專利名稱：治療和預(yù)防與αVβ5整聯(lián)蛋白有關(guān)的疾病的方法和組合物的制作方法
交叉參考相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求2004年4月2日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/559,175的權(quán)益，其中公開(kāi)的內(nèi)容完全引入作為參考。
有關(guān)發(fā)明權(quán)利的聲明由聯(lián)邦發(fā)起研究和開(kāi)發(fā)本發(fā)明是由國(guó)家衛(wèi)生研究院(the National Institutes of Health)資助的HL53949號(hào)基金在政府支持下進(jìn)行的。政府擁有本發(fā)明的一些權(quán)利。
背景技術(shù)：
肺水腫(“PE”)每年影響數(shù)百萬(wàn)的人，引起大量的發(fā)病率和死亡率。在PE患者中，具有來(lái)自肺毛細(xì)血管液體的肺泡流體妨礙氧向系統(tǒng)循環(huán)的轉(zhuǎn)運(yùn)(Hall等，in Current Therapy in Respiratory Medicine(R.Cherniack，Ed.，1986)，pp.222-227)。如果未采取正確的措施，這一系列事件將導(dǎo)致低血氧、高碳酸血癥和死亡。
破壞肺部流體動(dòng)態(tài)平衡的所有情況或藥物可導(dǎo)致PE，廣義上PE可分成心源性的和非心源性的PE(參見(jiàn)，例如，Kakouros和Kakouros，Hellenic J.Cardiol.44385-391(2003)。例如，急性肺損傷/成人(急性)呼吸窘迫癥或“ARDS”(其可由例如肺炎、感染性休克、創(chuàng)傷、嘔吐吸引術(shù)、或吸入化學(xué)物質(zhì)產(chǎn)生的肺損傷導(dǎo)致)經(jīng)常與非心源性PE同時(shí)出現(xiàn)。非心源性PE的特點(diǎn)是肺組織血管通透性增加，導(dǎo)致肺中流體水平增加。心源性PE通常由左心衰竭導(dǎo)致，也可以是心梗發(fā)作、心瓣膜泄漏或狹窄(二尖瓣或主動(dòng)脈瓣)、或?qū)е滦募√撊鹾?或僵硬(心肌病)的任何心臟疾病的并發(fā)癥。病態(tài)的心臟將其增加的壓力傳遞給肺靜脈。當(dāng)肺靜脈壓力增加時(shí)，流體擠入氣體空間(肺泡)。然后這些液體成為正常氧交換的障礙，導(dǎo)致呼吸急促。心源性PE的特點(diǎn)是毛細(xì)管流體靜水壓增加，導(dǎo)致肺中流體水平增加。
PE是由下列疾病導(dǎo)致的例如毛細(xì)血管通透性改變、感染、吸入的或循環(huán)毒素、血管活性物質(zhì)(例如組胺、激肽)、彌散性血管內(nèi)凝血、免疫反應(yīng)、放射相關(guān)的肺炎、尿毒癥、近乎溺死(near drowning)、吸煙和急性呼吸窘迫癥、左心室衰竭、二尖瓣狹窄、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、肺靜脈纖維化、肺靜脈起點(diǎn)先天性狹窄、肺靜脈占位性疾病(pulmonary venoocclusive disease)、流體過(guò)度灌注、血白蛋白減少(如腎、肝臟、營(yíng)養(yǎng)或蛋白丟失性腸病導(dǎo)致)、高高度(high-altitude)、藥物過(guò)量、CNS創(chuàng)傷、蛛網(wǎng)膜下出血、肺栓塞、肺實(shí)質(zhì)性疾病、驚厥、麻醉、和心肺分流手術(shù)。
PE癥狀可包括，例如，呼吸短促、呼吸急促和/或用力呼吸、心悸、高血壓、胸悶、伴有或不伴有發(fā)紺的四肢發(fā)冷、咳嗽伴有發(fā)泡或粉紅色痰、附屬呼吸肌廣泛參與呼吸、伴有或不伴有哮喘的濕羅音、及其組合。PE診斷的檢測(cè)包括血液測(cè)試如全血計(jì)數(shù)(CBC)、血液尿素氮(BUN)、肌酐和血清蛋白質(zhì)。尿液分析、動(dòng)脈血?dú)夥治?ABGs)、胸部X-射線、心電圖(ECG)和所有用于幫助醫(yī)生縮小PE診斷范圍的檢測(cè)方法。
心源性PE治療的代表性方法包括將患者置于100％的氧氣中、使用嗎啡減輕焦慮和提供某些有益的心臟作用，速尿利尿，血管擴(kuò)張劑用于減少相對(duì)于心肌必須泵出的量的工作量、影響肌收縮力的藥物如doputamine以增加心肌收縮性。其他使用過(guò)的方法是在四肢中的三個(gè)上使用旋轉(zhuǎn)止血帶，可以減少500ml血容積。
不幸的是，還沒(méi)有特異的或療效令人滿意的PE治療方法。因此，所屬領(lǐng)域中仍需要更有效和特異性的PE治療方式。本申請(qǐng)是針對(duì)此問(wèn)題及其他一些問(wèn)題的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于治療和預(yù)防與αvβ5整聯(lián)蛋白有關(guān)的疾病如PE的組合物和方法。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供治療或預(yù)防哺乳動(dòng)物對(duì)象(subject)(例如靈長(zhǎng)類動(dòng)物如人、猴子、或黑猩猩；犬科動(dòng)物；或貓)的PE的方法。給藥所述對(duì)象治療量或預(yù)防量的αvβ5整聯(lián)蛋白拮抗劑。所述拮抗劑可以是，例如，小于1kDa、小于0.5Da、或小于0.25KDa的藥物。