑是 生理可接受的并且對施用途徑耐受。也參見Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations”PDA J Pharm Sci Technol 52 :238_311 (1998)，和本文關(guān) 于藥物化學(xué)家所知的賦形劑和載體的附加信息的引文。在一實(shí)施方式中，所述治療性制劑是局部制劑施用。施用的局部制劑可包含，例 如含水和無水的凝膠、乳膏劑、復(fù)合乳劑、微乳劑、脂質(zhì)體、藥膏、含水和無水溶液、洗劑、氣 霧劑、皮膚斑塊、碳?xì)浠衔锘|(zhì)和粉劑、并包含賦形劑、比如增溶劑、滲透促進(jìn)劑(如脂肪 酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)、和親水性聚合物(如聚卡波非和聚乙烯吡咯烷酮)。本發(fā)明的局部制劑可包含一個(gè)皮膚可接受的載體，比如，能遞送其他制劑成分到 皮膚，并且這些成分被皮膚敷用接受或吸收的物質(zhì)。所述載體通常包括溶解或使治療性 制劑分散的溶劑或者一個(gè)或多個(gè)賦形劑或其他載體成分。符合本發(fā)明通常制劑的有用的 載體可包括(作為非限制性示例)水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁烷-1，3-二醇、丙烯 酸酯共聚物、肉豆蔻酸異丙酯、棕櫚酸異丙酯、礦物油、黃油、蘆薈、滑石粉、植物油、植物 汁液、植物提取物、植物粉、其他植物衍生物、羊毛脂、尿素、石油制劑、焦油制劑、植物或 動(dòng)物脂肪、植物或動(dòng)物油、肥皂、甘油三酸脂和角蛋白。根據(jù)本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的方法， 例如報(bào)道于標(biāo)準(zhǔn)參考書(例如，Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 1577-1591，1672-1673，866-885 (Alfonso R. Gennaro ed. 19th ed. 1995)；和 Ghosh et al. ,Transdermal and Topical Drug Delivery Systems (1997))白勺方^去，ffliit昆發(fā)日月 的化合物和典型載體制備本發(fā)明的局部制劑。此外，保濕劑或濕潤劑、防曬劑、芳香劑、染料和/或增稠劑(如石蠟、霍霍巴油、對 氨基苯甲酸、蠟)、表面活性劑、閉塞劑、吸濕劑、乳化劑、潤膚劑、無脂清潔劑、抗氧化劑和親 脂劑，需要時(shí)可被添加到所述本發(fā)明的典型制劑中。本發(fā)明的典型制劑可被設(shè)計(jì)在短暫敷用后保持在皮膚上并且不被洗掉?；蛘撸?br> 27述典型制劑可被設(shè)計(jì)在敷用一定時(shí)間后被洗掉。遞送方法本發(fā)明的方法包含治療性制劑的施用，單獨(dú)或以組合物的形式，通過任 何期望的方式，比如經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)消化道、脊柱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi) (intra-articularly)、關(guān)節(jié)內(nèi)(intra-joint)、皮下、頰部、陰道、經(jīng)直腸、皮膚、透皮、眼部、 經(jīng)耳、粘膜、經(jīng)鼻、經(jīng)氣管、經(jīng)支氣管、舌下、結(jié)內(nèi)、通過任何腸胃外途徑或通過吸入，以藥物 可接受的劑型。在一實(shí)施方式中，所述治療性制劑被直接施用到其治療活性位點(diǎn)，例如，淋巴結(jié)。 例如，所述治療性制劑被直接注射到淋巴結(jié)。用于T細(xì)胞依賴性活化抑制劑結(jié)內(nèi)注射的優(yōu) 選的淋巴結(jié)是位于腹股溝、腋下和頸部區(qū)域的主要淋巴結(jié)。在另一實(shí)施方式中，所述治療性 制劑被施用到其治療活性位點(diǎn)的遠(yuǎn)端。在一實(shí)施方式中，所述治療性制劑被局部施用。在某些這類實(shí)施方式中，所述治療 性制劑被局部施用來治療皮膚病。盡管使用的局部制劑的量將取決于(例如)預(yù)期使用的 總組合物(即相對于維持方案的治療劑)和受試個(gè)體對所述治療劑的敏感性，但在一實(shí)施 方式中，所述本發(fā)明的局部制劑被每隔一定時(shí)間使用來影響受體身體。在一些實(shí)施方式中， 在治療的起始階段所述組合物被更頻繁地使用，直到達(dá)到理想的效果，然后在需要維持時(shí) 較少頻率使用。所述本發(fā)明的局部制劑可用各種方法使用。在一實(shí)施方式中，所述制劑被施用在 炎癥影響的皮膚區(qū)域。然后按摩或摩擦該區(qū)域直到所述制劑被均勻分布或消失。一天可重 復(fù)該過程1、2、3、4、5、6或更多次。在另一方法中，所述局部制劑在皮膚貼片上使用，然后將 其貼在受影響的皮膚區(qū)域30分鐘到數(shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)月、數(shù)周或更長。在另一實(shí)施方式中， 所述本發(fā)明的局部制劑用離子電滲療法遞送到受影響的區(qū)域。該方法中，所述局部制劑位 于和電極接觸的容器或接線板中。然后所述容器被放置在受影響的區(qū)域上，激活電極。這 引起電流產(chǎn)生，通過電斥力遞送所述局部制劑穿過皮膚。其他用于遞送所述本發(fā)明的局部制劑穿過皮膚的合適方法包括超聲波法和玻璃 紙包裝法。在超聲波法中，首先在受影響的皮膚區(qū)域使用所述局部制劑。然后將超聲波裝 置放在所述受影響的區(qū)域。一旦啟動(dòng)，所述裝置通過超聲波能量遞送制劑穿過皮膚。在玻 璃紙包裝法，所述制劑被使用到受影響的區(qū)域并用玻璃紙薄膜包裹所有地方，從幾分鐘到 幾小時(shí)、幾天、幾周或幾個(gè)月。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明制劑被納米膠囊化成納米顆粒用 于遞送。所述納米膠囊化材料可是生物降解性的或非降解性的。所述納米膠囊化材料可用 合成聚合物、天然聚合物、寡聚物或單體制成。聚合物、天然聚合物、寡聚物或單體包括那些 物質(zhì)，這些物質(zhì)源于多聚環(huán)氧烷烴前體分子，比如聚(環(huán)氧乙烷)(PEO)，聚(乙二醇)(PEG) 和聚(環(huán)氧丙烷)(PEG-共-ΡΡ0)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙 基噁唑啉)(PEOX)的共聚物，聚氨基酸和假聚氨基酸，以及這些聚合物的共聚物Sawhney et al.，Macromolecules 26 :581_587 (1993)。共聚物也可用其他水溶性聚合物或水不溶性聚 合物形成，只要其綴合物是水溶的。一個(gè)水溶性綴合物的實(shí)施例是阻斷的聚乙二醇和聚環(huán) 氧丙烷的共聚物，商品名為Pluronic. TM.表面活性劑(BASF)。天然聚合物、寡聚物或單體包括蛋白質(zhì)(比如纖維蛋白原、纖維蛋白、明膠、膠原蛋白、彈性蛋白、醇溶蛋白和白蛋白，無論產(chǎn)于天然來源還是重組來源)和多糖(比如瓊脂 糖、海藻酸鈉、透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素、葡聚糖、硫酸葡聚糖、肝素、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素、 殼聚糖、結(jié)冷膠、黃原膠、瓜爾豆膠、水溶性纖維素衍生物和角叉菜)。這些聚合物僅是能被 利用的納米膠囊化材料的示例類型，并且不打算代表所用可能范圍之內(nèi)的所述納米膠囊化 材料?！笆芸蒯尫拧敝钢苿?比如源于組合物或劑型的藥物)的釋放，其中制劑根據(jù)期望 的維持一段延長期的圖譜被釋放。受控釋放圖譜包括，例如持續(xù)釋放、延長釋放、脈沖釋放、 延遲釋放圖譜。與立即釋放組合物相反，受控釋放組合物允許根據(jù)預(yù)定圖譜遞送制劑給受 試者維持一段延長期。該釋放速度能提供治療用于一段延長期的有效的制劑水平，并因而 相比于傳統(tǒng)的快速釋放藥物形式，提供一個(gè)較長的藥理學(xué)或診斷反應(yīng)的周期。這些較長的 反應(yīng)周期可提供許多內(nèi)在益處，這些益處在相應(yīng)的短效作用的、立即的釋放制劑中不能實(shí) 現(xiàn)。例如，在慢性疼痛的治療中，相比于傳統(tǒng)的短效作用的制劑，受控釋放制劑通常是非常 優(yōu)選的。