制備具有改良的脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度特性的脂肪酸及其衍生物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及包含多核苷酸序列、氨基酸序列、重組微生物和重組微生物培養(yǎng)物的組合物，所述重組微生物和重組微生物培養(yǎng)物產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度和/或優(yōu)選的百分比飽和度的脂肪酸和衍生物的組合物。另外，本發(fā)明涉及制備和使用所述組合物的方法。所述組合物和方法可提供高滴度、高產(chǎn)率和高生產(chǎn)力的脂肪酸及其衍生物。
【專(zhuān)利說(shuō)明】制備具有改良的脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度特性的脂肪酸及其衍生物【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及制備具有選定的脂肪鏈長(zhǎng)度和/或飽和度特性的脂肪酸及其衍生物以及它們的組合物的方法。另外，本發(fā)明涉及重組宿主細(xì)胞(例如，微生物)、重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物以及制備和使用重組宿主細(xì)胞的方法，例如，利用所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物發(fā)酵產(chǎn)生具有選定的脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度特性的脂肪酸及其衍生物。
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[0005]發(fā)明背景
[0006]大多數(shù)生物體的脂肪酸生物合成涉及一系列酶對(duì)乙酰-CoA和丙二酰-CoA前體的作用。脂肪酸生物合成中的兩種重要的輔因子為輔酶A(CoA)和?；d體蛋白(ACP)。這兩種輔因子涉及從一種酶將增長(zhǎng)的?；溸\(yùn)輸至另一種酶，以及供應(yīng)前體用于縮合反應(yīng)。
[0007]大腸桿菌(Escher ichia coli或E.coli)的脂肪酸生物合成循環(huán)為討論該循環(huán)提供了便利的參考框架。Heath, R.J., et al., (J Biol.Chem.271 (44):27795-801 (1996))提供了大腸桿菌脂肪酸生物合成的綜述?？s合酶所利用的丙二酰-ACP通過(guò)丙二酰-Cok轉(zhuǎn)?；帘?ACP產(chǎn)生，其由丙二酰-CoA = ACP轉(zhuǎn)?；?fabD)催化。在脂肪酸延伸的每個(gè)循環(huán)中，主要存在4個(gè)反應(yīng)。該循環(huán)由利用乙酰-CoA縮合丙二酰-ACP的β-酮脂酰-ACP合酶III(fabH)起始。
[0008]以下參考圖1給出延伸循環(huán)的描述。延伸循環(huán)以由酮脂酰-ACP合酶I (fabB)和β -酮脂酰-ACP合酶II (fabF)催化的丙二酰-ACP和酰基-ACP的縮合起始，以產(chǎn)生β -酮-酰基-ACP。
[0009]第二，所述β -酮-?；?ACP被NADPH依賴性β -酮脂酰-ACP還原酶(fabG)還原，以產(chǎn)生β -羥基-?；?ACP。
[0010]第三，β -羥基-?；?ACP被fabA或fabZ β -羥酰基-ACP脫水酶脫水為反式-2-烯酰-?；?ACP。FabA還可以將反式_2_烯酰-?；?ACP異構(gòu)化為順式_3_烯酰-?；?ACP，其可以繞開(kāi)fabl并可以被fabB (通常為多達(dá)C16的脂肪鏈長(zhǎng)度)利用，以產(chǎn)生酮-酰基-ACP。
[0011 ] 每個(gè)循環(huán)的第四個(gè)步驟通過(guò)將反式-2-烯酰-?；?ACP轉(zhuǎn)變?yōu)轷；?ACP的NADH或NADHPH依賴性烯酰-ACP還原酶(fabl)催化。
[0012]在本文描述的方法中，脂肪酸合成的終止通過(guò)硫酯酶從?；?ACP去除酰基以釋放游離脂肪酸(FFA)發(fā)生。硫酯酶(例如，tesA)水解硫酯鍵，其通過(guò)巰基鍵在?；満虯CP之間發(fā)生。[0013]發(fā)明概述
[0014]本發(fā)明總體涉及重組宿主細(xì)胞、重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物、制備重組宿主細(xì)胞的方法以及利用重組宿主細(xì)胞的方法，所述重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生多種脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物，從所述重組宿主細(xì)胞中可得到產(chǎn)生特定脂肪酸衍生物的重組宿主細(xì)胞。本發(fā)明給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供挑選產(chǎn)生具有所需目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度和所需飽和度水平的脂肪酸衍生物的重組宿主細(xì)胞的能力。相比先于本發(fā)明報(bào)道的滴度、產(chǎn)率和生產(chǎn)力，本發(fā)明的方法、重組微生物和培養(yǎng)物能用于以更大的滴度、產(chǎn)率和生產(chǎn)力產(chǎn)生脂肪酸衍生物的方法中。
[0015]在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，其經(jīng)改造用于產(chǎn)生高滴度的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物，所述高滴度通常為約30g/L至約250g/L。
[0016]在本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞的實(shí)施方案中，所述多核苷酸序列包含編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC2.3.1.-的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的開(kāi)放閱讀框。所述編碼序列可操作地連接至促進(jìn)重組宿主細(xì)胞中蛋白表達(dá)的調(diào)控序列。相對(duì)于從相應(yīng)的宿主細(xì)胞中野生型基因表達(dá)的酮脂酰-ACP合酶蛋白的活性，重組宿主細(xì)胞的β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的活性被改良。另外，培養(yǎng)物中的重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列，其含有編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC3.1.1.5或EC3.1.2.-的硫酯酶的開(kāi)放閱讀框。所述編碼序列可操作地連接至促進(jìn)重組宿主細(xì)胞中蛋白表達(dá)的調(diào)控序列。相對(duì)于從相應(yīng)的宿主細(xì)胞中相應(yīng)野生型基因表達(dá)的硫酯酶活性，重組宿主細(xì)胞的硫酯酶活性被改良。
[0017]相比對(duì)照培養(yǎng)物，本發(fā)明的重組培養(yǎng)物通常產(chǎn)生更高滴度、更高產(chǎn)率和/或更高生產(chǎn)力的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度和優(yōu)選的百分比飽和度的脂肪酸衍生物。
[0018]本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞和宿主細(xì)胞培養(yǎng)物還可以包含一個(gè)或多個(gè)編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC6.2.1.3或ECl.2.1.42的羧酸還原酶蛋白的核苷酸序列，以及可操作地連接的調(diào)控序列。
[0019]本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及提供所需飽和度的脂肪鏈的脂肪酸衍生物(例如，月旨肪醇)。在該方面，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞還包含一個(gè)或多個(gè)包含編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-或4.2.1.60的β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的開(kāi)放閱讀框的多核苷酸序列，以及可操作地連接的調(diào)控序列。相對(duì)于從相應(yīng)的宿主細(xì)胞的野生型基因表達(dá)的羥?；?ACP脫水酶蛋白的活性，重組宿主細(xì)胞的β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的活性被改良。
[0020]本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物。所述重組宿主細(xì)胞通常具有酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-或
4.2.1.60的β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的改良的活性。相對(duì)于從相應(yīng)的宿主細(xì)胞的野生型基因表達(dá)的羥?；?ACP脫水酶蛋白的活性，所述重組宿主細(xì)胞的β-羥酰基-ACP脫水酶蛋白的活性被改良。
[0021]本發(fā)明的第四個(gè)方面涉及產(chǎn)生具有優(yōu)選的百分比飽和度的脂肪酸衍生物組合物的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物。所述重組宿主細(xì)胞包含缺少異構(gòu)酶活性且酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-的β-羥?；?ACP脫水酶蛋白的改良的活性。相對(duì)于從相應(yīng)宿主細(xì)胞的野生型基因表達(dá)的缺少異構(gòu)酶活性的β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的活性，所述重組宿主細(xì)胞中缺少異構(gòu)酶活性的β -羥酰基-ACP脫水酶蛋白的活性被改良。
[0022]在本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中，所述重組宿主細(xì)胞可以為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、真菌細(xì)胞、藻細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。[0023]本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的實(shí)施方案還可以包含一個(gè)或多個(gè)編碼一個(gè)或多個(gè)其他蛋白的核苷酸序列，以及可操作地連接的調(diào)控序列。此類(lèi)其他蛋白的實(shí)例包括但不限于，酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC6.2.1.3或ECl.2.1.42的羧酸還原酶蛋白，及酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為ECl.1.-、ECl.1.1.1或ECl.2.1.10的醇脫氫酶蛋白。此類(lèi)其他的蛋白可以表達(dá)于重組宿主細(xì)胞中，從而促進(jìn)以?；?ACPs作為底物產(chǎn)生特定的脂肪酸衍生物。
[0024]本發(fā)明的第五個(gè)方面涉及制備本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞和重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。通過(guò)本發(fā)明的方法可以制備產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物(例如，脂肪醇)的重組宿主細(xì)胞。該方法通常包含選自步驟(A)、步驟(B)和步驟(C)的兩個(gè)核心步驟。通常，所述兩個(gè)步驟為不相同的步驟，并且所述兩個(gè)步驟可按任何順序進(jìn)行，以產(chǎn)生所述重組宿主細(xì)胞；例如，步驟(A)之后為步驟(B)、步驟(A)之后為步驟(C)、步驟(B)之后為步驟(A)、步驟(B)之后為步驟(C)、步驟(C)之后為步驟(B)或步驟(C)之后為步驟㈧。
[0025]簡(jiǎn)單地說(shuō)，方法步驟㈧涉及挑選產(chǎn)生具有長(zhǎng)于目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物的重組宿主細(xì)胞。方法步驟(B)涉及挑選產(chǎn)生高滴度的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物的重組宿主細(xì)胞。方法步驟(C)涉及挑選產(chǎn)生高滴度的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度和優(yōu)選的百分比飽和度的脂肪酸衍生物的重組宿主細(xì)胞。
[0026]在本發(fā)明方法優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組宿主細(xì)胞還包含一個(gè)或多個(gè)編碼羧酸還原酶蛋白的核苷酸序列，以及可操作地連接的調(diào)控序列。所述羧酸還原酶蛋白通常是酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC6.2.1.3或ECl.2.1.42的蛋白。
[0027]在本發(fā)明方法的其他實(shí)施方案中，所述重組宿主細(xì)胞還包含一個(gè)或多個(gè)編碼一個(gè)或多個(gè)其他蛋白的核苷酸序列，以及可操作地連接的調(diào)控序列。此類(lèi)其他蛋白的實(shí)例包括但不限于:醇脫氫酶 ；醛-醇脫氫酶；乙酰-CoA乙酰轉(zhuǎn)移酶；β -羥基丁酰-CoA脫氫酶；巴豆酸酶丁酰-CoA脫氫酶；及輔酶A-酰化醛脫氫酶。此類(lèi)其他蛋白可以表達(dá)于重組宿主細(xì)胞中，從而促進(jìn)以?；?ACPs作為底物產(chǎn)生特定的脂肪酸衍生物。
[0028]在第六個(gè)方面，本發(fā)明更具體涉及制備重組宿主細(xì)胞和重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，所述重組宿主細(xì)胞和重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物。這些重組宿主細(xì)胞通常具有酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-或4.2.1.60的β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的改良的活性。本發(fā)明的用于產(chǎn)生這些重組宿主細(xì)胞的方法通常至少利用步驟(C)，或步驟(A)的變型。
[0029]本發(fā)明的第七個(gè)方面更具體涉及制備重組宿主細(xì)胞和重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，所述重組宿主細(xì)胞和重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生具有優(yōu)選的百分比飽和度的脂肪酸衍生物組合物。這些重組宿主細(xì)胞通常具有缺少異構(gòu)酶活性且酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-的β_羥?；?ACP脫水酶蛋白的改良的活性。本發(fā)明的用于產(chǎn)生這些重組宿主細(xì)胞的方法通常至少利用步驟(C)，或步驟(A)的變型。
[0030]本發(fā)明的第八個(gè)方面更具體涉及制備具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度和/或優(yōu)選的飽和度的脂肪酸衍生物組合物的方法，例如，通過(guò)在碳源存在下培養(yǎng)本文所述的重組宿主細(xì)胞。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)包括發(fā)酵。
[0031]本發(fā)明的第九個(gè)方面涉及利用本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的、具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度和/或優(yōu)選的飽和度的基本上純化的脂肪酸衍生物組合物。[0032]根據(jù)本文的公開(kāi)，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易想到本發(fā)明的這些和其他方面以及實(shí)施方案。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1所示為根據(jù)來(lái)自大腸桿菌的基因產(chǎn)物的脂肪酸生物合成途徑的實(shí)例的概略圖。
[0034]圖2所示為?；?ACPs作為將其轉(zhuǎn)化為脂肪酸衍生物的酶的底物的示意圖。
[0035]圖3所示為用于例示本發(fā)明實(shí)施方案的多種表達(dá)構(gòu)建物的示意圖(圖A-D)。
[0036]圖4所示為克隆的篩選數(shù)據(jù)，其中相對(duì)于對(duì)照微生物的硫酯酶活性，所述重組微生物的硫酯酶活性被改良。在圖中，Y軸為“％脂肪類(lèi)(“FA”=游離脂肪酸+脂肪醛+脂肪醇)相對(duì)于對(duì)照株”，并且X軸為C12/C14比率。圖中每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都對(duì)應(yīng)于培養(yǎng)的克隆或培養(yǎng)的對(duì)照株。
[0037]圖5所示為克隆的篩選數(shù)據(jù)，其中相對(duì)于對(duì)照微生物的硫酯酶活性，所述重組微生物的硫酯酶活性被改良。在圖中，Y軸為“%FA相對(duì)于對(duì)照株”，并且X軸為C16/C18比率。圖中每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都對(duì)應(yīng)于培養(yǎng)的克隆或培養(yǎng)物的對(duì)照株。
[0038]圖6所示為克隆的篩選數(shù)據(jù)，其中相對(duì)于對(duì)照微生物的延伸β -酮脂酰-ACP合酶蛋白，所述重組微生物的延伸β_酮脂酰-ACP合酶蛋白活性被改良。在圖中，Y軸為“%FA相對(duì)于對(duì)照株”，并且X軸為C12/C14比率。圖中每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都對(duì)應(yīng)于培養(yǎng)的克隆或培養(yǎng)物的對(duì)照株。
[0039]圖7所示為克隆的篩選數(shù)據(jù)，其中相對(duì)于對(duì)照微生物的延伸β -酮脂酰-ACP合酶蛋白，所述重組微生物的延伸β_酮脂酰-ACP合酶蛋白活性被改良。在圖中，Y軸為“%FA相對(duì)于對(duì)照株”，并且X軸為C16/C18比率。圖中每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都對(duì)應(yīng)于培養(yǎng)的克隆或培養(yǎng)物的對(duì)照株。
[0040]圖8所示為克隆的篩選數(shù)據(jù)，其中相對(duì)于對(duì)照微生物的硫酯酶活性，所述重組微生物的硫酯酶活性被改良。在圖中，Y軸為“%FA相對(duì)于對(duì)照株”，并且X軸為C12/C14比率。圖中每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都對(duì)應(yīng)于培養(yǎng)的克隆或培養(yǎng)物的對(duì)照株。
[0041]圖9所示為克隆的篩選數(shù)據(jù)，其中相對(duì)于對(duì)照微生物的硫酯酶活性，所述重組微生物的硫酯酶活性被改良。在圖中，Y軸為“%FA相對(duì)于對(duì)照株”，并且X軸為C16/C18比率。圖中每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)都對(duì)應(yīng)于培養(yǎng)的克隆或培養(yǎng)物的對(duì)照株。
[0042]圖10所示為克隆的篩選數(shù)據(jù)，其中重組微生物的延伸酮脂酰-ACP合酶蛋白活性被改良，以評(píng)估對(duì)脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度的影響。在圖中，左側(cè)的Y軸為“％飽和物質(zhì)”；右側(cè)的Y軸為具有C12和C14脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物(組合的游離脂肪酸和脂肪醇)的滴度的c12/c14比率。來(lái)自篩選的重組微生物組的克隆基于它們的％飽和物質(zhì)沿X軸布置，并且顯示了它們c12/c14比率的對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
