專利名稱：免疫反應(yīng)測(cè)定方法以及免疫反應(yīng)測(cè)定裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可以測(cè)定樣品中被測(cè)定物質(zhì)的含量的免疫反應(yīng)測(cè)定方法以及其中使用免疫反應(yīng)測(cè)定裝置。
背景技術(shù)：
在臨床檢查領(lǐng)域中，為了研究各種各樣疾病的診斷以及病狀的經(jīng)過，廣泛進(jìn)行存在于人體液的各種疾病中特征蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。在這些蛋白質(zhì)含量的測(cè)定中，主要廣泛利用特異識(shí)別靶蛋白抗原的抗體的反應(yīng)(抗原抗體反應(yīng))的免疫反應(yīng)測(cè)定方法。現(xiàn)在，在免疫反應(yīng)測(cè)定方法中開發(fā)了利用各種各樣原理的測(cè)定方法。
其中，有人們都了解的為了測(cè)定樣品中被測(cè)定物質(zhì)的含量，對(duì)利用抗原抗體反應(yīng)生成的抗原抗體復(fù)合物的凝集物(以下稱之為凝集復(fù)合物)進(jìn)行檢測(cè)的免疫散射測(cè)濁法(以下略稱為散射測(cè)濁法)、免疫比濁法(以下略稱為比濁法)以及膠乳凝集法等測(cè)定方法。在抗原抗體反應(yīng)中，由于凝集復(fù)合物的生成使得反應(yīng)體系出現(xiàn)渾濁。由于凝集復(fù)合物生成在反應(yīng)體系中出現(xiàn)的渾濁程度與抗原的量和抗體的量有關(guān)。散射測(cè)濁法和比濁法是根據(jù)這一現(xiàn)象對(duì)上述反應(yīng)體系產(chǎn)生的渾濁程度進(jìn)行光學(xué)測(cè)定，由其測(cè)定值算出抗原的量或抗體的量的方法。具體來說，散射測(cè)濁法是根據(jù)反應(yīng)體系中散射光量的變化，而比濁法是根據(jù)反應(yīng)體系中因散射而減少的透過光量的變化測(cè)定凝集復(fù)合物的方法。這些測(cè)定方法由于是在溶液中抗原和抗體都以同樣分散的狀態(tài)下進(jìn)行的方法，所以統(tǒng)稱為「均一體系的免疫反應(yīng)測(cè)定方法」。一般來說，人們知道如果在均一體系的免疫反應(yīng)測(cè)定方法中會(huì)發(fā)生稱之為區(qū)帶現(xiàn)象的現(xiàn)象。所謂區(qū)帶現(xiàn)象是當(dāng)無論是抗原還是抗體存在的量與抗原和抗體形成最大量的凝集復(fù)合物的當(dāng)量區(qū)相比還過剩時(shí)，凝集復(fù)合物難于形成的現(xiàn)象。特別是抗原過剩時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)該問題。就該問題，以下參照?qǐng)D20(a)、(b)進(jìn)行說明。圖20(a)、(b)給出了均一體系免疫反應(yīng)測(cè)定方法中的反應(yīng)體系抗原和抗體反應(yīng)樣子的模式圖。
就象圖20(a)所示，如果利用通常均一體系的免疫反應(yīng)測(cè)定方法，會(huì)生成抗原與抗體交互結(jié)合形成的巨大的分子鏈的凝集復(fù)合物。所謂區(qū)帶現(xiàn)象就象20(b)所示那樣，與抗原和抗體形成最大量的凝集復(fù)合物的當(dāng)量區(qū)相比，抗原相對(duì)于抗體過量存在時(shí)，凝集復(fù)合物難于形成的現(xiàn)象。多價(jià)抗體和2價(jià)以上的抗原之間的結(jié)合反應(yīng)最著名的是Heidelberger等人的格子學(xué)說，下述非專利文獻(xiàn)1中有詳細(xì)記載。
在不發(fā)生區(qū)帶現(xiàn)象的抗體和抗原的濃度范圍內(nèi)，如圖20(a)所示那樣，會(huì)生成抗原與抗體交互結(jié)合形成的巨大分子鏈的凝集復(fù)合物。此時(shí)如果抗體濃度一定，該凝集復(fù)合物的量和大小的增加依賴于抗原濃度。因此，通過將該凝集復(fù)合物的量或大小作為光學(xué)的變化量進(jìn)行測(cè)定，可以定量測(cè)定抗原濃度。另外，凝集復(fù)合物由于抗體和抗原的濃度關(guān)系，溶液中的渾濁或凝集物即使用肉眼也可以充分確認(rèn)，因此通過目視等也可以進(jìn)行定性判定。
然而，在實(shí)際的均一體系的免疫反應(yīng)測(cè)定方法中，往往使用抗體測(cè)定抗原濃度。而當(dāng)抗原濃度比低的情形高時(shí)，測(cè)定值往往具有重要的意義?？墒钱?dāng)抗原濃度與抗體相比過剩時(shí)，就象圖20(b)所示那樣，抗體的結(jié)合部位被抗原飽和的抗體量增加，凝集復(fù)合物產(chǎn)生變得困難。因此，很難區(qū)別抗原低濃度情況和抗原過剩情況之間的抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果。因此擔(dān)心不能依賴于抗原濃度進(jìn)行正確的定量以及判定，或者說，要依賴于抗原濃度進(jìn)行正確的定量以及判定會(huì)產(chǎn)生所謂的測(cè)定濃度被限制的問題。這樣一來，由于抗原存在過量產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象往往是均一體系免疫反應(yīng)測(cè)定方法不適用的一個(gè)原因。
為了解決上述問題，準(zhǔn)備含量為1/n(n＞1的任意數(shù))的多個(gè)不同濃度的與作為被測(cè)定物質(zhì)的抗原(或抗體)特異結(jié)合物質(zhì)抗體(或抗原)，使各個(gè)濃度的結(jié)合物質(zhì)和被測(cè)定物質(zhì)分別反應(yīng)，測(cè)定生成凝集復(fù)合物的方法已公開(參照專利文獻(xiàn)1)。利用該方法可以判定在抗原過量存在的濃度范圍(以下稱之為區(qū)帶區(qū))是否進(jìn)行了抗原抗體反應(yīng)。
另外，由利用兩種不同波長(zhǎng)光測(cè)定得到的測(cè)定結(jié)果通過計(jì)算求出吸光度等判定指標(biāo)，根據(jù)該判定指標(biāo)判定在區(qū)帶區(qū)中是否進(jìn)行了抗原抗體反應(yīng)的方法已公開(專利文獻(xiàn)2、3和4)。
另外，利用測(cè)定的光學(xué)信號(hào)隨時(shí)間變化的微分得到反應(yīng)速度，以反應(yīng)速度達(dá)到峰速度值和由反應(yīng)開始到峰速度經(jīng)過的時(shí)間為基礎(chǔ)，判定在該區(qū)帶區(qū)內(nèi)是否進(jìn)行了抗原抗體反應(yīng)的方法已公開(參照專利文獻(xiàn)5)。
特開昭60-79269號(hào)公報(bào)。
特開昭63-19560號(hào)公報(bào)。
特開昭63-149564號(hào)公報(bào)。
特開平4-204378號(hào)公報(bào)。
美國(guó)專利第4157871號(hào)公報(bào)。
Fundamental Immunology，William E.Parl編(1989)。
然而，如果利用上述專利文獻(xiàn)1公開的方法，對(duì)于一個(gè)樣品需要準(zhǔn)備多個(gè)反應(yīng)容器，測(cè)定多次，測(cè)定手續(xù)煩雜。
另外如果利用上述專利文獻(xiàn)2、3和4公開的方法，需要準(zhǔn)備多個(gè)光源、或由白色光分離各個(gè)波長(zhǎng)光的機(jī)構(gòu)、以及多次測(cè)定機(jī)構(gòu)、或在檢測(cè)器一側(cè)設(shè)置波長(zhǎng)分離機(jī)構(gòu)，測(cè)定裝置構(gòu)成復(fù)雜，另外測(cè)定手續(xù)煩雜。
而如果利用上述專利5文獻(xiàn)公開的方法，在峰速度低的時(shí)候，容易受到氣泡、灰塵等雜物的影響、以及電磁波等對(duì)檢測(cè)器的影響造成的噪音發(fā)生的影響，給出錯(cuò)誤判定結(jié)果的擔(dān)心增高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明鑒于上述事情，目的在于提供簡(jiǎn)便、測(cè)定精度高的免疫反應(yīng)測(cè)定方法以及該方法中使用的免疫學(xué)測(cè)定裝置。
本發(fā)明的免疫反應(yīng)測(cè)定方法，是測(cè)定樣品溶液中含有的被測(cè)定物質(zhì)濃度的免疫反應(yīng)測(cè)定方法，包括對(duì)上述樣品溶液和與上述被測(cè)定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)進(jìn)行混合，在所定的采樣周期，在上述被測(cè)定物質(zhì)和與上述特異結(jié)合物質(zhì)反應(yīng)中光學(xué)變化量隨時(shí)間的變化以離散的測(cè)定數(shù)據(jù)獲得的步驟(a)；選擇在上述測(cè)定數(shù)據(jù)中包括光學(xué)變化量增加率變?yōu)樽畲蟮臅r(shí)刻在內(nèi)的時(shí)間區(qū)間的步驟(b)；將上述時(shí)間區(qū)間作為周期函數(shù)的一個(gè)周期，通過對(duì)處于上述時(shí)間區(qū)間內(nèi)的上述測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行離散傅立葉變換處理，獲得振幅光譜分布的步驟(c)；根據(jù)上述振幅光譜分布的形狀，判定在上述步驟(a)的上述反應(yīng)中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的步驟(d)，上述被測(cè)定物質(zhì)和上述特異結(jié)合物質(zhì)的組合是抗原和抗體的組合。
根據(jù)本發(fā)明的免疫學(xué)測(cè)定方法，可以獲得被測(cè)定物質(zhì)的含量(濃度)。特別是根據(jù)本發(fā)明，由于一方面可以判定在反應(yīng)體系中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的同時(shí)，可以測(cè)定反應(yīng)體系的光學(xué)變化量，所以根據(jù)光學(xué)變化量得到的被測(cè)定物質(zhì)的含量(濃度)的數(shù)值的可信度非常高。另外由于一方面可以判定在反應(yīng)體系中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的同時(shí)，可以測(cè)定反應(yīng)體系的光學(xué)變化量，因此測(cè)定手續(xù)非常簡(jiǎn)便。另外，在本發(fā)明中由于利用傅立葉變換，相對(duì)于測(cè)定數(shù)據(jù)的變化，可以認(rèn)為噪音為高頻率信號(hào)，可以將測(cè)定數(shù)據(jù)變化引起的信號(hào)和由噪音引起的信號(hào)分離。因此很難受到噪音的影響。
上述光學(xué)的變化量可以是散射光強(qiáng)度的變化量或透射光量的變化量。
上述時(shí)間區(qū)間也可以根據(jù)不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的反應(yīng)中測(cè)定的光學(xué)的變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)預(yù)先決定。
上述時(shí)間區(qū)間也可以是從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止。
在上述步驟(d)中，最好是根據(jù)上述振幅光譜分布的形狀和在不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的反應(yīng)中測(cè)定的振幅光譜分布的形狀判定在上述步驟(a)的上述反應(yīng)中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