受控釋放藥物組合物和劑型被設(shè)計(jì)改善制劑的遞送圖譜，比如藥品、藥劑、活性 劑、診斷試劑、或任何被內(nèi)部施用給動(dòng)物(包括人)的物質(zhì)。受控釋放組合物通常用于通過 優(yōu)化遞送動(dòng)力學(xué)提高施用的物質(zhì)的效用，因而能增強(qiáng)生物利用度、便利性、病人依從性，并 使不適當(dāng)?shù)牧⒓瘁尫潘俣?比如高起始釋放速度和(如果不是故意的)不均勻的血液或組 織水平)相關(guān)的負(fù)作用最小化。一些組合物提供活化的化合物的受控釋放，制備和使用這些組合物的現(xiàn)有技術(shù)教 導(dǎo)提供用于延長施用后藥物釋放的各種技術(shù)。本領(lǐng)域內(nèi)已知的示例性受控釋放制劑具體包 括包覆顆粒、微粒、納米粒子、植入物、片劑、小片劑和膠囊，其中所述藥物的受控釋放(例 如)通過制劑包膜的選擇性破裂，或通過穿過包膜釋放，或通過和特異的基質(zhì)混合來影響 藥物的釋放，或通過這些技術(shù)組合釋放。一些受控釋放制劑提供在施用后的預(yù)定時(shí)期單個(gè) 活化的化合物藥物的脈沖式釋放。在一實(shí)施方式中，包含調(diào)節(jié)至少一種T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答的制劑的受控釋放制 劑靶向于具體細(xì)胞類型或組織。這可以被實(shí)現(xiàn)，例如通過結(jié)合所述受控釋放制劑的靶藥物 /靶物質(zhì)來保護(hù)其在體內(nèi)或體外(例如，在細(xì)胞培養(yǎng)中或離體)遠(yuǎn)離外部干擾，直到其暴露 于期望的靶點(diǎn)，比如在靶細(xì)胞內(nèi)，報(bào)道于美國專利公開No. 2007/0190160。在一優(yōu)選的實(shí)施 方式中，所述受控釋放制劑靶向受體的淋巴結(jié)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述受控釋放制 劑靶向移植物(例如，移植的器官)或植入物(例如，包含生物材料的植入裝置)的位點(diǎn)或 其附近。本發(fā)明的方法包含以各種劑量施用所述治療性制劑的步驟?？诜⒎蔚暮途植縿?量范圍可在約每天每公斤體重0. 01mg(mg/kg/day)到約100mg/kg/天，優(yōu)選約0. 01mg/kg/ 天到約10mg/kg/天，更優(yōu)選約0. lmg/kg/天到約5. Omg/kg/天。例如，口服施用，所述組合 物通常包含約0. Olmg到約500mg活性成分，優(yōu)選約Img到約IOOmg活性成分。靜脈內(nèi)施用， 最優(yōu)選的劑量范圍為在恒定速度輸液時(shí)約0. 001到約10mg/kg/小時(shí)。有利的是，治療性制 劑可用單個(gè)日劑量施用，或總的日劑量分為每日2、3、4次施用。在一些實(shí)施方式中，施用所 述制劑達(dá)1、2、3、或4周、兩個(gè)月、三個(gè)月、一年、兩年、幾年或更長，根據(jù)熟練的從業(yè)醫(yī)師決 定是合適的。
用本發(fā)明的方法分化和/或擴(kuò)展的Treg細(xì)胞用于抑制受試者的免疫功能。具體為 自體細(xì)胞被分離；在體外修飾、分化、和/或擴(kuò)展；隨后施用或重新植入給受試者。治療有效 量的Treg細(xì)胞可結(jié)合藥物可接受載體施用。施用路徑可包括任何合適的方式，包括但不限 于，口、直腸、陰道、頰部、局部、鼻腔、皮膚、透皮、氣管、舌下、結(jié)內(nèi)、腸胃外、靜脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、 注射、鼻吸入、肺吸入、皮下、目艮部、黏膜、耳、關(guān)節(jié)內(nèi)和鞘內(nèi)路徑，以及經(jīng)過消化道(例如，經(jīng) 過淋巴集結(jié))。施用的局部路徑包括關(guān)節(jié)內(nèi)，肌肉內(nèi)和脊柱內(nèi)施用，以及經(jīng)過排入胰腺的血 管(比如前、后胰十二指腸動(dòng)脈)施用。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的Treg細(xì)胞和包含所 述細(xì)胞的藥物組合物通過肌肉、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射或直接注射到患者的淋巴結(jié)施用給受 試者。在一例示實(shí)施例中，所述Treg細(xì)胞被局部施用于所述炎癥位點(diǎn)。施用路徑將根據(jù)具 體治療選擇。所述細(xì)胞可用單次劑量施用或用跨越選定間隔期的幾個(gè)劑量來滴定藥物。在 某些實(shí)施方式中，劑量范圍從104/kg到109/kg治療的細(xì)胞，優(yōu)選從105/kg到107/kg細(xì)胞， 更優(yōu)選約106/kg細(xì)胞被施用給受試者。所述細(xì)胞能被一次施用或在一段時(shí)期內(nèi)施用，比如 12、24、48、72、96個(gè)小時(shí)，或在一段延長的時(shí)期，比如一周、十天、兩周、1個(gè)月、3個(gè)月、或6個(gè) 月；或只要施用是治療有益的。在移植的事例中，使用受體細(xì)胞的所述Treg細(xì)胞是有同種活性的。在一優(yōu)選的實(shí) 施方式中，在移植手術(shù)之前，所述Treg細(xì)胞在體外被分化和/或擴(kuò)展，并隨后在手術(shù)中被施 用以治療或預(yù)防移植物抗宿主病。在某些實(shí)施方式中，所述Treg細(xì)胞以受控釋放機(jī)制施 用，比如人造凝膠或血漿凝塊。在一些實(shí)施方式中，在預(yù)期引起免疫應(yīng)答的事件中(比如輸血或移植)，施用所述 Treg細(xì)胞給受試者。在該事例中，例如，在輸液之前一周或6、5、4、3、2、1天或早于12天、早 于4天、或早于2小時(shí)，施用調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。在任何事件中，醫(yī)生或技術(shù)人員能決定最適合于患者個(gè)體的實(shí)際劑量，該劑量有 可能因施用路徑、治療的疾病類型和嚴(yán)重程度，以及治療的具體患者的種類、年齡、體重、性 別、腎功能、肝功能和反應(yīng)而變化。所述上述劑量是平均事例的例示；當(dāng)然，單個(gè)事例中具有 較高或較低的劑量范圍是允許的，并且這些在本發(fā)明的范圍內(nèi)。為了能更好地理解本發(fā)明，列舉下列實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅旨在例證，并不以任 何方式解釋為本發(fā)明的限制范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1T細(xì)胞中減少的ER的和增強(qiáng)的線粒體的Ca^攝入現(xiàn)有研究已經(jīng)顯示CRT表達(dá)水平和ER儲(chǔ)存的Ca2+數(shù)量直接相關(guān)(Pinton et al. , EMBO J 20:2690-2701 (2001) ；Arnaudeau et al. , J Biol Chem 277 46696-46705 (2002)) ο我們檢測CRT是否在特異于卵清蛋白肽323-339 (OVAp)的CD4+T細(xì) 胞克隆上發(fā)揮類似功能。這些克隆源于crtv+或crt+DO. 11. 10TCR轉(zhuǎn)基因胚胎的造血祖細(xì) 胞產(chǎn)生的 FLC(Porcellini et al. ,J Exp Med 203:461—471(2006))。在無細(xì)胞外鈣時(shí)，細(xì) 胞被負(fù)載Ca2+指示劑Fura-2，并被毒胡蘿卜內(nèi)酯(一個(gè)肌漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP酶(SERCA)抑制 劑)刺激。通過ER中Ca2+被動(dòng)滲漏產(chǎn)生的緩慢的細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+升高的定量顯示，和crtv+ 細(xì)胞相比，crt"-細(xì)胞中ER Ca2+含量減少20% (圖2A)。細(xì)胞刺激后Ca2+升高被線粒體察覺，線粒體通過緩沖細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+來調(diào)節(jié)Ca2+信