[0043]圖11所示為克隆的篩選數(shù)據(jù)，其中重組微生物的β-羥?；?ACP脫水酶蛋白(這里為β_羥基癸?；蝓ッ撍?異構(gòu)酶蛋白大腸桿菌fabA蛋白)活性被改良，以評(píng)估對(duì)脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度的影響。在圖中，左側(cè)的Y軸為“％飽和物質(zhì)”;右側(cè)的Y軸為具有C8和Cltl脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物(組合的游離脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C8/10比率。來(lái)自篩選的重組微生物組的克隆基于它們的％飽和物質(zhì)沿X軸布置，并且顯示了它們C8/C10比率的對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
[0044]圖12所示為克隆的篩選數(shù)據(jù)，其中重組微生物中的羥酰基-ACP脫水酶蛋白(這里為β -羥基癸?；蝓ッ撍?異構(gòu)酶蛋白大腸桿菌fabA蛋白)活性被改良，以評(píng)估對(duì)脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度的影響。在圖中，左側(cè)的Y軸為“％飽和物質(zhì)”;右側(cè)的Y軸為具有C12和C14脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物(組合的游離脂肪酸和脂肪醇)的滴度的c12/c14比率。來(lái)自篩選的重組微生物組的克隆基于它們的％飽和物質(zhì)沿X軸布置，并且顯示了它們c12/c14比率的對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
[0045]圖13所示為克隆的篩選數(shù)據(jù)，其中重組微生物的β-羥酰基-ACP脫水酶蛋白(這里為β_羥基癸?；蝓ッ撍?異構(gòu)酶蛋白大腸桿菌fabA蛋白)活性被改良，以評(píng)估對(duì)脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度的影響。在圖中，左側(cè)的Y軸為“％飽和物質(zhì)”;右側(cè)的Y軸為具有C16和C18脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物(組合的游離脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C16/C18比率。來(lái)自篩選的重組微生物組的克隆基于它們的％飽和物質(zhì)沿X軸布置，并且顯示了它們C16/C18比率的對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
[0046]圖14所示為克隆的篩選數(shù)據(jù)，其中重組微生物的β-羥?；?ACP脫水酶蛋白(這里為(3R)-羥基肉豆蘧酰酰基載體蛋白脫水酶蛋白，大腸桿菌fabZ蛋白)活性被改良，以評(píng)估對(duì)脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度的影響。在圖中，左側(cè)的Y軸為“％飽和物質(zhì)”;右側(cè)的Y軸為具有C8和Cltl脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物(組合的游離脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C8ZCki比率。來(lái)自篩選的重組微生物組的克隆基于它們的％飽和物質(zhì)沿X軸布置，并且顯示了它們c8/c10比率的對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)點(diǎn)。
[0047]圖15所示為克隆的篩選數(shù)據(jù)，其中重組微生物的β-羥?；?ACP脫水酶蛋白(這里為(3R)-羥基肉豆蘧酰酰基載體蛋白脫水酶蛋白，大腸桿菌fabZ蛋白)活性被改良，以評(píng)估對(duì)脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度的影響。在圖中，左側(cè)的Y軸為“％飽和物質(zhì)”;右側(cè)的Y軸為具有C12和C14脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物(組合的游離脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C12/C14比率。來(lái)自篩選的重組微生物組的克隆基于它們的％飽和物質(zhì)沿X軸布置，并且顯示了它們c12/c14比率對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)點(diǎn)。
[0048]圖16所示為克隆的篩選數(shù)據(jù)，其中重組微生物的β-羥酰基-ACP脫水酶蛋白(這里為(3R)-羥基肉豆蘧酰?；d體蛋白脫水酶蛋白，大腸桿菌fabZ蛋白)活性被改良，以評(píng)估對(duì)脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度的影響。在圖中，左側(cè)的Y軸為“％飽和物質(zhì)”;右側(cè)的Y軸為具有C16和C18脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物(組合的游離脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C16/C18比率。來(lái)自篩選的重組微生物組的克隆基于它們的％飽和物質(zhì)沿X軸布置，并且顯示了它們c16/c18比率對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)點(diǎn)。
[0049]圖17所示為菌株的篩選數(shù)據(jù)，其中重組微生物的β -羥?；?ACP脫水酶蛋白(這里為β_羥基癸酰基硫酯脫水酶/異構(gòu)酶蛋白大腸桿菌fabA蛋白)活性被改良，以評(píng)估對(duì)脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度的影響。在圖中，左側(cè)的Y軸為“％飽和物質(zhì)”;右側(cè)的Y軸為具有C12和C14脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物(組合的游離脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C12/C14比率。圖的X軸底部所示為兩株菌株:〃ALC487〃和〃D178PT5_fabA/pALC487〃。在圖中，對(duì)于這兩株菌株中的每一株，C12ZC14比率用菱形表示，并且％飽和物質(zhì)用柱狀圖表示。
[0050]圖18所示為菌株的篩選數(shù)據(jù)，其中重組微生物的β -羥酰基-ACP脫水酶蛋白(這里為β_羥基癸?；蝓ッ撍?異構(gòu)酶蛋白大腸桿菌fabA蛋白)活性被改良，以評(píng)估對(duì)脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度的影響。在圖中，左側(cè)的Y軸為“％飽和物質(zhì)”;右側(cè)的Y軸為具有C8和Cltl脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物(組合的游離脂肪酸和脂肪醇)的滴度的0/(:1(|比率。圖的X軸底部所示為兩株菌株:〃ALC487〃和〃D178PT5_fabA/pALC487〃。在圖中，對(duì)于這兩株菌株中的每一株，C8Aki比率用菱形表示，并且％飽和物質(zhì)用柱狀圖表示。
[0051]圖19所示為菌株的篩選數(shù)據(jù)，其中重組微生物的β-羥?；?ACP脫水酶蛋白(這里為β_羥基癸?；蝓ッ撍?異構(gòu)酶蛋白大腸桿菌fabA蛋白)活性被改良，以評(píng)估對(duì)脂肪鏈長(zhǎng)度和飽和度的影響。在圖中，左側(cè)的Y軸為“％飽和物質(zhì)”;右側(cè)的Y軸為具有C16和C18脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物(組合的游離脂肪酸和脂肪醇)的滴度的C16/C18比率。圖的X軸底部所示為兩株菌株:〃ALC487〃和〃D178PT5_fabA/pALC487〃。在圖中，對(duì)于這兩株菌株中的每一株，C16/C18比率用菱形表示，并且％飽和物質(zhì)用柱狀圖表示。
[0052]圖20A-B所示為于55小時(shí)，來(lái)自通過(guò)將FabB加入至carB操縱子而改良的脂肪醇生產(chǎn)菌株的脂肪類(lèi)(“FAS”;脂肪醇和游離脂肪酸)產(chǎn)生的鏈長(zhǎng)度分布。所示數(shù)據(jù)為親本菌株(Alc-287 ;圖20A)和具有細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的fabB的額外拷貝的變體(Alc-383 ;圖20B)的數(shù)據(jù)。
[0053]圖2IA-D所示為于58小時(shí)，來(lái)自通過(guò)將FabA加入至carB操縱子而改良的脂肪醇生產(chǎn)菌株的脂肪類(lèi)(“FAS”;脂肪醇和游離脂肪酸)產(chǎn)生的鏈長(zhǎng)度分布。所示數(shù)據(jù)為親本菌株(LC-302 ;圖21A)和具有不同量的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的fabA的3種變體(LC-369 ;圖21B，LC-372 ;圖 21C, LC-375 ;圖 21D)的數(shù)據(jù)。
[0054]發(fā)明詳述
[0055]為所有目的，本說(shuō)明書(shū)引用的所有專(zhuān)利、出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)均通過(guò)引用并入本文，就像明確和單獨(dú)指出每個(gè)專(zhuān)利、出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)均通過(guò)其完整引用并入。
[0056]定義
[0057]應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定的實(shí)施方案，并且不試圖進(jìn)行限制。如本說(shuō)明書(shū)和所述權(quán)利要求中所使用，除非上下文另有明確說(shuō)明，單數(shù)形式的“一個(gè)(a)”、“一個(gè)(an) ”和“所述(the) ”包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如，提及“重組微生物”包括兩種或更多種此類(lèi)重組微生物，提及“脂肪酸衍生物”包括一種或多種脂肪酸衍生物或者脂肪酸衍生物的混合物，提及“多核苷酸序列”包括一個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列，提及“酶”包括一種或多種酶，提及“對(duì)照序列”包括一個(gè)或多個(gè)對(duì)照序列，等等。
[0058]除非另有限定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解相同的意義。盡管與本文所述的那些方法和材料相似或等同的其他方法和材料可以用于本發(fā)明的實(shí)施，本文仍然描述了優(yōu)選的材料和方法。
[0059]在本發(fā)明的描述和權(quán)利要求中，將根據(jù)下述定義來(lái)使用以下術(shù)語(yǔ)。
[0060]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核苷酸”是指由雜環(huán)堿基、糖及一個(gè)或多個(gè)磷酸基組成的多核苷酸的單體單元。天然存在的堿基(鳥(niǎo)嘌呤，(G);腺嘌呤，(A);胞嘧啶，(C);胸腺嘧啶，(T)和尿嘧啶(U))通常為嘌呤或嘧啶衍生物，盡管應(yīng)當(dāng)理解還包括天然和非天然存在的堿基類(lèi)似物。天然存在的糖為戊糖(五碳糖)脫氧核糖(其形成DNA)或核糖(其形成RNA)，盡管應(yīng)當(dāng)理解還包括天然和非天然存在的糖類(lèi)似物。核酸通常通過(guò)磷酸鍵連接以形成核酸或多核苷酸，盡管本領(lǐng)域還已知許多其他連接(例如，硫代磷酸酯、硼烷磷酸酯等)。
[0061]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)的聚合物，其可以為單鏈或雙鏈的，并且其可以含有非天然的或改變的核苷酸。本文的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“核酸序列”和“核苷酸序列”可互換使用，是指任何長(zhǎng)度的核苷酸聚合形式，包括RNA或DNA。這些術(shù)語(yǔ)是指分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)，并因此包括雙鏈和單鏈DNA，以及雙鏈和單鏈RNA。該術(shù)語(yǔ)包括由核苷酸類(lèi)似物構(gòu)成的RNA或DNA等同物、類(lèi)似物和修飾的多核苷酸諸如，但不限于甲基化和/或加帽的多核苷酸。多核苷酸可以為任何形式，包括但不限于質(zhì)粒、病毒、染色體、EST、cDNA、mRNA 和 rRNA。
[0062]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白”可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。術(shù)語(yǔ)“重組多肽”是指通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生的多肽，其中編碼被表達(dá)蛋白的DNA或RNA通常被插入至合適的表達(dá)載體，其反過(guò)來(lái)被用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生所述多肽。[0063]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“同系物(homolog) ”和“同源的(homologous) ”是指包含與相應(yīng)多核苷酸或多肽序列具有至少約50%同一性的序列的多核苷酸或多肽。優(yōu)選地，同源的多核苷酸或多肽具有這樣的多核苷酸序列或氨基酸序列，其與相應(yīng)的氨基酸序列或多核苷酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%的同源性。如本文所用，術(shù)語(yǔ)序列“同源性”和序列“同一性”可互換使用。
[0064]本領(lǐng)域技術(shù)人員早已知道測(cè)定兩個(gè)或更多個(gè)序列之間的同源性的方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，可以按下述進(jìn)行兩個(gè)序列之間的“同源性”的計(jì)算。比對(duì)序列以用于最優(yōu)比較(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列的一個(gè)或兩個(gè)中引入空位以用于最優(yōu)比對(duì)，并且為了比較目的可忽略非同源序列)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，為比較目的進(jìn)行比對(duì)的第一序列長(zhǎng)度，為第二序列長(zhǎng)度的至少約30%，優(yōu)選至少約40%，更優(yōu)選至少約50%，甚至更優(yōu)選至少約60%，并且甚至更優(yōu)選至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。然后比較在所述第一和第二序列中對(duì)應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置處的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中相應(yīng)位置處相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，則分子在該位置處相同?？紤]到需要引入以用于兩個(gè)序列的最優(yōu)比對(duì)的空位數(shù)和每個(gè)空位的長(zhǎng)度，兩個(gè)序列之間的百分比同源性為序列共有的相同位置數(shù)的函數(shù)。
[0065]可以利用數(shù)學(xué)算法來(lái)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)序列之間的序列比較和百分比同源性的確定，如BLAST (Altschul, et al.，J.Mol.Biol.，215(3): 403-410 (1990))。還可以利用整合到GCG 軟件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch算法,使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，以及
16、14、12、10、8、6或4的空位加權(quán)值，以及1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度加權(quán)值，測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列之間的百分比同源性(Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol.，48:444-453 (1970))。還可以利用GCG軟件包的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣，以及40、50、60、70或80的空位加權(quán)值和1、2、3、4、5或6的長(zhǎng)度加權(quán)值，測(cè)定兩個(gè)核苷酸序列間的百分比同源性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行初始的同源性計(jì)算，并相應(yīng)地調(diào)節(jié)算法參數(shù)。優(yōu)選的參數(shù)集(以及如果實(shí)踐者不確定應(yīng)當(dāng)使用何種參數(shù)來(lái)確定分子是否位于權(quán)利要求的同源性限制內(nèi)時(shí)，應(yīng)當(dāng)使用的參數(shù)集)為BloSSum62打分矩陣，其使用空位罰分12、空位延伸罰分4以及移碼空位罰分5。序列比對(duì)的其他方法為生物【技術(shù)領(lǐng)域】已知(參見(jiàn),例如,Rosenberg, BMCBioinformatics, 6:278(2005) ;Altschul, et al., FEBS J.，272(20):5101 - 5109(2005))。
[0066]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“低嚴(yán)格、中嚴(yán)格、高嚴(yán)格或非常高嚴(yán)格條件下的雜交”描述雜交和洗漆條件。進(jìn)行雜交反應(yīng)的指導(dǎo)參見(jiàn)Current Protocols in Molecular Biology, Johnffiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。該參考文獻(xiàn)中描述了含水和無(wú)水方法，并且兩種方法都可使用。本文提及的具體性雜交條件如下:1)低嚴(yán)格雜交條件一約45°C下，6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)，然后在至少50°C下(對(duì)于低嚴(yán)格條件，洗滌溫度可以增至55°C)，于
0.2X SSC、0.1%SDS中洗滌兩次；2)中嚴(yán)格雜交條件——約45°C下，6X SSC，然后在60°C下，于0.2X SSC、0.1%SDS中洗滌一次或多次；3)高嚴(yán)格雜交條件——約45°C下，6X SSC，然后在65°C下，于0.2.XSSC、0.1%SDS中洗滌一次或多次；和4)非常高嚴(yán)格雜交條件——65°C下，0.5M磷酸鈉、7%SDS，然后在65°C下，于0.2X SSC、1%SDS中洗滌一次或多次。除非另有說(shuō)明，非常高嚴(yán)格條件(4)為優(yōu)選的條件。
[0067]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“異源的”通常是指非天然存在于生物體中的核苷酸序列或蛋白。例如，可以通過(guò)重組方法將植物內(nèi)源性多核苷酸序列引入到細(xì)菌細(xì)胞中，并且所述植物多核苷酸即為細(xì)菌細(xì)胞中的異源性多核苷酸。
[0068]如本文所用，術(shù)語(yǔ)多肽的“片段”是指全長(zhǎng)多肽或蛋白的更短部分，其大小范圍為4個(gè)氨基酸殘基至整個(gè)氨基酸序列減去一個(gè)氨基酸殘基。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，片段是指多肽或蛋白的結(jié)構(gòu)域(例如，底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域或催化結(jié)構(gòu)域)的整個(gè)氨基酸序列。
[0069]如本文所用，本文的術(shù)語(yǔ)“突變體”和“變體”多肽可互換使用，是指具有與相應(yīng)野生型多肽存在至少一個(gè)氨基酸差異的氨基酸序列的多肽。在一些實(shí)施方案中，所述突變體多肽具有約 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100 個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代、添加、插入或缺失。例如，所述突變體可以包含一個(gè)或多個(gè)保守氨基酸取代。如本文所用，“保守氨基酸取代”為其中的氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基取代的情形。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域已有定義。這些家族包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)；具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)；具有不帶電的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)；具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；具有分枝側(cè)鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸和異亮氨酸)；以及具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和組氨酸)。