所述拮抗劑可以是抗體或抗體片段、包括人源化抗體，scFv，F(xiàn)ab，或(Fab’)2。所述抗體可以是ALULA、人源化ALULA、或與ALULA競(jìng)爭(zhēng)特異性與αvβ5整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體。給藥可以是但不限于靜脈內(nèi)、鼻腔內(nèi)、或氣管內(nèi)。本發(fā)明的方法可用于治療患有PE或處于發(fā)生PE危險(xiǎn)的個(gè)體?？梢越o所述對(duì)象第二種用于治療或預(yù)防急性肺損傷和/或ARDs和或PE的治療藥物，所述治療藥物包括但不限于，例如TGFβ途徑抑制劑、活化的蛋白C、類固醇、GM-CSF、利尿劑、支氣管擴(kuò)張劑、血小板抑制劑、與αvβ5整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體，與β5結(jié)合的抗體、第二種αvβ5整聯(lián)蛋白拮抗劑、αvβ6整聯(lián)蛋白的拮抗劑、β2激動(dòng)劑，或表面活性劑。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了特異性與ALULA競(jìng)爭(zhēng)與αvβ5整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體。本實(shí)施方案的抗體可以是ALULA本身、人源化ALULA、ALULA片段包括，例如ALULA的scFv、Fab和(Fab’)2，或其他與ALULA競(jìng)爭(zhēng)與αvβ5整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體。本發(fā)明同時(shí)提供了含所述抗體和可藥用賦形劑的藥物組合物。所述藥物組合物可進(jìn)一步含有第二種治療或預(yù)防PE的治療劑(如TGFβ途徑抑制劑、活化的蛋白C、類固醇、GM-CSF、血小板抑制劑、利尿劑、支氣管擴(kuò)張劑、與αvβ5整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體，與β5結(jié)合的抗體、第二種αvβ5整聯(lián)蛋白拮抗劑、αvβ6整聯(lián)蛋白的拮抗劑)?；蛘?，所述藥物組合物可以含有治療中風(fēng)、心肌梗死、和癌癥(如血管生成)的藥物。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供鑒定治療PE藥物的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括，將多種藥物(agents)與αvβ5整聯(lián)蛋白接觸，選擇與αvβ5整聯(lián)蛋白配體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的藥物，然后測(cè)定所選擇的藥物對(duì)PE的效果。對(duì)PE有作用的藥物可鑒定為治療PE的藥物。所述多種藥物可以是多種抗體或可在1KDa以下。所述配體可以是抗體，包括，例如ALULA，或者可以是玻連蛋白、纖連蛋白、骨橋蛋白、生腱蛋白c和腺病毒五鄰體基(adenoviruspenton base)。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了治療或預(yù)防PE的試劑盒。所述試劑盒含αvβ5整聯(lián)蛋白的拮抗劑(如包括ALULA的單克隆抗體、與ALULA競(jìng)爭(zhēng)與αvβ5整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體)和第二種治療肺水腫的藥物(如TGFβ途徑抑制劑、活化蛋白C、類固醇、GM-CSF、血小板抑制劑、利尿劑、支氣管擴(kuò)張劑、與αvβ5整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體，與β5結(jié)合的抗體、第二種αvβ5整聯(lián)蛋白拮抗劑、αvβ6整聯(lián)蛋白拮抗劑、β2激動(dòng)劑，或表面活性劑)。
本發(fā)明的這些和其他實(shí)施方案進(jìn)一步在下列詳述部分闡明。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1顯示了體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果，證明可保護(hù)β5-/-小鼠免受PE誘導(dǎo)的肺損傷。
圖2顯示了體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果，證明與β5特異性結(jié)合的抗體(即ALULA)可減輕PE誘導(dǎo)的缺血再灌注損傷的嚴(yán)重程度。
圖3顯示體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果，證明與β5特異性結(jié)合的抗體(即ALULA)可減輕高潮氣量換氣肺損傷誘導(dǎo)的嚴(yán)重程度。
圖4顯示體外試驗(yàn)結(jié)果，證明與β5特異性結(jié)合的抗體(即ALULA)可阻斷表達(dá)αvβ5整聯(lián)蛋白的細(xì)胞與包被有多種濃度αvβ5整聯(lián)蛋白配體玻連蛋白的培養(yǎng)皿的粘附。

發(fā)明內(nèi)容
