干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基，特別涉及一種干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞培養(yǎng)在干細(xì)胞凍存中廣泛應(yīng)用。在傳統(tǒng)培養(yǎng)過程中通常需要添加一定量的胎 牛血清，血清中含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的生長(zhǎng)因子、激素、載體蛋白、貼壁因子、微量元素以及其 他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)。但是，在規(guī)?；a(chǎn)和實(shí)際應(yīng)用中，血清的添加存在如下 缺點(diǎn)：
[0003] 1)血清易受病毒、支原體或其他病原體的污染；
[0004] 2)不同批次的血清之間的質(zhì)量差異造成最終產(chǎn)品批次間的質(zhì)量差異；
[0005] 3)大量血清的存在增加生產(chǎn)后期純化的難度，增加工藝流程、提高生產(chǎn)成本，回收 率降低；
[0006] 4)部分血清成分難以徹底去除，嚴(yán)重影響最終產(chǎn)品質(zhì)量，具有安全隱患。
[0007] 為了克服血清添加帶來的上述缺陷，自上世紀(jì)八十年代起許多科研單位或生物醫(yī) 藥公司就相繼開發(fā)出了若干無血清培養(yǎng)基，如Sigma公司旗下JRH公司生產(chǎn)的Excell系列 無血清培養(yǎng)基，Invitrogen公司旗下Gibco公司生產(chǎn)的VP-AGT系列無血清培養(yǎng)基等等。但 是，上述無血清培養(yǎng)基未針對(duì)不同細(xì)胞進(jìn)行分化，用于干細(xì)胞培養(yǎng)仍存在一些問題，如干細(xì) 胞易發(fā)生分化、干細(xì)胞的純度及干性低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，采用本發(fā)明的干細(xì)胞無血清培養(yǎng) 基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，具有細(xì)胞周期短，增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞均一性好，純度高，有效的抑制干細(xì)胞 的分化和內(nèi)皮細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，保證干細(xì)胞的純度和干性，另外該培養(yǎng)基不含胎牛血清等 動(dòng)物源成分，通過該培養(yǎng)基獲得的干細(xì)胞適合于臨床應(yīng)用。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，由基 礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12,添加物包含：血清替代物2~15% (v/ v)、維生素 C 20~100ug/ml、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子0. 5~10ng/ml、人血小板源生長(zhǎng)因子5~ 20ng/ml、L-谷氨酰胺 1 ~5mmol/ml。
[0010] 在一些實(shí)施方式中，無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為 DMEM/F12,添加物包含：血清替代物5% (v/v)、維生素 C 50ug/ml、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子2ng/ml、 人血小板源生長(zhǎng)因子20ng/ml、L-谷氨酰胺2mmol/ml。
[0011] 在一些實(shí)施方式中，干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基用于培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0012] 本發(fā)明的有益效果為：
[0013] 人血小板源生長(zhǎng)因子（Platelet derived growth factor，F(xiàn)1DGF)是一個(gè)具有雙 鏈結(jié)構(gòu)的蛋白多肽，是血小板分泌的主要絲裂原，是一個(gè)極為重要的、隨血循環(huán)而行、作用 于間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)因子。它直接促進(jìn)正常細(xì)胞的增殖和分化。人血小板源生長(zhǎng)因子有 BB、AB、AA三種類型，本發(fā)明采用PDGF~BB。
[0014] 干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Stem Cell Growth Factors SCGF)是美國(guó) AgingOff Biotech，Inc.聯(lián)合哈弗大學(xué)、賓夕法尼亞大學(xué)、匹茲堡大學(xué)、麻省理工大學(xué)等機(jī)構(gòu)共同開放 的一種具有刺激自體內(nèi)源性干細(xì)胞生長(zhǎng)的高效蛋白質(zhì)、酶組合，也是體外培養(yǎng)干細(xì)胞必不 可少的各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子的組合，富含表皮生長(zhǎng)因子（EGF)、纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF)Ji 經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF)、血小板源性生長(zhǎng) 因子（PDGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF)等多重有效成分。
