專利名稱：一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素d的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥制備技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種中藥藥物活性成分的提取制備方法，特別是涉及一種從鴉膽 子中提取純化鴉膽子素D的制備方法。
背景技術(shù)：
鴉膽子素D (bruceine D)是從苦木科鴉膽子屬植物鴉膽子CSrwcea javanica (L)Merr)中分離到的一種四環(huán)三萜類苦木素，研究表明其不僅對多種腫瘤細胞有強的抑制活性，而且對多種植物病毒的侵染和增殖具有強烈的抑制作用。鴉膽子素D不僅可以抑制煙草花葉病毒(TMV)基因組RNA及亞基因組RNA的復(fù)制，阻止病毒相關(guān)蛋白CP和MP的表達夕卜，還可抑制煙草葉片中TMV向莖部及植株上部葉片的移動，誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生對TMV的抗性并對感染TMV的煙草起到保護作用，是研制新型、高效、安全的植物源抗病毒劑的理想化合物。然而由于鴉膽子素D的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜、手性碳多，難以化學(xué)合成，目前其來源仍然依賴于從植物中分離獲得。通常提取純化鴉膽子素D的方法是材料粉碎——95%工業(yè)乙醇回流提取一提取液濃縮一有機溶劑萃取(或有機溶劑回流提取)一娃膠柱層析一重結(jié)晶。在有機溶劑萃取(或有機溶劑回流提取)工藝中，通常使用石油醚、氯仿、甲醇等有毒有機溶劑進行萃取或提??；在硅膠柱層析工藝中，最常用的是采用濕柱法進行分離，即用經(jīng)有機溶劑浸泡后的硅膠粉填充層析柱，將樣品加到填充層析柱上部，再用不同有機溶劑進行洗脫，分部收集洗脫液，如此反復(fù)層析直至獲得純品。整個工藝較繁瑣、耗時，制備人員與有毒溶劑接觸的時間長，嚴(yán)重?fù)p害制備人員的身體健康。DlOl大孔吸附樹脂是一種具有多孔海綿狀結(jié)構(gòu)人工合成的聚合物吸附劑，依靠樹脂骨架和被吸附的分子之間的范德華力，通過樹脂巨大的比表面積進行物理吸附而達到從水溶液中分離提取水溶性較差的有機物質(zhì)的目的。DlOl樹脂是一種非極性吸附劑，一般用于中草藥中皂甙類物質(zhì)的提取與分離，具有操作簡便、成本較低、樹脂可反復(fù)使用等優(yōu)點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種更為簡便、高效地從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，以解決當(dāng)前從植物鴉膽子中提取純化鴉膽子素D效率低、費時、制備人員與有毒有機溶劑接觸時間長，嚴(yán)重?fù)p害制備人員的身體健康等問題。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實施的
本發(fā)明的一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，包括材料粉碎、回流提取、提取液濃縮、提取物去糖、硅膠柱層析、重結(jié)晶。所述制備方法的具體步驟如下
(1)材料粉碎取新鮮鴉膽子經(jīng)曬干或置烘干箱中經(jīng)45°c-55°C烘干后，用植物粉碎機粉碎成粉末；
(2)回流提取取一定量的粉末于回流燒瓶中，按樣品與提取溶劑的質(zhì)量體積比為I:8-10加入95%的乙醇，搖勻，安裝好相應(yīng)的冷凝裝置，將回流燒瓶置于電熱恒溫水浴鍋中，80°c回流1-2小時，自然冷卻至室溫，過濾，殘渣用同樣方法回流1-2次，合并濾液，即為提取液；
(3)提取液濃縮將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至溶液成粘稠狀，得到濃縮液；
(4)提取物去糖按體積比為I:5-8于濃縮液中加入蒸餾水，80°C水浴加熱并攪拌使之充分溶解，抽濾，濾液經(jīng)DlOl大孔樹脂柱層析吸附，先用2-4個柱體積的水洗脫，再用3-5個柱體積的80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，減壓濃縮至膏狀，得到膏狀提取物；