[0070]優(yōu)選的多肽或多肽片段變體保留有相應(yīng)野生型多肽的一些或所有生物學(xué)功能(例如，酶活性)。在一些實(shí)施方案中，所述變體或片段保留有相應(yīng)野生型多肽的至少約75%(例如，至少約80%、至少約90%或至少約95%)的生物學(xué)功能。在其他實(shí)施方案中，所述變體或片段保留有相應(yīng)野生型多肽的約100%的生物學(xué)功能。在進(jìn)一步的其他實(shí)施方案中，所述變體或片段具有相應(yīng)野生型多肽的大于100%的生物學(xué)功能?？梢岳帽绢I(lǐng)域熟知的計(jì)算機(jī)程序找到確定哪些氨基酸殘基可被取代、插入或缺失而不影響生物學(xué)活性的指導(dǎo)，例如，LASERGENE? 軟件(DNASTAR, Inc.，Madison, WI)。
[0071]應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的多肽可以具有其他對(duì)多肽功能沒(méi)有本質(zhì)影響的保守型或非必需氨基酸取代?？梢园碆owie et al.(Science247:13061310 (1990))所述確定是否特定的取代會(huì)被允許(即不會(huì)不利地影響諸如脫羧還原酶活性或硫酯酶活性的所需生物學(xué)功能)。
[0072]如本文所用，編碼蛋白的“來(lái)源于野生型基因的開(kāi)放閱讀框”包括但不限于以下:編碼由該基因編碼的野生型蛋白的開(kāi)放閱讀框；編碼由該基因編碼的野生型蛋白的變體(例如，具有例如通過(guò)修飾野生型蛋白獲得的不同序列的變體蛋白)的開(kāi)放閱讀框；和編碼野生型蛋白的開(kāi)放閱讀框，其中所述開(kāi)放閱讀框得到密碼子優(yōu)化。本文闡述了來(lái)源于野生型基因的開(kāi)放閱讀框的一些實(shí)例(參見(jiàn)，例如，野生型恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis) carB的優(yōu)化核苷酸序列(SEQ ID NO: 15),脂肪酸還原酶蛋白；編碼來(lái)源于大腸桿菌tesA的序列的變體蛋白(12H08:SEQ ID NO: 18)，硫酯酶蛋白)。
[0073]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“誘變”是指借此以穩(wěn)定方式改變生物體的遺傳信息的過(guò)程。編碼核酸序列的蛋白的誘變產(chǎn)生突變體蛋白。誘變還指導(dǎo)致改良的蛋白活性的非編碼性核酸序列的改變。
[0074]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基因”是指編碼RNA產(chǎn)物或蛋白產(chǎn)物的核酸序列，以及影響RNA或蛋白表達(dá)的可操作地連接的核酸序列(例如，此類(lèi)序列包括但不限于啟動(dòng)子或增強(qiáng)子序列)或編碼影響RNA或蛋白表達(dá)的序列的可操作地連接的核酸序列(例如，此類(lèi)序列包括但不限于核糖體結(jié)合位點(diǎn)或翻譯控制序列)。
[0075]如本文所用，“酰基-CoA”是指烷基鏈的羰基碳與輔酶A (CoA)的4’ -磷酸泛酰巰基乙胺基(4’ -phosphopantethionyl)部分的巰基之間形成的?；蝓?其具有式R-C(0)S-CoA，其中R為具有至少4個(gè)碳原子的任何烷基。
[0076]如本文所用，“?；?ACP”是指烷基鏈的羰基碳與?；d體蛋白(ACP)的磷酸泛酰巰基乙胺基(phosphopantetheinyl)部分的巰基之間形成的酰基硫酯。所述磷酸泛酰巰基乙胺基部分通過(guò)全?；d體蛋白合酶(ACPS)(磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶)的作用，在翻譯后連接至ACP上的保守絲氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，?；?ACP為合成完全飽和的?；?ACPs的中間物。在其他實(shí)施方案中，?；?ACP為合成不飽和酰基-ACPs的中間物。在一些實(shí)施方案中，碳鏈可具 有約 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25或26個(gè)碳。這些?；?ACPs中的每個(gè)都是將其轉(zhuǎn)化為諸如圖2中描述的那些脂肪酸衍生物的酶的底物。
[0077]如本文所用，“脂肪醛”指具有式RCHO的醛，其特征為具有羰基(C=O)。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪醛為任何源自脂肪酸或脂肪酸衍生物的醛。在某些實(shí)施方案中，所述R基為至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)或至少19個(gè)碳長(zhǎng)度。可選地，或另外，所述R基為20個(gè)或更少、19個(gè)或更少、18個(gè)或更少、17個(gè)或更少、16個(gè)或更少、15個(gè)或更少、14個(gè)或更少、13個(gè)或更少、12個(gè)或更少、11個(gè)或更少、10個(gè)或更少、9個(gè)或更少、8個(gè)或更少、7個(gè)或更少，或者6個(gè)或更少的碳長(zhǎng)度。因此，所述R基可以具有任何兩個(gè)上述端點(diǎn)所約束的R基。例如，所述R基可以為6-16個(gè)碳長(zhǎng)度、10-14個(gè)碳長(zhǎng)度或12-18個(gè)碳長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，所述脂肪醛為C6、C7、C8、C9、C10, Cn、C12、C13, C14, C15, C16, C17,C18> C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25或C26脂肪醛。在某些實(shí)施方案中，所述脂肪醛為C6、C8、C10,C12> C13、C14, C15, C16, C17 或 C18 脂肪醛。
[0078]如本文所用，“脂肪醇”指具有式ROH的醇。在一些施方案中，脂肪醇為任何源自脂肪酸或脂肪酸衍生物的醇。在某些實(shí)施方案中，R基為至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少11個(gè)、至少12個(gè)、至少13個(gè)、至少14個(gè)、至少15個(gè)、至少16個(gè)、至少17個(gè)、至少18個(gè)或至少19個(gè)碳長(zhǎng)度。可選地，或另外，R基為20個(gè)或更少、19個(gè)或更少、18個(gè)或更少、17個(gè)或更少、16個(gè)或更少、15個(gè)或更少、14個(gè)或更少、13個(gè)或更少、12個(gè)或更少、11個(gè)或更少、10個(gè)或更少、9個(gè)或更少、8個(gè)或更少、7個(gè)或更少，或者6個(gè)或更少的碳長(zhǎng)度。因此，R基可以具有任何兩個(gè)上述端點(diǎn)所約束的R基。例如，R基可以為6-16個(gè)碳長(zhǎng)度、10-14個(gè)碳長(zhǎng)度或12-18個(gè)碳長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，脂肪醇為C6、C7、C8、C9、C10> cn、C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25 或 C26 脂肪醇。在某些實(shí)施方案中，脂肪醇為c6、C8、C10, C12, C13、C14, C15, C16, C17或C18脂肪醇。經(jīng)改造用于產(chǎn)生脂肪醛的微生物可將一些脂肪醛轉(zhuǎn)化為脂肪醇。當(dāng)產(chǎn)生脂肪醇的微生物被改造以用于表達(dá)編碼酯合成酶的多核苷酸時(shí)，產(chǎn)生蠟酯。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪醇源自脂肪酸生物合成途徑。例如，酰基-ACP可以通過(guò)硫酯酶(例如，大腸桿菌tesA)的作用轉(zhuǎn)化為脂肪酸，其通過(guò)羧酸還原酶(例如，分枝桿菌carB、carA或fadD9)的作用轉(zhuǎn)化為脂肪醒和脂肪醇。例如,通過(guò)醇脫氫酶(例如，大腸桿菌YqhD或不動(dòng)桿菌alrAadpl)的作用可以進(jìn)一步促進(jìn)脂肪醛轉(zhuǎn)化為脂肪醇。
[0079]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脂肪酸”指具有式RCOOH的羧酸。R表示脂肪族基團(tuán)，優(yōu)選烷基。R可以包含約4至約22個(gè)碳原子。脂肪酸可以為飽和的或單不飽和的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，脂肪酸源自脂肪酸生物合成途徑。
[0080]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脂肪酸生物合成途徑”指產(chǎn)生?；蝓サ纳锖铣赏緩健Ｔ轮挤舅嵘锖铣赏緩桨梢员桓脑煊糜诋a(chǎn)生?；蝓サ闹舅岷厦福⑶以谝恍?shí)施方案中，可以與其他酶一起表達(dá)，以產(chǎn)生具有期望的碳鏈特性的脂肪酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，脂肪酸并非作為“酸”，而是作為?；蝓ケ簧锖铣桑?，該酸作為硫酯與ACP或CoA的
4-磷酸泛酰巰基乙胺基輔基結(jié)合。脂肪?；陨砜梢杂糜诩?xì)胞以構(gòu)建膜、細(xì)胞壁、脂肪、水解為脂肪酸，并且可以進(jìn)一步進(jìn)行生物化學(xué)修飾，以產(chǎn)生脂肪酸衍生物，如醛、醇、烯烴、烷烴、酯等。
[0081]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脂肪酸衍生物”指部分通過(guò)脂肪酸生物合成途徑產(chǎn)生的產(chǎn)物。本文的術(shù)語(yǔ)“脂肪酸衍生物”可以與術(shù)語(yǔ)“脂肪酸或其衍生物”可互換使用，并且包括部分源自?；?ACP或?；?ACP衍生物的產(chǎn)物。示例性“脂肪酸衍生物”包括，例如，脂肪酸、酰基-CoA、脂肪醛、短鏈和長(zhǎng)鏈醇、烴類(lèi)(例如，烷烴、烯烴或鏈烯，如末端或內(nèi)部鏈烯)、脂肪醇、酯(例如，蠟酯、脂肪酸酯(例如，甲基酯或乙基酯))，以及酮類(lèi)。
[0082]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“烷烴”指僅由碳(C)和氫(H)組成的飽和烴類(lèi)或化合物，其中這些原子通過(guò)單鍵連接在一起(即，它們?yōu)轱柡突衔?。
[0083]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“鏈烯(olefin) ”和“烯烴(alkene) ”可互換使用，并且是指含有至少一個(gè)碳-碳雙鍵的烴類(lèi)(即，它們?yōu)椴伙柡突衔?。
[0084]如本文所用，關(guān)于化學(xué)式為CxH2x的α-鏈烯或烯烴，本文的術(shù)語(yǔ)“末端鏈烯(terminal olefin) ”、“ α -鏈烯”、“末端烯烴(terminal alkene) ”和 “1-烯烴”可互換使用，其與具有類(lèi)似分子式的其他鏈烯的區(qū)別在于線性烴鏈和雙鍵位于第一或α位置。
[0085]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“脂肪酯”是指源自脂肪酸，例如脂肪酸酯的任何酯。在一些實(shí)施方案中，脂肪酯含有A側(cè)和B測(cè)。如本文所用，酯的“Α側(cè)”是指結(jié)合所述酯的羧酸酯氧的碳鏈。如本文所用，酯的“B側(cè)”是指包含所述酯的親本羧酸酯的碳鏈。在脂肪酯源自脂肪酸生物合成途徑的實(shí)施方案中，A側(cè)由醇(例如，乙醇或甲醇)提供，并且B側(cè)由脂肪酸提供。
[0086]任何醇都可以用來(lái)形成脂肪酯的A側(cè)。例如，所述醇可以源自脂肪酸生物合成途徑?？蛇x地，所述醇可以通過(guò)非脂肪酸生物合成途徑產(chǎn)生。此外，可以外源提供醇。例如，當(dāng)脂肪酯由生物體產(chǎn)生時(shí)，可以在發(fā)酵液中提供醇?？蛇x地，當(dāng)脂肪酯由也可以產(chǎn)生醇的生物體產(chǎn)生時(shí)，可以外源提供羧酸如脂肪酸或乙酸。
[0087]包含A側(cè)或B側(cè)的碳鏈可以為任何長(zhǎng)度。在一些實(shí)施方案中，酯的A側(cè)為至少約
1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16或18個(gè)碳長(zhǎng)度。當(dāng)脂肪酯為脂肪酸甲基酯時(shí)，酯的A側(cè)為I個(gè)碳長(zhǎng)度。當(dāng)脂肪酯為脂肪酸乙酯時(shí)，酯的A側(cè)為2個(gè)碳長(zhǎng)度。酯的B側(cè)可以為至少約
4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26個(gè)碳長(zhǎng)度。此外，A側(cè)和/或B側(cè)可以為飽和的或不飽和的。[0088]在一些實(shí)施方案中，脂肪酯為蠟。蠟可以源自長(zhǎng)鏈醇和長(zhǎng)鏈脂肪酸。在另一實(shí)施方案中，脂肪酯為脂肪酸硫酯，例如酰基-ACP。脂肪酯可以，例如，用作生物燃料或表面活性劑。
[0089]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“重組宿主細(xì)胞”是指相對(duì)于相應(yīng)的野生型宿主細(xì)胞，遺傳組成發(fā)生改變的宿主，例如，通過(guò)有意引入新遺傳元件和/或有意修飾宿主細(xì)胞中天然存在的遺傳元件。此類(lèi)重組宿主細(xì)胞的后代還含有這些新的和/或修飾的遺傳元件。在本文描述的本發(fā)明的任何方面中，宿主細(xì)胞可以選自:哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、真菌細(xì)胞(例如，絲狀真菌如假絲酵母(Candida sp.)或出芽酵母如酵母(Saccharomyces sp.))、藻細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組宿主細(xì)胞為“重組微生物”。
[0090]如本文所用，“與重組宿主細(xì)胞種類(lèi)相同的宿主細(xì)胞”通常指不具有重組宿主細(xì)胞中所描述的重組修飾的相同物種宿主細(xì)胞。例如,“與重組微生物種類(lèi)相同的微生物”通常是指與重組微生物物種相同(例如，大腸桿菌)和株系相同(例如，大腸桿菌K-12)的微生物，其中所述微生物不包含重組微生物中所描述的重組修飾。
[0091]微生物宿主細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于以下細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。
[0092]在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞選自以下屬:埃希氏桿菌(Escherichia)、芽孢桿菌(Bacillus)、乳桿菌(Lactobacillus)、發(fā)酵單胞菌(Zymomonas)、紅球菌(Rhodococcus)、假單胞菌(Pseudomonas)、曲霉菌(Aspergillus)、木霉菌(Trichoderma)、脈抱菌(Neurospora)、鍵刀菌(Fusarium)、腐質(zhì)霉菌(Humicola)、根毛霉菌(Rhizomucor)、克魯維酵母(Kluyveromyces)、畢赤酵母(Pichia)、毛霉菌(Mucor)、毀絲霉菌(Myceliophtora)、青霉菌(Penicillium)、平革菌(Phanerochaete)、側(cè)耳菌(Pleurotus)、栓菌(Trametes)、金抱子菌(Chrysosporium)、酵母(Saccharomyces)、寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophamonas)、裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母(Yarrowia)或鏈霉菌(Streptomyces)。
[0093]在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，大腸桿菌細(xì)胞為B株、C株、K株或W株大腸桿菌細(xì)胞。
[0094]在其他實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為遲緩芽孢桿菌(Bacillus lentus)細(xì)胞、短芽孢桿菌(Bacillus brevis)細(xì)胞、嗜熱脂肪芽抱桿菌(Bacillus stearothermophilus)細(xì)胞、地衣芽抱桿菌(Bacillus lichenoformis)細(xì)胞、嗜喊芽抱桿菌(Bacillus alkalophilus)細(xì)胞、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)細(xì)胞、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)細(xì)胞、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilis)細(xì)胞、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)細(xì)胞、克勞氏芽孢桿菌(Bacillus clausii)細(xì)胞、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)細(xì)胞、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)細(xì)胞或解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)細(xì)胞。
[0095]在其他實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為康氏木霉(Trichoderma koningii)細(xì)胞、綠色木霉(Trichoderma viride)細(xì)胞、里氏木霉(Trichoderma reesei)細(xì)胞、長(zhǎng)枝木霉(Trichoderma 1ngibrachiatum)細(xì)胞、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)細(xì)胞、煙曲霉(Aspergillus fumigates)細(xì)胞、臭曲霉(Aspergillus foetidus)細(xì)胞、構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)細(xì)胞、黑曲霉(Aspergillus niger)細(xì)胞、米曲霉(Aspergillusoryzae)細(xì)胞、特異腐質(zhì)霉(Humicola insolens)細(xì)胞、棉毛狀腐質(zhì)霉(HumicolaIanuginose)細(xì)胞、混池紅球菌(Rhodococcus opacus)細(xì)胞、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)細(xì)胞或米黑毛酶(Mucor michei)細(xì)胞。
[0096]在進(jìn)一步的其他實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是變鉛青鏈霉菌(StreptomycesIividans)細(xì)胞或鼠灰鏈霉菌(Streptomyces murinus)細(xì)胞。
[0097]在其他實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為放線菌(Actinomycetes)細(xì)胞。
[0098]在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)細(xì)胞。