I.前言本發(fā)明部分基于用結(jié)合αvβ5整聯(lián)蛋白的藥物治療動(dòng)物可減輕PE癥狀的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)。具體而言，阻斷配體與αvβ5整聯(lián)蛋白的結(jié)合可減輕PE的嚴(yán)重程度。發(fā)明人已經(jīng)證實(shí)與一種與αvβ5整聯(lián)蛋白結(jié)合的抗體可阻斷玻連蛋白與αvβ5整聯(lián)蛋白的結(jié)合，玻連蛋白是αvβ5整聯(lián)蛋白的配體。發(fā)明人進(jìn)一步證實(shí)給藥與αvβ5整聯(lián)蛋白的結(jié)合抗體可減輕PE的嚴(yán)重程度。因此，本發(fā)明提供了通過(guò)給藥所述對(duì)象治療有效量的αvβ5拮抗劑治療或預(yù)防對(duì)象PE的方法。
本發(fā)明也提供了與指定為“ALULA”的公開(kāi)抗體競(jìng)爭(zhēng)的抗體以及含所述抗體的藥物組合物。正如下面實(shí)施例中的更詳細(xì)的描述，ALULA與αvβ5整聯(lián)蛋白結(jié)合，向哺乳動(dòng)物對(duì)象給藥ALULA可減輕所述對(duì)象中PE的嚴(yán)重程度。
通過(guò)鑒定與αvβ5整聯(lián)蛋白相互作用的藥物并測(cè)試其治療PE的能力，本發(fā)明也提供了鑒定治療PE的新藥物的方法。
II.定義“αvβ5拮抗劑”指所有與αvβ5配體競(jìng)爭(zhēng)αvβ5整聯(lián)蛋白上可配體結(jié)合位點(diǎn)的藥物。αvβ5拮抗劑包括特異性與αvβ5、β5結(jié)合的藥物、以及與αvβ5或β5結(jié)合并至少與一種其他整聯(lián)蛋白如αvβ3或αvβ6結(jié)合的藥物。
αvβ5整聯(lián)蛋白是含非共價(jià)結(jié)合的α/β異二聚體，尤其是介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)相互作用、和細(xì)胞-病原體相互作用的粘附分子家族中的一員。αvβ5是唯一含β5亞單位的整聯(lián)蛋白。αvβ5整聯(lián)蛋白識(shí)別RGD肽序列并與玻連蛋白結(jié)合(參見(jiàn)，例如Hynes，Cell 6911-25(1992)，其參與多種疾病如中風(fēng)、心肌梗塞、癌癥(如血管生成)、和眼新血管生成疾病(參見(jiàn)，例如，F(xiàn)riedlander等，Science 270(5241)1500-2(1995)；Friedlander等，PNAS USA93(18)9764-9(1996)；Elicieri等，J.Cell Biol.157(10149-159(2002)；Heba等，J.Vasc.Res.38(3)288-300(2001)；Soeki等，Cardiology 93(3)168-74(2000)；和Li等，Am.J.Physiol.270(5Pt2)H1803-11(1996)。αv和β5都已經(jīng)測(cè)序并表征(分別參見(jiàn)，例如，Hynes，1992supra和美國(guó)專利5,527,679)。
αvβ5整聯(lián)蛋白拮抗劑的“治療劑量”或“治療有效量”或“有效量”是指所述拮抗劑預(yù)防、緩解、緩和、或減輕患者與αvβ5整聯(lián)蛋白有關(guān)的疾病癥狀的嚴(yán)重程度的量，有關(guān)的疾病包括，例如中風(fēng)、心肌梗塞、癌癥(如血管生成)、眼新血管生成疾病、和PE(如肺中流體積聚、肺毛細(xì)血管靜水壓增加、或呼吸急促)。
術(shù)語(yǔ)“抗體”指編碼免疫球蛋白基因的多肽或其特異性結(jié)合和識(shí)別抗原的功能性片段。所述識(shí)別的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、σ、和μ恒定區(qū)基因，以及無(wú)數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分為κ或λ。重鏈分為μγ、α、δ、或σ，其反過(guò)來(lái)限定了免疫球蛋白的類型，分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
典型的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單位含四聚體。每個(gè)四聚體由兩對(duì)相同的多肽鏈組成，每對(duì)有一條“輕鏈”(約25kDa)和一條“重鏈”(約50-70kDa)組成。每條鏈的N-末端有約100至110或更多氨基酸形成的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。因此，術(shù)語(yǔ)“重鏈可變區(qū)”、“VH”、或“VH”代表免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)。包括Fv、scFv、dsFv或Fab；而術(shù)語(yǔ)“輕鏈可變區(qū)”、“VL”或“VL”代表免疫球蛋白輕鏈的可變區(qū)，包括Fv、scFv、dsFv或Fab。