30號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Rizzuto and Pozzan, Physiol Rev 86 369-408 (2006)) 我們研究 T 細(xì)胞中線粒 體的Ca2+攝入是否受到crt缺失的影響。我們通過在無Ca2+的培養(yǎng)基中用毒胡蘿卜內(nèi)酯耗 盡Ca2+儲(chǔ)存，并隨后添加0. 5mM Ca2+來誘導(dǎo)crt+和crt+AT細(xì)胞中的CCE。在大量沖洗掉細(xì) 胞外的Ca2+后，添加所述Ca2+離子載體離子霉素來通過CCE釋放線粒體中積累的Ca2+(Hoth et al.，J Cell Biol 137:633-648(1997))。圖 IA 顯示和 crt+/+細(xì)胞相比，crt+細(xì)胞中 Ca2+積累到更高的程度，盡管CCE期間細(xì)胞溶質(zhì)鈣升高的幅度在兩種細(xì)胞中相似。如果在添 加0. 5mM Ca2+之前添加離子霉素，則在crt+和crtv+T細(xì)胞中沒有觀測到差異(未顯示)， 表明Ca2+是在CCE期間被積累到線粒體中。這排除了在crt+細(xì)胞中組成性線粒體Ca2+的 過載。在crt+/+細(xì)胞中，耗盡Ca2+儲(chǔ)存后升高的細(xì)胞外鈣濃度并行于線粒體鈣攝入的增加， 但在crt+細(xì)胞中不存在(圖1B)。事實(shí)上，在crt+T細(xì)胞中線粒體緩沖維持細(xì)胞外Ca2+ 的恒定范圍在0. 5 2mM。線粒體的Ca2+緩沖依賴通過耗盡通道口附近的Ca2+離子使CRAC通道的失活來影 口向 Ca2+(Gilabert et al.，EMBO J 20 :2672_2679 (2001) ；Hoth et al.，Proc Natl Acad Sci USA 97 10607-10612(2000)；和 Gilabert et al. ,EMBO J 19 :6401_6407(2000))。我 們利用這一性質(zhì)進(jìn)一步證實(shí)在crt+T細(xì)胞中線粒體的Ca2+攝入是增強(qiáng)的。在無Ca2+的培 養(yǎng)基中，我們耗盡毒胡蘿卜內(nèi)酯-敏感的負(fù)載Fura-2的細(xì)胞的儲(chǔ)存，并對細(xì)胞連續(xù)兩次添 加0. 5mM Ca2+(圖IC和圖2C)。由于細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+濃度升高速率決定于CRAC通道的活性， 在第一和第二次添加細(xì)胞外Ca2+時(shí)定量該參數(shù)，能估計(jì)CRAC通道的Ca2+依賴性失活的程度 (Hoth et al.，J Cell Biol 137:633-648(1997))。在 crt+/+細(xì)胞中，我們計(jì)算出第二次 添加細(xì)胞外Ca2+時(shí)CRAC活性減少57%。然而，在crt+細(xì)胞中，第二次添加細(xì)胞外Ca2+時(shí) CRAC通道顯示只有14%失活(圖1C)，因此證明在crt+細(xì)胞中CRAC通道的Ca2+依賴性失 活是降低的。為了證實(shí)該現(xiàn)象中線粒體的作用，我們在CCCP(—個(gè)線粒體解偶聯(lián)劑)存在 下重復(fù)所述相同的實(shí)驗(yàn)。當(dāng)線粒體鈣攝入被抑制時(shí)，crt+和crtv+細(xì)胞中所述CRAC通道 的Ca2+依賴性失活是相當(dāng)?shù)?圖1D)。通過正吖啶橙染色的細(xì)胞的FACS分析測量線粒體質(zhì)量，揭示了其在crt+和 crtv+細(xì)胞中沒有差異(未顯示)。類似的，通過熒光染料TMRM(其以電壓依賴性方式保留 在線粒體中)染色的細(xì)胞的FACS分析測定所述線粒體膜電勢，揭示了其在crt+和erf+ 細(xì)胞中沒有差異(圖2B)。因此，crt+⑶4+T細(xì)胞有減少的ER的Ca2+儲(chǔ)存能力和增強(qiáng)的線 粒體Ca2+緩沖潛能，這導(dǎo)致較慢的Ca2+依賴性的CRAC失活。實(shí)施例2 :crt^T細(xì)胞中增加的ATP生成線粒體Ca2+攝入的另一個(gè)重要結(jié)果是刺激提高的ATP合成的線粒體代謝活動(dòng) (Jouaville et al. , Proc Natl Acad Sci USA 96 13807-13812 (1999) ；Hajnoczky et al.，Cell 82 :415_424(1995))。因而通過crt+CD4+T細(xì)胞的抗原激活誘導(dǎo)的CCE可能和 較高的(和crtv+細(xì)胞相比)ATP產(chǎn)量有關(guān)。實(shí)際上，在刺激離體分離的幼稚的(圖3A)和 效應(yīng)子/記憶(未顯示)⑶4+T細(xì)胞后，相對于crtv+細(xì)胞，我們在crt+細(xì)胞中檢測較高的 ATP水平。誘導(dǎo)ATP合成的活性源于線粒體的呼吸，因?yàn)橥ㄟ^寡霉素處理其被摧毀(圖3B)。作為細(xì)胞溶質(zhì)鈣升高結(jié)果的ATP生成被認(rèn)為用于提供細(xì)胞活化期間需要的細(xì)胞 能量。另外，認(rèn)為ATP對嘌呤型受體的刺激涉及T細(xì)胞的有絲分裂刺激(Baricordi et al. , Blood 87:682-690(1996))。ATP或者儲(chǔ)存在分泌顆?；蛘咴诩?xì)胞溶質(zhì)中。為了分析T細(xì)胞中ATP的亞細(xì)胞分布，我們在含4nM奎納克林的培養(yǎng)基中溫育離體純化的CD4+T細(xì) 胞30分鐘。該熒光化合物高親和性集合核酸，并用于使含ATP的囊泡可視化(Belai and Burnstock, Neuroreport 11:5-8(2000))。如圖3D所示，奎納克林染色顯示均勻的細(xì)胞 溶質(zhì)分布且沒有任何關(guān)于分泌顆粒的囊泡染色的跡象。為了進(jìn)一步證實(shí)T細(xì)胞中ATP的 專一性細(xì)胞溶質(zhì)定位，我們用連續(xù)蔗糖梯度分級分離T細(xì)胞裂解物。用生物發(fā)光分析來檢 WJ^I^B&Wjy^ ATP 白勺(Lyman and De Vincenzo, Analytical Biochemistry 21 435-443 (1967))。根據(jù)奎納克林的分布，我們僅在相應(yīng)于細(xì)胞溶質(zhì)的級分發(fā)現(xiàn)可檢測的ATP 含量，由在Western印記分析中存在Zap 70確定。有趣的是，在分級分離前用CD3抗體刺 激T細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞溶質(zhì)級分中ATP恢復(fù)增強(qiáng)(圖3E)。這些結(jié)果排除了源于活化的T細(xì)胞 的ATP的調(diào)控性分泌釋放，并暗示ATP可能通過連接蛋白/pannexin hemichannels或P2X7 嘌呤型受體被釋放。已顯示細(xì)胞外ATP能通過激活膜金屬蛋白酶引起L選擇素(⑶62L)的流出。認(rèn)為 該流出受到P2X受體拮抗劑oATP的抑制(Gu et al. ,Blood 92:946-951(1998))。幼稚的 ⑶4 T細(xì)胞的體外活化引起⑶62L的流出，其在TCR觸動(dòng)后逐漸再次表達(dá)。在crt+T細(xì)胞 中，和野生型細(xì)胞相比，活化后CD62L的再次表達(dá)受損，暗示細(xì)胞周圍存在較高的ATP濃度。 事實(shí)上，添加oATP到培養(yǎng)基，在crt+和野生型細(xì)胞中引起增強(qiáng)的且等同的再次表達(dá)效率 (圖3C)。因此，在crt+FLC的外周淋巴器官中CD62L陰性細(xì)胞顯著增加(Porcellini et aL·, J Exp Med 203 :461_471(2006))。實(shí)施例3 :crt^T細(xì)胞中通過P2X警體的自分泌活化延長MAPK活化ATP已被證明作為共刺激物參與T細(xì)胞有絲分裂反應(yīng)(Baricordi et al.，Blood 87 682-690 (1996))。因此，我們假設(shè)crt+T細(xì)胞的高反應(yīng)性可能源于抗原遭遇時(shí)增加的 ATP產(chǎn)物和釋放，其導(dǎo)致延長的MAP激酶活化和NFAT核轉(zhuǎn)移(Porcellini et al.，J Exp Med 203 461-471 (2006))。為了深刻理解T細(xì)胞中潛在的自分泌ATP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，我們首先 用RT-PCR測定D011. IOT細(xì)胞克隆表達(dá)的嘌呤型受體的組成。發(fā)現(xiàn)P2X1、4和7連同P2Y1、 12、13和14共表達(dá)(圖4A)。