[0099]在其他實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞來(lái)自真核植物、藻、藍(lán)藻、綠色硫細(xì)菌、綠色非硫細(xì)菌、紫色硫細(xì)菌、紫色非硫細(xì)菌、極端微生物、酵母、真菌、藻、及其改造的生物體或合成的生物體。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞依賴光或固定碳。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞依賴光或固定碳。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞具有自養(yǎng)活性。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞具有光合自養(yǎng)活性，如在光存在下。在一些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞在光存在下為異養(yǎng)型或?yàn)榛旌蠣I(yíng)養(yǎng)型。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞為來(lái)自以下的細(xì)胞:擬南芥(Arabidopsisthaliana)、柳枝稷(Panicum virgatum)、奇崗(Miscanthus giganteus)、玉蜀黍(Zeamays)、葡萄藻(Botryococcuse braunii)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、杜氏鹽藻(Dunaliela salina)、聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7002 (Synechococcus Sp.PCC7002)、聚球藍(lán)細(xì)菌 PCC7942 (Synechococcus Sp.PCC7942)、集胞藻 PCC6803 (SynechocystisSp.PCC6803)、長(zhǎng)嗜熱聚球藍(lán)細(xì)菌 BP-1 (Thermosynechococcus elongatus BP-1)、綠硫菌(Chlorobium tepidum)、嗜熱光合綠絲菌(Chlorojlexus auranticus)、酒色著色菌(Chromatiumm vinosum)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、莢膜紅細(xì)菌(Rhodobacter capsulatus)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palusris)、楊氏梭菌(Clostridium I jungdahlii)、熱纖梭菌(Clostridiuthermocellum)、產(chǎn)黃青霉菌(Penicillium chrysogenum)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、焚光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)或運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)。
[0100]其他宿主細(xì)胞的實(shí)例包括但不限于:CH0細(xì)胞、COS細(xì)胞、VERO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Cvl細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞、3T3細(xì)胞或PC12細(xì)胞。
[0101]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“克隆”通常是指起源于并且遺傳上基本上與單一共同袓先相同的細(xì)胞或細(xì)胞群，例如，克隆細(xì)菌菌落的細(xì)菌產(chǎn)生于單一細(xì)菌細(xì)胞。
[0102]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“培養(yǎng)物”通常是指包含活細(xì)胞的液體培養(yǎng)基，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞獲自克隆。在一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)物包含于受控條件下在預(yù)定培養(yǎng)基中繁殖的細(xì)胞，例如，培養(yǎng)于包含選定的碳源和氮的液體培養(yǎng)基中的重組微生物克隆。[0103]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“發(fā)酵”廣義是指宿主細(xì)胞將有機(jī)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為目標(biāo)物質(zhì)，例如，重組微生物通過(guò)在包含碳源的培養(yǎng)基中繁殖重組微生物培養(yǎng)物，將碳源轉(zhuǎn)化為脂肪酸或其衍生物。
[0104]如本文所用，重組微生物中蛋白例如酶的“改良的”活性，是指相對(duì)于親本微生物而確定的在活性上的一個(gè)或多個(gè)可遺傳特性差異。通常，測(cè)定具有改良的活性的重組微生物與相應(yīng)野生型微生物之間的活性差異(例如，重組大腸桿菌的克隆培養(yǎng)物相對(duì)于野生型大腸桿菌進(jìn)行比較)。改良的活性可源于以下原因，例如，重組微生物表達(dá)蛋白的修改的量(例如，由于編碼該蛋白的DNA序列的拷貝數(shù)增加或減少、編碼該蛋白的mRNA轉(zhuǎn)錄物的數(shù)目增加或減少和/或來(lái)自mRNA的蛋白的蛋白翻譯量增加或減少)；蛋白結(jié)構(gòu)的改變(例如，一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，諸如，蛋白編碼序列的改變引起底物特異性改變、觀察到的動(dòng)力學(xué)參數(shù)改變)；以及蛋白穩(wěn)定性的改變(例如，蛋白降解增加或減少)。在一些實(shí)施方案中，多肽為本文描述的任何多肽的突變體或變體。
[0105]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”通常是指最終控制蛋白表達(dá)的元件如DNA中的堿基序列。調(diào)控序列的實(shí)例包括但不限于，DNA啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列、轉(zhuǎn)錄終止序列、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(如增強(qiáng)子元件)、影響RNA穩(wěn)定性的核苷酸序列，以及翻譯調(diào)控序列(如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、起始密碼子、終止密碼子)。
[0106]如本文所用，短語(yǔ)“相對(duì)于野生型核苷酸序列，所述核苷酸序列的表達(dá)被修改”指內(nèi)源核苷酸序列的表達(dá)和/或活性水平，或者編碼異源或非天然多肽的核苷酸序列的表達(dá)和/或活性增加或減少。在一些實(shí)施方案中，控制編碼多肽的內(nèi)源性或異源性多核苷酸表達(dá)的內(nèi)源性調(diào)控元件， 是通過(guò)重組整合到宿主細(xì)胞基因組中的可操作地連接至內(nèi)源性或異源性多核苷酸的表達(dá)控制序列。在一些實(shí)施方案中，利用本領(lǐng)域已知的方法，通過(guò)同源重組將表達(dá)控制序列整合到宿主細(xì)胞染色體中。在一些實(shí)施方案中，編碼多肽的序列為本文描述的任何編碼多肽的序列的突變體或變體。
[0107]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“氧?；鵄CP合酶”和“ β -酮脂酰-ACP合酶蛋白”可互換使用，是指將來(lái)自丙二酰-ACP (?；d體蛋白)的雙碳單元加入至另一脂肪?；?ACP分子的長(zhǎng)鏈脂肪酸合成酶，產(chǎn)生β -酮脂酰-ACP并釋放二氧化碳，例如，EC2.3.1.41酶。III型酮脂酰-ACP合酶(KAS)催化初始縮合反應(yīng)；如本文所用，短語(yǔ)“初始縮合β-酮脂酰-ACP合酶”是指這些類(lèi)型的多肽。I型和II型KAS負(fù)責(zé)催化脂肪酸生物合成中的延伸步驟；如本文所用，短語(yǔ)“延伸β_酮脂酰-ACP合酶”是指這些類(lèi)型的多肽。該組酶包括但不限于:3_氧?；?[?；?載體-蛋白]合酶I (EC2.3.1.41)和3-氧?；?[?；?載體-蛋白]合酶II (EC2.3.1.179)，以及通過(guò)國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)盟(International Union of Biochemistry and Molecular Biology)的數(shù)字分類(lèi)鑒定的、酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC2.3.1.-的酶；名稱EC2.3.1.-包括EC2.3.1.X，其中X為整數(shù)；EC2.3.1.nX，其中X為整數(shù)(初始的EC號(hào)包括‘η’，作為部分的第四個(gè)(系列)數(shù)字，例如，其中X=nl)，以及具有EC2.3.1分類(lèi)的酶。由編碼此類(lèi)酶的基因編碼的蛋白的實(shí)例包括但不限于:fabB 蛋白，大腸桿菌(J Biol.Chem.13; 279 (33): 34489-95 (2004))；fabF 蛋白，大腸桿菌(J Bacteriol.169(4):1469-73(1987)) ；CEM1 蛋白，啤酒酵母(S.cerevisiae) (Mol.Microbiol.9 (3): 545-55 (1993)) ；KAS2 蛋白，擬南芥(Arabidopsis)(Plant J29 (6): 761—70 (2002));和 fabF 蛋白，幾球腸菌(Enterococcus faecalis) (JBiol.Chem.13; 279 (33): 34489-95 (2004))。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，β _酮脂酰-ACP合酶蛋白為3-氧?；?[?；?載體-蛋白]合酶I (EC2.3.1.41)或3-氧?；?[?；?載體-蛋白]合酶II (EC2.3.1.179)。β -酮脂酰-ACP合酶蛋白的其他實(shí)例列于以下的表1中。
[0108]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“?；?ACP水解酶”蛋白是指通過(guò)水解脂肪酸的?；?，終止脂肪?；由斓拈L(zhǎng)鏈脂肪酸合成酶，通常為作用于硫酯鍵并水解1-?；I的那些酶。該組酶包括但不限于，酰基-ACP硫酯酶，以及通過(guò)國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)盟的數(shù)字分類(lèi)鑒定的、酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC3.L 1.5或EC3.1.2.-的酶；名稱EC3.1.2.-包括EC3.1.2.X，其中X為整數(shù)；EC3.1.2.nX，其中X為整數(shù)(初始的EC號(hào)包括‘η’，作為部分的第四個(gè)(系列)數(shù)字，例如，其中X=nl)，以及具有EC3.1.2分類(lèi)的酶。由編碼此類(lèi)酶的基因編碼的蛋白的實(shí)例包括但不限于:tesA蛋白，大腸桿菌(J Biol.Chem.268:9238-45 (1993)) ;fatB蛋白，毛白楊(Populus tomentosa) (J.Genet.Genomics34:267-273 (2007));及酸基-ACP 硫酯酶，多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron) (Science299:2074-2076 (2003))。硫酯酶的其他實(shí)例列于以下的表1中。
[0109]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“ β -羥?；?ACP脫水酶”通常是指催化β -羥酰基?；d體蛋白(ACP)脫水的長(zhǎng)鏈脂肪酸合成酶。該組酶包括但不限于，國(guó)際生物化學(xué)與分子生物學(xué)聯(lián)盟的酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-或EC4.2.1.60的酶；名稱EC4.2.1.-包括EC4.2.1.X，其中X為整數(shù)；EC4.2.1.nX，其中X為整數(shù)(初始的EC號(hào)包括‘η’，作為部分的第四個(gè)(系列)數(shù)字，例如，其中X=nl)，以及具有EC4.2.1分類(lèi)的酶。由編碼此類(lèi)酶的基因編碼的蛋白的實(shí)例包括但不限于:fabA蛋白，大腸桿菌(Heath, R.J.，et al.，J Biol.Chem.271(44):27795-801(1996));及 fabZ 蛋白，大腸桿菌(Heath, R.J., et al., J Biol.Chem.271 (44): 27795-801 (1996))。β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的其他實(shí)例列于以下的表I中。大腸桿菌fabA和fabZ編碼的蛋白催化β -羥?；鵄CP脫水，如圖1所示。fabA和fabZ底物特異性的細(xì)微差別已有報(bào)道。例如，已報(bào)道fabA起異構(gòu)酶作用，而fabZ無(wú)報(bào)道。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“滴度”是指每單位體積的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的脂肪酸或脂肪酸衍生物的量。在本文描述的組合物和方法的任何方面中，以下述滴度產(chǎn)生脂肪酸或其衍生物:約25mg/L、約 50mg/L、約 75mg/L、約 100mg/L、約 125mg/L、約 150mg/L、約 175mg/L、約 200mg/L、約 225mg/L、約 250mg/L、約 275mg/L、約 300mg/L、約 325mg/L、約 350mg/L、約 375mg/L、約 400mg/L、約 425mg/L、約 450mg/L、約 475mg/L、約 500mg/L、約 525mg/L、約 550mg/L、約 575mg/L、約 600mg/L、約 625mg/L、約 650mg/L、約 675mg/L、約 700mg/L、約 725mg/L、約 750mg/L、約 775mg/L、約 800mg/L、約 825mg/L、約 850mg/L、約 875mg/L、約 900mg/L、約925mg/L、約 950mg/L、約 975mg/L、約 1000mg/L、約 1050mg/L、約 1075mg/L、約 1100mg/L、約1125mg/L、約 1150mg/L、約 1175mg/L、約 1200mg/L、約 1225mg/L、約 1250mg/L、約 1275mg/L、約 1300mg/L、約 1325mg/L、約 1350mg/L、約 1375mg/L、約 1400mg/L、約 1425mg/L、約 1450mg/L、約 1475mg/L、約 1500mg/L、約 1525mg/L、約 1550mg/L、約 1575mg/L、約 1600mg/L、約1625mg/L、約 1650mg/L、約 1675mg/L、約 1700mg/L、約 1725mg/L、約 1750mg/L、約 1775mg/L、約 1800mg/L、約 1825mg/L、約 1850mg/L、約 1875mg/L、約 1900mg/L、約 1925mg/L、約 1950mg/L、約 1975mg/L、約 2000mg/L(2g/L)、3g/L、5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、125g/L、150g/L、200g/L、250g/L，或任何兩個(gè)前述值所約束的范圍。在其他實(shí)施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物以下述滴度產(chǎn)生:大于100g/L、大于200g/L、大于 300g/L，或大于，諸如 500g/L、700g/L、1000g/L、1200g/L、1500g/L 或 2000g/L。根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施方案，重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪酸或其衍生物的優(yōu)選的滴度為5g/L至 200g/L、10g/L 至 150g/L、20g/L 至 120g/L、30g/L 至 100g/L 或 30g/L 至 250g/L。
[0110]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪酸或其衍生物的產(chǎn)率”是指宿主細(xì)胞將投入的碳源轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(即，脂肪酸或脂肪酸衍生物如脂肪醇或脂肪酯)的效率。根據(jù)本發(fā)明方法的實(shí)施方案，經(jīng)改造用于產(chǎn)生脂肪酸和脂肪酸衍生物的宿主細(xì)胞可以具有如下產(chǎn)率:至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%%、至少31%、至少32%、至少33%、至少34%、至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%或至少40%，或任何兩個(gè)前述值所約束的范圍。在其他實(shí)施方案中，脂肪酸或脂肪酸衍生物以如下產(chǎn)率產(chǎn)生:大于30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多?？蛇x地，或另外，在一些實(shí)施方案中，產(chǎn)率為約40%或更少、約37%或更少、約35%或更少、約32%或更少、約30%或更少、約27%或更少、約25%或更少或約22%或更少。因此,產(chǎn)率可以落入任何兩個(gè)上述端點(diǎn)所約束的范圍。例如，根據(jù)本發(fā)明方法，通過(guò)重組宿主細(xì)胞的實(shí)施方案產(chǎn)生的脂肪酸或其衍生物的產(chǎn)率可以為:5% 至 15%、10% 至 25%、10% 至 22%、15% 至 27%、18% 至 22%、20% 至 28%、20% 至30%、15%至30%、10%至30%或10%至40%。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法，重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪酸或其衍生物的產(chǎn)率為10%至30%，或10%至40%。
[0111]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)生的脂肪酸或其衍生物的生產(chǎn)力”是指每單位體積的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物在每 單位時(shí)間產(chǎn)生的脂肪酸或脂肪酸衍生物的量。在本文描述的組合物和方法的任何方面中，重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪酸或脂肪酸衍生物的生產(chǎn)力為:至少100mg/L/小時(shí)、至少200mg/L/小時(shí)、至少300mg/L/小時(shí)、至少400mg/L/小時(shí)、至少500mg/L/小時(shí)、至少600mg/L/小時(shí)、至少700mg/L/小時(shí)、至少800mg/L/小時(shí)、至少900mg/L/小時(shí)、至少1000mg/L/小時(shí)、至少1100mg/L/小時(shí)、至少1200mg/L/小時(shí)、至少1300mg/L/小時(shí)、至少1400mg/L/小時(shí)、至少1500mg/L/小時(shí)、至少1600mg/L/小時(shí)、至少1700mg/L/小時(shí)、至少1800mg/L/小時(shí)、至少1900mg/L/小時(shí)、至少2000mg/L/小時(shí)、至少2100mg/L/小時(shí)、至少2200mg/L/小時(shí)、至少2300mg/L/小時(shí)、至少2400mg/L/小時(shí)、至少2500mg/L/小時(shí)、至少2600mg/L/小時(shí)、至少2700mg/L/小時(shí)、至少2800mg/L/小時(shí)、至少2900mg/L/小時(shí)或至少3000mg/L/小時(shí)?？蛇x地，或另外，在一些實(shí)施方案中，生產(chǎn)力為3500mg/L/小時(shí)或更少、3000mg/L/小時(shí)或更少、2500mg/L/小時(shí)或更少、2000mg/L/小時(shí)或更少、1500mg/L/小時(shí)或更少、120mg/L/小時(shí)或更少、1000mg/L/小時(shí)或更少、800mg/L/小時(shí)或更少，或者600mg/L/小時(shí)或更少。因此，生產(chǎn)力可以落入任何兩個(gè)上述端點(diǎn)所約束的范圍。例如，在一些實(shí)施方案中，生產(chǎn)力可以為:30至3000mg/L/小時(shí)、60至2000mg/L/小時(shí)，或100至1000mg/L/小時(shí)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明方法，重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪酸或其衍生物的生產(chǎn)力為:150mg/L/ 小時(shí)至 1500mg/L/ 小時(shí)、500mg/L/ 小時(shí)至 2500mg/L/ 小時(shí)，或 700mg/L/ 小時(shí)至 3000mg/L/小時(shí)。
[0112]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“過(guò)表達(dá)”指相比相應(yīng)野生型細(xì)胞在相同條件下的正常表達(dá)，細(xì)胞的多核苷酸或多肽以更大的濃度表達(dá)或造成被表達(dá)。例如，當(dāng)相比其在相同物種的非重組宿主細(xì)胞中于相同條件下的濃度，多核苷酸以更大的濃度存在于重組宿主細(xì)胞中時(shí)，多核苷酸可為在重組宿主細(xì)胞中“過(guò)表達(dá)”。
[0113]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指多核苷酸序列和表達(dá)控制序列以這樣的方式連接，即當(dāng)合適的分子(例如，轉(zhuǎn)錄激活蛋白)被結(jié)合至所述表達(dá)控制序列時(shí)，允許基因表達(dá)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄和翻譯方向，可操作地連接的啟動(dòng)子位于選定的多核苷酸序列的上游?？刹僮鞯剡B接的增強(qiáng)子可以位于選定的多核苷酸的上游、內(nèi)部或下游?？刹僮鞯剡B接的翻譯控制元件可以位于編碼蛋白的多核苷酸序列的外部、內(nèi)部或下游。
