本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體地涉及一株解磷菌根真菌及其在促進藍莓生長中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

藍莓又稱越橘，杜鵑花科越橘屬植物，是具有較高經(jīng)濟價值和廣闊開發(fā)前景的新興果樹。藍莓由于獨特的風(fēng)味及營養(yǎng)保健價值，被譽為“第三代水果和人類五大健康保健食品之一”。近年來，在我國山東、江蘇和遼寧等地開始了大面積的栽培生產(chǎn)，已成為最具發(fā)展?jié)摿Φ墓麡錁浞N之一。隨著栽培面積的擴大，藍莓苗的需求也日益增加。而藍莓同其它杜鵑花科植物一樣，為淺根系植物，沒有大的主根，根系纖細且不發(fā)達，對土壤中有機質(zhì)含量和酸堿度要求的苛刻。因此，如何加強藍莓植株健康快速生長已成為目前影響藍莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的因素之一。

菌根是生物界中一類備受關(guān)注的互惠共生體。植物可為菌根真菌提供碳素化合物和一些有機物以保證菌根真菌生存發(fā)展，而菌根真菌利用其龐大根外菌絲將土壤中豐富的礦質(zhì)營養(yǎng)傳遞宿主植物。杜鵑花科植物在自然狀態(tài)下普遍有菌根真菌共生，以促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。研究證實，將杜鵑花類植物根系上篩選出的有益菌根真菌進行回接，可以大大促進宿主植物生長。

磷是植物生長所必需的礦質(zhì)元素之一。磷在土壤中主要以無機磷化合物和有機磷化合物兩種形態(tài)存在，其中無機磷的含量約占全磷含量的50％以上，主要是以礦物形式存在無效磷，所以土壤中可溶性磷的含量很低。提高磷的利用率一直是科學(xué)工作者研究的熱點課題之一。

土壤中存在許多具有解磷特性的微生物，它們可以將植物難以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可吸收利用的形式，改善植物磷素營養(yǎng)，還能促進土壤中有益微生物的代謝活動。具有解磷能力的微生物包括細菌、真菌和放線菌。目前，關(guān)于根際土壤中解磷細菌的研究已有較多積累。相比之下，而對于解磷真菌的報道較少。解磷真菌的溶磷能力一般要強于細菌，且遺傳性狀更加穩(wěn)定，在微生物肥料應(yīng)用方面具有極大潛力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問題在于提供一株具有解磷能力的菌根真菌wr1；將其回接藍莓組培苗和實生苗，均表現(xiàn)出顯著促生效應(yīng)。因此，本發(fā)明的菌根真菌wr1能為開發(fā)微生物菌肥提供優(yōu)良的菌株資源，并具有良好的應(yīng)用開發(fā)前景。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實現(xiàn)的:

一株解磷菌根真菌wr1，其分類學(xué)名為minutisphaeraaspera，已在中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，其保藏號為cgmccno.13884。

本發(fā)明提供一種包含上述真菌wr1的促藍莓生長劑。

本發(fā)明還提供上述真菌wr1在促藍莓生長中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種所述解磷菌根真菌wr1接種劑的制備方法，從pda平板上打取3塊直徑為5mm的真菌wr1菌塊，接種到分裝后的pda培養(yǎng)液中，28℃震蕩培養(yǎng)15-20天，轉(zhuǎn)速為180rpm；所述分裝后的pda培養(yǎng)液制備：pda培養(yǎng)液分裝到容器中，放入玻璃球，并高壓滅菌。