在上述步驟(e)中，也可以根據(jù)上述振幅光譜分布的形狀和上述樣品溶液中含有的被測(cè)定物質(zhì)的濃度為不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的濃度時(shí)的振幅光譜分布的形狀判定在上述步驟(b)中反應(yīng)體系是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
在上述步驟(d)中，最好是根據(jù)相當(dāng)于上述時(shí)間區(qū)間的倒數(shù)的頻率處的振幅值相對(duì)于上述振幅光譜的直流成分(頻率為0時(shí)的振幅值)的比率為基礎(chǔ)，判定在上述步驟(a)的反應(yīng)體系中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
在上述步驟(d)中，上述比率超過由不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的反應(yīng)和產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的反應(yīng)兩者的分布結(jié)果求出的基準(zhǔn)值時(shí)，最好是判定上述步驟(a)的上述反應(yīng)中的不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象，當(dāng)?shù)陀谏鲜龌鶞?zhǔn)值時(shí)判定上述步驟(a)的上述反應(yīng)中產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
也可以在上述步驟(a)之前，進(jìn)一步包括構(gòu)建含有上述樣品溶液和上述特異結(jié)合物質(zhì)任一方的反應(yīng)體系，在上述所定的采樣周期，將上述反應(yīng)體系中光學(xué)變化量隨時(shí)間的變化以離散的測(cè)定數(shù)據(jù)獲得的步驟(e)，在上述步驟(a)，通過向上述反應(yīng)體系添加上述樣品溶液和上述特異結(jié)合物質(zhì)中不含在上述反應(yīng)體系中的一方，對(duì)上述樣品溶液和上述特異結(jié)合物質(zhì)進(jìn)行混合，上述時(shí)間區(qū)間也可以是從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)體系中的反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止。
在上述步驟(d)中，當(dāng)相當(dāng)于從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)體系中的反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和時(shí)刻為止的時(shí)間區(qū)間的倒數(shù)的頻率處的振幅值，與相當(dāng)于從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)體系中的反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止的時(shí)間區(qū)間的倒數(shù)的頻率處的振幅值的差，為正的數(shù)時(shí)，最好判定在上述步驟(a)的上述反應(yīng)體系中不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象，當(dāng)上述差值為負(fù)的數(shù)時(shí)，最好判定在上述步驟(a)的上述反應(yīng)體系中產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
也可以以上述步驟(c)中的上述振幅光譜分布的直流成分的振幅值為基礎(chǔ)，對(duì)上述測(cè)定物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量。
本發(fā)明的免疫學(xué)測(cè)定裝置，備有對(duì)含有被測(cè)定物質(zhì)的樣品溶液和與上述被測(cè)定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)進(jìn)行混合時(shí)反應(yīng)中的光學(xué)變化量進(jìn)行測(cè)定的測(cè)定機(jī)構(gòu)；和與上述測(cè)定機(jī)構(gòu)相連，對(duì)通過上述測(cè)定機(jī)構(gòu)得到的測(cè)定數(shù)據(jù)中包括光學(xué)變化量的增加率變?yōu)樽畲蟮臅r(shí)刻在內(nèi)的時(shí)間區(qū)間進(jìn)行選擇，將上述時(shí)間區(qū)間作為周期函數(shù)的一個(gè)周期，通過對(duì)處于上述時(shí)間區(qū)間內(nèi)的上述測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行離散傅立葉變換處理，獲得振幅光譜分布的測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)；以及與上述測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)連接，根據(jù)上述振幅光譜分布的形狀，對(duì)在的上述反應(yīng)中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象進(jìn)行判定的判定機(jī)構(gòu)。
利用本發(fā)明的免疫學(xué)測(cè)定裝置，可以在判定在反應(yīng)體系中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的同時(shí)，測(cè)定反應(yīng)體系的光學(xué)變化量。所以根據(jù)光學(xué)變化量得到的被測(cè)定物質(zhì)的含量(濃度)的數(shù)值的可信度非常高。另外由于在判定在反應(yīng)體系中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的同時(shí)，可以測(cè)定反應(yīng)體系的光學(xué)變化量，因此測(cè)定手續(xù)非常簡(jiǎn)單。另外，在本發(fā)明中由于利用傅立葉變換，相對(duì)于測(cè)定數(shù)據(jù)的變化，可以認(rèn)為噪音為高頻率信號(hào)，可以將測(cè)定數(shù)據(jù)變化引起的信號(hào)和由噪音引起的信號(hào)分離。因此很難受到噪音的影響。就是說，通過本發(fā)明可以進(jìn)行簡(jiǎn)便、而且可信度高的免疫反應(yīng)測(cè)定。
上述時(shí)間區(qū)間也可以是從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止。
上述判定機(jī)構(gòu)可以是將在上述反應(yīng)中不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的振幅光譜分布形狀作為基準(zhǔn)形狀預(yù)先存儲(chǔ)，通過比較上述基準(zhǔn)形狀與利用上述測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)得到的上述振幅光譜分布的形狀進(jìn)行判定的構(gòu)成。
上述判定機(jī)構(gòu)可以是以相當(dāng)于上述時(shí)間區(qū)間的倒數(shù)的頻率處的振幅值的相對(duì)于上述振幅光譜分布的直流成分的比率作為基礎(chǔ)進(jìn)行判定的構(gòu)成。
上述判定機(jī)構(gòu)可以是當(dāng)上述比率超過由不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的反應(yīng)和產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的反應(yīng)兩者的分布結(jié)果求出的基準(zhǔn)值時(shí)，最好是判定上述測(cè)定機(jī)構(gòu)的上述反應(yīng)中不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象，當(dāng)?shù)陀谏鲜龌鶞?zhǔn)值時(shí)判定上述測(cè)定機(jī)構(gòu)中的上述反應(yīng)中產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的構(gòu)成。
上述時(shí)間區(qū)間也可以是從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合前開始直至上述反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止，此時(shí)上述判定機(jī)構(gòu)的構(gòu)成最好是當(dāng)相當(dāng)于從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)實(shí)質(zhì)飽和時(shí)刻的為止的時(shí)間區(qū)間的倒數(shù)的頻率處的振幅值，與相當(dāng)于對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止的時(shí)間區(qū)間的倒數(shù)的頻率處的振幅值的差，為正的數(shù)時(shí)，最好判定在上述反應(yīng)中不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象，當(dāng)上述差值為負(fù)的數(shù)時(shí)，最好判定在上述反應(yīng)中產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
另外，上述免疫反應(yīng)測(cè)定裝置，還可以備有與上述測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)連接，根據(jù)上述振幅光譜分布的形狀，對(duì)上述被測(cè)定物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量的定量機(jī)構(gòu)。
對(duì)上述被測(cè)定物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量的定量機(jī)構(gòu)，可以以上述振幅光譜分布的直流成分的振幅值作為基礎(chǔ)對(duì)上述被測(cè)定物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量。
根據(jù)本發(fā)明可以提供簡(jiǎn)便、測(cè)定精度高的免疫學(xué)測(cè)定方法以及方法中使用的免疫學(xué)測(cè)定裝置。


圖1是表示本發(fā)明實(shí)施方式中的免疫反應(yīng)測(cè)定方法的各個(gè)步驟的流程圖。
圖2(a)是表示本發(fā)明的實(shí)施方式中的離散的光學(xué)的變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)的圖，圖2(b)是表示本發(fā)明的實(shí)施方式中的振幅光譜分布的圖。
圖3是表示本發(fā)明的實(shí)施方式的免疫學(xué)測(cè)定裝置構(gòu)成的梗概圖。
圖4是表示對(duì)于在本發(fā)明的實(shí)施例中利用免疫散射測(cè)濁法進(jìn)行人白蛋白溶液的測(cè)定，免疫反應(yīng)充分飽和150秒至200秒之間測(cè)定值的平均值作圖的結(jié)果圖。
圖5是表示在本發(fā)明實(shí)施例中的人白蛋白溶液的測(cè)定中得到的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的圖。
圖6是表示對(duì)于在本發(fā)明實(shí)施例中的5mg/dl的人白蛋白溶液的測(cè)定中得到的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間變化，實(shí)施傅立葉變換得到的振幅光譜分布。