當(dāng)Ca2+存在于細(xì)胞外培養(yǎng)基中時(shí)，用ImM ATP刺激引起細(xì)胞 中鈣上升52%。當(dāng)無細(xì)胞外Ca2+下使用時(shí)，由于IP3介導(dǎo)的Ca2+從ER儲(chǔ)存中釋放，ATP也 引發(fā)適度的細(xì)胞溶質(zhì)的鈣上升，從而證實(shí)存在代謝型P2Y受體(圖4B)。用優(yōu)選的P2X亞型 激動(dòng)劑，我們發(fā)現(xiàn)在用P2X1和P2X3特異的激動(dòng)劑α β MeATP刺激后有18%的細(xì)胞被激活， 而35%的細(xì)胞對Ρ2Χ激動(dòng)劑MeSATP有反應(yīng)，33%的細(xì)胞對Ρ2Χ7特異的激動(dòng)劑BzATP有反 應(yīng)(圖4C)，31 %的細(xì)胞對2MeSADP (其激活P2Y1、12、13)有反應(yīng)，36%的細(xì)胞對P2Y14激動(dòng) 劑UDP-葡萄糖有反應(yīng)(圖4D)。因此，在培養(yǎng)的D011. IOT細(xì)胞克隆中，通過RT-PCR檢測的 P2受體亞型是有功能的。考慮到crt+T細(xì)胞中的較高的活性依賴性ATP合成，我們檢測P2受體的自分泌 活化是否可能在T細(xì)胞高反應(yīng)性中起作用，通過分析MAPK活化，其在crt+T細(xì)胞中是延長 的。為此，在寡霉素存在下用⑶3抗體刺激crt+⑶4+T細(xì)胞16小時(shí)，來抑制Ca2+刺激的線 粒體的ATP合成，作為非特異的P2受體拮抗劑的PPADS或oATP，優(yōu)先抑制P2X7受體。在 未處理的細(xì)胞中檢出的延長的MAPK活化被各種藥物制劑幾乎完全廢除(圖5B)。然而，相 同的處理并不顯著影響NFATl的核定位(未顯示)。用寡霉素、PPADS或oATP處理后降低 的MAPK活化并不歸因于毒性引起的細(xì)胞損傷，由于處理細(xì)胞的碘化丙錠(PI)染色揭示相
32對于未處理的相應(yīng)部分，二者沒有差異(未顯示)。這些結(jié)果暗示活化的共刺激作用在T 細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中誘導(dǎo)ATP合成和釋放。為了進(jìn)一步證實(shí)該假說，我們通過用CD3抗體刺激 進(jìn)行ERK活化。如圖5A的第一個(gè)圖所示，ERK活化峰出現(xiàn)在⑶3刺激后1. 5小時(shí)左右，3. 5 小時(shí)短暫下降并在5. 5 7. 5小時(shí)回到高水平。為了區(qū)分TCR依賴性和獨(dú)立的ERK活化， 在⑶3活化后30分鐘時(shí)用酪氨酸激酶抑制劑PP2 (其抑制TCR依賴性lck/fyn src-類激 酶活性)阻斷TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。如圖5A的第二個(gè)圖所示，鑒于PP2處理影響的TCR依賴性的 ZAP-70的磷酸化，其在稍后的時(shí)間點(diǎn)沒有顯著影響ERK磷酸化，因而暗示ERK活化可獨(dú)立 于TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)維持。然而，當(dāng)PP2和PPADS (未顯示)或oATP (圖5A)聯(lián)合加入時(shí)，觀測 到ERK磷酸化的顯著抑制。因此，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)PP2和ARL67156 (外切ATP酶抑制劑，其延長 細(xì)胞外培養(yǎng)基中ATP的半衰期)聯(lián)用時(shí)，ERK活性增加。這些結(jié)果表明P2X受體依賴性的 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在維持T細(xì)胞活化中的重要作用。實(shí)施例4 :IL~2表汰和T細(xì)胞增殖依賴于細(xì)胞外ATP在T細(xì)胞活化后期ERK的磷酸化已被證明對IL-2表達(dá)有關(guān)鍵作用(Koike et al.， J Biol Chem 278 15685-15692 (2003))。因此我們推測在存在oATP時(shí)T細(xì)胞刺激可能抑制 IL-2表達(dá)。事實(shí)上，在oATP存在下，用結(jié)合平板的⑶3和⑶28單克隆抗體刺激離體分離的 幼稚的(圖6B)和效應(yīng)子/記憶(未顯示)CD4+T細(xì)胞，和未處理的細(xì)胞相比，引起細(xì)胞培養(yǎng) 液上清中IL-2顯著減少。用PPADS處理也觀測到類似抑制。根據(jù)假設(shè)的ATP在MAPK活化 中的作用，IL-2表達(dá)的oATP和PPADS依賴性抑制被同時(shí)添加(12_)十四酸佛波酯(_13_) 乙酸鹽(PMA)解救，其中PMA激活蛋白激酶C(PKC)(圖6B)。oATP對外周血液T細(xì)胞增殖 的抑制效應(yīng)已被報(bào)道(Baricordi et al. ,Blood 87:682-690(1996))。如圖6A所示，用結(jié) 合平板的CD3和CD28單克隆抗體刺激的幼稚的CD4 T細(xì)胞中，oATP幾乎完全抑制T細(xì)胞增 殖，測量為CFSE稀釋。該抑制通過以250U/ml添加IL-2解救，并通過添加PMA完全解救。 因而我們假設(shè)源于活化的T細(xì)胞釋放的ATP是自分泌環(huán)的一部分，其在T細(xì)胞生成活化中 其必要作用。NFAT核轉(zhuǎn)移不需要伴隨的MAPK活化，這獲得于寡霉素處理，提供導(dǎo)致T細(xì)胞無反 應(yīng)性的轉(zhuǎn)錄程序(Macian et al.，Cell 109:719-731(2002))。盡管有顯著的MAPK抑制， 但oATP不影響NFAT核轉(zhuǎn)移。然后，我們假設(shè)存在oATP時(shí)T細(xì)胞的活化能誘導(dǎo)T細(xì)胞無反 應(yīng)性。根據(jù)顯示在誘導(dǎo)無反應(yīng)性后早期有減少的TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的現(xiàn)有結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)在存 在oATP下，先前刺激的T細(xì)胞的鈣成像實(shí)驗(yàn)中有減少的反應(yīng)性。用離子霉素處理細(xì)胞也獲 得類似結(jié)果(圖 6D)(也見 Heissmeyer et al.，Nat Immunol 5 :255_265 (2004))。通過 FACS分析測定，oATP的效應(yīng)不是由于改變的TCR/CD3復(fù)合體在細(xì)胞表面的翻轉(zhuǎn)(數(shù)據(jù)未顯 示)。為了證實(shí)在存在oATP下T細(xì)胞刺激能上調(diào)無反應(yīng)性相關(guān)的基因，我們進(jìn)行Egr2和 Egr3(兩個(gè)經(jīng)無反應(yīng)性誘導(dǎo)特異誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子)的實(shí)時(shí)PCR分析(Safford et al.，Nat Immunol 6 472-480 (2005))。圖6C顯示當(dāng)添加oATP到培養(yǎng)基，在T細(xì)胞活化后早期(2小 時(shí))和晚期(16小時(shí))，Egr2和Egr3的轉(zhuǎn)錄顯著上調(diào)。一起添加PMA和oATP來克服MAPK 活化的缺乏，能強(qiáng)烈降低Egr2和Egr3的轉(zhuǎn)錄。這些結(jié)果指示T細(xì)胞活化中P2X信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo) 的缺乏使MAPK活化鈍化并提供無反應(yīng)性特有的轉(zhuǎn)錄程序。實(shí)施例5 :oATP在T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥中的效應(yīng)我們研究oATP作為藥物制劑來限制T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥的可能用途。在表達(dá)受小