(5)硅膠柱層析采用硅膠干柱層析法結(jié)合濕柱層析法對提取物進行分離，先用干柱法分離，再用濕柱法分離；采用干柱法分離時，膏狀提取物先用適量甲醇充分溶解，再將溶液與硅膠拌勻，提取物與拌樣硅膠的質(zhì)量比為I :5_10，待甲醇揮干后，將拌樣硅膠加到填好硅膠的干柱上，拌樣硅膠與填柱硅膠的質(zhì)量比為I :15-20，以氯仿與丙酮體積比為8 :5的混合溶劑作為展開劑進行柱層析，當(dāng)展開劑到達柱底部時結(jié)束展開，待層析柱中多余溶劑揮干后，根據(jù)鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品在硅膠薄層層析中所測的Rf值，推算其在層析柱上的相應(yīng)位置，以該位置為中心，將柱中硅膠平均分為4-8段，每段約5-10 cm，分別取出各段硅膠并用甲醇充分洗脫，將各洗脫液進行薄層層析檢測，合并含鴉膽子素D的部位，并用常規(guī)方法濃縮，得濃縮物A ;將干柱法分離得到的濃縮物A再用濕柱法分離，濕柱法分離與通常采用的硅膠柱層析法相同，以氯仿、丙酮、甲醇體積比為10 2 1的混合溶劑為洗脫劑進行洗脫，分部收集洗脫液柱(一般為直徑3cm，長80cm的柱每約20 mL收集一份)，將各洗脫液進行薄層層析檢測，合并僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點的部位，即可獲得含鴉膽子素D的洗脫液；
(6)重結(jié)晶將薄層層析檢測僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點的合并洗脫液減壓濃縮后，用甲醇充分溶解，過濾，濾液靜置于4°C冰箱中，待結(jié)晶析出后，濾出結(jié)晶即為鴉膽子素D純品。所述步驟(I)中的鴉膽子為鴉膽子植物的種子、皮、葉中的任一種。所述步驟(5)中若不能獲得純度高的鴉膽子素D洗脫液，可用濕柱法再進行一次分離。本發(fā)明的顯著優(yōu)點
(I)在提取物去糖工藝中采用提取液濃縮后的水懸浮液上DlOl大孔樹脂，先用水洗脫2-4個柱體積，再用80%乙醇洗脫3-5個柱體積，收集乙醇洗脫液并減壓濃縮處理。通過該處理可有效除去提取物中糖份等雜質(zhì)，富集提取物中鴉膽子素D等水溶性較差的有機成分，提高柱層析過程中硅膠的承載量及分離效率，避免采用有機溶劑萃取或有機溶劑回流提取工藝中有毒有機溶劑的使用。(2)本方法通過大孔樹脂和硅膠干柱層析兩步處理后，可去除提取物中的大部分雜質(zhì)，使目標(biāo)成分鴉膽子素D得到有效的富集，顯著提高分離效率，鴉膽子素D的提取率可達75%-85%。而現(xiàn)有技術(shù)中鴉膽子素D的提取率較低，一般為50%-70%。(3)本發(fā)明人通過多次試驗證明，采用本發(fā)明方法可從鴉膽子中提取純化到高純度的鴉膽子素D，純度(采用HPLC檢測)可達98%以上，可用于各種生物活性研究，具有制備方法簡單、制備過程有毒有機溶劑使用量少、制備人員與有毒溶劑接觸時間短等優(yōu)點。


圖I為從鴉膽子種子中提取純化的鴉膽子素D結(jié)晶。
具體實施例方式為了對本發(fā)明的一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法作進一步說明，以下介紹鴉膽子素D的具體提取制備方法，但其絕不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。實施例I ::稱取曬干的鴉膽子種子1.0 kg，用植物粉碎機粉碎后用10 L 95%的工業(yè)乙醇回流提取3次(條件為80°C回流I小時)，合并提取液，過濾并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至粘稠狀，得到約165 mL的濃縮液，加入蒸餾水至1000 mL，80°C水浴加熱攪拌使之充分溶解，抽濾，濾液分3次上DlOl大孔樹脂。每次取約300 mL懸浮液過裝有IOOOg DlOl大孔樹脂的層析柱(柱直徑6cm，長60cm)，上樣流速約為10 mL/min，先用2個柱體積的水洗脫，再用3個柱體積的80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，合并3次洗脫液，減壓濃縮成膏狀，得膏狀物46 g。將膏狀物用甲醇溶解后加入260 g硅膠粉均勻吸附，待甲醇揮干后，將樣品加到裝有4. 5 kg硅膠粉(200-300目)的干柱(柱直徑8cm，長120cm)上，以氯仿丙酮(體積t匕)=8 5的溶劑為展開劑進行層析，當(dāng)展開劑到達柱底部時結(jié)束展開，待多余溶劑揮干后， 根據(jù)薄層層析所測鴉膽子素D的Rf值，計算目標(biāo)成分在柱體中的位置，將該位置及附近的硅膠分4段取出，每段約7 cm，分別用甲醇將取出的各部分洗脫并將各洗脫液進行薄層層析檢測，合并含鴉膽子素D的第2、3部分洗脫液，減壓濃縮成膏狀，將含鴉膽子素D的濃縮物再用濕柱法分離，以氯仿、丙酮、甲醇體積比為10 2 1的混合溶劑為洗脫劑進行洗脫，分部收集洗脫液，將各洗脫液進行薄層層析檢測，合并僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點的部位，待其中溶劑揮干后即為高純度的鴉膽子素D，用甲醇重結(jié)晶(用甲醇充分溶解，過濾，濾液靜置于4°C冰箱中，待結(jié)晶析出后，濾出結(jié)晶即為鴉膽子素D純品，下同)后最終獲得純度為99%的鴉膽子素D 78 mg，鴉膽子素D的提取率為83. 