圖7是表示對(duì)于在本發(fā)明實(shí)施例中的10mg/dl的人白蛋白溶液的測(cè)定中得到的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間變化，實(shí)施傅立葉變換得到的振幅光譜分布。
圖8是表示對(duì)于在本發(fā)明實(shí)施例中的20mg/dl的人白蛋白溶液的測(cè)定中得到的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間變化，實(shí)施傅立葉變換得到的振幅光譜分布。
圖9是表示對(duì)于在本發(fā)明實(shí)施例中的30mg/dl的人白蛋白溶液的測(cè)定中得到的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間變化，實(shí)施傅立葉變換得到的振幅光譜分布。
圖10是表示對(duì)于在本發(fā)明實(shí)施例中的50mg/dl的人白蛋白溶液的測(cè)定中得到的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間變化，實(shí)施傅立葉變換得到的振幅光譜分布。
圖11是表示對(duì)于在本發(fā)明實(shí)施例中的100mg/dl的人白蛋白溶液的測(cè)定中得到的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間變化，實(shí)施傅立葉變換得到的振幅光譜分布。
圖12是表示對(duì)于在本發(fā)明實(shí)施例中的200mg/dl的人白蛋白溶液的測(cè)定中得到的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間變化，實(shí)施傅立葉變換得到的振幅光譜分布。
圖13是表示對(duì)于在本發(fā)明實(shí)施例中的300mg/dl的人白蛋白溶液的測(cè)定中得到的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間變化，實(shí)施傅立葉變換得到的振幅光譜分布。
圖14是表示對(duì)于在本發(fā)明實(shí)施例中的5mg/dl和300mg/dl的人白蛋白溶液的測(cè)定中得到的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間變化，實(shí)施傅立葉變換得到的振幅光譜分布。
圖15是表示在5mg/dl和300mg/dl的人白蛋白溶液的測(cè)定中的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的圖。
圖16是表示對(duì)圖15所示的時(shí)間區(qū)間的測(cè)定數(shù)據(jù)付加散亂噪音后的結(jié)果。
圖17表示對(duì)圖15所示的測(cè)定數(shù)據(jù)，錯(cuò)開0.5秒數(shù)據(jù)后獲得的差分結(jié)果。
圖18表示對(duì)圖16所示的測(cè)定數(shù)據(jù)，錯(cuò)開0.5秒數(shù)據(jù)后獲得的差分結(jié)果。
圖19表示對(duì)圖16所示的付加散亂噪音時(shí)的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行離散傅立葉變換，求出的振幅光譜分布的結(jié)果。
圖20(a)和(b)是表示在均一體系的免疫反應(yīng)測(cè)定方法的反應(yīng)體系中的抗原和抗體反應(yīng)的樣子的模式圖。
圖中10免疫學(xué)測(cè)定裝置，11測(cè)定機(jī)構(gòu)，12測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)，13判定/定量機(jī)構(gòu)，14測(cè)定杯具體實(shí)施方式
在對(duì)樣品中被測(cè)定物質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定的免疫反應(yīng)測(cè)定方法中，使被測(cè)定物質(zhì)和與被測(cè)定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)反應(yīng)，對(duì)該反應(yīng)過程中的光學(xué)特性的變化量進(jìn)行測(cè)定，由測(cè)定的結(jié)果算出被測(cè)定物質(zhì)的量。
(第一個(gè)免疫學(xué)測(cè)定方法)以下參照?qǐng)D1和圖2，對(duì)本發(fā)明的第一個(gè)免疫學(xué)測(cè)定方法進(jìn)行說明。圖1是表示本實(shí)施方式的第一個(gè)免疫學(xué)測(cè)定方法的各個(gè)步驟的流程圖，圖2(a)是表示離散的光學(xué)變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)的曲線圖，圖2(b)是表示振幅光譜分布的曲線圖。圖2(b)中進(jìn)行離散傅立葉變換的時(shí)間區(qū)間(1周期)的倒數(shù)作為基本頻率用f表示，被測(cè)定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)的組合是抗原和抗體的組合。
在本發(fā)明的第一個(gè)免疫反應(yīng)測(cè)定方法中，首先，在圖1所示的步驟St1(相當(dāng)于權(quán)利要求范圍的步驟(e))，構(gòu)建只含有被測(cè)定物質(zhì)或特異結(jié)合物質(zhì)任一方的反應(yīng)體系，開始進(jìn)行反應(yīng)體系的光學(xué)變化量的測(cè)定。這里，作為反應(yīng)體系，所謂可以是含有被測(cè)定物質(zhì)或特異結(jié)合物質(zhì)任一方的反應(yīng)體系是因?yàn)榭梢韵虮粶y(cè)定物質(zhì)添加特異結(jié)合物質(zhì)，也可以向特異結(jié)合物質(zhì)添加被測(cè)定物質(zhì)。
接下來，在步驟St2(相當(dāng)于權(quán)利要求范圍的步驟(a))，被測(cè)定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)開始混合，反應(yīng)體系的光學(xué)的變化量隨時(shí)間的變化以離散的測(cè)定數(shù)據(jù)獲得。而所謂的該「光學(xué)的變化量」具體指的是散射光強(qiáng)度或透射光量的變化量，光學(xué)的變化量的測(cè)定是以一定的采樣周期進(jìn)行的。這里，當(dāng)反應(yīng)體系含有被測(cè)定物質(zhì)時(shí)，向反應(yīng)體系添加特異結(jié)合物質(zhì)，當(dāng)反應(yīng)體系含有特異結(jié)合物質(zhì)時(shí)向反應(yīng)體系添加被測(cè)定物質(zhì)。
通過以上的步驟St1和步驟St2可以獲得例如圖2(a)所示的光學(xué)變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)。而圖2(a)的光學(xué)變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)是用線將在各個(gè)測(cè)定時(shí)間的離散的測(cè)定結(jié)果連接起來的數(shù)據(jù)。
在本實(shí)施方式的免疫學(xué)的測(cè)定方法中，被測(cè)定物質(zhì)是抗原時(shí)，特異結(jié)合物質(zhì)是抗體，被測(cè)定物質(zhì)是抗體時(shí)，特異結(jié)合物質(zhì)是抗原。在步驟St1中，當(dāng)反應(yīng)體系只含有被測(cè)定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)中任一方時(shí)，在反應(yīng)體系中不會(huì)發(fā)生通過被測(cè)定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)生成凝集復(fù)合物。與此相反，在步驟St2中，當(dāng)將被測(cè)定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)混合時(shí)，在反應(yīng)體系中開始生成由被測(cè)定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)形成的凝集復(fù)合物。
當(dāng)在步驟St2反應(yīng)體系中生成凝集復(fù)合物時(shí)，反應(yīng)體系出現(xiàn)渾濁、散射光強(qiáng)度以及透射光量等光學(xué)的變化量發(fā)生變化。因此通過測(cè)定該光學(xué)變化量，可以估計(jì)反應(yīng)體系的渾濁程度。而作為該評(píng)估的基準(zhǔn)最好是測(cè)定反應(yīng)體系中只含有被測(cè)定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)中任一方時(shí)的光學(xué)變化量、即散射光強(qiáng)度或透射光量的變化量。
接下來，在圖1所示的步驟St3(相當(dāng)于權(quán)利要求范圍的步驟(b))，在獲得的測(cè)定數(shù)據(jù)中選擇含有光學(xué)的變化量的增加率(即反應(yīng)速度)為最大時(shí)的時(shí)間區(qū)間。即在圖2(a)中選擇時(shí)間區(qū)間d2+d3。
接下來，在圖1所示的步驟St4(相當(dāng)于權(quán)利要求范圍的步驟(c))，將選擇的時(shí)間區(qū)間d2+d3作為周期函數(shù)的1個(gè)周期，通過對(duì)被選擇的時(shí)間區(qū)間d2+d3內(nèi)的離散的光學(xué)變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行離散傅立葉變換處理，可以得到如圖2(b)所示的振幅光譜分布。
接下來，在圖1所示的步驟St5(相當(dāng)于權(quán)利要求范圍的步驟(d))，根據(jù)振幅光譜分布的形狀，判定在上述步驟St2反應(yīng)體系中是否產(chǎn)生了區(qū)帶現(xiàn)象。具體來說，此時(shí)作為「基準(zhǔn)形狀」預(yù)先獲得在反應(yīng)體系中不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的振幅光譜分布的形狀，通過將步驟St4中得到的振幅光譜分布與基準(zhǔn)形狀進(jìn)行比較來判定。該判定方法在下面敘述的實(shí)施例4中進(jìn)行詳細(xì)說明。另外，在本步驟中，也可以通過目視判定振幅光譜分布的形狀，也可以用計(jì)算機(jī)進(jìn)行判定。就象下面實(shí)施例2說明的那樣，也可以以步驟St4中得到的振幅光譜分布的直流成分的振幅值為基礎(chǔ)對(duì)上述被測(cè)定物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量。
通過實(shí)施以上步驟，可以得到被測(cè)定物質(zhì)的含量(濃度)。特別是根據(jù)本實(shí)施方式的免疫學(xué)測(cè)定方法，由于可以在判定在反應(yīng)體系中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的同時(shí)，可以測(cè)定反應(yīng)體系的光學(xué)變化量，所以根據(jù)光學(xué)變化量得到的被測(cè)定物質(zhì)的含量(濃度)的數(shù)值的可信度非常高。
另外，根據(jù)本實(shí)施方式的免疫學(xué)測(cè)定方法，由于可以在判定在反應(yīng)體系中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的同時(shí)，可以測(cè)定反應(yīng)體系的光學(xué)變化量，因此對(duì)于一個(gè)樣品溶液不需要進(jìn)行多次測(cè)定，不需要準(zhǔn)備多個(gè)反應(yīng)容器，所以測(cè)定手續(xù)非常簡(jiǎn)單。