33鼠胰島素啟動(dòng)子控制的流感血凝素(HA) (INS-HA)的RAG-2+小鼠中，繼承性轉(zhuǎn)移HA特異 的轉(zhuǎn)基因的TCR 6.5(TCR-HA)CD4細(xì)胞，能激起胰島炎和糖尿病迅速發(fā)作。我們從重建后1 到10天，通過每日兩次靜脈內(nèi)和腹腔內(nèi)注射PBS(陰性對照)或oATP處理小鼠。在oATP 處理的小鼠中血糖到12天都是正常的，而未處理和PBS處理的小鼠表現(xiàn)嚴(yán)重的多糖癥(圖 7A)。在oATP處理的小鼠的胰腺中沒有出現(xiàn)相關(guān)病理學(xué)發(fā)現(xiàn)。相反，在PBS處理的動(dòng)物中 檢出多病灶的聚結(jié)的炎癥損傷代替了胰島(圖7B)。繼承性轉(zhuǎn)移小鼠的TCR-HA+細(xì)胞在脾 中顯著減少(圖7C)，并且僅在oATP處理的動(dòng)物的胰腺中檢出(圖7D)。另外，鑒于在PBS 處理的小鼠的胰腺中大部分轉(zhuǎn)基因的T細(xì)胞被激活并表達(dá)CD69，在oATP處理的動(dòng)物的胰腺 中，CD69+細(xì)胞是不可檢出的(圖7D)。用HA 110 120肽脈沖離體培養(yǎng)脾細(xì)胞，并且培養(yǎng) 液中IL-6、IFN- y ,TNF- α的分析表明，相較于PBS處理的對照組，來自oATP處理的小鼠的 培養(yǎng)物的這些細(xì)胞因子在每個(gè)細(xì)胞中均顯著降低(圖7Ε)。為了檢測T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥的非轉(zhuǎn)基因的模型中的οΑΤΡ，我們在T淋巴細(xì)胞減少 性的cd3 ε +小鼠中通過注射幼稚的CD4+T細(xì)胞誘導(dǎo)炎性腸病(IBD)。我們使用注射結(jié)合 包含調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的⑶4+⑶25+細(xì)胞的幼稚的⑶4+Τ細(xì)胞的cd3 ε +小鼠作為健康 對照。事實(shí)上，通過調(diào)節(jié)性淋巴細(xì)胞和免疫抑制細(xì)胞因子的有效抑制被證明能調(diào)控粘膜免 疫和器官完整性。在細(xì)胞轉(zhuǎn)移后第15天開始，每日給所述IBD組靜脈內(nèi)注射PBS或oATP。 重建5周后腸的宏觀分析揭示，在用CD4+細(xì)胞繼承性轉(zhuǎn)移的小鼠和PBS注射的小鼠中，存在 腸壁增厚和未成形的或缺少的糞便。該表型在oATP處理的動(dòng)物中顯著改善；另外，脾和腸 系膜淋巴結(jié)大小正常(圖8Α)。oATP處理的小鼠的炎癥分值與注射CD4+和Treg細(xì)胞的動(dòng)物 無顯著差異(圖8Β)。引人注目的是，oATP處理的小鼠的脾和腸系膜淋巴結(jié)中⑶4+效應(yīng)子 /記憶亞類(⑶44+62L-)和⑶69+細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和表征和健康對照難以區(qū)分(圖8D、F)。 此外oATP顯著減少分泌促炎癥細(xì)胞因子(IL-2、IFN-y和TNF-α )的細(xì)胞的數(shù)量。有趣的 是，分泌IL-17的細(xì)胞(最近證明其協(xié)同生產(chǎn)IFN-γ的細(xì)胞激起嚴(yán)重的腸炎(Kullberg et al.，J Exp Med 203 =2485-2494(2006))數(shù)量，類似于注射CD4+和CD25+T細(xì)胞的對照小鼠 中的數(shù)量(圖8E)?？傊?，這些結(jié)果強(qiáng)烈支持oATP對P2X受體的抑制能抑制T細(xì)胞活化、增 殖和效應(yīng)功能，并在T細(xì)胞依賴性的炎癥中抑制組織損傷。實(shí)施例6 在T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥中施用PXlO的效應(yīng)我們的結(jié)果表明T細(xì)胞中parmexin hemicharmels在ATP釋放中的作用。為了進(jìn) 一步檢驗(yàn)該假說，我們研究parmexin hemichannels組裝的抑制是否類似于oATP抑制T細(xì) 胞活化。在存在100 μ M oATP或200 μ M PXlO肽時(shí)，用結(jié)合平板的抗⑶3/28抗體刺激負(fù)載 CFSE的人類T細(xì)胞。4天后，用FACS分析測量其增殖。PXlO肽和oATP都強(qiáng)烈抑制T細(xì)胞 增殖(圖9Α)。類似的，在存在oATP或PXlO肽時(shí)刺激小鼠T細(xì)胞，通過ELISA檢測檢出強(qiáng) 烈已知的IL-2分泌(圖9Β)。最后，我們檢測抑制parmexin-介導(dǎo)的ATP釋放是否可導(dǎo)致T細(xì)胞活化后ATP迅 速積累。預(yù)先用200 μ M PXlO溫育T細(xì)胞克隆30分鐘。然后用生物素化的抗⑶3抗體和 strepavidine交聯(lián)后刺激它們。在指示的時(shí)刻收集樣品，用去垢劑溶解并冰凍直到它們用 于標(biāo)準(zhǔn)的熒光素酶檢測來測定細(xì)胞ATP含量。如圖10所示，PXlO引起細(xì)胞內(nèi)ATP迅速上 升，因此指示parmexin hemi channels表示一個(gè)T細(xì)胞中釋放ATP到細(xì)胞外培養(yǎng)基的重要 路徑。
實(shí)施例7 施用oATP治療炎件腸病為了治療人的炎性腸病，可靜脈內(nèi)施用oATP達(dá)到局部濃度為100 μ M?？梢惶煲淮?或幾次施用oATP長達(dá)數(shù)周、數(shù)月、數(shù)年，或只要oATP治療能對患者提供治療效應(yīng)。預(yù)期這將 改善癥狀(比如腸壁增厚和未成形或減少的糞便)，并能減少分泌促炎癥細(xì)胞因子(IL-2、 IFN- y、TNF- α、IL-17)細(xì)胞的數(shù)量。實(shí)施例8 施用oATP治療糖尿病 為了治療人的糖尿病，可通過靜脈內(nèi)和/或腹腔內(nèi)注射施用oATP達(dá)到局部濃度為 100 μ Μ?？梢惶煲淮位驇状问┯胦ATP長達(dá)數(shù)周、數(shù)月、數(shù)年，或只要oATP治療能對患者提 供治療效應(yīng)。預(yù)期oATP治療將幫助使血糖水平正常化。實(shí)施例9 施用oATP抑制抑制排斥患有糖尿病的患者被植入包含胰島細(xì)胞的裝置。所述胰島優(yōu)選同種的或同基因型 的。結(jié)內(nèi)施用oATP到移植位點(diǎn)附近、鄰近或周圍的淋巴結(jié)，達(dá)到局部濃度為ΙΟΟμΜ。移植后，每天監(jiān)測患者的血糖水平。預(yù)期血糖水平的調(diào)控將通過植入裝置和施用 oATP而改善?？梢惶煲淮位驇状问┯胦ATP長達(dá)數(shù)周、數(shù)月、數(shù)年，或只要oATP治療能對患 者提供治療效應(yīng)。實(shí)施例10 通過oATP分化和擴(kuò)展Treg細(xì)胞在包含0. 5 μ g/ml抗CD3抗體、并增加100 μ M oATP和50U/ml IL-2的培養(yǎng)基中 共培養(yǎng)分選的幼稚的CD4+ CD25— CD44— CD62L+T細(xì)胞(105)和2. 5x10s耗盡受輻射的(50Gy) 脾細(xì)胞的T細(xì)胞。培養(yǎng)2 6天后，沖洗細(xì)胞并在包含50U/ml IL-2的培養(yǎng)基中重懸。培 養(yǎng)7 10天后通過流式細(xì)胞術(shù)檢測Treg細(xì)胞增殖。在oATP以100 μ M存在下，刺激幼稚 的⑶4+Τ細(xì)胞顯著增強(qiáng)⑶4+⑶25sFoXp3+Treg細(xì)胞的百分比(圖11A)。在抗⑶3抗體刺激 后第6天，用定量RT-PCR分析Thl (T-bet)、Thl7 (RORyT)給和Treg(Foxp3)細(xì)胞系的主 要轉(zhuǎn)錄因子，揭示在oATP存在下，存在Foxp3的連續(xù)上調(diào)，相反，在未治療的培養(yǎng)物中存在 T-bet的連續(xù)上調(diào)。另外，在以100 μ M添加oATP到培養(yǎng)基中時(shí)，包含天然Treg細(xì)胞的分選 的CD4+CD25 細(xì)胞的刺激在相同條件下誘導(dǎo)具有較高Foxp3表達(dá)水平的Treg細(xì)胞的擴(kuò)展 (圖 11B)。用100 μ M oATP制療抑制Thl7分化并促進(jìn)Foxp3表達(dá)。通過定量RT-PCR，我們 證明在偏向 Thl7 的條件(10ng/ml TGF β 和 20ng/mlIL_6 ；也參見，例如 Bettelli et al.， Nature 441 :235_238 (2006))下用抗CD3抗體刺激的T細(xì)胞中，100 μ M oATP逐漸增加 Foxp3的表達(dá)而抑制ROR y T的表達(dá)(圖12A)。通過FACS分析，表達(dá)Foxp3的⑶4+⑶25 s細(xì) 胞的絕對數(shù)是增加的(圖12B)。此外，刺激后分選的⑶4+CD25 天然Treg細(xì)胞向Thl7細(xì) 胞系的去分化(Koenen et al.，Blood 112(6) :2340_2352 (2008)被 100 μ M oATP 阻礙(圖 12C)。實(shí)施例11 通過用oATP治療Treg細(xì)胞有效抑制炎性腸病在IBD的小鼠模型中，其中不足以控制炎癥數(shù)量的Treg細(xì)胞被繼承性轉(zhuǎn)移給動(dòng) 物，繼承性轉(zhuǎn)移后14天開始每日用100μ1 3mM oATP靜脈內(nèi)施用治療，在第28天測量發(fā)現(xiàn) Treg細(xì)胞中增強(qiáng)的Foxp3表達(dá)(圖13A)。oATP治療的動(dòng)物沒有顯示腸炎的跡象，并且脾 和腸系膜淋巴結(jié)大小沒有增加(圖13B)，并在腸系膜淋巴結(jié)中表現(xiàn)出效應(yīng)子/記憶T細(xì)胞 數(shù)量減少(圖13C)。oATP施用后，較高的Foxp3表達(dá)可能揭示了在該環(huán)境下Treg細(xì)胞較