[0114]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“載體”是指能運(yùn)輸與其連接的另一核酸，即多核苷酸序列的核酸分子。一類(lèi)有用載體為附加體(即，能進(jìn)行染色體外復(fù)制的核酸)。有用的載體為能自主復(fù)制和/或表達(dá)與它們連接的核酸的那些載體。能指導(dǎo)可操作地與它們連接的基因進(jìn)行表達(dá)的載體，在本文稱為“表達(dá)載體”。一般來(lái)說(shuō)，用于重組DNA技術(shù)的表達(dá)載體常常為“質(zhì)粒”形式，其通常是指以它們的載體形式存在的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，不局限于染色體。本文的術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！焙汀拜d體”可互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒為最常使用的載體形式。然而，還包括此類(lèi)其他表達(dá)載體形式，其具有等同功能并迄今為本領(lǐng)域已知。[0115]可以通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體引入到原核或真核細(xì)胞內(nèi)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”可互換使用，是指多種本領(lǐng)域認(rèn)可的用于將外來(lái)核酸(例如，DNA)引入至宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔。合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法可以參見(jiàn)，例如，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Third Edition), Sambrook, et al., Cold Spring Harbor LaboratoryPress(2001)。
[0116]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“在有效表達(dá)所述異源性核苷酸序列的條件下”指允許宿主細(xì)胞產(chǎn)生所需脂肪酸或脂肪酸衍生物的任何條件。合適的條件包括，例如，發(fā)酵條件。發(fā)酵條件可以包含許多參數(shù)，如溫度范圍、曝氣水平和培養(yǎng)基組成。這些條件中的每一個(gè)單獨(dú)地并聯(lián)合地允許宿主細(xì)胞生長(zhǎng)。示例性培養(yǎng)基包括培養(yǎng)液或凝膠。通常，培養(yǎng)基包含可以被宿主細(xì)胞直接代謝的碳源。發(fā)酵指生產(chǎn)宿主如重組微生物利用碳源。發(fā)酵可以為需氧的、厭氧的或其變體(如微需氧)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，重組微生物能將碳源加工為?；?ACP或所需脂肪酸或其衍生物(例如，脂肪酯、烷烴、鏈烯或醇)的條件存在差異，這部分取決于具體微生物。在一些實(shí)施方案中，該過(guò)程發(fā)生在需氧環(huán)境中。在一些實(shí)施方案中，該過(guò)程發(fā)生在缺氧環(huán)境中。在一些實(shí)施方案中，該過(guò)程發(fā)生在微需氧環(huán)境中。
[0117]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“碳源”是指適合用作原核或簡(jiǎn)單的真核細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源的底物或化合物。碳源可以為各種形式，包括但不限于:聚合物、糖類(lèi)、酸類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、氨基酸、肽和氣體(例如，CO和CO2)。示例性碳源包括但不限于，單糖如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖；寡糖如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖如淀粉、纖維素、果膠和木聚糖；二糖如蔗糖、麥芽糖、纖維二糖和松二糖；纖維素原料及變體如半纖維素、甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉；飽和或不飽和脂肪酸、琥珀酸酯、乳酸酯和醋酸酯；醇類(lèi)如乙醇、甲醇、丙三醇或其混合物。碳源還可以是光合作用的產(chǎn)物如葡萄糖。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，碳源為生物質(zhì)。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，碳源為葡萄糖、蔗糖、果糖或其組合。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，碳源直接或間接源自天然原料如甘蔗、甜高粱、柳枝稷、甜菜等。
[0118]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“生物質(zhì)”是指從中得到碳源的任何生物材料。在一些實(shí)施方案中，生物質(zhì)被加工為適合生物轉(zhuǎn)化的碳源。在其他實(shí)施方案中，生物質(zhì)不需要進(jìn)一步加工為碳源。碳源可以轉(zhuǎn)化為脂肪酸或脂肪酸衍生物的任何組合物。生物質(zhì)的示例性來(lái)源為植物材料或草木如玉米、甘蔗或柳枝稷。生物質(zhì)的另一示例性來(lái)源為代謝廢物如動(dòng)物物質(zhì)(例如，牛糞)。生物質(zhì)的其他示例性來(lái)源包括藻類(lèi)和其他海洋植物。生物質(zhì)還包括來(lái)自工業(yè)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)和家庭的廢物，包括但不限于發(fā)酵廢物、青貯飼料、稻草、木材、污水、垃圾、纖維質(zhì)城市廢物和食物剩余物。術(shù)語(yǔ)“生物質(zhì)”還可指諸如糖類(lèi)(例如，單糖、二糖或多糖)的碳源。
[0119]如本文所用，關(guān)于產(chǎn)物(如脂肪酸及其衍生物)，術(shù)語(yǔ)“分離的”是指分離自細(xì)胞組分、細(xì)胞培養(yǎng)基或者化學(xué)或合成前體的產(chǎn)物。通過(guò)本文所述方法制備的脂肪酸及其衍生物在發(fā)酵液中可能是相對(duì)不混溶的，在細(xì)胞質(zhì)中也是。因此，脂肪酸及其衍生物可以通過(guò)在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外收集于有機(jī)相中。在有機(jī)相中收集產(chǎn)物可以減少脂肪酸衍生物一脂肪醛或脂肪醇對(duì)細(xì)胞功能的影響，并且可以允許重組微生物產(chǎn)生更多的產(chǎn)物。通過(guò)本發(fā)明方法制備的脂肪酸及其衍生物通常分離自重組微生物所培養(yǎng)的液體培養(yǎng)基中。
[0120]如本文所用的術(shù)語(yǔ)“純化(purify) ”、“純化的(purified)”或“純化(purification) ”指通過(guò)例如純化或分離從分子的環(huán)境中移除或分離所述分子?！盎旧霞兓摹狈肿訛橹辽偌s60%游離(例如，至少約70%游離、至少約75%游離、至少約85%游離、至少約90%游離、至少約95%游離、至少約97%游離、至少約99%游離)于與其結(jié)合的其他組分。如本文所用，這些術(shù)語(yǔ)還指從樣品中去除污染物。例如，污染物的去除可以使得樣品中脂肪醛或脂肪醇的百分比增加。例如，當(dāng)脂肪醛或脂肪醇在重組微生物中產(chǎn)生時(shí)，可以通過(guò)去除重組微生物蛋白來(lái)純化脂肪醛或脂肪醇。純化后，同樣的樣品中脂肪醛或脂肪醇的百分比增加。術(shù)語(yǔ)“純化(purify) ”、“純化的(purified) ”或“純化(purification) ”不要求絕對(duì)純的相對(duì)術(shù)語(yǔ)。因此，例如，當(dāng)脂肪醛或脂肪醇在重組微生物中產(chǎn)生時(shí)，純化的脂肪醛或純化的脂肪醇是基本與其他細(xì)胞組分(例如，核酸、多肽、脂質(zhì)、糖類(lèi)或其他烴類(lèi))分離的脂肪醛或脂肪醇。
[0121]如本文所用的“現(xiàn)代碳分?jǐn)?shù)(fraction of modern carbon) ”或“fM”與分別稱為草酸標(biāo)準(zhǔn)HOxI和HOxII的、由國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院(National Institute of Standardsand Technology (NIST))標(biāo)準(zhǔn)參考物(SRMs) 4990B和4990C所定義的含義相同。基本定義涉及0.95倍的14C/12C同位素比率HOxI (參考AD1950)。這粗略地等于衰變校正的工業(yè)革命前樹(shù)木(decay-corrected pre-1ndustrial Revolution wood)。對(duì)于現(xiàn)今生命生物圈(植物物質(zhì))而言，fM約為1.1。
[0122]發(fā)明總體概述
[0123]在詳細(xì)描述本發(fā)明前，應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于特定類(lèi)型的重組宿主細(xì)胞、特定多核苷酸序列、特定突變、特定蛋白等，因?yàn)槭褂眠@類(lèi)特定物質(zhì)可能基于本發(fā)明的教導(dǎo)而選定。還應(yīng)當(dāng)理解，本文所用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述本發(fā)明特定實(shí)施方案的目的，并且不試圖進(jìn)行限制。
[0124]重組宿主細(xì)胞和重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物
[0125]在第一個(gè)方面，本發(fā)明涉及經(jīng)改造用于產(chǎn)生高滴度的、具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，所述滴度通常為約30g/L至約250g/L。本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的脂肪酸衍生物，包括但不限于脂肪酸、?；?CoA、脂肪醛、短鏈和長(zhǎng)鏈醇、烴類(lèi)(例如，烷烴、烯烴或鏈烯如末端或內(nèi)部鏈烯)、脂肪醇、酯(例如，蠟酯、脂肪酸酯(例如，甲基酯或乙基酯)，以及酮類(lèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及脂肪醇的產(chǎn)生。
[0126]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型宿主細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)物產(chǎn)生的相同脂肪酸衍生物的滴度，重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生的更高滴度的脂肪酸衍生物為更高滴度的、具有選定脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物。此類(lèi)更高滴度的實(shí)例包括但不限于以下:相對(duì)于相應(yīng)野生型宿主細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)物產(chǎn)生的具有脂肪鏈長(zhǎng)度C8的脂肪醇的滴度，所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生更高滴度的、具有脂肪鏈長(zhǎng)度C8的脂肪醇；相對(duì)于相應(yīng)野生型宿主細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)物產(chǎn)生的具有脂肪鏈長(zhǎng)度C8和Cltl的脂肪醇的滴度，所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生更高滴度的、具有脂肪鏈長(zhǎng)度C8和Cltl的脂肪醇；相對(duì)于相應(yīng)野生型宿主細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)物產(chǎn)生的具有脂肪鏈長(zhǎng)度C12的脂肪醇的滴度，所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生更高滴度的、具有脂肪鏈長(zhǎng)度C12的脂肪醇；相對(duì)于相應(yīng)野生型宿主細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)物產(chǎn)生的具有脂肪鏈長(zhǎng)度C12和C14的脂肪醇的滴度，所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生更高滴度的、具有脂肪鏈長(zhǎng)度C12和C14的脂肪醇；以及，相對(duì)于相應(yīng)野生型宿主細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)物產(chǎn)生的具有脂肪鏈長(zhǎng)度C12, C14和C18的脂肪醇的滴度，所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生更高滴度的、具有脂肪鏈長(zhǎng)度C12X14和C18的脂肪醇。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，相對(duì)于相應(yīng)野生型宿主細(xì)胞的對(duì)照培養(yǎng)物產(chǎn)生的相同脂肪酸衍生物的滴度，所述更高滴度的脂肪酸衍生物是更高滴度的特定類(lèi)型脂肪酸衍生物(例如，脂肪醇、脂肪酸酯或烴類(lèi))。
[0127]在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，多核苷酸序列包含編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC2.3.1.-的延伸β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的開(kāi)放閱讀框，以及可操作地連接的、促進(jìn)重組宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)的調(diào)控序列。在重組宿主細(xì)胞中，相對(duì)于編碼延伸酮脂酰-ACP合酶蛋白的相應(yīng)的野生型基因，所述開(kāi)放閱讀框編碼序列和/或所述調(diào)控序列被修改。相對(duì)于從相應(yīng)宿主細(xì)胞的野生型基因表達(dá)的β -酮脂酰-ACP合酶蛋白的活性，重組宿主細(xì)胞的β_酮脂酰-ACP合酶蛋 白活性被改良。另外，培養(yǎng)物中的重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)含有編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC3.1.1.5或EC3.1.2.-的硫酯酶的開(kāi)放閱讀框的多核苷酸序列，以及可操作地連接的、促進(jìn)重組宿主細(xì)胞蛋白表達(dá)的調(diào)控序列。在重組宿主細(xì)胞中，相對(duì)于編碼硫酯酶的相應(yīng)野生型基因，所述開(kāi)放閱讀框編碼序列和/或所述調(diào)控序列被修改。相對(duì)于從相應(yīng)宿主細(xì)胞的相應(yīng)野生型基因表達(dá)的硫酯酶的活性，重組宿主細(xì)胞的硫酯酶活性被改良。
[0128]制備具有改良的酶活性的蛋白的方法描述如下。另外，表達(dá)具有此類(lèi)改良的活性的蛋白的示例性重組宿主細(xì)胞描述于本發(fā)明實(shí)施例中。
[0129]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及產(chǎn)生高滴度的、具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物。所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物包含重組宿主細(xì)胞。所述重組宿主細(xì)胞經(jīng)改造用于產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物。所述重組宿主細(xì)胞通常包含酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC2.3.1.-的延伸β_酮脂酰-ACP合酶蛋白的改良的活性。所述改良的活性不同于在與重組宿主細(xì)胞種類(lèi)相同的宿主細(xì)胞(例如，重組宿主細(xì)胞源自的野生型宿主細(xì)胞)中通過(guò)表達(dá)起始多核苷酸序列(SPSa)產(chǎn)生的β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的活性，所述SPSa包含編碼延伸β -酮脂酰-ACP合酶蛋白的開(kāi)放閱讀框多核苷酸序列(ORFa)以及5’非編碼多核苷酸序列(NCa)，所述ORFa具有5’和3’端，所述NCa包含鄰近所述0RFa5’端的可操作地連接的調(diào)控序列。所述起始多核苷酸序列，例如，可以為編碼延伸酮脂酰-ACP合酶蛋白的野生型基因。另外，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)編碼β -酮脂酰-ACP合酶蛋白的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，包括與所述ORFa或所述NCa分別具有小于100%序列同一性的ORFa變體和/或NCa變體。另外，所述重組宿主細(xì)胞包含酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC3.1.1.5或EC3.1.2.-的硫酯酶的改良的活性。所述改良的活性不同于在與重組宿主細(xì)胞種類(lèi)相同的宿主細(xì)胞中通過(guò)表達(dá)起始多核苷酸序列(SPSb)產(chǎn)生的硫酯酶的活性，所述SPSb包含編碼硫酯酶的開(kāi)放閱讀框多核苷酸序列(ORFb)以及5’非編碼多核苷酸序列(NCb)，所述ORFb具有5’和3’端，所述NCb包含鄰近所述0RFB5’端的可操作地連接的調(diào)控序列。所述起始多核苷酸序列，例如，可以為編碼硫酯酶的野生型基因。另外，所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)編碼硫酯酶的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，包括與所述ORFb或所述NCb具有小于100%序列同一性的ORFb變體和/或NCb變體。
[0130]重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物通常產(chǎn)生高滴度(約30g/L至約250g/L)的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物。
[0131 ] 相比在與重組培養(yǎng)物相同的條件下培養(yǎng)的對(duì)照培養(yǎng)物所產(chǎn)生的脂肪酸衍生物的滴度，重組培養(yǎng)物通常產(chǎn)生的脂肪酸衍生物的滴度為至少約3倍大、至少約5倍大、至少約8倍大，或至少約10倍大。重組培養(yǎng)物通常包含重組宿主細(xì)胞，其含有誘變的多核苷酸序列(具有開(kāi)放閱讀框，其編碼可操作地連接至促進(jìn)該蛋白表達(dá)的調(diào)控序列的蛋白)。對(duì)照培養(yǎng)物通常包含宿主細(xì)胞，其表達(dá)編碼延伸β -酮脂酰-ACP合酶蛋白和硫酯酶的野生型基因?？蛇x地，對(duì)照培養(yǎng)物可以包含宿主細(xì)胞，其含有多核苷酸序列(具有開(kāi)放閱讀框，其編碼可操作地連接至促進(jìn)該蛋白表達(dá)的調(diào)控序列的蛋白)，所述多核苷酸序列被用作在引入至本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞前進(jìn)行誘變的起始多核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生約30g/L至約250g/L滴度的脂肪酸衍生物。
[0132]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，相比在與重組培養(yǎng)物相同條件下培養(yǎng)的對(duì)照培養(yǎng)物產(chǎn)生的脂肪酸衍生物的滴度，所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的脂肪酸衍生物產(chǎn)率為至少約3倍大、約5倍大、約8倍大或約10倍大。脂肪酸衍生物產(chǎn)率的實(shí)例包括重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生約10%至約40%的脂肪酸衍生物。通常，滴度和產(chǎn)率具有正相關(guān)關(guān)系。