7%。實施例2 :稱取經(jīng)55°C烘干的鴉膽子植物的皮I. O kg,用植物粉碎機粉碎后用8 L95%的工業(yè)乙醇回流提取3次(條件為80°C回流I. 5小時)，合并提取液，過濾并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至約180 mL，加入蒸餾水至1200 mL，于80°C水浴中攪拌加熱使之充分溶解，抽濾，濾液分3次上DlOl大孔樹脂。每次取約400 mL懸浮液過裝有1300g DlOl大孔樹脂的層析柱(柱直徑6cm，長80cm)，上樣流速約為10 mL/min，先用3個柱體積的水洗脫，再用4個柱體積的80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，合并3次洗脫液，減壓濃縮成膏狀,得膏狀物41go將膏狀物用甲醇溶解后加入280 g硅膠粉均勻吸附，待甲醇揮干后，將樣品加到裝有4. 3kg硅膠粉(200-300目)的干柱(柱直徑8cm，長120cm)上，以氯仿丙酮(體積比)=8 5的溶劑為展開劑進行層析，當(dāng)展開劑到達柱底部時結(jié)束展開，待多余溶劑揮干后，根據(jù)薄層層析所測鴉膽子素D的Rf值，計算目標(biāo)成分在柱體中的位置，將該位置及附近的硅膠分5段取出，每段約6 cm，分別用甲醇將取出的各部分洗脫并將各洗脫液進行薄層層析檢測，合并含鴉膽子素D的洗脫液，減壓濃縮成膏狀。將含鴉膽子素D的濃縮物再用濕柱法分離，以氯仿、丙酮、甲醇體積比為10 2 1的混合溶劑為洗脫劑進行洗脫，分部收集洗脫液，將各洗脫液進行薄層層析檢測，合并僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點的部位，待其中溶劑揮干后即為高純度的鴉膽子素D，用甲醇重結(jié)晶后最終獲得純度為99%的鴉膽子素D 47mg,鴉膽子素D的提取率為81. 1%。實施例3 :稱取經(jīng)45°C烘干的鴉膽子植物的葉I. 5 kg,用植物粉碎機粉碎后用15L 95%的工業(yè)乙醇回流提取3次(條件為80°C回流2小時)，合并提取液，過濾并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至約300 mL，加入蒸餾水至2000 mL，于80°C水浴中攪拌加熱使之充分溶解，抽濾，濾液分5次上DlOl大孔樹脂。每次取約400 mL懸浮液過裝有1300g DlOl大孔樹脂的層析柱(柱直徑6cm，長80cm)，上樣流速約為10 mL/min，先用4個柱體積的水洗脫，再用5個柱體積的80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，合并5次洗脫液，減壓濃縮成膏狀,得膏狀物62g。將膏狀物用甲醇溶解后加入320 g硅膠粉均勻吸附，待甲醇揮干后，將樣品加到裝有5. 6kg硅膠粉(200-300目)的干柱(柱直徑8cm，長130cm)上，以氯仿丙酮(體積比)=8 5的溶劑為展開劑進行層析，當(dāng)展開劑到達柱底部時結(jié)束展開，待多余溶劑揮干后，根據(jù)薄層層析所測鴉膽子素D的Rf值，計算目標(biāo)成分在柱體中的位置，將該位置及附近的硅膠分6段取出，每段約7 cm，分別用甲醇將取出的·各部分洗脫并將各洗脫液進行薄層層析檢測，合并含鴉膽子素D的洗脫液，減壓濃縮成濃縮物A。將濃縮物A用濕柱法分離，以氯仿、丙酮、甲醇體積比為10 2 1的混合溶劑為洗脫劑進行洗脫，分部收集洗脫液，將各洗脫液進行薄層層析檢測，合并含鴉膽子素D的部位，常規(guī)方法濃縮后獲得濃縮物B，濃縮物B再用濕柱法分離一次，以氯仿與甲醇體積比為9 1的混合溶劑為洗脫劑，其余步驟與第一次濕柱法相同，合并僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點的部位，待其中溶劑揮干后用甲醇重結(jié)晶后可得純度為99%的鴉膽子素D 22 mg,鴉膽子素D的提取率為76. 2%。
權(quán)利要求