35高的免疫活性，由于腸系膜淋巴結(jié)中Treg/EM細(xì)胞的比例沒有通過oATP治療顯著改變(圖 13D)。t施例12 在炎t牛腸病的鼠類1草型中oATP對Treg細(xì)胞并歹言的效用我們觀察炎性腸病的鼠類模型中新Treg細(xì)胞的生成。該模型基于繼承性轉(zhuǎn)移分 選的幼稚的T細(xì)胞(⑶4+⑶25—⑶44—⑶62L+)到Cd3 ε +動(dòng)物中，其中沒有內(nèi)在的T細(xì)胞 區(qū)室。轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞迅速被腸道中的細(xì)菌激活，因而如果它們的活化/擴(kuò)展不被共轉(zhuǎn)移的 調(diào)控性T細(xì)胞控制，將在4周內(nèi)引起大面積腸炎，檢測Cd3 ε +小鼠的4個(gè)實(shí)驗(yàn)組中的Treg生殖(圖14)。組(1)(陰性對照)繼 承性轉(zhuǎn)移2 X IO5幼稚的⑶4+Τ細(xì)胞。組(2)繼承性轉(zhuǎn)移2 X IO5幼稚的⑶4+Τ細(xì)胞和100 μ 1 3mM oATP。組(3)繼承性轉(zhuǎn)移2X IO5幼稚的⑶4+T細(xì)胞，并在繼承性轉(zhuǎn)移16小時(shí)候接受 100 μ 1 3mM oATP的首次治療。組(4)繼承性轉(zhuǎn)移2X IO5幼稚的CD4+T細(xì)胞和IO5天然的 Treg細(xì)胞(陽性對照)。在第2 5天和8 12天組⑵和組(3)每日接受100 μ 1 3mM oATP的靜脈內(nèi)施用，而在第6和第7天沒有oATP施用。在第28天檢測小鼠。在最后一次注射oATP的第14天檢測動(dòng)物結(jié)腸的炎癥(圖15A)。另外檢測 脾和腸系膜淋巴結(jié)(LN)(如引流淋巴結(jié))中⑶4+亞群的存在。進(jìn)行FACS檢測來鑒定 ⑶4+CD25sFoxp3調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(圖15B)。效應(yīng)子記憶T細(xì)胞被認(rèn)為是⑶4+⑶44+CD62L—或 ⑶4+CD25+⑶69+。在該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭校c系膜淋巴結(jié)(而不是脾)中的Treg細(xì)胞和效應(yīng)子記 憶T細(xì)胞的比例似乎是防止疾病開始的關(guān)鍵(圖15C)。此外，當(dāng)在幼稚的T細(xì)胞首次活化 期間存在oATP時(shí)。從幼稚的T細(xì)胞生成Treg是最有效的。^MM 13/或擴(kuò)展調(diào)TreR細(xì)朐i臺(tái)療言言4勿抗箱t病移植手術(shù)之前，Treg細(xì)胞被分化和擴(kuò)展，如實(shí)施例10所報(bào)道，用受體細(xì)胞同種激 活(alloactivation)。然后在手術(shù)前或手術(shù)期間，在移植位點(diǎn)或附近進(jìn)行施用之前，檢測所 產(chǎn)生的Treg細(xì)胞產(chǎn)物的細(xì)胞活力和無菌性、以及存在的任何污染物。如有必要，隨后施用 相同劑量的分化和擴(kuò)展的Treg細(xì)胞給受試者，只要所述施用是有利的。實(shí)施例14 通過使用oATP治療改善NZB/NZW Fl小鼠的腎小球性腎炎全身性紅斑狼瘡(SLE)或其小鼠模型NZB/NZW Fl (Andrews et al.，J. Exp. Med. 148 :1198-1215(1978))，是一個(gè)慢性炎性病，特征描述為伴隨稍后血丙種球蛋白過多 的多克隆的B細(xì)胞激活和免疫復(fù)合物沉積引起的器官損傷。由于CD4+T細(xì)胞在疾病的開始 和傳播中起關(guān)鍵作用，我們檢測oATP治療是否可改善病癥。對25周齡(當(dāng)大部分動(dòng)物表現(xiàn) 蛋白尿時(shí))的雌性NZB/NZW Fl小鼠靜脈內(nèi)施用PBS或oATP(以100 μ 1 3mM,治療5天，中 斷2天)6周。在首次治療后和oATP施用3周后每隔一段時(shí)間測量蛋白尿值。大多數(shù)PBS 治療的動(dòng)物表現(xiàn)逐漸增長的蛋白尿值，而oATP治療的小鼠中，蛋白尿值仍類似于治療前水 平(圖16和圖17，上圖)。腎的組織病理學(xué)評估顯示oATP治療的動(dòng)物中，腎小球增殖、淋 巴單核細(xì)胞滲透、免疫復(fù)合物沉積顯著減少(圖17，下圖)。此外，oATP施用顯著減少脾和 淋巴結(jié)中的效應(yīng)子/記憶T細(xì)胞的數(shù)量(圖18，下圖)。在源于oATP治療動(dòng)物的細(xì)胞中， 分選的效應(yīng)子/記憶T細(xì)胞的再次刺激引起較低的IL-4和IFNy分泌水平(圖18、16，下 圖)。實(shí)施例15 :oATP在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的鼠類模型中的效用DBA/1小鼠，易感于膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，是風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的鼠類模型
36(Stuart et al.，J. Clin. Invest. 69 :673_683 (1982))。通過在尾巴根部皮內(nèi)注射 0. 2ml 乳 劑免疫DBA/1小鼠(第0天)，所述乳劑包含200 μ g牛的二型膠原蛋白和包含0. 2mg結(jié)核 桿菌的弗氏完全佐劑。該方法通常大約從18 20天開始引起出現(xiàn)影響一個(gè)或多個(gè)肢體的 炎癥跡象。從第18天開始，根據(jù)臨床評分對所述動(dòng)物單獨(dú)劃分疾病嚴(yán)重度，具體評分如下(a)在前腳和后腳的指頭上存在炎癥的臨床可視的評分0 =沒有病癥0. 5 = 1 5根指頭/腳趾具有炎癥跡象1 = 6 10根指頭/腳趾具有炎癥跡象1. 5 = 11 15根指頭/腳趾具有炎癥跡象2 = 16 20根指頭/腳趾具有炎癥跡象(b)在前腳和后腳上出現(xiàn)爪水腫的臨床腫脹的評分。用精密的卡尺每日測量前腳 和后腳的爪子厚度前據(jù)P0 =沒有病癥(爪子厚度達(dá)1. 29mm)0. 5 =爪子厚度在1. 30和1. 49mm之間1 =爪子厚度在1.50和1.89mm之間2 =爪子厚度在1. 90和2. 20mm之間3 =爪子厚度大于2. 20mm后腳0 =沒有病癥(爪子厚度達(dá)1. 99mm)0. 5 =爪子厚度在2. 00和2. 19mm之間1 =爪子厚度在2. 20和2. 59mm之間2 =爪子厚度在2. 60和3. OOmm之間3 =爪子厚度大于3. OOmm之間兩個(gè)獨(dú)立的臨床評分的總和(指頭和爪子的炎癥跡象)是總的臨床評分。因此每 個(gè)動(dòng)物最大的腫脹評分是14。免疫后當(dāng)它們臨床評分至少為1. 5時(shí)，治療小鼠18 20天。使小鼠靜脈內(nèi)接受 οΑΤΡ(100μ 1 3mM)或?qū)φ盏腜BS，用藥方案為治療5天，中斷2天，再治療5天，從第0天開 始，共12天。每天評估oATP治療和對照組的起始臨床評分的平均偏差。第13天處死小鼠。 治療開始5天后，oATP治療組的臨床評分偏差仍始終維持低于對照組的臨床評分偏差(圖 19)。對源于oATP治療小鼠和對照小鼠的樣品進(jìn)行二型膠原蛋白ELISA，用抗二型膠 原蛋白的小鼠 IgG ELISA 試劑盒 #CIIAB96-M，源于 MDBiosciences，Europe, division of Morwell Diagnostics，Zurich，Switzerland。