抗體功能性片段的例子包括但不限于，完整的抗體分子、抗體片段如Fv、單鏈Fv(scFv)，互補(bǔ)識(shí)別區(qū)(CDRs)，VL(輕鏈可變區(qū))、VH(重鏈可變區(qū))、Fab、F(ab)2′和這些片段的所有組合或其他任何能與目標(biāo)抗原結(jié)合的免疫球蛋白的功能部分(參見(jiàn)，例如，F(xiàn)undamental Immunology(Paul ed.，4th ed.2001)。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)意識(shí)到，不同的抗體片段可通過(guò)不同的方法獲得，例如，用酶如胰酶消化完整的抗體；或從頭合成?？贵w片段經(jīng)常使用化學(xué)或重組DNA方法進(jìn)行從頭合成。因此，這里使用的術(shù)語(yǔ)抗體包括對(duì)整個(gè)抗體進(jìn)行修飾的、或那些采用重組DNA技術(shù)(如單鏈Fv)從頭合成的抗體片段或那些用噬菌體表達(dá)文庫(kù)(phage display libraries)鑒定的(參見(jiàn)，例如McCafferty等(1990)Nature 348552)。術(shù)語(yǔ)“抗體”還包括二價(jià)或雙特性分子、二聯(lián)體(diabodies)、三聯(lián)體(triabodies)、和四聯(lián)體(tetrabodies)。二價(jià)和雙特性分子如下列文獻(xiàn)所述Kostelny等(1992)J.Immunol.1481547，Pack和Pluckthun(1992)Biochemistry 311579，Hollinger等(1993)，PNAS.USA906444，Gruber等，(1994)J Immunol.5368，Zhu等(1997)Protein Sci.6781，Hu等(1996)Cancer Res.563055，Adams等(1993)Cancer Res.534026，和McCartney等(1995)Protein Eng.8301。
“人源化”抗體是指保留非人抗體的反應(yīng)性而對(duì)人的免疫原性較小。例如這可以通過(guò)保留非人CDR區(qū)而用人的相對(duì)應(yīng)的部分替換所述抗體剩余的部分。參見(jiàn)，例如，Morrison等，PNAS USA，816851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，4465-92(1988)；Verhoeyen等，Science，2391534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.，28489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)169-217(1994)。
“單鏈Fv(scFv)或“單鏈抗體”是指一種蛋白質(zhì)，其中scFv抗體的VH和VL區(qū)含單鏈，該鏈折疊后形成類似雙鏈抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。制備scFv抗體的方法在例如Ward等，Exp Hematol.(5)660-4(1993)；以及Vaughan等，Nat Biotechnol.14(3)309-14(1996)中有詳細(xì)描述。單鏈Fv(scFv)任選含有長(zhǎng)度不超過(guò)50個(gè)氨基酸的肽接頭，一般不超過(guò)40個(gè)氨基酸，優(yōu)選不超過(guò)30個(gè)氨基酸，更優(yōu)選不超過(guò)20個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，肽接頭是一種Gly-Gly-Gly-Gly-Ser連環(huán)體，例如2、3、4、5或6個(gè)這樣的序列。但應(yīng)當(dāng)意識(shí)到接頭中的某些氨基酸可以被替代。例如，纈氨酸可以被替代為甘氨酸。其他肽接頭及其用途是所屬領(lǐng)域所熟知的。參見(jiàn)，例如Huston等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 85879(1988)；Bird等，Science 2424236(1988)；Glockshuber等，Biochemistry 291362(1990)；美國(guó)專利4,946,778，美國(guó)專利5,132,405和Stemmer等，Biotechniques 14256-265(1993)。
當(dāng)短語(yǔ)“特異性(或選擇性)與抗體結(jié)合”指蛋白質(zhì)或肽時(shí)，是指存在異種蛋白質(zhì)和其他生物制劑時(shí)所述蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)是限速反應(yīng)。因此，在指定的免疫測(cè)定條件下，指定抗體與特定的蛋白結(jié)合(如αvβ5整聯(lián)蛋白、β5、或其部分片段)，并且與樣品中存在的其他蛋白質(zhì)的結(jié)合量很小。在此條件下與抗體特異性結(jié)合要求選擇的抗體對(duì)某一特定蛋白具有特異性。例如，可以選擇針對(duì)αvβ5或β5多肽的抗體得到除多態(tài)性變異體(例如，與感興趣的序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列)外僅與該蛋白而不與其他蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的抗體?？刹捎枚喾N免疫測(cè)定方法選擇與與特定蛋白質(zhì)特異性反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫測(cè)定、Western blots、或免疫組化是常規(guī)用于選擇與特定蛋白特異性反應(yīng)的單克隆抗體的方法。用于檢測(cè)特異性免疫反應(yīng)的免疫測(cè)定方法和條件的詳細(xì)描述參見(jiàn)Harlow和Lane Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Publications，NY(1988)。典型的，特異性或選擇性反應(yīng)至少是背景信號(hào)或噪聲的兩倍，更典型的大于背景10到100倍。