[0133]在一些實(shí)施方案中，相比與重組培養(yǎng)物相同條件下培養(yǎng)時(shí)的對(duì)照培養(yǎng)物的生產(chǎn)力，所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的脂肪酸衍生物生產(chǎn)力為至少約3倍大、約5倍大、約8倍大，或約10倍大。所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的脂肪酸衍生物生產(chǎn)力的實(shí)例包括約700mg/L/小時(shí)至約3000mg/L/小時(shí)。通常，滴度和生產(chǎn)力具有正相關(guān)關(guān)系。
[0134]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物培養(yǎng)在包含碳源的培養(yǎng)基中。合適的碳源包括但不限于單糖(例如，葡萄糖)、二糖(例如，蔗糖)、低聚糖、多糖(例如，纖維素或淀粉)、纖維素物質(zhì)和生物質(zhì)。
[0135]在任何前述實(shí)施方案的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中，編碼酮脂酰-ACP合酶蛋白的核苷酸序列的實(shí)例包括但不限于，編碼3-氧?；鵢[?；?載體-蛋白]合酶I蛋白(酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)EC2.3.1.41)或3-氧?；?[?；?載體-蛋白]合酶II蛋白(酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)EC2.3.1.179)的序列。在利用3-氧?；鵢[酰基_載體-蛋白]合酶I蛋白的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述合酶蛋白ORFa編碼來(lái)自大腸桿菌fabB的3-氧?；?[酰基-載體-蛋白]合酶I蛋白，其具有SEQ ID NO:2所示的序列，并且變體合酶蛋白ORFa編碼的3-氧?；?[酰基-載體-蛋白]合酶I蛋白與大腸桿菌fabB蛋白(SEQ ID NO: 2)具有至少約70%、約75%、約80%、約85%，優(yōu)選約90%或約95%或更大的序列同一性。在利用3-氧酰基-[?；?載體-蛋白]合酶II蛋白的優(yōu)選實(shí)施方案中，合酶蛋白ORFa編碼來(lái)自大腸桿菌fabF的3-氧?；?[?；?載體-蛋白]合酶II蛋白，其具有SEQ ID N0:4所示的序列，并且變體合酶蛋白ORFa編碼的3-氧?；鵢[酰基-載體-蛋白]合酶II蛋白與大腸桿菌fabF蛋白(SEQ ID NO: 4)具有至少約70%、約75%、約80%、約85%、優(yōu)選約90%或約95%或更大的序列同一性。另外，例如，可以從通過(guò)NCa隨機(jī)化產(chǎn)生的文庫(kù)提供5’非編碼多核苷酸序列變體(NCa變體)。當(dāng)相比起始非編碼多核苷酸序列(例如，NCa)時(shí)，非編碼多核苷酸序列變體(例如，變體NCa)通常具有0%的百分比序列同一性至〈100%的百分比序列同一性。
[0136]在任何前述實(shí)施方案的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中，編碼硫酯酶的核苷酸序列的實(shí)例包括但不限于，編碼硫酯酶蛋白(酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)EC3.1.1.5*EC3.1.2.-)的序列。在利用硫酷酶蛋白的優(yōu)選實(shí)施方案中，硫酷酶蛋白ORFb編碼來(lái)自大腸桿囷tesA的硫酷酶蛋白，其具有 SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO: 17 或 SEQ ID NO: 19 所示的序列，并且 ORFb變體編碼的硫酯酶蛋白與大腸桿菌tesA蛋白(分別為SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:8、SEQ IDNO: 17或SEQ ID NO: 19)具有至少約70%、約75%、約80%、約85%，優(yōu)選約90%或約95%或更大的序列同一性。另外，例如，可以從通過(guò)NCb的隨機(jī)化產(chǎn)生的文庫(kù)提供5’非編碼多核苷酸序列變體(NCb變體)。當(dāng)相比起始非編碼多核苷酸序列(例如，NCb)時(shí)，非編碼多核苷酸序列變體(例如，NCb變體)通常具有0%的百分比序列同一性至〈100%的百分比序列同一性。
[0137]本發(fā)明培養(yǎng)物的重組宿主細(xì)胞還可以包含一個(gè)或多個(gè)編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC6.2.1.3或ECl.2.1.42的羧酸還原酶蛋白的核苷酸序列，以及可操作地連接的調(diào)控序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，所述羧酸還原酶蛋白為與恥垢分枝桿菌carB脂肪酸還原酶蛋白(SEQ ID NO: 10)具有至少約70%、約75%、約80%、約85%，優(yōu)選約90%或約95%或更大序列同一性的蛋白。在其他實(shí)施方案中，所述羧酸還原酶蛋白為與以下蛋白具有至少約70%、約75%、約80%、約85%，優(yōu)選約90%或約95%或更大序列同一性的蛋白:(i)結(jié)核分枝桿菌fadD9蛋白(SEQ ID NO: 21 ;也參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第20100105963號(hào))，或(ii)恥垢分枝桿菌carA蛋白(SEQ ID NO:23 ;也參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)第20100105963號(hào))。
[0138]另外，本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞還可以包含一個(gè)或多個(gè)編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為ECl.1.-.-、EC1.1.1.1或ECl.2.1.10的醇脫氫酶蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地連接的調(diào)控序列。此類(lèi)醇脫氫酶蛋白的實(shí)例包括但不限于，大腸桿菌AdhE(醛-醇脫氫酶蛋白)或大腸桿菌yqhD(醇脫氫酶蛋白)。
[0139]在本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中，所述高滴度的脂肪酸衍生物可以為具有選自以下脂肪鏈長(zhǎng)度之間的脂肪鏈長(zhǎng)度的高滴度脂肪酸衍生物:c8、c1(l、c12、c14、c16、c18、c2(l，以及它們的組合。所述高滴度的脂肪酸衍生物可以為，例如，具有脂肪鏈長(zhǎng)度C8的高滴度的脂肪醇、具有脂肪鏈長(zhǎng)度Cltl的高滴度的脂肪醇、具有脂肪鏈長(zhǎng)度C12的高滴度的脂肪醇、具有脂肪鏈長(zhǎng)度C14的高滴度的脂肪醇、具有脂肪鏈長(zhǎng)度C16的高滴度的脂肪醇、具有脂肪鏈長(zhǎng)度C18的高滴度的脂肪醇、具有脂肪鏈長(zhǎng)度C2tl的高滴度的脂肪醇，以及它們的組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)選定的脂肪鏈長(zhǎng)度的比率(CX/CY)被用于定征脂肪鏈長(zhǎng)度。CX/CY比率為具有脂肪鏈長(zhǎng)度Cx的脂肪酸衍生物的滴度與具有脂肪鏈長(zhǎng)度Cy的脂肪酸衍生物的滴度的比率。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，CX/CY具有約1.5至約6的值，其中X和Y為整數(shù)值，并且X小于Y。在本發(fā)明的其他實(shí)施方案中，CX/CY具有至少約2的值，其中X和Y為整數(shù)值，并且X小于Y。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，C1ZC1具有約2至約4的值，其中X和Y為整數(shù)值，并且X 小于 Y。X 和 Y 值的實(shí)例包括但不限于:X=8, Y=IO ；Χ=12, Υ=14 ；Χ=14, Υ=16 ;及 Χ=18, Υ=20。根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的教導(dǎo)，X和Y值的其他組合對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
[0140]本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及提供所需飽和度的脂肪鏈的脂肪酸衍生物(例如，脂肪醇)。在該方面，如上所述的重組宿主細(xì)胞還包含一個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列，其含有編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-或4.2.1.60的β _羥?；?ACP脫水酶蛋白的開(kāi)放閱讀框，以及可操作地連接的促進(jìn)在重組宿主細(xì)胞中表達(dá)該蛋白的調(diào)控序列。在所述重組宿主細(xì)胞中，相對(duì)于編碼β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的相應(yīng)野生型基因，所述開(kāi)放閱讀框編碼序列和/或調(diào)控序列被修改。相對(duì)于從相應(yīng)宿主細(xì)胞的野生型基因表達(dá)的羥?；?ACP脫水酶蛋白的活性，所述重組宿主細(xì)胞的β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的活性被改良。
[0141]在一些實(shí)施方案中，所述改良的活性不同于在與重組宿主細(xì)胞種類(lèi)相同的宿主細(xì)胞中通過(guò)表達(dá)起始多核苷酸序列(SPS。)產(chǎn)生的β-羥?；?ACP脫水酶蛋白的活性，所述SPS。包含編碼β-羥?；?ACP脫水酶蛋白的開(kāi)放閱讀框多核苷酸序列(0RF。)以及5’非編碼多核苷酸序列(NC。)，所述0RF。具有5’和3’端，所述NC。包含鄰近所述ORFf端的可操作地連接的調(diào)控序列。所述重組宿主細(xì)胞通常包含一個(gè)或多個(gè)編碼羥酰基-ACP脫水酶蛋白的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，包括分別與所述0RF。或所述NC。具有小于100%序列同一性的0RF。變體和/或NCe變體。
[0142]在一些實(shí)施方案中，所述0RF。編碼來(lái)自大腸桿菌fabZ的(3R)-羥基肉豆蘧酰?；d體蛋白脫水酶蛋白，其具有SEQ ID NO: 14所示的序列，并且所述ORFc變體編碼的(3R)-羥基肉豆蘧酰?；?載體蛋白脫水酶蛋白與大腸桿菌fabZ蛋白(SEQ ID NO: 14)具有至少約70%、約75%、約80%、約85%、優(yōu)選約90%或約95%或更大的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，所述0RF。編碼來(lái)自大腸桿菌fabA的β -羥基癸?；蝓ッ撍?異構(gòu)酶蛋白，其具有SEQ ID Ν0:12所示的序列，并且所述0RF。變體編碼的β-羥基癸?；蝓ッ撍?異構(gòu)酶蛋白與大腸桿菌fabA蛋白(SEQ ID NO: 12)具有至少約70%、約75%、約80%、約85%，優(yōu)選約90%或約95%或更大的序列同一性。
[0143]另外，例如，可以從通過(guò)NCe的隨機(jī)化產(chǎn)生的文庫(kù)提供5’非編碼多核苷酸序列變體(NC。變體)。當(dāng)相比起始非編碼多核苷酸序列(例如，NC。)時(shí)，非編碼多核苷酸序列變體(例如，變體NCc)通常具有0%的百分比序列同一性至〈100%的百分比序列同一性。
[0144]在一個(gè)實(shí)施方案中，具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物還具有優(yōu)選的百分比飽和度。例如，具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物包含飽和的和不飽和的脂肪鏈，并且至少約90%的目標(biāo)脂肪酸衍生物具有飽和脂肪鏈。根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以挑選所需百分比飽和度的目標(biāo)脂肪酸衍生物。
[0145]本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，其產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物。所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物包含重組宿主細(xì)胞。所述重組宿主細(xì)胞經(jīng)改造用于產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物。所述重組宿主細(xì)胞通常具有酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-或4.2.1.60的β -羥酰基-ACP脫水酶蛋白的改良的活性。所述改良的活性不同于在與重組宿主細(xì)胞種類(lèi)相同的宿主細(xì)胞中通過(guò)表達(dá)起始多核苷酸序列(SPSd)產(chǎn)生的β_羥酰基-ACP脫水酶蛋白的活性，所述SPSd包含編碼β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的開(kāi)放閱讀框多核苷酸序列(ORFd)以及5’非編碼多核苷酸序列(NCd)，所述ORFd具有5’和3’端，所述NCd包含鄰近所述0RFd5’端的可操作地連接的調(diào)控序列。所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)編碼β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的SPSd變體以及可操作地連接的調(diào)控序列，包括分別與所述ORFd或所述NCd具有小于100%序列同一性的ORFd變體和/或NCd變體。相比與表達(dá)SPSd的重組宿主細(xì)胞種類(lèi)相同的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的脂肪酸衍生物組合物，所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物包含更高滴度的、具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物。所述起始多核苷酸序列可以為，例如，編碼羥?；?ACP脫水酶蛋白的野生型基因。
[0146]在一些實(shí)施方案中，所述ORFd編碼來(lái)自大腸桿菌fabZ的(3R)-羥基肉豆蘧酰酰基載體蛋白脫水酶蛋白，其具有SEQ ID NO: 14所示的序列，并且所述ORFd變體編碼的(3R)-羥基肉豆蘧酰?；d體蛋白脫水酶蛋白與大腸桿菌fabZ蛋白(SEQ ID NO: 14)具有至少約70%、約75%、約80%、約85%、優(yōu)選約90%或約95%或更大的序列同一性。在一些實(shí)施方案中，所述ORFd編碼來(lái)自大腸桿菌fabA的β -羥基癸?；蝓ッ撍?異構(gòu)酶蛋白，其具有SEQ ID Ν0:12所示的序列，并且所述ORFd變體編碼的β-羥基癸酰基硫酯脫水酶/異構(gòu)酶蛋白與大腸桿菌fabA蛋白(SEQ ID NO: 12)具有至少約70%、約75%、約80%、約85%、優(yōu)選約90%或約95%或更大的序列同一性。
[0147]另外，例如，可以從通過(guò)NCd的隨機(jī)化產(chǎn)生的文庫(kù)提供5’非編碼多核苷酸序列變體(NCd變體)。當(dāng)相比起始非編碼多核苷酸序列(例如，NCd)時(shí)，非編碼多核苷酸序列變體(例如，NCd變體)通常具有0%的百分比序列同一性至〈100%的百分比序列同一性。
[0148]本發(fā)明的該第三方面的重組宿主細(xì)胞還可以包含如本文所述的其他元件，例如，延伸β -酮脂酰-ACP合酶基因、酰基-ACP水解酶基因、羧酸還原酶基因、醇脫氫酶基因等。
[0149]本發(fā)明的第四方面涉及重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物，其產(chǎn)生具有優(yōu)選的百分比飽和度的脂肪酸衍生物組合物。所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物包含重組宿主細(xì)胞，其經(jīng)改造用于產(chǎn)生具有優(yōu)選的百分比飽和度的脂肪酸衍生物組合物。所述重組宿主細(xì)胞包含缺少異構(gòu)酶活性且酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-的β_羥酰基-ACP脫水酶蛋白的改良的活性。所述改良的活性不同于在與重組宿主細(xì)胞種類(lèi)相同的宿主細(xì)胞中通過(guò)表達(dá)起始多核苷酸序列(SSPe)產(chǎn)生的缺少異構(gòu)酶活性的β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的活性，所述SSPe包含編碼缺少異構(gòu)酶活性的β_羥?；?ACP脫水酶蛋白的開(kāi)放閱讀框多核苷酸序列(ORFe)以及5’非編碼多核苷酸序列(NCe)，所述ORFe具有5’和3’端，所述NCe包含鄰近所述0RFE5’端的可操作地連接的調(diào)控序列。所述重組宿主細(xì)胞包含一個(gè)或多個(gè)編碼缺少異構(gòu)酶活性的β_羥?；?ACP脫水酶蛋白的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，包括分別與所述ORFe或所述NCe具有小于100%序列同一性的ORFe變體和/或NCe變體。相比與表達(dá)所述SPSe的重組宿主細(xì)胞種類(lèi)相同的宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的脂肪酸衍生物組合物，所述重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的具有優(yōu)選的百分比飽和度的脂肪酸衍生物組合物包含更高滴度的、具有優(yōu)選的百分比飽和度的脂肪酸衍生物。所述起始多核苷酸序列可以為，例如，編碼缺少異構(gòu)酶活性的羥?；?ACP脫水酶蛋白的野生型基因。
[0150]在一些實(shí)施方案中，所述ORFe編碼來(lái)自大腸桿菌fabZ的(3R)-羥基肉豆蘧酰酰基載體蛋白脫水酶蛋白，其具有SEQ ID NO: 14所示序列，并且所述ORFe變體編碼的(3R)-羥基肉豆蘧酰?；d體蛋白脫水酶蛋白與大腸桿菌fabZ蛋白(SEQ ID N0:14)具有至少約70%、約75%、約80%、約85%、優(yōu)選約90%或約95%或更大的序列同一性。
[0151]另外，例如，可以從通過(guò)NCe的隨機(jī)化產(chǎn)生的文庫(kù)提供5’非編碼多核苷酸序列變體(NCe變體)。當(dāng)相比起始非編碼多核苷酸序列(例如，NCe)時(shí)，非編碼多核苷酸序列變體(例如，NCe變體)通常具有0%的百分比序列同一性至〈100%的百分比序列同一性。
[0152]本發(fā)明的該第四方面的重組宿主細(xì)胞還可以包含如本文所述的其他元件，例如，延伸β -酮脂酰-ACP合酶基因、?；?ACP水解酶基因、羧酸還原酶基因、醇脫氫酶基因等。
[0153]在本文所述的重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物中，所述重組宿主細(xì)胞可以為哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞、真菌細(xì)胞、藻細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述重組宿主細(xì)胞為微生物(例如，細(xì)菌或真菌)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述重組宿主細(xì)胞為細(xì)菌。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)菌為大腸桿菌。[0154]在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述“脂肪酸衍生物”為脂肪醇。
[0155]在本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞和培養(yǎng)物的一些實(shí)施方案中，所述可操作地連接的調(diào)控序列可以賦予可操作地連接的開(kāi)放閱讀框的組成型表達(dá)或可調(diào)控表達(dá)；引起由開(kāi)放閱讀框編碼的蛋白的組成型或可調(diào)控表達(dá)。例如，可以通過(guò)組成型啟動(dòng)子，或通過(guò)可誘導(dǎo)的/可抑制的啟動(dòng)子介導(dǎo)宿主細(xì)胞的蛋白表達(dá)?？烧T導(dǎo)/可抑制啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于以下:大腸桿菌Iac操縱子啟動(dòng)子以及GAL4-可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其中Iac操縱子的誘導(dǎo)物如IPTG (異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)或異乳糖(天然誘導(dǎo)物)結(jié)合Iac阻遏物，其不再能作用于啟動(dòng)子，并且啟動(dòng)子控制下的基因轉(zhuǎn)錄物被去抑制。
[0156]所述一個(gè)或多個(gè)包含編碼蛋白的開(kāi)放閱讀框以及可操作地連接的調(diào)控序列的多核苷酸序列，可以整合到重組宿主細(xì)胞的染色體中、整合到位于重組宿主細(xì)胞中的一個(gè)或多個(gè)質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)中，或兩者。在實(shí)施例中，質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)通常被用來(lái)闡述本發(fā)明的實(shí)施方案。
