一種基于數(shù)字pcr精準定量分型檢測hpv16/18的試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子診斷生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于數(shù)字PCR精準定量分型 檢測HPV16/18的試劑盒及其檢測方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 人乳頭瘤病毒（human papillomavirus HPV)在人類感染中非常普遍，能侵犯人 類上皮細胞，引起皮膚和黏膜組織良性及惡性腫瘤。越來越多的證據(jù)表明，人類感染HPV 的后果與感染的HPV的分型密切相關(guān)，不同亞型具有特定的感染部位和病變，其中40多種 亞型與人類生殖道疾病有關(guān)。根據(jù)其危險度可分為高危型和低危型兩類。低危型HPV如 HPV-6、11、40、42、43、44、54、61、67等主要引起生殖道、肛周皮膚和陰道外生殖性濕疣類、扁 平濕疣類病變，引起惡性病變的概率較??；高危型HPV如HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、 52、56、58、59、68等主要導(dǎo)致高度鱗狀上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的發(fā)生。其中，即￥16/18的感染 率和致癌率都明顯高于其他高危型別，在我國不同區(qū)域的宮頸癌及宮頸高度病變都是以感 染HPV16/18為主，因此確定被感染的HPV型別對診斷和治療由其引發(fā)的疾病就顯得非常重 要。
[0004] HPV難以用細胞培養(yǎng)方式進行培養(yǎng)，目前雖然用血清學(xué)技術(shù)可以檢測HPV的特異 性抗體，對宮頸癌患者的診斷具有一定的實用價值，但該方法的特異性和靈敏度均不高，且 血清學(xué)實驗并不能區(qū)分近期和遠期感染；采用放射免疫技術(shù)檢測抗體可以提高靈敏度和特 異性，但操作繁瑣，不適用于大樣本的常規(guī)檢測。另外，電鏡檢查法雖然準確率很高，但費 時，需要特殊儀器設(shè)備，且陽性檢出率低?，F(xiàn)有宮頸癌的標準檢測方法是宮頸癌脫落細胞學(xué) 和組織活檢，但細胞學(xué)檢測不能對HPV感染的危險度進行分級。HPV的核酸檢測不僅可以直 接檢出HPV DNA的存在，而且可以對病原體的危險度進行分級；因此診斷HPV感染的主要實 驗技術(shù)是利用分子生物學(xué)方法檢測HPV的DNA。
[0005] 目前，HPV核酸檢測主要包括核酸雜交方法、基因芯片技術(shù)、熒光PCR技術(shù)等。其 中核酸雜交包括斑點雜交、Southern印跡雜交、原味雜交、雜交捕獲方法和分子導(dǎo)流雜交等 方法，但是這些方法由于雜交步驟較為繁瑣，在大樣本研究中耗時較長，易導(dǎo)致交叉雜交反 應(yīng)，存在著一定的缺陷?；蛐酒捎谄涑杀据^高，制作工藝復(fù)雜，而且信號檢測需要專門 的儀器設(shè)備，限制了其在臨床上的應(yīng)用。目前認為實時熒光定量PCR技術(shù)是檢測HPV DNA 以及分型的最好方法，該技術(shù)目前被公認為第二代定量PCR技術(shù)。但其定量需要參考標品、 標準曲線和內(nèi)標校正，對有限的標本材料以及低拷貝數(shù)HPV的準確定量仍存在一定的應(yīng)用 限制。
[0006] 數(shù)字PCR技術(shù)是近年興起的第三代PCR絕對定量技術(shù)，采用分析化學(xué)領(lǐng)域的微流 控或微滴化方法，將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成數(shù)萬個納升級的微滴，其中每個微滴或 不含待檢測核酸靶標分子，或者只含有一個至數(shù)個待檢測核酸靶標分子。經(jīng)過PCR擴增后， 對每個微滴的熒光信號進行逐個分析，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判 讀為0,根據(jù)泊松分布計算出樣品的原始濃度。與實時熒光定量PCR技術(shù)相比，數(shù)字PCR不 依賴于擴增曲線的閾值（CT)進行定量，不受擴增效率的影響，也不必采用看家基因和標準 曲線，具有很好的準確度和重現(xiàn)性，可以實現(xiàn)絕對定量分析。在現(xiàn)階段的低豐度因子檢測 中，實時熒光定量PCR技術(shù)都因受到背景DNA或雜質(zhì)的干擾，使得檢測靈敏度及精確性都達 不到精準定量的要求，而數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)通過微滴化處理，使得稀有檢測片段從大量的 復(fù)雜背景中分離出來，從而提高檢測的靈敏度和精確性。然而，目前并沒有基于數(shù)字PCR精 準定量分型檢測HPV16/18的試劑盒及其檢測方法。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于數(shù)字PCR精準定量 分型檢測HPV16/18的試劑盒，其中包括HPV16/18通用引物和各自特異的檢測探針。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供一種基于數(shù)字PCR精準定量分型檢測HPV16/18的檢測 方法，利用上述試劑盒中兩條不同的探針對HPV DNA模板進行檢測，根據(jù)熒光類型和熒光微 滴數(shù)對HPV16/18進行分型和絕對定量檢測。