“特異性競(jìng)爭(zhēng)”結(jié)合藥物減少抗體對(duì)多肽的特異性結(jié)合。采用所屬領(lǐng)域已知的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)方法，當(dāng)?shù)谝豢贵w存在時(shí)，如果第二抗體對(duì)抗原的結(jié)合減少了至少30％，通常至少約40％、50％、60％或75％，并經(jīng)常至少約90％，則認(rèn)為第一抗體競(jìng)爭(zhēng)性的抑制第二抗體的結(jié)合(參見(jiàn)，例如，Harlow和Lane，supra)。
這里的術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”可以互換使用，指氨基酸殘基的多聚物。該術(shù)語(yǔ)用于氨基酸多聚物時(shí)，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基是相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬，以及天然存在的氨基酸多聚體和非天然存在的氨基酸多聚體。這里使用的該術(shù)語(yǔ)包含任何長(zhǎng)度的氨基酸，包括全長(zhǎng)蛋白質(zhì)(如抗原)，其中所述氨基酸殘基通過(guò)共價(jià)肽鍵連接。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸類似物和氨基酸模擬物(mimetics)。天然存在的氨基酸是那些由基因編碼的，以及那些后來(lái)經(jīng)修飾的氨基酸，如羥基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸鹽、和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物是指與天然氨基酸有相同基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，例如α碳與氫結(jié)合、羧基、氨基，和R基團(tuán)，例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸甲砜、蛋氨酸甲基锍(methionine methyl sulfonium)。這些類似物具有修飾的R基團(tuán)(例如正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留了與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)?！鞍被崮M物”是指化合物的結(jié)構(gòu)與一般氨基酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，但其功能與天然存在的氨基酸相似。
這里的氨基酸可以用它們通常已知的三個(gè)字母標(biāo)記或IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的一個(gè)字母標(biāo)記表示。同樣地，核苷酸可以用其通常接受的單字母代碼表示。
術(shù)語(yǔ)“肽模擬物”和“模擬物”是指合成的化合物，基本上具有與本發(fā)明的αvβ5拮抗劑相同的結(jié)構(gòu)和功能特性。肽類似物通常用于制藥工業(yè)，作為非肽藥物，具有類似模板肽的性質(zhì)。這些類型的非肽化合物稱為“肽模擬物”或“肽模擬物(peptidomimetics)”(參見(jiàn)，例如，F(xiàn)auchere，J.Adv.Drug Res.1529(1986)；Veber和Freidinger TINS p.392(1985)；和Evans等J.Med.Chem.301229(1987))。肽模擬物結(jié)構(gòu)類似可用于治療的肽，可以產(chǎn)生等效或增強(qiáng)的治療或預(yù)防效果。通常，肽模擬物結(jié)構(gòu)類似典型的多肽(即具有生物學(xué)或藥理學(xué)活性的多肽)，例如天然存在的αvβ5配體，但其中一個(gè)或多個(gè)肽鍵任選被選自例如CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH＝CH-(順式和反式)、-COCH2-、-CH(OH)CH2-、和-CH2SO-鍵代替。所述模擬物可以完全由合成的、非天然的氨基酸類似物組成，或是部分天然肽氨基酸的嵌合分子和部分非天然氨基酸類似物。所述模擬物也可以結(jié)合有任意含量的天然氨基酸保守基團(tuán)，只要所述基團(tuán)基本上不改變所述模擬物的結(jié)構(gòu)和/或活性。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“核苷酸”和“多核苷酸”可以互相替代。使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”包括寡核苷酸(即短多核苷酸)。