[0157]本發(fā)明培養(yǎng)物的重組宿主細(xì)胞的實(shí)施方案還可以包含一個(gè)或多個(gè)編碼一種或多種其他蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地連接的調(diào)控序列。此類(lèi)其他蛋白的實(shí)例包括但不限于，乙酰-Cok乙酰轉(zhuǎn)移酶；β -羥基丁酰-Cok脫氫酶；巴豆酸酶丁酰-Cok脫氫酶；和輔酶A-?；┟摎涿?。此類(lèi)其他蛋白可以表達(dá)于重組宿主細(xì)胞中，以促進(jìn)從底物?；?ACPs產(chǎn)生特定脂肪酸衍生物(參見(jiàn)，例如，圖2和表1)。
[0158]表1
[0159]
【權(quán)利要求】
1.一種重組微生物培養(yǎng)物，其產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物，所述重組微生物培養(yǎng)物包含重組微生物: 所述重組微生物經(jīng)改造用于產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物，所述重組微生物包含: 酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-或4.2.1.60的β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的改良的活性，其中(i)所述改良的活性不同于在與所述重組微生物種類(lèi)相同的微生物中由起始多核苷酸序列(SPSd)表達(dá)產(chǎn)生的β_羥?；?ACP脫水酶蛋白的活性，所述SPSd包含編碼所述羥?；?ACP脫水酶蛋白的開(kāi)放閱讀框多核苷酸序列(ORFd)以及5’非編碼多核苷酸序列(NCd)，所述ORFd具有5’和3’端，所述NCd包含鄰近所述0RFD5’端的可操作地連接的調(diào)控序列；并且(ii)所述重組微生物包含編碼所述羥酰基-ACP脫水酶蛋白的所述SPSd的一個(gè)或多個(gè)變體以及可操作地連接的調(diào)控序列，包括分別與所述ORFd或所述NCd具有小于100%序列同一性的ORFd變體和/或NCd變體； 其中，相比由與表達(dá)所述SPSd的所述重組微生物種類(lèi)相同的微生物培養(yǎng)物產(chǎn)生的脂肪酸衍生物組合物，由所述重組微生物培養(yǎng)物產(chǎn)生的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物包含更高滴度的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物。
2.如權(quán)利要求1所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中編碼所述羥?；?ACP脫水酶蛋白的ORFd編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-的蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述ORFd編碼具有SEQID NO: 14所示序列的大腸桿菌fabZ來(lái)源的(3R)-羥基肉豆蘧酰?；d體蛋白脫水酶蛋白，并且所述ORFd變體編碼與所述大腸桿菌fabZ蛋白(SEQ ID NO: 14)具有至少約90%序列同一性的(3R)-羥基肉豆蘧酰?；d體蛋白脫水酶蛋白。
4.如權(quán)利要求2所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中編碼所述β-羥?；?ACP脫水酶蛋白的ORFd編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.60的蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述ORFd編碼具有SEQID NO: 12所示序列的大腸桿菌fabA來(lái)源的β -羥基癸?；蝓ッ撍?異構(gòu)酶蛋白，并且所述ORFd變體編碼與大腸桿菌fabA蛋白(SEQ ID NO: 12)具有至少約90%序列同一性的β-羥基癸?；蝓ッ撍?異構(gòu)酶蛋白。
6.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述NCd變體獲自所述NCd隨機(jī)化產(chǎn)生的文庫(kù)。
7.—種重組微生物培養(yǎng)物，其產(chǎn)生具有優(yōu)選的百分比飽和度的脂肪酸衍生物組合物，所述重組微生物培養(yǎng)物包含重組微生物: 所述重組微生物經(jīng)改造用于產(chǎn)生具有優(yōu)選的百分比飽和度的脂肪酸衍生物組合物，所述重組微生物包含: 缺少異構(gòu)酶活性且酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-的β_羥?；?ACP脫水酶蛋白的改良的活性，其中(i)所述改良的活性不同于在與所述重組微生物種類(lèi)相同的微生物中由起始多核苷酸序列(SSPe)表達(dá)產(chǎn)生的、缺少異構(gòu)酶活性的β_羥?；?ACP脫水酶蛋白的活性，所述SSPe包含編碼缺少異構(gòu)酶活性的所述β_羥酰基-ACP脫水酶蛋白(FabA/Z)的開(kāi)放閱讀框多核苷酸序列(ORFe)以及5’非編碼多核苷酸序列(NCe)，所述ORFe具有5’和3’端，所述NCe包含鄰近所述0RFe5’端的可操作地連接的調(diào)控序列；并且(ii)所述重組微生物包含一個(gè)或多個(gè)編碼缺少異構(gòu)酶活性的所述β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，包括分別與所述ORFe或所述NCe具有小于100%序列同一性的ORFe變體和/或NCe變體； 其中，相比由與所述重組微生物種類(lèi)相同的、表達(dá)所述SPSe的微生物培養(yǎng)物產(chǎn)生的脂肪酸衍生物組合物，由所述重組微生物培養(yǎng)物產(chǎn)生的具有優(yōu)選的百分比飽和度的脂肪酸衍生物組合物包含更高滴度的具有優(yōu)選的百分比飽和度的脂肪酸衍生物。
8.如權(quán)利要求7所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述01^^編碼具有SEQID NO: 14所示序列的大腸桿菌fabZ來(lái)源的(3R)-羥基肉豆蘧酰?；d體蛋白脫水酶蛋白，并且所述ORFe變體編碼與大腸桿菌fabZ蛋白(SEQ ID NO: 14)具有至少約90%序列同一性的(3R)-羥基肉豆蘧酰?；d體蛋白脫水酶蛋白。
9.如權(quán)利要求7或8所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述NCe變體獲自所述NCe隨機(jī)化產(chǎn)生的文庫(kù)。
10.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述重組微生物還包含一個(gè)或多個(gè)含有編碼延伸β -酮脂酰-ACP合酶蛋白的開(kāi)放閱讀框的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，所述蛋白的酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC2.3.1.-。
11.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物,其中所述重組微生物還包含一個(gè)或多個(gè)含有編碼硫酯酶的開(kāi)放閱讀框的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，所述蛋白的酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC3.1.1.5*EC3.1.2.-。
12.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述重組微生物還包含一個(gè)或多個(gè)含有編碼羧酸還原酶蛋白的開(kāi)放閱讀框的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，所述蛋白的酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC6.2.1.3或ECl.2.1.42。
13.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，還包含一個(gè)或多個(gè)含有編碼其他蛋白的開(kāi)放閱讀框的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，所述其他蛋白選自:乙酰-Cok乙酰轉(zhuǎn)移酶；β -羥基丁酰-Cok脫氫酶；巴豆酸酶丁酰-Cok脫氫酶；及輔酶A-?；┟摎涿浮?br> 14.如前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述重組微生物為細(xì)菌。
15.如權(quán)利要求14所述的重組微生物培養(yǎng)物,其中所述細(xì)菌為大腸桿菌(Escherichiacoli)。
16.一種重組微生物培養(yǎng)物，其產(chǎn)生高滴度的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物，所述重組微生物培養(yǎng)物包含重組微生物: 所述重組微生物經(jīng)改造用于產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物，所述重組微生物包含: 酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC2.3.1.-的延伸酮脂酰-ACP合酶蛋白的改良的活性，其中(i)所述改良的活性不同于在與所述重組微生物種類(lèi)相同的微生物中由起始多核苷酸序列(SPSa)表達(dá)產(chǎn)生的酮脂酰-ACP合酶蛋白的活性，所述SPSa包含編碼延伸β -酮脂酰-ACP合酶蛋白的開(kāi)放閱讀框多核苷酸序列(ORFa)以及5’非編碼多核苷酸序列(NCa)，所述ORFa具有5’和3’端，所述NCa包含鄰近所述0RFa5’端的可操作地連接的調(diào)控序列；并且(ii)所述重組微生物包含一個(gè)或多個(gè)編碼β_酮脂酰-ACP合酶蛋白的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，包括分別與所述ORFa或所述NCa具有小于100%序列同一性的ORFa變體和/或NCa變體；和 酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC3.1.1.5或EC3.1.2.-的硫酯酶的改良的活性，其中(i)所述改良的活性不同于在與所述重組微生物種類(lèi)相同的微生物中由起始多核苷酸序列(SPSb)表達(dá)產(chǎn)生的硫酯酶的活性，所述SPSb包含編碼所述硫酯酶的開(kāi)放閱讀框多核苷酸序列(ORFb)以及5’非編碼多核苷酸序列(NCb)，所述ORFb具有5’和3’端，所述NCb包含鄰近所述0RFB5’端的可操作地連接的調(diào)控序列；并且(ii)所述重組微生物包含一個(gè)或多個(gè)編碼所述硫酯酶的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，包括分別與所述ORFb或所述NCb具有小于100%序列同一'I"生的ORFb變體和/或NCb變體； 其中所述重組微生物培養(yǎng)物產(chǎn)生具有約30g/L至約250g/L的高滴度的脂肪酸衍生物組合物，其中所述組合物具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度。
17.如權(quán)利要求16所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述重組微生物還包含: 酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-或4.2.1.60的β -羥?；?ACP脫水酶蛋白的改良的活性，其中(i)所述改良的活性不同于在與所述重組微生物種類(lèi)相同的微生物中由起始多核苷酸序列(SPS。)表達(dá)產(chǎn)生的β_羥酰基-ACP脫水酶蛋白的活性，所述SPS。包含編碼所述羥酰基-ACP脫水酶蛋白的開(kāi)放閱讀框多核苷酸序列(0RF。)以及5’非編碼多核苷酸序列(NC。)，所述0RF。具有5’和3’端，所述NC。包含鄰近所述0RF#’端的可操作地連接的調(diào)控序列；并且(ii)所述重組微生物包含一個(gè)或多個(gè)編碼所述羥酰基-ACP脫水酶蛋白的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，包括分別與所述0RF?；蛩鯪C。具有小于100%序列同一'I"生的0RF。變體和/或Ne。變體。
18.如權(quán)利要求17所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物還具有優(yōu)選 的百分比飽和度。
19.如權(quán)利要求18所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物包含飽和及不飽和脂肪鏈，并且至少約90%的所述目標(biāo)脂肪酸衍生物具有飽和脂肪鏈。
20.如權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述編碼β-羥?；?ACP脫水酶蛋白的0RF。編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-的蛋白。
21.如權(quán)利要求20所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述0RF。編碼具有SEQID NO: 14所示序列的大腸桿菌fabZ來(lái)源的(3R)-羥基肉豆蘧酰?；d體蛋白脫水酶蛋白，并且所述ORFc變體編碼與所述大腸桿菌fabZ蛋白(SEQ ID NO: 14)具有至少約90%序列同一性的(3R)-羥基肉豆蘧酰?；d體蛋白脫水酶蛋白。
22.如權(quán)利要求20所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述編碼β-羥?；?ACP脫水酶蛋白的0RF。編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.60的蛋白。
23.如權(quán)利要求22所述重組微生物培養(yǎng)物，其中所述0RF。編碼具有SEQID NO: 12所示序列的大腸桿菌fabA來(lái)源的β -羥基癸?；蝓ッ撍?異構(gòu)酶蛋白，并且所述0RF。變體編碼與大腸桿菌fabA蛋白(SEQ ID NO: 12)具有至少約90%序列同一性的β-羥基癸?；蝓ッ撍?異構(gòu)酶蛋白。
24.如權(quán)利要求17-23中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述NCe變體獲自所述NCc隨機(jī)化產(chǎn)生的文庫(kù)。
25.如權(quán)利要求16-24中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物為具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪醇組合物。
26.如權(quán)利要求16-25中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述重組微生物培養(yǎng)物以10%至40%產(chǎn)率產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物。
27.權(quán)利要求16-26中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述重組微生物培養(yǎng)物特征為700mg/L/小時(shí)至3000mg/L/小時(shí)的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的所述脂肪酸衍生物組合物的生產(chǎn)力。
28.如權(quán)利要求16-27中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述編碼β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的ORFa編碼選自以下的蛋白:酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC2.3.1.41的3-氧?；?[?；?載體-蛋白]合酶I蛋白，及酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC2.3.1.179的3-氧?；?[?；?載體-蛋白]合酶II蛋白。
29.如權(quán)利要求28所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述ORFa編碼具有SEQID NO: 2所示序列的大腸桿菌fabB來(lái)源的3-氧?；?[?；?載體-蛋白]合酶I蛋白，并且所述ORFa變體編碼與大腸桿菌fabB蛋白(SEQ ID NO: 2)具有至少約90%序列同一性的3-氧?；?[?；?載體-蛋白]合酶I蛋白。
30.如權(quán)利要求28所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述ORFa編碼具有SEQID NO:4所示序列的大腸桿菌fabF來(lái)源的3-氧?；鵢[?；?載體-蛋白]合酶II蛋白，并且所述ORFa變體編碼與所述大腸桿菌fabF蛋白(SEQ ID NO: 4)具有至少約90%序列同一性的3-氧酰基-[酰基-載體-蛋白]合酶II蛋白。
31.如權(quán)利要求16-30中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述變體NCa獲自所述NCa隨機(jī)化產(chǎn)生的文庫(kù)。
32.如權(quán)利要求16-31中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述編碼硫酯酶的ORFb編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC3.1.1.5或EC3.1.2.-的tesA蛋白。
33.如權(quán)利要求32所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述ORFb編碼具有SEQID NO: 6所示序列的大腸桿菌tesA來(lái)源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFb變體編碼與所述大腸桿菌tesA蛋白(SEQ ID NO:6)具有至少約90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
34.如權(quán)利要求32所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述ORFb編碼具有SEQID NO: 8所示序列的大腸桿菌tesA來(lái)源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFb變體編碼與所述大腸桿菌tesA蛋白(SEQ ID NO:8)具有至少約90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
35.如權(quán)利要求32所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述01^^編碼具有SEQID NO: 17所示序列的大腸桿菌tesA來(lái)源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFb變體編碼與所述大腸桿菌tesA蛋白(SEQ ID NO: 17)具有至少約90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
36.如權(quán)利要求32所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述01^^編碼具有SEQID NO: 19所示序列的大腸桿菌tesA來(lái)源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFb變體編碼與所述大腸桿菌tesA蛋白(SEQ ID NO: 19)具有至少約90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
37.如權(quán)利要求16-36中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述NCb變體獲自所述NCb隨機(jī)化產(chǎn)生的文庫(kù)。
38.如權(quán)利要求16-37中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述重組微生物還包含一個(gè)或多個(gè)編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC6.2.1.3或ECl.2.1.42的羧酸還原酶蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地連接的調(diào)控序列。
39.如權(quán)利要求38所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述羧酸還原酶蛋白與選自以下的羧酸還原酶蛋白具有至少約90%的序列同一性:恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis) carB 蛋白(SEQ ID NO: 10)、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)fadD9 蛋白(SEQ ID N0:21)和恥垢分枝桿菌 carA 蛋白(SEQ ID NO:23) ?