另外，在本實(shí)施方式的免疫學(xué)測(cè)定方法中，由于利用傅立葉變換，相對(duì)于測(cè)定數(shù)據(jù)的變化，可認(rèn)為噪音為高頻率信號(hào)，可以將測(cè)定數(shù)據(jù)變化引起的信號(hào)和由噪音引起的信號(hào)分離。因此很難受到噪音的影響。因此按照本實(shí)施方式可以提供簡(jiǎn)便、可信度高的免疫反應(yīng)測(cè)定方法。
而在本實(shí)施方式的免疫學(xué)測(cè)定方法中，光學(xué)的變化量最好是散射光強(qiáng)度的變化量或透射光量的變化量。由于測(cè)定依賴于抗原和抗體的復(fù)合物生成的透射光量的變化的免疫比濁法以及測(cè)定散射光量變化的免疫散射測(cè)濁法容易受到區(qū)帶現(xiàn)象的影響，因此使用本實(shí)施方式測(cè)定方法時(shí)的效果非常大。
另外，在步驟St3中選擇的時(shí)間區(qū)間d2、d3最好是根據(jù)不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的光學(xué)變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)決定的時(shí)間區(qū)間。就是說，作為d2、d3最好是在不測(cè)定作為測(cè)定對(duì)象的反應(yīng)體系的反應(yīng)時(shí)間，而使用預(yù)先測(cè)定不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的反應(yīng)時(shí)間。不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的測(cè)定數(shù)據(jù)與產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的測(cè)定數(shù)據(jù)相比，反應(yīng)體系的光學(xué)的變化量的增加率(反應(yīng)速度)的峰值時(shí)刻、抗原抗體反應(yīng)的飽和時(shí)刻等信息是明確的，抗原抗體反應(yīng)飽和后的穩(wěn)定性高，在對(duì)時(shí)間區(qū)間進(jìn)行選擇上的基準(zhǔn)位置的選定容易。
特別是，根據(jù)不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的光學(xué)變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)選擇的測(cè)定數(shù)據(jù)的時(shí)間區(qū)間d2+d3，最好是從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻(即反應(yīng)開始)直至反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后反應(yīng)體系的光學(xué)變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻。這樣一來，可以得到反映不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的測(cè)定數(shù)據(jù)與產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的測(cè)定數(shù)據(jù)的差別的離散傅立葉變換光譜，可以更明確地判定步驟St2的反應(yīng)體系中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。而在本說明書和權(quán)利要求范圍內(nèi)所謂的「光學(xué)變化量實(shí)質(zhì)上一定」具體來說不僅指的是圖2(a)所示的時(shí)間區(qū)間d3的光學(xué)變化量，測(cè)定的光學(xué)的變化量一定的情形，也包括光學(xué)的變化量變化的情形，該變化程度與在時(shí)間區(qū)間d2的光學(xué)變化量的變化可明顯區(qū)別。另外在本說明書和權(quán)利要求的范圍內(nèi)，所謂「反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和的時(shí)刻」具體來說指的是圖2(a)所示的時(shí)間區(qū)間d2和時(shí)間區(qū)間d3交界的時(shí)刻，指的是圖2(a)所示的曲線中的光學(xué)的變化量的變化趨勢(shì)為最大的地方。
另外，在步驟St5中，在步驟St4得到的離散傅立葉變換振幅光譜分布中，最好是以相對(duì)于頻率的振幅值的直流成分的大小的變化為基礎(chǔ)判定抗原抗體反應(yīng)是否是區(qū)帶區(qū)。上述振幅光譜分布中的振幅值，由于明顯反映出免疫反應(yīng)的反應(yīng)曲線上升的不同，所以步驟St2的反應(yīng)體系中產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象情形和不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的情形的判定變得容易。
另外最好是以步驟St4得到的振幅光譜分布的直流成分的振幅值作為基礎(chǔ)對(duì)上述被測(cè)定物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量。這樣一來，可以降低噪音對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)的影響，另外也可以有效地活用離散傅立葉變換后的數(shù)據(jù)。
(第2個(gè)免疫學(xué)測(cè)定方法)以下象上述第1個(gè)免疫學(xué)測(cè)定方法那樣，作為時(shí)間區(qū)間對(duì)于不是從反應(yīng)開始時(shí)直至反應(yīng)飽和后光學(xué)變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定為止的時(shí)間區(qū)間(圖2(a)所示的時(shí)間區(qū)間d2+d3)，而是從對(duì)特異結(jié)合物質(zhì)和樣品溶液進(jìn)行混合前(反應(yīng)開始前)直至反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定為止的時(shí)刻進(jìn)行選擇的情形進(jìn)行說明。
此時(shí)，在圖1所示的步驟St1、St2中進(jìn)行與第1個(gè)免疫學(xué)測(cè)定方法同樣的測(cè)定，在步驟St3中選擇時(shí)間區(qū)間d1+d2+d3，在步驟St4中將時(shí)間區(qū)間d1+d2+d3作為一個(gè)周期通過進(jìn)行離散傅立葉變換處理獲得振幅光譜分布。然后在步驟St5中，在步驟St4得到的離散傅立葉變換振幅光譜分布中，相當(dāng)于反應(yīng)開始時(shí)刻直至反應(yīng)達(dá)到飽和的時(shí)間區(qū)間(圖2(a)表示的時(shí)間區(qū)間d2)的倒數(shù)的頻率(1/d2)的振幅值減去相當(dāng)于反應(yīng)開始時(shí)刻直至反應(yīng)達(dá)到飽和的時(shí)間區(qū)間(d2)和反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止的時(shí)間區(qū)間(d3)的和(d2+d3)的倒數(shù)的頻率(1/(d2+d3)的振幅值的值作為基礎(chǔ)，可以判定進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)是否是區(qū)帶區(qū)。此時(shí)，當(dāng)[(1/d2的振幅值)-(1/(d2+d3)的振幅值)]的差為正數(shù)時(shí)，判定上述反應(yīng)體系中不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象，當(dāng)上述差值為負(fù)數(shù)時(shí)，判定上述反應(yīng)體系中產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。這樣一來，反應(yīng)體系中產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象情形和不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的情形的判定就變得容易了。
此時(shí)，在選擇從反應(yīng)開始前到反應(yīng)達(dá)到飽和的時(shí)間區(qū)間時(shí)，反應(yīng)開始前的時(shí)間區(qū)間d1、反應(yīng)速度增加中的時(shí)間區(qū)間d2以及反應(yīng)飽和后的時(shí)間區(qū)間d3的各個(gè)時(shí)間區(qū)間，如果能夠?qū)嵸|(zhì)上按照3等分那樣選擇時(shí)間區(qū)間，上述差值就變得明確了。
(免疫學(xué)測(cè)定裝置)以下參照?qǐng)D3對(duì)上述免疫學(xué)測(cè)定方法中使用的免疫學(xué)測(cè)定裝置進(jìn)行說明。就象圖3所示那樣，本實(shí)施方式的免疫學(xué)測(cè)定裝置10由測(cè)定機(jī)構(gòu)11、與測(cè)定機(jī)構(gòu)11電連接的測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12、與測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12電連接的判定機(jī)構(gòu)兼定量機(jī)構(gòu)13構(gòu)成。而本說明書中所謂的「連接」沒有特別指定的話，指的是「電連接」。
測(cè)定機(jī)構(gòu)11是收容測(cè)定杯14、對(duì)測(cè)定杯14內(nèi)構(gòu)建的反應(yīng)體系的光學(xué)變化量進(jìn)行測(cè)定的機(jī)構(gòu)，例如可以舉出測(cè)定作為光學(xué)變化量的散射光強(qiáng)度或透射光量的變化量的裝置等。而在本實(shí)施方式中，將測(cè)定機(jī)構(gòu)11作為測(cè)定時(shí)導(dǎo)入測(cè)定杯14的構(gòu)成，但是對(duì)此沒有限定。例如也可以是在測(cè)定機(jī)構(gòu)11的內(nèi)部設(shè)置測(cè)定杯的構(gòu)成。
測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12，選擇通過測(cè)定機(jī)構(gòu)11得到的測(cè)定數(shù)據(jù)中包括光學(xué)變化量的增加率(即反應(yīng)速度)變?yōu)樽畲髸r(shí)刻在內(nèi)的時(shí)間區(qū)間(例如圖2(a)中的時(shí)間區(qū)間d2+d3或時(shí)間區(qū)間d1+d2+d3)，將選擇的時(shí)間區(qū)間D作為周期函數(shù)的一個(gè)周期，通過對(duì)處于上述時(shí)間區(qū)間d2+d3或時(shí)間區(qū)間d1+d2+d3內(nèi)的離散的光學(xué)變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行離散傅立葉變換處理。通過這樣處理可以得到如圖2(b)所示的振幅光譜分布。