附圖說明

圖1wr1菌株的解磷量；

圖2wr1菌株的解磷率；

圖3wr1菌株發(fā)酵液可溶性磷含量的動態(tài)變化；

圖4wr1菌株發(fā)酵液ph的動態(tài)變化；

圖5wr1菌落的形態(tài)，a，菌落正面；b，菌落反面；

圖6wr1的菌絲；

圖7接種wr1對藍莓組培苗生長的影響；a、對照組，b、接種wr1組；

圖8wr1侵入藍莓根的皮層細胞：箭頭所指為wr1在細胞內(nèi)形成的菌絲團；

圖9接種wr1對藍莓實生苗地上部分干重的影響。

菌株保藏信息：菌株為wr1，其分類命名為minutisphaeraaspera；該菌株保藏于2017年4月11日中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏編號為：cgmccno.13884。

具體實施方式

下面通過實施例來對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步解釋，但本發(fā)明的技術(shù)方案不受實施例任何形式上的限制。

實施例1

藍莓根部解磷內(nèi)生真菌的分離、純化和篩選，步驟如下：

1、在大興安嶺地區(qū)采集帶土樣的野生藍莓根系，用清水洗凈藍莓根段，然后將其轉(zhuǎn)移至超凈工作臺中進行如下操作：將根段浸泡在10％(質(zhì)量比)雙氧水中8min，期間用無菌鑷子輕輕翻動幾次，以保證消毒徹底；無菌水漂洗2-3次后，將其轉(zhuǎn)入6％(質(zhì)量比)次氯酸鈉，浸泡15分鐘，無菌水漂洗2次；濾紙吸干根段表面殘留的液體。將消毒后的根段用無菌的剪刀剪成0.5cm長的根段，接入制備好的pda平板，于25-30℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)。pda平板的配方：0.6％馬鈴薯浸粉，2％葡萄糖，2％瓊脂，ph5.6。115℃滅菌20分鐘，冷卻至60℃時，加入無菌的氨芐青霉素(50ug/ml)和硫酸鏈霉素(100ug/ml)。上述各成份濃度均為pda培養(yǎng)基中的終濃度。

2、當(dāng)發(fā)現(xiàn)組織切口處有真菌長出來的時候，盡快用接種針將其挑入不加青霉素和鏈霉素的pda平板中，25-30℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置進行純化培養(yǎng)，轉(zhuǎn)移3-5次后得到純菌落。

3、將純化后的內(nèi)生真菌分別接種于無機磷固體培養(yǎng)基上，25-30℃恒溫培養(yǎng)10天，測定菌落直徑(d)和溶磷圈直徑(d)，并計算比值(d/d)。無機磷固體培養(yǎng)基的配方：葡萄糖10g；ca3(po4)25g；mgso4·7h2o0.25g；mgcl2·6h2o5g；kcl0.2g；(nh4)2so40.1g；雙篜水定容1l后調(diào)節(jié)ph6.5-7.5，加入瓊脂16g，115℃滅菌20min。

實施例2

wr1菌株的解磷能力測試，步驟如下：

1、檢測菌株wr1對無機磷和有機磷的降解情況。經(jīng)上述初篩，得到一菌株，命名為wr1，其d/d為1.02。在超凈工作臺上，用打孔器打取5mm的wr1菌塊分別接種至裝有100ml無機磷和有機磷液體培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶規(guī)格是250ml，28℃，180rpm震蕩培養(yǎng)。以接種無菌的pda培養(yǎng)基塊為對照，所有處理均設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)7天后，過濾掉菌絲，采用鉬銻抗比色法測定上清液中od值，并計算上清液中的有效磷含量和解磷率。其中，解磷率(％)＝(接菌可溶性磷含量－對照可溶性磷含量)/加入磷酸鹽的量×100。無機磷酸鹽液體培養(yǎng)基有三種，其中1號培養(yǎng)基成分包括：葡萄糖10g、ca3(po4)25g、mgso4·7h2o0.25g、mgcl2·6h2o5g、kcl0.2g、(nh4)2so40.5g、雙篜水定容1l后調(diào)節(jié)ph6.5-7.5；2號培養(yǎng)基用磷酸鋁(alpo4)代替1號中的ca3(po4)2，其它成分和含量相同；3號培養(yǎng)基用磷酸鐵(fepo4·4h2o)代替1號中的ca3(po4)2，其它成分和含量相同。有機磷培養(yǎng)基成分包括：葡萄糖10g，(nh4)2so40.5g，mgso4·7h2o0.3g，kcl0.3g，feso4·7h2o0.03g，mnso4·7h2o0.03g，植酸鈣5g，蒸餾水1000ml，ph7.2。結(jié)果顯示，菌株wr1對磷酸三鈣、磷酸鋁、磷酸鐵及植酸鈣均有溶解，其中對磷酸三鈣的溶解效果最好(圖1和圖2)。