該術(shù)語(yǔ)也指脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、和天然存在的變異體，同時(shí)也指合成的和/或非天然存在的核苷酸(即包含核苷酸類似物或主鏈殘基或鍵被修飾的核苷酸)，如，例如但非限制性的，磷硫酰(phosphorothioates)、氨基磷酸酯(phosphoramidates)、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNAs)等。除非另有說(shuō)明，特定核苷酸序列也暗示包含其適當(dāng)修飾的變異體(例如簡(jiǎn)并密碼子取代)和互補(bǔ)序列以及明確指出的序列。特別地，將序列的一個(gè)或多個(gè)選定(或所有)密碼子的第三個(gè)位點(diǎn)用混和堿基和/或脫氧肌苷殘基取代可以得到簡(jiǎn)并密碼子取代(參見(jiàn)，例如，Batzer等，核酸Res.195081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；和Cassol等(1992)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 891-98(1994))。
“siRNA”或“RNAi”是指形成雙鏈RNA的核苷酸，當(dāng)所述siRNA與基因或靶標(biāo)基因在同一細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，所述雙鏈RNA能減少或抑制所述基因或靶標(biāo)基因的表達(dá)(參見(jiàn)，例如，Bass，Nature，411，428-429(2001)；Elbashir等，Nature，411，494-498(2001)；WO00/44895；WO01/36646；WO99/32619；WO00/01846；WO01/29058；WO99/07409；和WO00/44914)。因此“siRNA”指由互補(bǔ)鏈形成的雙鏈RNA。所述siRNA互補(bǔ)部分雜交形成的雙鏈分子通常具有基本上或完全的同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，siRNA指與靶標(biāo)基因有實(shí)質(zhì)的或完全的同一性，并形成雙鏈siRNA。siRNA序列可與全長(zhǎng)的靶標(biāo)基因或其序列相應(yīng)。典型的，所述siRNA至少長(zhǎng)約15-50個(gè)核苷酸(例如雙鏈siRNA的每個(gè)互補(bǔ)序列長(zhǎng)15-50個(gè)核苷酸、且所述雙鏈siRNA長(zhǎng)約15-50個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選約20-30個(gè)堿基核苷酸，優(yōu)選長(zhǎng)約20-25個(gè)核苷酸，如，長(zhǎng)度為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸。
“沉默”或“下調(diào)”是指靶標(biāo)序列可檢測(cè)的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯減少，即，RNAi靶定的序列，或在無(wú)干擾RNA或其他核酸序列存在時(shí)靶標(biāo)序列或蛋白質(zhì)與正常水平相比數(shù)量或活性降低?？蓹z測(cè)的降低可以小至5％或10％，或高達(dá)80％、90％或100％。更典型的，可檢測(cè)的降低范圍為20％、30％、40％、50％、60％或70％。
III.αvβ5的抑制通過(guò)抑制配體與αvβ5整聯(lián)蛋白的結(jié)合，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防涉及αvβ5整聯(lián)蛋白的疾病如，舉例來(lái)說(shuō)PE、中風(fēng)、心肌梗塞、癌癥(例如通過(guò)阻斷αvβ5整聯(lián)蛋白有關(guān)的血管生成)和眼新生血管疾病(例如通過(guò)阻斷αvβ5整聯(lián)蛋白有關(guān)的血管生成)。按照本發(fā)明的方法，所有抑制αvβ5整聯(lián)蛋白表達(dá)或配體與αvβ5整聯(lián)蛋白結(jié)合的方法可用于治療涉及αvβ5整聯(lián)蛋白的疾病。例如，與αvβ5整聯(lián)蛋白特異性結(jié)合的抗體、與β5亞單位特異性結(jié)合的抗體、αvβ5整聯(lián)蛋白的配體和肽、非肽、和所述配體的肽模擬物類似物可用于抑制與αvβ5整聯(lián)蛋白的結(jié)合，因而可治療或預(yù)防涉及αvβ5的疾病。此外，抑制β5表達(dá)的多核苷酸(例如siRNA分子、反義序列等)可用于治療或預(yù)防涉及αvβ5整聯(lián)蛋白的疾病。在一些實(shí)施方案中，所述疾病是PE(例如包括心源性和非心源性PE)。在一些實(shí)施方案中，治療PE的同時(shí)也治療或預(yù)防了下游的疾病如，例如肺纖維化。
A.抗體按照本發(fā)明的一個(gè)方面，特異性與αvβ5整聯(lián)蛋白或αvβ5整聯(lián)蛋白β5亞單位結(jié)合的抗體被用于治療或預(yù)防涉及αvβ5整聯(lián)蛋白的疾病，包括，例如PE、中風(fēng)、心肌梗塞、癌癥(即血管生成)，和眼新生血管疾病(即血管生成)。所述抗體也可以與其他配體競(jìng)爭(zhēng)與αvβ5整聯(lián)蛋白或αvβ5整聯(lián)蛋白β5亞單位的結(jié)合。適宜的抗體包括，例如，單克隆抗體、人源化抗體和抗體片段(即Fv、Fab、(Fab’)2，或scFv)。