[0015] 血清替代物（Ultroser G)包含6類真核生物細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的物質(zhì)，包括生長(zhǎng)因 子、粘附因子、荷爾蒙、結(jié)合蛋白、維生素、微量礦物元素等，它的生物活性遠(yuǎn)高于血清。血清 替代物一般為液體形態(tài)。
[0016] 采用本發(fā)明的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，具有細(xì)胞周期短，增殖能力強(qiáng)， 細(xì)胞均一性好，純度高，有效的抑制干細(xì)胞的分化和內(nèi)皮細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，保證干細(xì)胞的純 度和干性，另外該培養(yǎng)基不含胎牛血清等動(dòng)物源成分，通過該培養(yǎng)基獲得的干細(xì)胞適合于 臨床應(yīng)用。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明的五個(gè)實(shí)驗(yàn)組中A組的細(xì)胞1 :3傳代后達(dá)80%融合度時(shí)的流式檢 測(cè)結(jié)果；
[0018] 圖2為本發(fā)明的五個(gè)實(shí)驗(yàn)組中A組中細(xì)胞培養(yǎng)首次達(dá)到80%融合度時(shí)的顯微鏡觀 察照片以及Pio代的顯微鏡觀察照片；
[0019] 圖3為本發(fā)明的五個(gè)實(shí)驗(yàn)組中B組的細(xì)胞1 :3傳代后達(dá)80%融合度時(shí)的流式檢 測(cè)結(jié)果；
[0020] 圖4為本發(fā)明的五個(gè)實(shí)驗(yàn)組中B組中細(xì)胞培養(yǎng)首次達(dá)到80%融合度時(shí)的顯微鏡觀 察照片以及Pio代的顯微鏡觀察照片；
[0021] 圖5為本發(fā)明的五個(gè)實(shí)驗(yàn)組中C組的細(xì)胞1 :3傳代后達(dá)80%融合度時(shí)的流式檢 測(cè)結(jié)果；
[0022] 圖6為本發(fā)明的五個(gè)實(shí)驗(yàn)組中C組中細(xì)胞培養(yǎng)首次達(dá)到80%融合度時(shí)的顯微鏡觀 察照片以及Pio代的顯微鏡觀察照片；
[0023] 圖7為本發(fā)明的五個(gè)實(shí)驗(yàn)組中D組的細(xì)胞1 :3傳代后達(dá)80%融合度時(shí)的流式檢 測(cè)結(jié)果；
[0024] 圖8為本發(fā)明的五個(gè)實(shí)驗(yàn)組中D組中細(xì)胞培養(yǎng)首次達(dá)到80%融合度時(shí)的顯微鏡觀 察照片以及Pio代的顯微鏡觀察照片；
[0025] 圖9為本發(fā)明的五個(gè)實(shí)驗(yàn)組中E組的細(xì)胞1 :3傳代后達(dá)80%融合度時(shí)的流式檢 測(cè)結(jié)果；
[0026] 圖10為本發(fā)明的五個(gè)實(shí)驗(yàn)組中E組中細(xì)胞培養(yǎng)首次達(dá)到80%融合度時(shí)的顯微鏡 觀察照片以及P8代的顯微鏡觀察照片。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面采用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0028] 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)的步驟如下：
[0029] 獲取脂肪組織：由專業(yè)的醫(yī)院或美容機(jī)構(gòu)通過腫脹法吸脂手術(shù)獲得患者腹部淺表 層的脂肪組織，其中，患者經(jīng)篩查合格，即HBV抗原、抗HCV抗體、抗HIV抗體、抗梅毒螺旋體 抗體、ALT、支原體檢測(cè)項(xiàng)目均為陰性。
[0030] 消化脂肪組織：采用生理鹽水洗滌脂肪組織，取IOml脂肪組織，加入等體積的 0. 4% (v/v)的P型膠原酶充分混勻，37°C 150rpm震蕩消化16min。
[0031] 離心收集：消化產(chǎn)物經(jīng)150目篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞初懸液，將細(xì)胞初懸液經(jīng)三次梯 度離心后，取離心得到的沉淀即脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0032] 細(xì)胞培養(yǎng)：將分離的單個(gè)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞接種于五組盛有不同培養(yǎng)基的六孔板 中，每組三個(gè)樣本，每個(gè)樣板接種1. 0 X IO5個(gè)細(xì)胞，然后置于37°C、飽和濕度、CO 2體積分?jǐn)?shù) 為5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
[0033] 換液：細(xì)胞培養(yǎng)24h后首次換液，每三天全量換液，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況；
[0034] 傳代培養(yǎng)：待細(xì)胞達(dá)到80%~90%融合度，倒掉培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基，用0. 9%的生 理鹽水洗滌細(xì)胞表面兩次，加入IOml的0.075%~0. 125% (m/v)的胰蛋白酶（購(gòu)自羅氏 公司Roch)，37°C消化1~3min后，顯微鏡下觀察到細(xì)胞開始變圓，加入適量培養(yǎng)液終止消 化，用移液管吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫落，將脫落的細(xì)胞和培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1200~ 1800rpm，離心6~8min，將離心所得的沉淀用無血清培養(yǎng)基重懸，按1 :3的比例接種進(jìn)行 傳代培養(yǎng)。