2、wr1菌株解磷能力的動態(tài)變化。選擇wr1菌株最敏感的磷酸鈣作為磷源，檢測其解磷能力的動態(tài)變化。從選擇pda平板上取2個直徑5mm的wr1菌塊接入50mlpda液體培養(yǎng)基，28℃搖瓶震蕩4-5天制成種子液，按10％體積比例接入裝有200ml上述1號無機磷酸鹽液體培養(yǎng)液的500ml三角瓶中，放置于28℃震蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為180rpm。以接種無菌的pda培養(yǎng)液為對照，所有處理均設(shè)3次重復(fù)。自培養(yǎng)第二天起每隔12h測一次發(fā)酵液的ph值及發(fā)酵液中可溶磷的含量，測至120小時。每個時間點直接用ph計測定發(fā)酵液，并采用上述鉬銻抗比色法測定發(fā)酵液中可溶性磷的含量。結(jié)果顯示，發(fā)酵液中的可溶性磷含量從24hr開始增加，持續(xù)到96hr達到最高1600mg/l，之后出現(xiàn)稍微下降趨勢(圖3)；發(fā)酵液的ph值與解磷量基本呈負相關(guān)，0-24hr變化不大，之后出現(xiàn)明顯下降趨勢，96hr時最低4.34(圖4)。

實施例3

菌株wr1的形態(tài)和分子生物學(xué)鑒定，步驟如下：

1、挑取上述保存的純化菌種，接種到pda平板中，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化1-2周。用直徑為0.5cm的無菌打孔器從菌落的最外層打取菌餅，接種到新的pda平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周，觀察菌落的形態(tài)。圖5示菌落呈灰白色，絨毛狀，菌絲致密，菌落的中間凸起，有放射狀的裂痕，菌落背面呈暗黃色。

2、用接種針挑取少量純化后的單菌落菌絲，將其放入滴有一滴生理鹽水的載玻片上制成臨時裝片，并在顯微鏡下觀察內(nèi)生真菌的菌絲結(jié)構(gòu)。圖6示菌絲曲直不一，有隔，不能產(chǎn)生孢子。

3、對菌種進行分子生物學(xué)鑒定。采用全式金的plantgenomicdnakit試劑盒提取培養(yǎng)菌絲的基因組dna，擴增引物是its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′。pcr反應(yīng)體系(25μl)包括：2.5μl10×pcr緩沖液(含mg2+)，2μldntp(2.5mmeach)，1.5μlits1(10μm)，1.5μlits4(10μm)，0.2μltaq酶，2μl基因組dna，15.3μlddh2o，。擴增反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3min，循環(huán)1次；94℃變性1min，51℃退火1min，72℃延伸1min，35次循環(huán)；最后72℃延伸10min。pcr擴增產(chǎn)物寄至北京六合華大基因科技有限公司進行測序。將獲得的rdna基因間內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列，即its序列(internallytranscribedspacer)，與美國國立生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(ncbi，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的序列進行blastn比對，與阿斯佩拉微球菌minutisphaeraaspera(no.kp309990.1)最為相似，最大相似度達97％。該菌株編號為wr1，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定為一株minutisphaeraaspera，已在中國普通微生物菌種保藏管理中心(chinageneralmicrobiologicalculturecollectioncenter,cgmcc)保藏，其保藏號為13884。