1.一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，包括材料粉碎、95%工業(yè)乙醇回流提取、提取液濃縮、提取物去糖、硅膠柱層析、重結(jié)晶，其特征在于所述提取物去糖是采用提取液濃縮液的水懸浮液上DlOl大孔樹脂，先用2-4個柱體積的水洗脫，再用3-5個柱體積的80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液后減壓濃縮。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，其特征在于所述硅膠柱層析是先用干柱法分離，再用濕柱法分離。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，其特征在于所述干柱法分離中樣品與拌樣硅膠的質(zhì)量比為I :5_10，拌樣硅膠與填柱硅膠的質(zhì)量比為I 15-20 ;所述濕柱法分離與通常采用的硅膠柱層析法相同。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，其特征在于所述制備方法的步驟如下 (1)材料粉碎取新鮮鴉膽子經(jīng)曬干或置烘干箱中經(jīng)45°C_55°C烘干后，用植物粉碎機粉碎成粉末； (2)95%工業(yè)乙醇回流提取取一定量的粉末于回流燒瓶中，按樣品與提取溶劑的質(zhì)量體積比為I :8-10加入95%的工業(yè)乙醇，搖勻，安裝好相應(yīng)的冷凝裝置，將回流燒瓶置于電熱恒溫水浴鍋中，80°C回流1-2小時，自然冷卻至室溫，過濾，殘渣用同樣方法回流1-2次，合并濾液，即為提取液； (3)提取液濃縮將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至溶液成粘稠狀，得到濃縮液； (4)提取物去糖按體積比為I:5-8于濃縮液中加入蒸餾水，80°C水浴加熱并攪拌使之充分溶解，抽濾，濾液經(jīng)DlOl大孔樹脂柱層析吸附，先用2-4個柱體積的水洗脫，再用3-5個柱體積的80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液，減壓濃縮至膏狀，得到膏狀提取物； (5)硅膠柱層析先用干柱法分離，用適量甲醇充分溶解膏狀提取物，將所得溶液與硅膠拌勻，提取物與拌樣硅膠的質(zhì)量比為I :5_10，待甲醇揮干后，將拌樣硅膠加到填好硅膠的干柱上，拌樣硅膠與填柱硅膠的質(zhì)量比為I :15_20，以氯仿與丙酮體積比為8 :5的混合溶劑作為展開劑進行柱層析，當(dāng)展開劑到達柱底部時結(jié)束展開，待層析柱中多余溶劑揮干后，根據(jù)鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品在硅膠薄層層析中所測的Rf值，推算其在層析柱上的相應(yīng)位置，以該位置為中心，將柱中硅膠平均分為4-8段，每段約5-10 cm，分別取出各段硅膠并用甲醇充分洗脫，將各洗脫液進行薄層層析檢測，合并含鴉膽子素D的部位，并用常規(guī)方法濃縮，得濃縮物A ;將干柱法分離得到的濃縮物A再用濕柱法分離，濕柱法分離與通常采用的硅膠柱層析法相同，以氯仿、丙酮、甲醇體積比為10 2 1的混合溶劑為洗脫劑進行洗脫，分部收集洗脫液，將各洗脫液進行薄層層析檢測，合并僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點的部位，即可獲得含鴉膽子素D的洗脫液； (6)重結(jié)晶將薄層層析檢測僅在與鴉膽子素D標(biāo)準(zhǔn)品Rf值相同處出現(xiàn)點的合并洗脫液減壓濃縮后，用甲醇充分溶解，過濾，濾液靜置于4°C冰箱中，待結(jié)晶析出后，濾出結(jié)晶即為鴉膽子素D純品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，其特征在于所述步驟(I)中的鴉膽子為鴉膽子植物的種子、皮、葉中的任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，其特征在于所述步驟(5)中若不能獲得獲得純度高的鴉膽子素D洗脫液，可用濕柱法再進行一次分離。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從鴉膽子中提取純化鴉膽子素D的制備方法，所述方法包括材料粉碎、95%工業(yè)乙醇回流提取、提取液濃縮、提取物去糖、硅膠柱層析、重結(jié)晶，其中提取物去糖工藝采用提取濃縮液的水懸浮液上D101大孔樹脂，先用水洗脫，再用80%乙醇洗脫，收集醇洗脫液處理。通過該處理可有效除去提取物中的糖份等雜質(zhì)，提高硅膠的承載量及分離效率。硅膠柱層析工藝采用先進行一次干柱法分離，再用濕柱法分離處理。干柱法分離可縮短分離時間，減少人力投入。本發(fā)明提供的制備方法獲得的鴉膽子素D純度可達98%以上，且操作簡單，可節(jié)約有毒溶劑的使用量，節(jié)省人力，節(jié)約時間。
文檔編號C07D493/10GK102924467SQ20121043956
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月7日
發(fā)明者陳啟建, 歐陽明安, 譚慶偉 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)