[0035] 檢測(cè)：對(duì)收集細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)。經(jīng)流式檢測(cè)：陽性指標(biāo)⑶73、⑶90、⑶105,陰性 指標(biāo) CD34、HLA-DR。
[0036] 五組實(shí)驗(yàn)中，A組、B組、C組、D組采用本發(fā)明的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，E組采用的 培養(yǎng)基為含15%胎牛血清的DMEM/F12。其中，A組、B組、C組、D組的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基 由DMEM/F12和添加物構(gòu)成，添加物含量如表1所示。
[0037] A組、本發(fā)明的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，由DMEM/F12和添加物構(gòu)成，添加物為：血清 替代物5% (v/v)、維生素 C 50ug/ml、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子2ng/ml、人血小板源生長(zhǎng)因子20ng/ ml，L-谷氨酰胺 2mmol/ml ;
[0038] B組、本發(fā)明的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，由DMEM/F12和添加物構(gòu)成，添加物為：血清 替代物15% (v/v)、維生素 C 100ug/ml、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子10ng/ml、人血小板源生長(zhǎng)因子 20ng/ml，L-谷氨酰胺為 5mmol/ml ;
[0039] C組、本發(fā)明的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，由DMEM/F12和添加物構(gòu)成，添加物為：血清 替代物2% (v/v)、維生素 C 20ug/ml、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子0. 5ng/ml、人血小板源生長(zhǎng)因子5ng/ ml，L-谷氨酰胺為lmmol/ml ;
[0040] D組、本發(fā)明的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，由DMEM/F12和添加物構(gòu)成，添加物為：血清 替代物8% (v/v)、維生素 C 80ug/ml、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子5ng/ml、人血小板源生長(zhǎng)因子IOng/ ml，L-谷氨酰胺為3mmol/ml ;
[0041] 表 1
[0042]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為 DMEM/F12,所述添加物包含：血清替代物2~15% (v/v)、維生素C 20~100ug/ml、干細(xì)胞 生長(zhǎng)因子〇? 5~10ng/ml、人血小板源生長(zhǎng)因子5~20ng/ml、L-谷氨酰胺1~5mmol/ml。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述無血清培養(yǎng)基由基 礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12,所述添加物包含：血清替代物5 % (v/v)、維生素C 50ug/ml、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子2ng/ml、人血小板源生長(zhǎng)因子20ng/ml、L-谷氨 酰胺 2mmol/ml。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，用于培養(yǎng)脂肪間充質(zhì) 干細(xì)胞。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12，添加物包含：血清替代物2～15％(v/v)、維生素C 20～100ug/ml、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子0.5～10ng/ml、人血小板源生長(zhǎng)因子5～20ng/ml、L-谷氨酰胺1～5mmol/ml。采用本發(fā)明的干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，具有細(xì)胞周期短，增殖能力強(qiáng)，細(xì)胞均一性好，純度高，有效的抑制干細(xì)胞的分化和內(nèi)皮細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，保證干細(xì)胞的純度和干性，另外該培養(yǎng)基不含胎牛血清等動(dòng)物源成分，通過該培養(yǎng)基獲得的干細(xì)胞適合于臨床應(yīng)用。
【IPC分類】C12N5-0775
【公開號(hào)】CN104805054
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510219207
【發(fā)明人】吳炯
【申請(qǐng)人】廈門中領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司
【公開日】2015年7月29日
【申請(qǐng)日】2015年4月30日