測序結(jié)果：

agttgttcgagcggccccaggcatcgccaggtggccgcttagacatcaacaccctctgtatatataccgcgttgctttggcgggacggcagccagcagccccgctgggaagctgtccgtagggcctgtccaagggccccgcgagcgcccgccagagaaccgtcaaactcatgttaaaccgtggtgtctgagctttacaagcaaataagttaaaactttcaacaacggatctcttggttctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgcgaagtaatgtgaattgcagtattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcatattgcgccccttggtattccgaggggcatgccttttcgagcgtcattacaaccgtcaagctctgcttggtactgggcctccgtccccacgccggcgggcctctaagtcatcagcggctgagagaacggcgttctagcgtagtagaaattaactcggcagggaccggcctcgggcagctgtcaaacccgcgcctctgcgcccatcttaggttgacctcggataaggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaaa。

實施例4

菌株wr1對藍莓組培苗的接種效應(yīng)分析，步驟如下：

1、藍莓苗的培養(yǎng)

(1)藍莓芽分化

選取生長狀態(tài)良好，株高4-5cm的藍莓組培苗進行快速繁殖。在超凈工作臺中用無菌的剪刀將組培瓶中的藍莓植株從基部剪斷，剪成2-3cm的莖段，然后用無菌的鑷子將其接到含有分化培養(yǎng)基的組培瓶中，每瓶中接入3-4個莖段，均勻分散放置。所用的培養(yǎng)基是以wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，在每升wpm培養(yǎng)基中均添加蔗糖20g、瓊脂5-10g，添加植物激素玉米素1.0-3.0mg，培養(yǎng)基ph5.0-5.5，培養(yǎng)容器裝量10-30％，121℃高壓滅菌20min。培養(yǎng)條件設(shè)置為23-25℃，2000-3000lx的光強，光照時間8-16h/天，培養(yǎng)時間40-60天。

(2)藍莓生根培養(yǎng)

在超凈工作臺中，選取高5-6cm生長狀態(tài)良好的藍莓組培苗進行生根培養(yǎng)。用無菌的剪刀從藍莓組培苗的基部剪斷，然后用無菌的鑷子將剪斷的植株插入帶有濾紙球的生根培養(yǎng)基中，植株插的深度以植株底部剛浸入培養(yǎng)基為宜，每瓶液體培養(yǎng)基中接入6-10株藍莓苗。所用培養(yǎng)基為1/2wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，然后加入蔗糖20g，吲哚丁酸1-2.5mg，定容到1升，調(diào)培養(yǎng)基的ph為5.0-5.5。將配好的液體培養(yǎng)基倒入裝有濾紙球的組培瓶中，培養(yǎng)容器裝量10-30％(體積比)，121℃高壓滅菌20min。濾紙球以鋪滿組培瓶的底部以便于固定藍莓幼苗。培養(yǎng)條件設(shè)置為23-25℃，2000-3000lx的光強，光照時間8-16h/天，培養(yǎng)時間40-60天。

2、wr1接種劑的制備

配制將pda液體培養(yǎng)基，分裝到1l三角瓶中，每瓶分裝100-200ml，并放入10-20個玻璃球，121℃高壓滅菌20min。將冷凍保藏的試管斜面上的菌株wr1活化后接入上述分裝后的pda液體培養(yǎng)基中，種子菌種接種量為培養(yǎng)容器裝量的10-20％(體積比)。培養(yǎng)液培養(yǎng)條件為28℃，震蕩培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180rpm，培養(yǎng)時間為15天。從pda平板上打取3塊直徑為5mm的wr1菌塊，接種到分裝后的pda培養(yǎng)液中，28℃震蕩培養(yǎng)15-20天，轉(zhuǎn)速為180rpm。所述分裝后的pda培養(yǎng)液制備：pda培養(yǎng)液分裝到500ml三角瓶中，每瓶分裝100-200ml，并放入10-20個玻璃球，121℃高壓滅菌20min。