判定/定量機(jī)構(gòu)13根據(jù)通過測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12得到的振幅光譜分布的形狀，判定測(cè)定杯14內(nèi)反應(yīng)體系中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象，另外當(dāng)判定不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)，對(duì)被測(cè)定物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量。另外判定/定量機(jī)構(gòu)13可以通過將反應(yīng)體系中不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的振幅光譜分布的形狀作為「基準(zhǔn)形狀」以電子數(shù)據(jù)的方式預(yù)先存儲(chǔ)，通過將測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12得到的振幅光譜分布與基準(zhǔn)形狀進(jìn)行比較來判定。另外判定/定量機(jī)構(gòu)13為了對(duì)被測(cè)定物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量，將特定頻率成分的振幅值與被測(cè)定物質(zhì)的濃度對(duì)應(yīng)給出的數(shù)式(校正曲線)以電子數(shù)據(jù)的方式預(yù)先存儲(chǔ)，可以通過將通過測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12得到的特定的頻率成分的振幅值代入到數(shù)式(校正曲線)中求被測(cè)定物質(zhì)的濃度。
測(cè)定杯14由透明的材料構(gòu)成，內(nèi)部可以貯存液體。進(jìn)行測(cè)定時(shí)，將反應(yīng)體系注入后置于測(cè)定機(jī)構(gòu)11中，以一定的采樣周期一邊繼續(xù)進(jìn)行光學(xué)的變化量的測(cè)定，一邊對(duì)特異結(jié)合物質(zhì)和樣品溶液進(jìn)行混合。
以下，就本實(shí)施方式中的免疫學(xué)測(cè)定裝置10的動(dòng)作進(jìn)行說明。
首先，將被測(cè)定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)中的任一方導(dǎo)入到測(cè)定杯14中后構(gòu)建反應(yīng)體系，將測(cè)定杯14置于測(cè)定機(jī)構(gòu)11中。
然后在測(cè)定機(jī)構(gòu)11中開始反應(yīng)體系的光學(xué)的變化量的測(cè)定。此時(shí)，反應(yīng)體系的光學(xué)的變化量的測(cè)定是以一定的采樣周期進(jìn)行的。
然后，以一定的采樣周期一邊繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)體系的光學(xué)的變化量的測(cè)定，一邊對(duì)與被測(cè)定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)和樣品溶液進(jìn)行混合。然后，作為離散光學(xué)變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)(例如圖2(a)所示的光學(xué)變化量的測(cè)定數(shù)據(jù))獲得反應(yīng)體系的光學(xué)變化量隨時(shí)間的變化。
而測(cè)定機(jī)構(gòu)11最好是以只含有被測(cè)定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)任一方的反應(yīng)體系作為基準(zhǔn)測(cè)定反應(yīng)體系的光學(xué)變化量(例如，散射光強(qiáng)度或透射光量的變化量)的構(gòu)成。
測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12選擇通過測(cè)定機(jī)構(gòu)11得到的測(cè)定數(shù)據(jù)中的包括光學(xué)變化量的增加率(即反應(yīng)速度)變?yōu)樽畲髸r(shí)刻在內(nèi)的時(shí)間區(qū)間。即選擇圖2(a)中的時(shí)間區(qū)間d2+d3或時(shí)間區(qū)間d1+d2+d3。
測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12通過將選擇的時(shí)間區(qū)間d2+d3或時(shí)間區(qū)間d1+d2+d3作為周期函數(shù)的一個(gè)周期，通過對(duì)處于上述d2+d3或時(shí)間區(qū)間d1+d2+d3內(nèi)的離散的光學(xué)變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行離散傅立葉變換處理，可以得到例如圖2(b)所示的振幅光譜分布。
判定/定量機(jī)構(gòu)13根據(jù)通過測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12得到的振幅光譜分布的形狀，判定測(cè)定杯14內(nèi)的反應(yīng)體系中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象，然后對(duì)被測(cè)定物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量。
利用本實(shí)施方式的免疫學(xué)測(cè)定裝置10可以判定在反應(yīng)體系中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的同時(shí)，測(cè)定反應(yīng)體系的光學(xué)變化量。由此根據(jù)光學(xué)變化量得到的被測(cè)定物質(zhì)的含量(濃度)的數(shù)值的可信度非常高。因此利用本實(shí)施方式可以進(jìn)行簡(jiǎn)便、可信度高的免疫反應(yīng)測(cè)定。
而作為測(cè)定機(jī)構(gòu)11的具體例子，可以舉出吸光光度計(jì)。而作為測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12最好是使用A/D變換元件，通過A/D變換由測(cè)定機(jī)構(gòu)11獲得測(cè)定數(shù)據(jù)的構(gòu)成。
本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測(cè)定裝置10可以做成測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12和判定/定量機(jī)構(gòu)13分別設(shè)置的構(gòu)成，但是對(duì)此沒有限定。例如也可以由軟件和1臺(tái)計(jì)算機(jī)構(gòu)成測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12和判定/定量機(jī)構(gòu)13。另外，也可以使用DSP(Digital Signal Processor)等電路元件構(gòu)成。
作為測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12使用計(jì)算機(jī)時(shí)，可以做成測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12中的時(shí)間區(qū)間的選擇基準(zhǔn)和范圍通過軟件由操作者任意指定的構(gòu)成。
另外，測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12是計(jì)算機(jī)，使用特定樣品溶液進(jìn)行測(cè)定時(shí)，最好是使通過測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12選擇的時(shí)間區(qū)間可在ROM、RAM等存儲(chǔ)器上存儲(chǔ)的構(gòu)成。此時(shí)存儲(chǔ)的時(shí)間區(qū)間最好是根據(jù)不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的光學(xué)變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)存儲(chǔ)的。
另外，作為判定/定量機(jī)構(gòu)13使用計(jì)算機(jī)時(shí)，區(qū)帶現(xiàn)象判定中使用的基準(zhǔn)形狀可以是根據(jù)軟件由操作者任意設(shè)定的構(gòu)成。
另外，判定/定量機(jī)構(gòu)13是計(jì)算機(jī)，使用特定樣品溶液進(jìn)行測(cè)定時(shí)，最好是使基準(zhǔn)形狀可在ROM、RAM等存儲(chǔ)器上存儲(chǔ)的構(gòu)成。另外，基準(zhǔn)形狀最好是做成具有各個(gè)頻率的振幅值的振幅光譜分布。
就象以上說明的那樣，利用本實(shí)施方式的免疫學(xué)測(cè)定方法和免疫學(xué)測(cè)定裝置，對(duì)于一個(gè)樣品溶液不需要進(jìn)行多次測(cè)定，不用準(zhǔn)備多個(gè)反應(yīng)容器，另外，不需要多波長(zhǎng)測(cè)定，測(cè)定手續(xù)和裝置構(gòu)成非常簡(jiǎn)單。
特別是利用本實(shí)施方式的免疫學(xué)測(cè)定方法和免疫學(xué)的測(cè)定裝置，通過利用一個(gè)波長(zhǎng)的光進(jìn)行的測(cè)定，由于可以判定是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象，所以裝置構(gòu)成變得簡(jiǎn)單，另外測(cè)定工序也不煩雜。另外由于利用傅立葉變換，相對(duì)于測(cè)定數(shù)據(jù)的變化，可以認(rèn)為噪音為高頻率信號(hào)，可以將測(cè)定數(shù)據(jù)變化引起的信號(hào)和由噪音引起的信號(hào)分離。因此很難受到噪音的影響。
實(shí)施例以下用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
(實(shí)施例1)以下敘述上述實(shí)施方式中說明的免疫學(xué)的測(cè)定裝置10的具體構(gòu)成例子。而在本實(shí)施例中，用上述第1、第2個(gè)免疫學(xué)測(cè)定方法中的后者的方法(選擇時(shí)間區(qū)間d1+d2+d3的方法)進(jìn)行說明。
本實(shí)施例中測(cè)定機(jī)構(gòu)11構(gòu)成如下。作為光源使用在270Hz調(diào)制的波長(zhǎng)680nm的發(fā)射功率15mW半導(dǎo)體激光指示器(キユ-技研生產(chǎn)、型號(hào)MLXS-D-12-680-35)，作為檢測(cè)器使用可見紅外精密測(cè)光用硅光電二極管(濱松フオトニクス公司生產(chǎn)、型號(hào)S2387-66R)。作為測(cè)定杯使用四周為厚0.1cm的光學(xué)玻璃板的正四角柱形，容量約為200μl的測(cè)定杯。光源、檢測(cè)器、測(cè)定杯的各個(gè)配置，在離開光源0.5cm的地方配置測(cè)定杯，使其一面與來自光源發(fā)射光的光軸垂直，檢測(cè)器配置在與光源成90°度的方向，離開測(cè)定杯5.5cm的地方，為了使雜散光不入射到檢測(cè)器，在檢測(cè)器和杯之間設(shè)置遮光筒。依賴于通過檢測(cè)器檢測(cè)的光量的電流信號(hào)通過電流電壓變換電路(106V/A)和運(yùn)算放大器經(jīng)放大電路放大到100倍的電壓信號(hào)后，通過同步放大器(エヌエフ電路設(shè)計(jì)ブロツグ生產(chǎn)、型號(hào)5610B)進(jìn)行相位敏感檢波，通過GPIB調(diào)控以一定間隔整合到計(jì)算機(jī)中。本實(shí)施例的采樣周期為0.5秒。