在一些實(shí)施方案中，與αvβ5整聯(lián)蛋白的β5亞單位結(jié)合的單克隆抗體ALULA(ATCC保藏號(hào)PTA-5817，2004年2月13日保藏在ATCC，10801University Blvd.Manassas，VA20110-2209)被用來(lái)治療和預(yù)防涉及αvβ5整聯(lián)蛋白的疾病，包括，例如PE、中風(fēng)、心肌梗塞、癌癥(如血管生成)，和眼新生血管疾病(如血管生成)。不受理論的限制，我們認(rèn)為ALULA是通過(guò)阻斷αvβ5整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的肺血管通透性變化而產(chǎn)生作用的。在一些實(shí)施方案中，人源化的ALULA、ALULA片段、或與ALULA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至αvβ5整聯(lián)蛋白或αvβ5整聯(lián)蛋白的β5亞單位的單克隆抗體用于治療PE。
可使用所屬領(lǐng)域熟知的各種技術(shù)獲取單克隆抗體。簡(jiǎn)言之，來(lái)自期望抗原免疫的動(dòng)物的脾細(xì)胞被永生化，一般是用骨髓瘤細(xì)胞融合(參見(jiàn)，例如，Kohler和Milstein，Eur.J.Immunol.6511-519(1976))。其他使細(xì)胞永生的方法包括用Epstein Barr病毒、癌基因、或逆轉(zhuǎn)錄病毒，或其他現(xiàn)有技術(shù)熟知的方法轉(zhuǎn)化。篩選單個(gè)永生化細(xì)胞形成的克隆用于產(chǎn)生對(duì)所述抗原具有期望的特異性和親和力的抗體，同時(shí)可以通過(guò)多種技術(shù)增加這些細(xì)胞產(chǎn)生的單克隆抗體的產(chǎn)量，包括注射到脊椎動(dòng)物宿主的腹腔中?；蛘?，也可以按照Huse等，Science 2461275-1281(1989)提出的常規(guī)方法通過(guò)篩選來(lái)源于人B細(xì)胞的DNA庫(kù)分離編碼單克隆抗體的DNA序列或其結(jié)合片段。
收集單克隆抗體，并在免疫試驗(yàn)中對(duì)免疫原進(jìn)行滴定，例如，在固相支持物上用固定的免疫原進(jìn)行固相免疫試驗(yàn)。單克隆抗體一般以Kd至少約0.1mM結(jié)合，更常見(jiàn)至少約1μM，優(yōu)選至少約0.1μM或更低、和最優(yōu)選0.01μM或更低。
在一個(gè)示范性的實(shí)施方案中，動(dòng)物如兔或小鼠用αvβ5多肽或構(gòu)建的編碼該多肽的核酸免疫?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)的方法分離免疫后產(chǎn)生的抗體。本發(fā)明的免疫球蛋白(包括其結(jié)合片段和其他衍生物)可以很容易地通過(guò)多種重組DNA技術(shù)生產(chǎn)，包括在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中(如永生化的真核細(xì)胞，如骨髓瘤或雜交瘤細(xì)胞)或在小鼠、大鼠、兔或其他能通過(guò)已熟知的方法產(chǎn)生抗體的脊椎動(dòng)物中表達(dá)。適宜的DNA序列的來(lái)源細(xì)胞和用于免疫球蛋白表達(dá)和分泌的宿主細(xì)胞可來(lái)自多種途徑，例如美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(American Type CultureCollection)(細(xì)胞系和雜交瘤目錄，第五版(1985)Rockville，Md。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體是人源化抗體，即抗體保留非人抗體的反應(yīng)性而對(duì)人的免疫原性較低。例如這可以通過(guò)保留非人CDR區(qū)而用其人源的相應(yīng)部分置換剩余的部分。例如參見(jiàn)Morrison等，PNAS USA，816851-6855(1984)；Morrison和Oi，Adv.Immunol.，4465-92(1988)；Vcrhoeyen等，Science，2391534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.，28489-498(1991)；Padlan，Molec.Immun.，31(3)169-217(1994)。人源化抗體的技術(shù)是所屬領(lǐng)域所熟知的，例如在美國(guó)專利4,816,567；5,530,101；5,859,205；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,777,085；6,180,370；6,210,671；和6,329,511；WO87/02671；EP專利申請(qǐng)0173494；Jones等(1986)Nature321522；和Verhoyen等(1988)Science2391534有詳細(xì)描述。另外在Winter和Milstein(1991)Nature349293中也詳細(xì)描述了人源化抗體。例如可以合成包含編碼人源化免疫球蛋白框架區(qū)第一序列和編碼期望的免疫球蛋白互補(bǔ)決定區(qū)的第二序列的多核苷酸或?qū)⑦m當(dāng)?shù)腸DNA和基因組DNA片段結(jié)合起來(lái)?？砂凑找阎椒◤亩喾N人細(xì)胞中分離人恒定區(qū)DNA序列。類似的，用于生產(chǎn)本發(fā)明免疫球蛋白的CDRs可以來(lái)源于特異性與αvβ5整聯(lián)蛋白結(jié)合的單克隆抗體(如ALULA或可與ALULA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至αvβ5整聯(lián)蛋白特異性的抗體)。