3、wr1促進藍莓組培苗生長

(1)共培養(yǎng)基質(zhì)的準(zhǔn)備

先將干苔蘚剪短，用清水洗凈，在蒸餾水中浸泡過夜，讓其充分吸水，再分裝到組培瓶中，容器裝量為15％-25％(體積比)，121℃高壓滅菌30min，備用。

(2)菌株wr1與藍莓組培苗共培養(yǎng)

將生根藍莓苗用無菌的鑷子接入上述制備共培養(yǎng)基質(zhì)中，再用移液槍加入4-6ml上述制備的dse接種劑。吸取前，需要將dse接種劑晃動混勻。移液槍頭前端需剪掉2-3mm，并滅菌后才能使用。接種后，放至25℃，2000-3000lx的光強，光照時間8-16h/天條件下進行共培養(yǎng)60天后，觀察接種菌株對藍莓苗生長的影響。

結(jié)果顯示，wr1對藍莓組培苗根、莖、葉生長均有明顯促生效應(yīng)(圖7)。取部分根段，檢測wr1真菌在藍莓組培苗根部的定植情況。將根段放入提前配制好的faa固定液中固定12小時，沖洗后脫色。所述的脫色方法為經(jīng)過10％(質(zhì)量體積比)koh透明、10％(質(zhì)量比)h2o2漂白、1％(質(zhì)量比)hcl酸化、0.05％(質(zhì)量體積比)臺盼藍染色和50％(體積比)甘油脫色。隨機選取藍莓根段，在顯微鏡下鏡檢觀察。圖8示在藍莓根的皮層細胞中可看到菌絲，表明wr1可侵入宿主植物根內(nèi)。此外，取接種的藍莓苗的根樣，從中只分離得到與接種劑相同的菌株，進一步證明上述接菌的藍莓苗所表現(xiàn)出的生長優(yōu)勢是dse真菌在藍莓根部定植引起的。

實施例6菌株wr1對藍莓實生苗的接種效應(yīng)分析

wr1對藍莓實生苗的接種效應(yīng)分析，具體步驟如下：

1、wr1與藍莓幼苗共培養(yǎng)

將原土與草炭土(1:1v/v)混合，121℃滅菌3hr，加入硫磺調(diào)節(jié)ph值為5.2后，分裝到經(jīng)75％酒精消毒的塑料營養(yǎng)缽中，營養(yǎng)缽直徑為10cm，高為9cm。將1年生藍莓幼苗，移栽至上述營養(yǎng)缽中，預(yù)培養(yǎng)2周。選取長勢一致的藍莓苗(株高為20±1cm)進行接種效應(yīng)分析。設(shè)置接菌實例組和對照組，每組各36盆。接菌實例組：每盆倒入20ml菌液，wr1接種劑的制備同實施例4；對照組：未加菌液。藍莓苗放置在玻璃溫室中培養(yǎng)，條件均為18-25℃，自然光照，環(huán)境濕度為60％-80％，常規(guī)管理。分別在接種后0天、30天、60天、90天時測定藍莓苗株高、葉片數(shù)，地上部分干重。在每個時間點，接菌實例組和對照組各取9盆，3個重復(fù)(3盆/重復(fù))。結(jié)果顯示，接菌實例組的藍莓苗株高高于對照組，葉片數(shù)和地上部分的干重顯著高于對照組(表1，圖9)。

表1接種wr1對藍莓實生苗生長的影響

由此可見本發(fā)明菌株wr1對藍莓具有促生長作用，可以制備成包含所述菌株的藍莓生長劑，用于實際藍莓種植。

sequencelisting

<110>魯東大學(xué)

<120>一株解磷菌根真菌及其在促進藍莓生長中的應(yīng)用

<130>無

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>578

<212>dna

<213>minutisphaeraaspera

<400>1

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