40.如任何前述權(quán)利要求所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述重組微生物還包含一個(gè)或多個(gè)編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為ECl.1.-._、EC1.1.1.1或ECl.2.1.10的醇脫氫酶蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地連接的調(diào)控序列。
41.如權(quán)利要求16-40中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度選自以下長(zhǎng)度之間的脂肪鏈長(zhǎng)度:C8、C10, C12, C14, C16, C18, C20及其組合。
42.如權(quán)利要求16-40中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中兩個(gè)選定的脂肪鏈長(zhǎng)度的比率(CX/CY)被用來(lái)定征所述脂肪酸衍生物的脂肪鏈長(zhǎng)度和所述目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度，所述比率為具有脂肪鏈長(zhǎng)度Cx的所述脂肪酸衍生物的滴度與具有脂肪鏈長(zhǎng)度Cy的所述脂肪酸衍生物的滴度的比率,其中X和Y為整數(shù)值,并且X小于Y。
43.如權(quán)利要求42所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中CX/CY的值為2至4。
44.如權(quán)利要求42或43所述的重組微生物，其中X和Y選自:X=8,Y=IO ；X=12, Y=14 ；Χ=14, Υ=16 ;及父=18，丫=20。
45.如權(quán)利要求16-44中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述重組微生物為細(xì)菌。
46.如權(quán)利要求16-45中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，其中所述細(xì)菌為大腸桿菌。
47.如權(quán)利要求16-46中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)編碼一個(gè)或多個(gè)其他蛋白的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，所述其他蛋白選自:乙酰-Cok乙酰轉(zhuǎn)移酶；β -羥基丁酰-Cok脫氫酶；巴豆酸酶丁酰-Cok脫氫酶；及輔酶A-?；┟摎涿浮?br> 48.制備重組微生物的方法，所述重組微生物產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物，所述方法包括選自步驟(A)、步驟(B)和步驟(C)中的兩個(gè)步驟，其中所述兩個(gè)步驟為不相同的步驟，并且所述兩個(gè)步驟以任何順序進(jìn)行，以產(chǎn)生所述重組微生物: 步驟㈧包括: 利用起始多核苷酸序列(SPSa)制備重組微生物起始組，所述SPSa包含開(kāi)放閱讀框(ORFa)以及5’非編碼多核苷酸序列(NCa)，所述ORFa具有5’和3’端，所述NCa包含鄰近所述0RFa5’端的可操作地連接的調(diào)控序列，每個(gè)重組微生物包含一個(gè)或多個(gè)所述SPSa的變體，其中(i)所述ORFa編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC2.3.1.-的延伸β -酮脂酰-ACP合酶蛋白，并且(ii)每個(gè)SPSa變體包括分別與所述ORFa或所述NCa具有小于100%序列同一性的ORFa變體和/或NCa變體； 在碳源存在下培養(yǎng)來(lái)自所述重組微生物組的克隆； 篩選所述克隆，以測(cè)定每個(gè)克隆產(chǎn)生的脂肪酸衍生物的脂肪鏈長(zhǎng)度和脂肪酸衍生物的滴度，其中存在產(chǎn)生最大滴度的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物的克隆；和 從所述重組微生物組挑選克隆，選定的克隆以小于所述最大滴度的滴度產(chǎn)生具有長(zhǎng)于目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物，其中所述選定的克隆包含SPSa變體(SPSva)，其包括 ORFa 變體( ORFva)和 / 或 NCa 變體(NCva)；條件為:(i)如果所述方法中步驟㈧在步驟⑶后，則步驟㈧的所述起始組的每個(gè)重組微生物還包含SPSvb，或者(ii)如果所述方法中步驟㈧在步驟(C)后，則步驟㈧的所述起始組的每個(gè)重組微生物還包含SPStc ； 步驟⑶包括: 利用起始多核苷酸序列(SPSb)制備重組微生物起始組，所述SPSb包含開(kāi)放閱讀框(ORFb)以及5’非編碼多核苷酸序列(NCb)，所述ORFb具有5’和3’端，所述NCb包含鄰近所述0RFb5’端的可操作地連接的調(diào)控序列，每個(gè)重組微生物包含一個(gè)或多個(gè)所述SPSb的變體，其中(i)所述ORFb編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC3.1.1.5或EC3.1.2.-的硫酯酶，并且(ii)每個(gè)SPSb變體包括分別與所述ORFb或所述NCb具有小于100%序列同一性的ORFb變體和/或NCb變體； 在碳源存在下培養(yǎng)來(lái)自所述重組微生物組的克隆； 篩選所述克隆，以測(cè)定每個(gè)克隆產(chǎn)生的脂肪酸衍生物的脂肪鏈長(zhǎng)度和脂肪酸衍生物的滴度，其中存在產(chǎn)生最大滴度的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物的克?。缓? 從所述重組微生物組挑選克隆，選定的克隆以近似等于所述最大滴度的滴度產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物，其中所述選定的克隆包含SPSb變體(SPSvb)，其包括ORFb變體(ORFvb)和/或NCb變體(NCvb)； 條件為:(i)如果所述方法中步驟⑶在步驟㈧后，則步驟⑶的所述起始組的每個(gè)重組微生物還包含SPSva，或者(ii)如果所述方法中步驟⑶在步驟(C)后，則步驟⑶的所述起始組的每個(gè)重組微生物還包含SPSto ;并且步驟(C)包括: 利用起始多核苷酸序列(SPS。)制備重組微生物起始組，所述SPS。包含開(kāi)放閱讀框(ORFc)以及5’非編碼多核苷酸序列(NC。)，所述0RF。具有5’和3’端，所述NCe包含鄰近所述0RFC5’端的可操作地連接的調(diào)控序列，每個(gè)重組微生物包含所述SPS。的一個(gè)或多個(gè)變體，其中(i)所述0RF。編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-或4.2.1.60的β -羥酰基-ACP脫水酶蛋白，并且(ii)每個(gè)SPS。變體包括分別與所述0RF?；蛩鯪Ce具有小于100%序列同一性的0RF。變體和/或NCe變體； 在碳源存在下培養(yǎng)來(lái)自所述重組微生物組的克??； 篩選所述克隆，以測(cè)定每個(gè)克隆的所述脂肪酸衍生物的脂肪鏈長(zhǎng)度、所述脂肪酸衍生物的脂肪鏈百分比飽和度以及所述脂肪酸衍生物的滴度，其中存在產(chǎn)生最大滴度的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度和優(yōu)選的百分飽和度的脂肪酸衍生物的克??；和 從所述重組微生物組挑選克隆，選定的克隆以近似等于所述最大滴度的滴度產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度和優(yōu)選的百分飽和度的脂肪酸衍生物，其中所述選定的克隆包含SPS。變體(SPSvc)，其包括 0RF。變體(ORFve)和 / 或 NCe 變體(NCvc)； 條件為:(i)如果所述方法中步驟(C)在步驟㈧后，則步驟(C)的所述起始組的每個(gè)重組微生物還包含SPSva，或者(ii)如果所述方法中步驟(C)在步驟⑶后，則步驟(C)的所述起始組的每個(gè)重組微生物還包含SPSvb。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中兩個(gè)選定的脂肪鏈長(zhǎng)度的比率(CX/CY)被用來(lái)定征所述脂肪酸衍生物的脂肪鏈長(zhǎng)度和所述目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度，所述比率為具有脂肪鏈長(zhǎng)度Cx的脂肪酸衍生物的滴度與具有脂肪鏈長(zhǎng)度Cy的脂肪酸衍生物的滴度的比率，其中X和Y為整數(shù)值，并且X小于Y。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度CX/CY比率的值為至少約2。
51.如權(quán)利要求49或50所述的方法，其中所述目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度CX/CY比率的值為2至4。
52.如權(quán)利要求49-51中任一項(xiàng)所述的方法，其中X和Y選自:X=8，Y=IO；X=12, Y=14 ；Χ=14, Υ=16 ;及父=18，丫=20。
53.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度選自以下長(zhǎng)度之間的脂肪鏈長(zhǎng)度:C8、C10, C12, C14, C16, C18, C20 及其組合。
54.如權(quán)利要求48-53中任一項(xiàng)所述的方法，其中Z=A、B或C的NCvz變體獲自所述NCvz隨機(jī)化產(chǎn)生的文庫(kù)。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其中所述隨機(jī)化為啟動(dòng)子序列的隨機(jī)化。
56.如權(quán)利要求54或55所述的方法，其中所述隨機(jī)化為翻譯控制序列的隨機(jī)化。
57.如權(quán)利要求48-56中任一項(xiàng)所述的方法，其中Z=A、B或C的ORFvz變體通過(guò)ORFvz誘變獲得。
58.如權(quán)利要求48-57中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括步驟(B)和其后的步驟 (A)0
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述方法包括步驟(B)和其后的步驟(A)以及隨后的步驟(B)。
60.如權(quán)利要求59所述的方法，其中所述方法包括步驟(B)和其后的步驟(A)和隨后的步驟⑶以及隨后的步驟(C)。
61.如權(quán)利要求48-57中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法包括步驟(B)和其后的步驟(C)。
62.如權(quán)利要求48-61中任一項(xiàng)所述的方法，其中在碳源存在下培養(yǎng)所述重組微生物，產(chǎn)生具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物且所述組合物的滴度為30g/L至250g/L。
63.如權(quán)利要求48-62中任一項(xiàng)所述的方法，其中在碳源存在下培養(yǎng)所述重組微生物，產(chǎn)生10%至40%產(chǎn)率的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的所述脂肪酸衍生物組合物。
64.如權(quán)利要求48-63中任一項(xiàng)所述的方法，其中在碳源存在下培養(yǎng)所述重組微生物，提供700mg/L/小時(shí)至3000mg/L/小時(shí)生產(chǎn)力的具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的所述脂肪酸衍生物組合物。
65.權(quán)利要求48-64中任一項(xiàng)所述的方法，其中具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的所述脂肪酸衍生物組合物還具有優(yōu)選的百分比飽和度。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述優(yōu)選的百分飽和度為至少約90%。
67.如權(quán)利要求48-66中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪酸衍生物組合物，為具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的脂肪醇組合物。
68.如權(quán)利要求48-67中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述編碼β-酮脂酰-ACP合酶蛋白的ORFa編碼選自以下的蛋白:酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC2.3.1.41的3-氧酰基-[?；?載體-蛋白]合酶I蛋白，和酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC2.3.1.179的3-氧?；?[?；?載體-蛋白]合酶II蛋白。
69.如權(quán)利要求68所述的方法，其中所述ORFa編碼具有SEQID Ν0:2所示序列的大腸桿菌fabB來(lái)源的3-氧酰基-[?；?載體-蛋白]合酶I蛋白，并且所述ORFa變體編碼與所述大腸桿菌fabB蛋白(SEQ ID NO: 2)具有至少約90%序列同一性的3-氧?；?[酰基-載體-蛋白]合酶I蛋白。
70.如權(quán)利要求68所述的方法，其中所述ORFa編碼具有SEQID N0:4所示序列的大腸桿菌fabF來(lái)源的3-氧酰基-[?；?載體-蛋白]合酶II蛋白，并且所述ORFa變體編碼與所述大腸桿菌fabF蛋白(SEQ ID NO:4)具有至少約90%序列同一性的3-氧酰基-[?；?載體-蛋白]合酶II蛋白。
71.如權(quán)利要求48-70中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述ORFb是酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC3.1.1.5或EC3.1.2.-的硫酯酶蛋白。
72.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述ORFb編碼具有SEQID N0:6所示序列的大腸桿菌tesA來(lái)源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFb變體編碼與所述大腸桿菌tesA蛋白(SEQ IDNO:6)具有至少約90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
73.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述ORFb編碼具有SEQID N0:8所示序列的大腸桿菌tesA來(lái)源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFb變體編碼與所述大腸桿菌tesA蛋白(SEQ IDNO: 8)具有至少約90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
74.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述ORFb編碼具有SEQID NO: 17所示序列的大腸桿菌tesA來(lái)源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFb變體編碼與所述大腸桿菌tesA蛋白(SEQ IDNO: 17)具有至少約90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
75.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述ORFb編碼具有SEQID NO: 19所示序列的大腸桿菌tesA來(lái)源的硫酯酶蛋白，并且所述ORFb變體編碼與所述大腸桿菌tesA蛋白(SEQ IDNO: 19)具有至少約90%序列同一性的硫酯酶蛋白。
76.如權(quán)利要求48-75中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述編碼β-羥?；?ACP脫水酶蛋白的0RF。編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.-的蛋白。
77.如權(quán)利要求76所述的方法，其中所述0RF。編碼具有SEQID NO: 14所示序列的大腸桿菌fabZ來(lái)源的(3R)-羥基肉豆蘧酰酰基載體蛋白脫水酶蛋白，并且所述0RF。變體編碼與所述大腸桿菌fabZ蛋白(SEQ ID NO: 14)具有至少約90%序列同一性的(3R)-羥基肉豆蘧酰?；d體蛋白脫水酶蛋白。
78.如權(quán)利要求76所述的方法，其中所述編碼β-羥?；?ACP脫水酶蛋白的0RF。編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC4.2.1.60的蛋白。
79.如權(quán)利要求78所述的方法，其中所述0RF。編碼具有SEQID NO: 12所示序列的大腸桿菌fabA來(lái)源的β -羥基癸酰基硫酯脫水酶/異構(gòu)酶蛋白，并且所述0RF。變體編碼與大腸桿菌fabA蛋白(SEQ ID NO: 12)具有至少約90%序列同一性的β -羥基癸?；蝓ッ撍?異構(gòu)酶蛋白。
80.如權(quán)利要求48-79中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組微生物還包含一個(gè)或多個(gè)編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為EC6.2.1.3或ECl.2.1.42的羧酸還原酶蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地連接的調(diào)控序列。
81.如權(quán)利要求80所述的方法，其中所述羧酸還原酶蛋白與選自以下的羧酸還原酶蛋白具有至少約90%的序列同一性:恥垢分枝桿菌carB蛋白(SEQ ID NO: 10)、結(jié)核分枝桿菌fadD9 蛋白(SEQ ID N0:21)和恥垢分枝桿菌 carA 蛋白(SEQ ID NO:23) ?
82.如權(quán)利要求48-81中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組微生物還包含一個(gè)或多個(gè)編碼酶學(xué)委員會(huì)編號(hào)為ECl.1._、EC1.1.1.1或ECl.2.1.10的醇脫氫酶蛋白的多核苷酸序列，以及可操作地連接的調(diào)控序列。
83.如權(quán)利要求48-82中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組微生物還包含一個(gè)或多個(gè)編碼一個(gè)或多個(gè)其他蛋白的多核苷酸序列以及可操作地連接的調(diào)控序列，所述其他蛋白選自:乙酰-Cok乙酰轉(zhuǎn)移酶；β -羥基丁酰-Cok脫氫酶；巴豆酸酶丁酰-Cok脫氫酶；及輔酶A-酰化醛脫氫酶。
84.如權(quán)利要求48-83中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述重組微生物為細(xì)菌。
85.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述細(xì)菌為大腸桿菌。
86.通過(guò)權(quán)利要求48-85中任一項(xiàng)所述的方法制備的重組微生物。
87.制備具有目標(biāo)脂肪鏈長(zhǎng)度的肪酸衍生物組合物的方法，包括在碳源存在下培養(yǎng)權(quán)利要求1-47中任一項(xiàng)所述的重組微生物培養(yǎng)物，或在碳源存在下培養(yǎng)權(quán)利要求86所述的重組微生物。
88.如權(quán)利要求87所述的方法，其中所述培養(yǎng)包括發(fā)酵。
【文檔編號(hào)】C12N9/16GK103842502SQ201280048631
【公開(kāi)日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年8月17日 優(yōu)先權(quán)日:2011年8月3日
【發(fā)明者】艾利·S·格羅班, 維克蘭斯·阿爾拉加達(dá), 斯科特·A·弗賴克曼, 德里克·L·格林菲爾德, 胡志浩 申請(qǐng)人:Ls9公司