相較于對照組，oATP治療降級治療小鼠中膠 原蛋白特異的抗體的百分比(圖20)。實(shí)施例16 :crt^小鼠中通過用oATP治療改善表型用源于鈣網(wǎng)蛋白(crt)+和(crt)v+E13胚胎的胎兒肝臟的造血祖細(xì)胞重建重組 酶缺陷的Balb/c小鼠(圖21)。產(chǎn)生的crt+胎兒肝臟嵌合體(FLC)的表型，其類似于移植物抗宿主病(GVHD)(參見，例如，Porcellini et al.，J Exp Med 203:461-471(2006))， 在轉(zhuǎn)移后第8、10、12周對其評估，并在第12周和crt+AFLC的表型比較。相較于crt+AFLC， 所述crt+FLC表現(xiàn)逐漸惡化的脫發(fā)、瞼炎、姿勢蜷縮和衰竭綜合征(圖22)。皮膚的蘇木 精-伊紅染色顯示在crt+FLC中有嚴(yán)重的真皮粒細(xì)胞炎性滲透，和crtv+FLC相反，其中缺 乏炎癥細(xì)胞(圖23)。使crtv+和crt+FLCs每天接受PBS或6mM οΑΤΡ(100 μ L)靜脈內(nèi)治療兩周。用 oATP治療顯著改善crt+小鼠的瞼炎(圖24)。此外，以隨機(jī)的方式進(jìn)行的皮膚活體組織 檢查的組織病理學(xué)評估顯示，在crt+FLC中用oATP治療引起瞼炎的組織學(xué)改善(包括炎 癥和表皮增生)(圖25)。本說明書所引用的所有出版物和專利通過引用并入本文，如同每個(gè)出版物或?qū)＠?申請都被具體且單獨(dú)地指出通過引用并入本文。
權(quán)利要求
1.抑制ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑用于制備抑制至少一種T細(xì)胞活性的藥物的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中所述T細(xì)胞活性選自活化、增殖、分化、存活、細(xì)胞裂解活 性及細(xì)胞因子產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求1的用途，其中所述抑制ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑是P2X受體拮抗劑。
4.權(quán)利要求3的用途，其中所述制劑是oATP。
5.權(quán)利要求1的用途，其中所述抑制ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑是抑制parmexin hemichannels功能的制劑。
6.權(quán)利要求5的用途，其中所述制劑是含SEQID NO :1的氨基酸序列的肽。
7.抑制ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑用于制備誘導(dǎo)T細(xì)胞無反應(yīng)性的藥物的用途。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述制劑是oATP。
9.抑制parmexinhemicharmels功能的制劑用于制備誘導(dǎo)T細(xì)胞無反應(yīng)性的藥物的用途。
10.權(quán)利要求9的用途，其中所述制劑是含SEQID NO :1的氨基酸序列的肽。
11.權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)的用途，其中所述T細(xì)胞是分泌IL-17的T細(xì)胞。
12.抑制ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑用于制備治療細(xì)胞死亡或組織損傷的藥物的用途。
13.抑制ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的制劑用于制備治療免疫或炎性疾病的藥物的用途。
14.權(quán)利要求13的用途，其中所述免疫或炎性疾病是T淋巴細(xì)胞依賴性炎性疾病。
15.權(quán)利要求14的用途，其中所述T淋巴細(xì)胞依賴性炎性疾病選自1型糖尿病、炎性 腸病、多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及銀屑病。
16.權(quán)利要求14的用途，其中所述T淋巴細(xì)胞依賴性炎性疾病是移植排斥或移植物抗 宿主病。
17.權(quán)利要求14的用途，其中所述T淋巴細(xì)胞依賴性炎性疾病是皮膚病。
18.權(quán)利要求17的用途，其中所述皮膚病選自銀屑病、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、皮膚移植 物抗宿主病、特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、斑禿、白癜風(fēng)、藥物相關(guān)的疹、接觸性超敏反 應(yīng)、紅斑狼瘡、苔蘚痘疹樣糠疹、慢性苔蘚性糠疹、濕疹及扁平苔蘚。
19.權(quán)利要求12 18中任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物配制成用于體內(nèi)施用。
20.權(quán)利要求19的用途，其中所述制劑經(jīng)納米膠囊化。
21.權(quán)利要求19的用途，其中所述藥物配制成用于結(jié)內(nèi)施用。
22.權(quán)利要求19的用途，其中所述藥物配制成用于局部施用。
23.含oATP的組合物用于制備促進(jìn)哺乳動(dòng)物祖細(xì)胞分化成Treg細(xì)胞的藥物的用途。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述含oATP的組合物還含至少一種下列物質(zhì)(a)T細(xì)胞初次刺激物；(b)細(xì)胞成分；及(c)可溶性介質(zhì)。
25.權(quán)利要求24的用途，其中所述T細(xì)胞初次刺激物含一種或多種選自下列的制劑 結(jié)合T細(xì)胞受體的配體及蛋白激酶C激活物。
26.權(quán)利要求25的用途，其中所述T細(xì)胞初次刺激物是抗CD3抗體。
27.權(quán)利要求24的用途，其中所述細(xì)胞成分選自受照射的脾細(xì)胞、移動(dòng)的細(xì)胞產(chǎn)物、 白細(xì)胞去除術(shù)細(xì)胞產(chǎn)物、髂嵴細(xì)胞產(chǎn)物和/或椎體。
28.權(quán)利要求27的用途，其中所述細(xì)胞成分是同基因受照射的脾細(xì)胞。
29.權(quán)利要求24的用途，其中所述可溶性介質(zhì)選自視黃酸、雷帕霉素、5-氮胞苷、制滴 菌素Α、α 1-抗胰蛋白酶、TGF-β、白介素(比)-2)、0)80、4-188、0)52激動(dòng)劑、0)28抗體、 淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原 _3 (LFA-3)、CD2、CD40、CD80/B7-1、CD86/B7-2、0X-2、CD70 及 CD82。
30.權(quán)利要求24的用途，其中所述組合物含oATP、T細(xì)胞初次刺激物及細(xì)胞成分。
31.權(quán)利要求30的用途，其中所述組合物含oATP、抗⑶3抗體及同基因受照射的脾細(xì)胞。
32.促進(jìn)調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞體外擴(kuò)展的方法，包括以下步驟使Treg細(xì)胞與含oATP 的組合物接觸。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述含oATP的組合物還含至少一種下列物質(zhì)(a)T細(xì)胞初次刺激物；(b)細(xì)胞成分；及(c)可溶性介質(zhì)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述T細(xì)胞初次刺激物含一種或多種選自下列的制劑 結(jié)合T細(xì)胞受體的配體及蛋白激酶C激活物。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述T細(xì)胞初次刺激物是抗CD3抗體。
36.權(quán)利要求33的方法，其中所述細(xì)胞成分選自受照射的脾細(xì)胞、移動(dòng)的細(xì)胞產(chǎn)物、 白細(xì)胞去除術(shù)細(xì)胞產(chǎn)物、髂嵴細(xì)胞產(chǎn)物和/或椎體。