[0010] 為了達到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種基于數(shù)字PCR精準定量 分型檢測HPV16/18的試劑盒，包括DNA提取液、數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液A、數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖 液B、HPV16病毒基因陽性質(zhì)控、HPV18病毒基因陽性質(zhì)控、陰性質(zhì)控和內(nèi)標溶液； 所述DNA提取液包括50 mM pH 8. 3的Tris-HCl、0. 5 M NaCl、5 mM EDTA、質(zhì)量濃度為 L 5% 的 CTAB 和 2 mM 的 DTT ; 所述數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液A包括HPV16型的引物及探針和HPV18型的引物及探針；所 述數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液B包括內(nèi)標的引物及探針；所述HPV16型、HPV18型和內(nèi)標的引物及 探針如下所示： HPV16型和HPV18型通用上游引物： AGATGKCTYTKTGGCKGCCTAGT ； HPV16型和HPV18型通用下游引物： ACATAffTCATCSGTRYTTACAAC ； HPV16 型探針：CCACTGTCTACTTGCCTCCTGTCCCA ; HPV18 型探針：ATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCT ; 內(nèi)標上游引物：CTGCCGTTACTGCCCTGTG ; 內(nèi)標下游引物：TTGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG ; 內(nèi)標探針：ACCACCAACTTCATCCACGTTCACC ; 所述HPV16型探針5'端熒光報告基因為FAM，HPV18型探針5'端熒光報告基團為VIC， 內(nèi)標探針5'端熒光報告基團為VIC，所有探針3'端淬滅基團均為BHQ ; 所述HPV16病毒基因陽性質(zhì)控為100 copies/ μ L的HPV16的標準質(zhì)粒液；所述HPV18 病毒基因陽性質(zhì)控為100 copies/ μ L的HPV18的標準質(zhì)粒液； 所述陰性質(zhì)控為滅菌生理鹽水； 所述內(nèi)標溶液為100 copies/yL的β-globin的標準質(zhì)粒液。
[0011] 一種基于數(shù)字PCR精準定量分型檢測HPV16/18的檢測方法，采用上述基于數(shù)字 PCR精準定量分型檢測HPV16/18的試劑盒進行檢測，具體檢測方法包括如下步驟： (1) 受檢樣品處理：將待測樣品用無菌生理鹽水洗滌并離心棄去上清液后，加入滅菌水 震蕩混勻，向震蕩混勻后的溶液中加入所述試劑盒中的DNA提取液和內(nèi)標溶液，劇烈震蕩 混勻，并于l〇〇°C恒溫處理10分鐘，再于12, 000 rpm/min離心5分鐘，取上清液，獲得PCR 擴增DNA模板； (2) 質(zhì)控品的處理：分別取所述試劑盒中的HPV16病毒基因陽性質(zhì)控、HPV18病毒基因 陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控，按照與步驟（1)相同的方法處理，得到相應(yīng)的DNA模板； (3 )配制數(shù)字PCR反應(yīng)混合液：向步驟（1)和步驟（2 )處理后得到的DNA模板中分別加 入滅菌水和所述試劑盒中的數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液，分別配制得到樣品、HPV16病毒基因陽性 質(zhì)控、HPV18病毒基因陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控的數(shù)字PCR反應(yīng)混合液；其中，陽性質(zhì)控和陰性 質(zhì)控的數(shù)字PCR反應(yīng)混合液均采用數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液A配制，樣品的數(shù)字PCR反應(yīng)混合 液分為兩種，分別由數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液A和數(shù)字PCR反應(yīng)緩沖液B配制； (4) 將步驟（3)制備的數(shù)字PCR混合液制作為油包水PCR微反應(yīng)液滴，生成的微反應(yīng)液 滴數(shù)量為10, 〇〇〇~20, 000個；然后對所述微反應(yīng)液滴進行PCR擴增反應(yīng)；其中，數(shù)字PCR擴 增反應(yīng)條件為：95°C變性5分鐘；95°C變性10秒，60°C延伸60秒，共進行30個循環(huán)；98°C 變性10分鐘，4 °C停止反應(yīng)； (5) 讀取熒光信號：步驟（4) PCR擴增后，將PCR反應(yīng)板放入熒光讀取儀器中，分別在 FAM和VIC通道中進行HPV16和HPV18分型檢測，通過儀器配套Quanta soft軟件進行定量 分析，計算出HPV16型和HPV18的拷貝數(shù)。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于： 1、本發(fā)明基于數(shù)字PCR平臺，對HPV進行絕對定量檢測，不依賴于擴增曲線的閾值（CT ) 進行定量，不受擴增效率的影響，也不必采用看家基因和標準曲線，具有很好的準確度和重 現(xiàn)性，可以實現(xiàn)HPV的絕對精準定量分析。
[0013] 2、本發(fā)明在HPV含量極低的組織樣品檢測中，對樣品溶液采用微滴化處理，數(shù)字 PCR檢測系