測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12的構(gòu)成如下。在本實(shí)施例中，將選擇的時(shí)間區(qū)間的設(shè)定做成從反應(yīng)開始前開始直至反應(yīng)飽和經(jīng)過一定時(shí)間后的范圍，按照反應(yīng)開始前、反應(yīng)增加中、以及飽和后的數(shù)據(jù)長(zhǎng)度實(shí)質(zhì)上等分那樣進(jìn)行設(shè)定。對(duì)于下面敘述的實(shí)施例2所示抗原抗體反應(yīng)，獲得從反應(yīng)開始10秒前直至反應(yīng)開始后約22秒為止的時(shí)間區(qū)間的64點(diǎn)的采樣數(shù)據(jù)。將這些數(shù)據(jù)當(dāng)作周期32秒、頻率0.03125Hz的周期信號(hào)，在Microsoft Excel(Microsoft公司生產(chǎn))上進(jìn)行離散的傅立葉變換處理，求出振幅光譜分布。
判定/定量機(jī)構(gòu)13中的判定機(jī)構(gòu)，采用對(duì)相當(dāng)于對(duì)被測(cè)定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)進(jìn)行混合、反應(yīng)開始時(shí)刻直至反應(yīng)達(dá)到飽和的時(shí)間區(qū)間(圖2(a)中的d2)的倒數(shù)(1/d2)的頻率處的振幅值，與相當(dāng)于反應(yīng)開始時(shí)刻直至反應(yīng)達(dá)到飽和的時(shí)間區(qū)間(圖2(a)中的d2)和反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止的時(shí)間區(qū)間(圖2(a)中的d3)的和(d2+d3)的倒數(shù)的頻率(1/(d2+d3))處的振幅值進(jìn)行比較的方法。具體來說，做成通過計(jì)算求相當(dāng)于上述的d2約10秒的倒數(shù)的頻率0.0938Hz處的振幅值與相當(dāng)于上述的d2+d3約15秒的倒數(shù)的頻率0.0625Hz處振幅值的差{(0.0938Hz的振幅值)-(0.0625Hz的振幅值)}值，該值為正時(shí)，判定沒有產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象，該值為負(fù)時(shí)判定為在上述反應(yīng)體系中產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的構(gòu)成。
另外，定量機(jī)構(gòu)采用使用振幅光譜分布的直流成分的振幅值進(jìn)行定量的方法。具體來說，做成將通過被測(cè)定物質(zhì)的測(cè)定得到的直流成分的振幅值代入將直流成分的振幅值和被測(cè)定物質(zhì)的濃度對(duì)應(yīng)給出的數(shù)式(校正曲線)中求出被測(cè)定物質(zhì)的濃度的構(gòu)成。
(實(shí)施例2)在本實(shí)施例中表示第1個(gè)實(shí)施例所述的判定是有效的。這里，使用預(yù)先已知濃度的被測(cè)定物質(zhì)進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，在對(duì)從哪一個(gè)濃度開始出現(xiàn)區(qū)帶現(xiàn)象進(jìn)行解析后，對(duì)產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的情形和不產(chǎn)生的情形的振幅光譜進(jìn)行比較。這里給出了以人白蛋白作為被測(cè)定物質(zhì)的免疫反應(yīng)測(cè)定方法的例子。而在以下所示緩沖液等的配制中，使用經(jīng)Milli-Q SP TOC(Millipore公司生產(chǎn))過濾的純水。而以下沒有特別說明的鹽、緩沖劑等試劑都使用和光純藥工業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品，聚乙二醇6000使用1級(jí)試劑，其他都使用特級(jí)試劑。
兔抗人白蛋白多克隆抗體(以下簡(jiǎn)單稱為抗體)溶液從經(jīng)免疫人白蛋白的兔採(cǎi)集的抗血清中使用蛋白A柱層析進(jìn)行純化后經(jīng)透析獲得。作為填充在柱中的蛋白A固定化凝膠使用Amersham Pharmacia生產(chǎn)的凝膠。純化使用的平衡緩沖液使用1.5M甘氨酸、3.0M NaCl、pH8.9，洗脫緩沖液使用檸檬酸水溶液(0.1M檸檬酸、pH4.0)。將洗脫下來的抗體級(jí)分裝入分級(jí)分子量1萬的透析袋中對(duì)組成為約100倍容量的0.05M 3-(嗎啉代)丙磺酸(Dojin生產(chǎn)，以下略稱為MOPS)、0.15M NaCl、0.04重量％NaN3、pH7.4的緩沖液透析數(shù)次，置換緩沖液成分。然后通過測(cè)定280nm的吸光度推定抗體濃度，使用與透析用緩沖液相同的緩沖液將抗體濃度調(diào)到3.0mg/ml。
用作抗原的人白蛋白(和光純藥工業(yè)制造)溶液(即樣品溶液)用與透析抗體的緩沖液相同的緩沖液溶解配制成濃度分別為0、5、10、20、30、50、70、100、200、300mg/dl的白蛋白溶液。
測(cè)定中使用的緩沖液為0.05M MOPS、4重量％聚乙二醇6000、pH7.4的組成。
就各個(gè)緩沖液象下面所述那樣進(jìn)行各個(gè)濃度的人白蛋白溶液的測(cè)定。反應(yīng)體系的組成，緩沖液為160μl，人白蛋白溶液為9μl、抗體溶液為23μl。反應(yīng)體系中的抗體和人白蛋白的最終濃度，抗體約0.11mg/ml、人白蛋白為測(cè)定時(shí)使用的人白蛋白溶液的濃度乘0.046的結(jié)果。
首先向上述那樣構(gòu)成的免疫測(cè)定裝置的測(cè)定杯內(nèi)按照上述容量加入緩沖液和人白蛋白溶液，攪拌混合，構(gòu)建反應(yīng)體系。然后再按照上述容量向反應(yīng)體系中加入抗體溶液，攪拌混合，使抗原抗體反應(yīng)發(fā)生。散射光的測(cè)定從加抗體溶液的10秒鐘之前開始，間隔0.5秒鐘連續(xù)200秒。測(cè)定值可以電壓值得到。測(cè)定杯的污染對(duì)測(cè)定的影響可以在各個(gè)反應(yīng)測(cè)定前向測(cè)定杯中加入純水進(jìn)行測(cè)定，通過對(duì)測(cè)定值進(jìn)行校正除去。測(cè)定在室溫(約20℃)下進(jìn)行。
圖4給出了對(duì)從免疫反應(yīng)充分飽和150秒至200秒之間測(cè)定值的平均值進(jìn)行作圖的結(jié)果。由圖4可知，100mg/dl以上的人白蛋白溶液的測(cè)定受到區(qū)帶現(xiàn)象的影響。
圖5是表示在各個(gè)人白蛋白溶液的測(cè)定中得到的散射光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的圖。用于檢測(cè)區(qū)帶現(xiàn)象的離散傅立葉變換相對(duì)于該測(cè)定值進(jìn)行。
圖6～13是表示對(duì)通過5mg/dl至300mg/dl濃度的人白蛋白溶液的測(cè)定得到的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行離散傅立葉變換后，求振幅光譜分布的結(jié)果的圖。根據(jù)這些結(jié)果可以確認(rèn)在沒有產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的5～50mg/dl的人白蛋白溶液的情形中，任一個(gè){(0.0938Hz的振幅值)-(0.0625Hz的振幅值)}的值都為正。而產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的100～300mg/dl的人白蛋白溶液的情形中，任一個(gè){(0.0938Hz的振幅值)-(0.0625Hz的振幅值)}的值都為負(fù)。實(shí)際的計(jì)算值分別為5mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果為1.65，10mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果為3.37，20mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果為5.54，30mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果為5.80，50mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果為8.69，100mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果為-0.962，200mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果為-1.93，300mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果為-2.44。
圖14是表示對(duì)實(shí)質(zhì)上經(jīng)歷與圖5同樣的時(shí)間變化的5mg/dl的人白蛋白溶液情形的振幅光譜分布和300mg/dl的人白蛋白溶液情形的振幅光譜的分布進(jìn)行對(duì)比給出的結(jié)果。由該圖可知，在沒有產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的5mg/dl的人白蛋白溶液的情形和產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的300mg/dl的人白蛋白溶液的情形中，0.0938Hz的振幅值和0.0625Hz的振幅值顛倒。即，{(0.0938Hz的振幅值)-(0.0625Hz的振幅值)}的值的正負(fù)反映區(qū)帶現(xiàn)象是否發(fā)生。
接下來敘述對(duì)濃度定量的結(jié)果。對(duì)于校正曲線使用上述得到的5、10、20mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果做成的曲線。求出的測(cè)量線，如果直流成分的振幅值為y，人白蛋白溶液濃度為x，則y＝6.12x+29.1。為了證實(shí)該校正曲線是有效的，將測(cè)定的15mg/dl的人白蛋白溶液的直流成分的振幅值的結(jié)果代入上述校正曲線，求人白蛋白溶液濃度，確認(rèn)與實(shí)際的濃度是否一致。
振幅值合計(jì)測(cè)定3次。在3次測(cè)定中，直流成分的振幅值分別為123、124、122，由上述測(cè)量線求出的人白蛋白溶液濃度分別為15.3、15.5、15.2mg/dl，對(duì)實(shí)際的濃度可進(jìn)行有效的推定。由此可以確認(rèn)使用直流成分的振幅值的方法作為用于對(duì)被測(cè)定物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量的機(jī)構(gòu)非常有效。
由以上結(jié)果可以確認(rèn)本發(fā)明的免疫學(xué)測(cè)定方法和免疫學(xué)測(cè)定裝置在區(qū)帶現(xiàn)象的檢測(cè)中是有效的。而本發(fā)明由于可進(jìn)行通過單一波長(zhǎng)、單一測(cè)定進(jìn)行區(qū)帶現(xiàn)象的檢測(cè)，所以不需要多次測(cè)定，也不需要準(zhǔn)備多個(gè)反應(yīng)容器，也不需要多波長(zhǎng)測(cè)定，測(cè)定工序和裝置構(gòu)成容易。另外通過本發(fā)明能夠確認(rèn)被測(cè)定物質(zhì)的濃度可以測(cè)定。
(實(shí)施例3)在本實(shí)施例中表示本發(fā)明的免疫學(xué)的測(cè)定方法很難受到噪音的影響的情況。圖15是表示實(shí)施例2得到的5mg/dl和300mg/dl的人白蛋白溶液中散射光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的圖。在實(shí)施例2中，對(duì)圖15所示的時(shí)間區(qū)間的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行離散傅立葉變換，得到振幅光譜分布。而圖16是表示相對(duì)于圖15所示的時(shí)間區(qū)間的測(cè)定數(shù)據(jù)，付加變動(dòng)幅度以散射光強(qiáng)度值換算相當(dāng)于0.2的散亂噪音后的結(jié)果。在本實(shí)施例中，利用圖15和圖16所示的數(shù)據(jù)，對(duì)利用以往的微分(差分)法和本發(fā)明的免疫學(xué)的測(cè)定方法進(jìn)行對(duì)比。