37.權(quán)利要求36的方法，其中所述細(xì)胞成分是同基因受照射的脾細(xì)胞。
38.權(quán)利要求33的方法，其中所述可溶性介質(zhì)選自視黃酸、雷帕霉素、5-氮胞苷、制滴 菌素Α、α 1-抗胰蛋白酶、TGF-β、白介素(比)-2)、0)80、4-188、0)52激動(dòng)劑、0)28抗體、 淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原 _3 (LFA-3)、CD2、CD40、CD80/B7-1、CD86/B7-2、0X-2、CD70 及 CD82。
39.權(quán)利要求33的方法，其中所述組合物含oATP、T細(xì)胞初次刺激物及細(xì)胞成分。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述組合物含oATP、抗CD3抗體及同基因受照射的脾細(xì)胞。
41.含oATP的組合物用于制備促進(jìn)調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)展的藥物的用途。
42.權(quán)利要求32 41中任一項(xiàng)的擴(kuò)展的Treg細(xì)胞用于制備治療細(xì)胞死亡或組織損傷 的藥物的用途。
43.權(quán)利要求32 41中任一項(xiàng)的擴(kuò)展的Treg細(xì)胞用于制備治療免疫或炎性疾病的藥 物的用途。
44.權(quán)利要求43的用途，其中所述免疫或炎性疾病是T淋巴細(xì)胞依賴性炎性疾病。
45.權(quán)利要求44的用途，其中所述T淋巴細(xì)胞依賴性炎性疾病是與肥大細(xì)胞脫顆粒相 關(guān)的疾病。
46.權(quán)利要求45的用途，其中所述與肥大細(xì)胞脫顆粒相關(guān)的疾病選自哮喘、過敏及過 敏性休克。
47.權(quán)利要求43的用途，其中所述免疫或炎性疾病是自身免疫疾病、移植排斥或移植 物抗宿主病。
48.權(quán)利要求32 41中任一項(xiàng)的擴(kuò)展的Treg細(xì)胞用于制備治療需要Treg細(xì)胞的受 試者的藥物的用途。
49.抑制Treg細(xì)胞體外轉(zhuǎn)變?yōu)榉荰reg細(xì)胞的方法，包括以下步驟使Treg細(xì)胞與含 oATP的組合物接觸。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述非Treg細(xì)胞是病原性T細(xì)胞。
51.權(quán)利要求50的方法，其中所述病原性T細(xì)胞是Thl7細(xì)胞。
52.將非Treg細(xì)胞體外轉(zhuǎn)變?yōu)門reg細(xì)胞的方法，包括以下步驟使非Treg細(xì)胞與含 oATP的組合物接觸。
53.權(quán)利要求52的方法，其中所述非Treg細(xì)胞是病原性T細(xì)胞。
54.權(quán)利要求53的方法，其中所述病原性T細(xì)胞是Thl7細(xì)胞。
55.體外增強(qiáng)Treg細(xì)胞活性的方法，包括以下步驟使Treg細(xì)胞與含oATP的組合物 接觸。
56.權(quán)利要求55的方法，其中所述活性是免疫抑制活性。
57.含oATP的組合物用于制備抑制Treg細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)榉荰reg細(xì)胞的藥物的用途。
58.含oATP的組合物用于制備將非Treg細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)門reg細(xì)胞的藥物的用途。
59.含oATP的組合物用于制備體內(nèi)增強(qiáng)Treg細(xì)胞活性的藥物的用途。
60.權(quán)利要求57 59中任一項(xiàng)的用途，其中所述oATP經(jīng)納米膠囊化。
61.權(quán)利要求57 59中任一項(xiàng)的用途，其中所述受試者具有細(xì)胞死亡或組織損傷。
62.權(quán)利要求57 59中任一項(xiàng)的用途，其中所述受試者患有免疫或炎性疾病。
63.權(quán)利要求62的用途，其中所述免疫或炎性疾病是自身免疫疾病、移植排斥或移植 物抗宿主病。
64.權(quán)利要求62的用途，其中所述免疫或炎性疾病是炎性腸病。
65.權(quán)利要求62的用途，其中所述免疫或炎性疾病是T淋巴細(xì)胞依賴性炎性疾病。
66.權(quán)利要求65的用途，其中所述T淋巴細(xì)胞依賴性炎性疾病是與肥大細(xì)胞脫顆粒相 關(guān)的疾病。
67.權(quán)利要求66的用途，其中所述與肥大細(xì)胞脫顆粒相關(guān)的疾病選自哮喘、過敏及過 敏性休克。
68.權(quán)利要求1、7、9、12、13、23、41及57 59中任一項(xiàng)的用途，其中所述藥物配制成用 于經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、經(jīng)消化道、脊柱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)(intra-articularly)、關(guān)節(jié) 內(nèi)(intra-joint)、皮下、頰部、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸、皮膚、透皮、眼部、經(jīng)耳、粘膜、經(jīng)鼻、經(jīng)氣管、 經(jīng)支氣管、舌下、結(jié)內(nèi)、通過任何腸胃外途徑或通過吸入施用。
69.權(quán)利要求48的用途，其中所述藥物配制成用于經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、 經(jīng)消化道、脊柱內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)(intra-articularly)、關(guān)節(jié)內(nèi)(intra-joint)、皮下、頰部、經(jīng)陰 道、經(jīng)直腸、皮膚、透皮、眼部、經(jīng)耳、粘膜、經(jīng)鼻、經(jīng)氣管、經(jīng)支氣管、舌下、結(jié)內(nèi)、通過任何腸 胃外途徑或通過吸入施用。
70.抑制至少一種T細(xì)胞活性的方法，包括以下步驟使T細(xì)胞與抑制ATP介導(dǎo)的T細(xì) 胞活化的制劑的接觸。
71.誘導(dǎo)T細(xì)胞無反應(yīng)性的方法，包括以下步驟使T細(xì)胞與抑制parmexin hemichannels功能的制劑接觸。
72.治療細(xì)胞死亡或組織損傷的方法，包括以下步驟使T細(xì)胞與抑制ATP介導(dǎo)的T細(xì) 胞活化的制劑的接觸。
73.治療免疫或炎性疾病的方法，包括以下步驟使T細(xì)胞與抑制ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活 化的制劑的接觸。
74.促進(jìn)哺乳動(dòng)物祖細(xì)胞分化成Treg細(xì)胞的方法，包括以下步驟使能分化成Treg細(xì) 胞的細(xì)胞與含oATP的組合物接觸。
75.促進(jìn)調(diào)節(jié)性T(Treg)細(xì)胞擴(kuò)展的方法，包括以下步驟使Treg細(xì)胞與含oATP的組 合物接觸。
76.抑制Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉荰reg細(xì)胞的方法，包括以下步驟使Treg細(xì)胞與含oATP 的組合物接觸。
77.將非Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)門reg細(xì)胞的方法，包括以下步驟使非Treg細(xì)胞與含oATP 的組合物接觸。
78.增強(qiáng)Treg細(xì)胞活性的方法，包括以下步驟使Treg細(xì)胞與含oATP的組合物接觸。
全文摘要
本發(fā)明提供使用ATP介導(dǎo)的T細(xì)胞活化的抑制劑(比如氧化的ATP)來調(diào)節(jié)至少一種T細(xì)胞依賴性免疫應(yīng)答，以用于治療和研究目的的方法和組合物。
文檔編號(hào)A61K31/56GK101998864SQ200980111707
公開日2011年3月30日 申請日期2009年3月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月3日
發(fā)明者烏爾蘇拉·申克, 卡米洛·理克迪, 法比奧·格拉西 申請人:聚合生物技術(shù)公司;法比奧·格拉西;烏爾蘇拉·申克