在某些情況下，將CDR轉(zhuǎn)移到人的框架上可導(dǎo)致人源化抗體的特異性喪失。在這些情況下，可以在所述抗體人源部分的框架區(qū)進(jìn)行回復(fù)突變。進(jìn)行回復(fù)突變的方法是現(xiàn)有技術(shù)中熟知的，在例如Co等，PNAS USA88；2269-2273(1991)和WO90/07861中有詳細(xì)描述。
在一些實(shí)施方案中，所述抗體是抗體片段如Fab、F(ab’)2、Fv或scFv。所述抗體片段可以采用現(xiàn)有技術(shù)中任何已知的方法制備，包括化學(xué)消化(如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)和重組方法。分離和制備重組核酸的方法是所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見(jiàn)，Sambrook等，Molecular Cloning.A LaboratoryManual(2d ed.1989)，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995))。所述抗體可以在多種宿主細(xì)胞中表達(dá)，包括E.coli、其他細(xì)菌宿主、酵母、和多種高等真核細(xì)胞如COS、CHO，和HeLa細(xì)胞系和骨髓瘤細(xì)胞系。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了鑒定與ALULA競(jìng)爭(zhēng)與αvβ5整聯(lián)蛋白特異性結(jié)合的抗體的方法。
可采用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)鑒定與ALULA競(jìng)爭(zhēng)與αvβ5整聯(lián)蛋白特異性結(jié)合的抗體?？刹捎矛F(xiàn)有技術(shù)中已知的多種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合試驗(yàn)中的任一種來(lái)測(cè)定兩種抗體對(duì)同一抗原的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。簡(jiǎn)言之，是檢測(cè)不同抗體抑制另一抗體的結(jié)合能力。例如，可以采用三明治ELISA試驗(yàn)通過(guò)其結(jié)合的抗原表位區(qū)分抗體。這是通過(guò)在孔的表面包被捕獲抗體進(jìn)行的。然后在捕獲表面加上不完全飽和濃度的標(biāo)記抗原。該蛋白質(zhì)通過(guò)特異性的抗體抗原表位相互作用與所述抗體結(jié)合。洗滌后，在ELISA中加入與可檢測(cè)部分共價(jià)結(jié)合的二抗(如HRP和定義為檢測(cè)抗體的標(biāo)記抗體)。如果此抗體與所述捕獲抗體識(shí)別相同的抗原表位，則其不能結(jié)合在靶蛋白質(zhì)上，因?yàn)樵撎囟ǖ目乖砦灰巡荒茉俳Y(jié)合了。但如果此二抗識(shí)別所述靶標(biāo)蛋白質(zhì)上不同的抗原表位，則它可以結(jié)合，并且這種結(jié)合可通過(guò)相應(yīng)的底物定量活性水平(和抗體結(jié)合)而進(jìn)行檢測(cè)。用單個(gè)抗體如捕獲抗體或檢測(cè)抗體定義背景，而最大信號(hào)可以通過(guò)抗原特異性抗體捕獲并用抗體檢測(cè)抗原上的標(biāo)記測(cè)定。用背景和最大信號(hào)作為參照，可用配對(duì)(pair-wise)方式評(píng)估抗體以確定特異的抗原表位。
采用上述任何試驗(yàn)方法，當(dāng)一抗存在時(shí)，如果二抗與抗原的結(jié)合降低至少30％、一般至少約40％、50％、60％或75％，經(jīng)常至少約90％，則認(rèn)為一抗競(jìng)爭(zhēng)性地抑制二抗的結(jié)合。
B.αvβ5小分子拮抗劑按照本發(fā)明的方法，所有αvβ5的小分子拮抗劑都可用于治療或預(yù)防PE。一般所述小分子質(zhì)量小于1000道爾頓，經(jīng)常小于500道爾頓。
典型地，αvβ5小分子拮抗劑包括，例如美國(guó)公開(kāi)專利申請(qǐng)2000/40019206、2004/0019037、2004/0019035、2004/0018192、2004/0010023、2003/0181440、2003/0171271、2003/0139398、2002/0037889、2002/0077321、2002/0072500，美國(guó)專利6,683,051和Goodman等，J.Med Chem.45(5)1045-51(2002)中描述的那些。
例如，可以使用美國(guó)專利
發(fā)明者迪安·謝潑德, 阿馬·阿塔基利特 申請(qǐng)人:加利福尼亞大學(xué)董事會(huì)