圖17表示相對(duì)于圖15所示的沒有付加散亂噪音時(shí)的測(cè)定數(shù)據(jù)，錯(cuò)開0.5秒數(shù)據(jù)后獲得的差分的結(jié)果。根據(jù)該結(jié)果，在沒有產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的5mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果和產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的300mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果中，峰的位置、即反應(yīng)速度的峰的位置發(fā)生變化。因此可知根據(jù)圖17可以判定是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
圖18表示相對(duì)于圖16所示的付加散亂噪音時(shí)的測(cè)定數(shù)據(jù)，錯(cuò)開0.5秒數(shù)據(jù)后獲得的差分的結(jié)果。根據(jù)該結(jié)果，由于散亂噪音的影響，決定峰的位置、即反應(yīng)速度的峰的位置不容易。另外沒有產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的5mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果和產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的300mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果的差不明確。因此可知根據(jù)圖18判定是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象不容易。就象以上說明的那樣，以微分(差分)為基礎(chǔ)的方法容易受到噪音的影響。
以下，就本發(fā)明的區(qū)帶現(xiàn)象的檢測(cè)方法，圖14給出了對(duì)于圖15所示的沒有付加散亂噪音情形的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行離散傅立葉變換，求出振幅光譜分布的結(jié)果，圖19給出了對(duì)于圖16所示的付加了散亂噪音情形的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行離散傅立葉變換，求出振幅光譜分布的結(jié)果。就象兩個(gè)圖表明的那樣，{(0.0938Hz的振幅值)-(0.0625Hz的振幅值)}的值不受噪音的影響，無論哪一種情形，5mg/dl的人白蛋白溶液的情形為正，300mg/dl的人白蛋白溶液的情形為負(fù)，都可以判定是否是區(qū)帶現(xiàn)象。
由以上結(jié)果可以確認(rèn)利用本發(fā)明的免疫學(xué)的測(cè)定方法，不受噪音的影響可以穩(wěn)定獲得區(qū)帶現(xiàn)象是否發(fā)生的判定結(jié)果。
(實(shí)施例4)以下就使用上述實(shí)施方式中說明的第1個(gè)、第2個(gè)的免疫學(xué)的測(cè)定方法中的前者的方法(選擇時(shí)間區(qū)間d2+d3的方法)時(shí)的免疫學(xué)的測(cè)定方法進(jìn)行說明。
測(cè)定機(jī)構(gòu)11的構(gòu)成與實(shí)施例1同樣。測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)12的構(gòu)成如下。在本實(shí)施例中，將選擇的時(shí)間區(qū)間的設(shè)定作為從混合被測(cè)定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)反應(yīng)開始時(shí)直至反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和經(jīng)過一定時(shí)間后的范圍。對(duì)于與上述實(shí)施例2所示的同樣的抗原抗體反應(yīng)，獲得從反應(yīng)開始直至反應(yīng)開始后約32秒為止的時(shí)間區(qū)間的64點(diǎn)采樣數(shù)據(jù)。將這些數(shù)據(jù)當(dāng)作周期32秒、頻率0.03125Hz的周期信號(hào)，在Microsoft Excel上進(jìn)行離散的傅立葉變換處理，作為求振幅光譜分布的構(gòu)成。
對(duì)于判定/定量機(jī)構(gòu)13的判定機(jī)構(gòu)，采用以上上述求出的振幅光譜分布為基礎(chǔ)至少對(duì)于相當(dāng)于被測(cè)定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)混合，反應(yīng)開始時(shí)刻直至反應(yīng)實(shí)質(zhì)上達(dá)到飽和后經(jīng)過一定期間后的時(shí)間區(qū)間(圖2(a)中的d2+d3)的倒數(shù)的頻率處的振幅值，求相對(duì)于直流成分的振幅值的比率，以其大小為基礎(chǔ)進(jìn)行判定的方法。
具體來說，通過計(jì)算求出相當(dāng)于上述d2+d3時(shí)間區(qū)域的約15秒的倒數(shù)的頻率0.0625Hz處振幅值的相對(duì)于直流成分的比率。通過這樣計(jì)算，在被測(cè)定物質(zhì)不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的濃度情形以及被測(cè)定物質(zhì)產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的濃度情形中，顯示求出的值不同的分布，差異變得明確。例如，對(duì)于實(shí)施例2所示的抗原抗體反應(yīng)的條件，相對(duì)于0.0625Hz處振幅值的直流成分的振幅值的比率在5mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果場(chǎng)合為0.135，10mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果場(chǎng)合為0.124，20mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果場(chǎng)合為0.125，30mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果場(chǎng)合為0.123，50mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果場(chǎng)合為0.133，100mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果場(chǎng)合為0.113，200mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果場(chǎng)合為0.110，300mg/dl的人白蛋白溶液的結(jié)果場(chǎng)合為0.095，對(duì)于被測(cè)定物質(zhì)的濃度不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的濃度情形，以超過0.120的值分布，對(duì)于被測(cè)定物質(zhì)的濃度產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的濃度的情形，相對(duì)于0.0625Hz的振幅值的直流成分的振幅值的比率以低于0.120的值分布。
因此，對(duì)于實(shí)施例2所示的抗原抗體反應(yīng)的條件，以基準(zhǔn)值為0.120，求出相對(duì)于通過濃度不清楚的樣品溶液算出的振幅值的直流成分的振幅值的比率和基準(zhǔn)值的差{(相對(duì)于0.0625Hz的振幅值的直流成分的振幅值的比率)-(基準(zhǔn)值)}，通過該值為正時(shí)判斷不是區(qū)帶區(qū)，該值為負(fù)時(shí)是區(qū)帶區(qū)的構(gòu)成可以判定被測(cè)定物質(zhì)的濃度是否是產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的濃度。
由以上結(jié)果可以確認(rèn)本發(fā)明的第4個(gè)實(shí)施例所述的免疫學(xué)測(cè)定方法和免疫學(xué)測(cè)定裝置在區(qū)帶現(xiàn)象的檢測(cè)中是有效的。而本發(fā)明由于可通過單一波長(zhǎng)、單一測(cè)定進(jìn)行區(qū)帶現(xiàn)象的檢測(cè)，所以不需要多次測(cè)定，也不需要準(zhǔn)備多個(gè)反應(yīng)容器，也不需要多波長(zhǎng)測(cè)定，測(cè)定工序和裝置構(gòu)成容易。
權(quán)利要求
1.一種免疫反應(yīng)測(cè)定方法，測(cè)定樣品溶液中含有的被測(cè)定物質(zhì)濃度包括對(duì)上述樣品溶液和與上述被測(cè)定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)進(jìn)行混合，以所定的采樣周期，將在上述被測(cè)定物質(zhì)與上述特異結(jié)合物質(zhì)的反應(yīng)中的光學(xué)變化量隨時(shí)間的變化以離散的測(cè)定數(shù)據(jù)獲得的步驟(a)，對(duì)在上述測(cè)定數(shù)據(jù)中包括光學(xué)變化量的增加率變?yōu)樽畲蟮臅r(shí)刻在內(nèi)的時(shí)間區(qū)間進(jìn)行選擇的步驟(b)，將上述時(shí)間區(qū)間作為周期函數(shù)的一個(gè)周期，通過對(duì)處于上述時(shí)間區(qū)間內(nèi)的上述測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行離散傅立葉變換處理，獲得振幅光譜分布的步驟(c)，根據(jù)上述振幅光譜分布的形狀，判定在上述步驟(a)的上述反應(yīng)中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象的步驟(d)，上述被測(cè)定物質(zhì)和上述特異結(jié)合物質(zhì)的組合是抗原和抗體的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫測(cè)定方法，其中上述光學(xué)的變化量可以是散射光強(qiáng)度的變化量或透射光量的變化量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫測(cè)定方法，其中上述時(shí)間區(qū)間，根據(jù)不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的反應(yīng)中測(cè)定的光學(xué)的變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)預(yù)先確定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫測(cè)定方法，其中上述時(shí)間區(qū)間是從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止的區(qū)間。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫測(cè)定方法，其中在上述步驟(d)中，根據(jù)上述振幅光譜分布的形狀和在不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的反應(yīng)中測(cè)定的振幅光譜分布的形狀，判定在上述步驟(a)的反應(yīng)中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫測(cè)定方法，其中在上述步驟(d)中，以相當(dāng)于上述時(shí)間區(qū)間的倒數(shù)的頻率處的振幅值的相對(duì)于上述振幅光譜的直流成分的比率為基礎(chǔ)，判定在上述步驟(a)的反應(yīng)中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫測(cè)定方法，其中在上述步驟(d)中，上述比率超過由不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的反應(yīng)和產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的反應(yīng)兩者的分布結(jié)果求出的基準(zhǔn)值時(shí)，判定上述步驟(a)的上述反應(yīng)中不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象，當(dāng)?shù)陀谏鲜龌鶞?zhǔn)值時(shí)判定上述步驟(a)的上述反應(yīng)中產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫測(cè)定方法，其中在上述步驟(a)之前還備有，構(gòu)建含有上述樣品溶液和上述特異結(jié)合物質(zhì)中任一方的反應(yīng)體系，再以上述所定的采樣周期，將上述反應(yīng)體系中光學(xué)變化量隨時(shí)間的變化以離散的測(cè)定數(shù)據(jù)獲得的步驟(e)，在上述步驟(a)中，通過向上述反應(yīng)體系添加上述樣品溶液和上述特異結(jié)合物質(zhì)中的不含在上述反應(yīng)體系中的一方，對(duì)上述樣品溶液和上述特異結(jié)合物質(zhì)進(jìn)行混合，上述時(shí)間區(qū)間是從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)體系中的反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止的區(qū)間。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的免疫測(cè)定方法，其中在上述步驟(d)中，當(dāng)相當(dāng)于從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)體系的反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和時(shí)刻的時(shí)間區(qū)間的倒數(shù)的頻率處的振幅值，與相當(dāng)于對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)體系的反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止的時(shí)間區(qū)間的倒數(shù)的頻率處的振幅值的差，為正的數(shù)時(shí)，判定在上述步驟(a)的上述反應(yīng)體系中不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象，當(dāng)上述差值為負(fù)的數(shù)時(shí)，判定在上述步驟(a)的上述反應(yīng)體系中產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫測(cè)定方法，其中以上述步驟(c)中的上述振幅光譜分布的直流成分的振幅值為基礎(chǔ)，對(duì)上述測(cè)定物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量。
11.一種免疫學(xué)反應(yīng)測(cè)定裝置，備有對(duì)含有被測(cè)定物質(zhì)的樣品溶液和與上述被測(cè)定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)進(jìn)行混合時(shí)反應(yīng)的光學(xué)變化量進(jìn)行測(cè)定的測(cè)定機(jī)構(gòu)，與上述測(cè)定機(jī)構(gòu)相連，對(duì)通過上述測(cè)定機(jī)構(gòu)得到的測(cè)定數(shù)據(jù)中包括光學(xué)變化量的增加率變?yōu)樽畲蟮臅r(shí)刻在內(nèi)的時(shí)間區(qū)間進(jìn)行選擇，將上述時(shí)間區(qū)間作為周期函數(shù)的一個(gè)周期，通過對(duì)處于上述時(shí)間區(qū)間內(nèi)的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行離散傅立葉變換處理，并由此獲得振幅光譜分布的測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)，以及與上述測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)連接，根據(jù)上述振幅光譜分布的形狀，對(duì)在上述反應(yīng)中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象進(jìn)行判定的判定機(jī)構(gòu)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的免疫學(xué)反應(yīng)測(cè)定裝置，其中上述時(shí)間區(qū)間是從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止的區(qū)間。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的免疫學(xué)反應(yīng)測(cè)定裝置，其中上述判定機(jī)構(gòu)將在上述反應(yīng)中不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的振幅光譜分布形狀作為基準(zhǔn)形狀預(yù)先存儲(chǔ)，通過比較上述基準(zhǔn)形狀與利用上述測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)得到的上述振幅光譜分布的形狀進(jìn)行判定。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的免疫學(xué)反應(yīng)測(cè)定裝置，其中上述判定機(jī)構(gòu)以相當(dāng)于上述時(shí)間區(qū)間的倒數(shù)的頻率處的振幅值的相對(duì)于上述振幅光譜分布的直流成分的比率作為基礎(chǔ)進(jìn)行判定。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫學(xué)反應(yīng)測(cè)定裝置，其中當(dāng)上述比率超過由不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的反應(yīng)和產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象時(shí)的反應(yīng)兩者的分布結(jié)果求出的基準(zhǔn)值時(shí)，上述判定機(jī)構(gòu)判定上述測(cè)定機(jī)構(gòu)的上述反應(yīng)中不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象，當(dāng)?shù)陀谏鲜龌鶞?zhǔn)值時(shí)判定為上述測(cè)定機(jī)構(gòu)的上述反應(yīng)中產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的免疫學(xué)反應(yīng)測(cè)定裝置，其中上述時(shí)間區(qū)間是從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合前開始直至上述反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止的區(qū)間，
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的免疫學(xué)反應(yīng)測(cè)定裝置，其中當(dāng)相當(dāng)于從對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和時(shí)刻的時(shí)間區(qū)間的倒數(shù)的頻率處的振幅值，與相當(dāng)于對(duì)上述特異結(jié)合物質(zhì)和上述樣品溶液進(jìn)行混合時(shí)刻開始直至上述反應(yīng)實(shí)質(zhì)上飽和后光學(xué)的變化量實(shí)質(zhì)上達(dá)到一定的時(shí)刻為止的時(shí)間區(qū)間的倒數(shù)的頻率處的振幅值的差，為正的數(shù)時(shí)，上述判定機(jī)構(gòu)判定在上述反應(yīng)中不產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象，當(dāng)上述差值為負(fù)的數(shù)時(shí)，判定在上述反應(yīng)中產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的免疫學(xué)反應(yīng)測(cè)定裝置，其中還備有與上述測(cè)定數(shù)據(jù)處理機(jī)構(gòu)連接，根據(jù)上述振幅光譜分布的形狀，對(duì)上述被測(cè)定物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量的定量機(jī)構(gòu)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的免疫學(xué)反應(yīng)測(cè)定裝置，其中上述定量機(jī)構(gòu)以上述振幅光譜分布的直流成分的振幅值作為基礎(chǔ)，對(duì)上述被測(cè)定物質(zhì)的濃度進(jìn)行定量。
全文摘要
本發(fā)明提供一種簡(jiǎn)便并且測(cè)定精度高的免疫學(xué)測(cè)定方法以及該方法中使用的免疫學(xué)測(cè)定裝置。在步驟St1構(gòu)建含有被測(cè)定物質(zhì)或特異結(jié)合物質(zhì)的反應(yīng)體系，開始光學(xué)的變化量的測(cè)定，在步驟St2將特異結(jié)合物質(zhì)和被測(cè)定物質(zhì)進(jìn)行混合，作為離散的測(cè)定數(shù)據(jù)獲得光學(xué)變化量隨時(shí)間的變化。在步驟St3，選擇在上述測(cè)定數(shù)據(jù)中包括光學(xué)變化量的增加率變?yōu)樽畲蟮臅r(shí)刻在內(nèi)的時(shí)間區(qū)間。在步驟St4，將選擇的時(shí)間區(qū)間作為周期函數(shù)的一個(gè)周期，通過對(duì)光學(xué)變化量的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行離散傅立葉變換處理，獲得振幅光譜分布。在步驟St5，根據(jù)上述振幅光譜分布的形狀，判定在上述反應(yīng)中是否產(chǎn)生區(qū)帶現(xiàn)象。
文檔編號(hào)G01N21/59GK1576843SQ20041006376
公開日2005年2月9日 申請(qǐng)日期2004年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月7日
發(fā)明者龜井明仁, 河村達(dá)朗 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社