一種與肝癌術(shù)后腫瘤復發(fā)相關(guān)的基因及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基因的檢測方法，更具體的是涉及一種變異基因的檢測方法，屬 于分子生物學領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國肝細胞癌（HepatocellularCareinoma，HCC，簡稱肝癌）的發(fā)生率位居全球 第一。據(jù)統(tǒng)計，全球每年肝癌發(fā)病人數(shù)約70萬人，中國占55%，死亡率占全球45%?，F(xiàn)已 發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒OfepatitisBvirus，HBV)與肝癌發(fā)病密切相關(guān)，尤其在我國約有80% 以上的肝癌與乙肝病毒感染有關(guān)。由于我國乙肝相關(guān)性肝癌患者就診時多屬中晚期，且多 數(shù)伴有肝硬化，手術(shù)切除率不足30%，術(shù)后復發(fā)率高達70 %。肝移植術(shù)具有徹底切除腫瘤 的同時又治愈乙肝肝硬化的特點，已成為乙肝相關(guān)性肝癌患者唯一的有效治療手段。但是 肝癌肝移植術(shù)后腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移，導致肝移植受者預后較差，當前尚無有效根治肝癌復發(fā) 的方法。術(shù)后腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移極大制約了肝移植治療肝癌的療效，造成了肝源浪費。臨床研 宄顯示腫瘤大小、數(shù)目等常見的臨床病理特征尚無法精確預測術(shù)后腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移。如何降 低乙肝相關(guān)性肝癌肝移植術(shù)后腫瘤的復發(fā)轉(zhuǎn)移已成為我國肝移植臨床上亟待解決的難題。
[0003]目前乙肝相關(guān)性肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復發(fā)的機制尚不清楚，特別是在肝癌肝移植 術(shù)后復發(fā)機制中起關(guān)鍵作用的基因變化還不明確。因此，揭示乙肝相關(guān)性肝癌肝移植術(shù)后 腫瘤復發(fā)的關(guān)鍵突變基因，對肝癌肝移植術(shù)后復發(fā)機制的研宄，解決乙肝相關(guān)性肝癌肝移 植后腫瘤復發(fā)高危人群的術(shù)前篩查、復發(fā)預測以及預防復發(fā)的個體化靶向治療的肝移植臨 床難題具有重大的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 基于上述發(fā)明目的，發(fā)明人首先發(fā)現(xiàn)了一種與乙肝相關(guān)性肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復 發(fā)高度相關(guān)的，位于人染色體18上的基因MPPE1第chrl8_11897016位點的C/T點突變與乙 肝相關(guān)性肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復發(fā)高度相關(guān)，進而提供了一種用于非診斷目的的MPPE1基 因點突變的檢測方法，所述方法包括鑒定MPPE1基因chrl8_11897016位點是否發(fā)生了C/T 點突變。所述chrl8_l1897016位點是指位于人染色體的第11897016位點。
[0005]目前已有多種方法可用于單核苷酸構(gòu)象多態(tài)性（SNP)檢測，傳統(tǒng)的方法是采用 一些已有的成熟技術(shù)，如DNA測序、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP)、限制性酶切片段長度多態(tài)性 (RFLP)、變性梯度凝膠電泳（DGGE)等。新的高通量測定SNP的方法有芯片技術(shù)、變性高效 液相色譜OHPLC)、動態(tài)等位基因特異的雜交、基質(zhì)輔助激光解析/電離-飛行時間質(zhì)樸 (MALDI-T0FMS)技術(shù)等。對于上述檢測C/T點突變而言，可以使用本領(lǐng)域各種SNP檢測的常 規(guī)技術(shù)手段進行。
[0006] 在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述方法包括：
[0007] (1)提取待測樣本的DNA;
[0008] (2)以步驟⑴獲取的DNA為模板進行PCR擴增；
[0009] (3)鑒定擴增產(chǎn)物在chrl8_11897016位點是否發(fā)生了所述C/T點突變。
[0010] 所謂C/T點突變，即該位點的核苷酸序列由野生型C突變?yōu)門。
[0011] 優(yōu)選地，步驟（1)所述待測樣本為血液、體液或組織樣本。
[0012] 在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟（3)的鑒定采用Sanger測序法。
[0013] 優(yōu)選地，所述PCR的引物序列分別為SEQIDN0:1和2所示，擴增片段的序列為 SEQIDN0:3所示，所述C/T點突變位于所述SEQIDN0:3的第166位堿基位點。
[0014] 在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述方法為PCR-MassArray質(zhì)譜法。所述方法包括以 下步驟：
[0015] (l)PCR擴增；
[0016] (2)SAP酶處理程序；
[0017] (3)延伸引物單堿基延伸反應；
[0018] (4)純化；
[0019] (5)芯片點樣；
[0020] (6)質(zhì)譜檢測和分析。
[0021] 在一個優(yōu)選的技術(shù)方案中，上述方法所述步驟（1)的PCR擴增的引物序列分別 為SEQIDN0:4和5所示，所述步驟（3)的延伸引物單堿基延伸反應的引物序列由SEQID NO: 6所示，擴增片段的序列為SEQIDNO: 7所示，所述C/T點突變位于所述SEQIDNO: 7的 第49位堿基位點。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種檢測MPPE1基因第chrl8_11897016位點點突變的PCR試劑 盒，所述試劑盒含有PCR反應緩沖液、dNTP、Taq聚合酶，以SEQIDNO: 1和2所示的上下游 引物。
[0023] 本發(fā)明還提供了一種用于PCR-MassArray質(zhì)譜法檢測MPPE1基因第 chrl8_11897016位點點突變的試劑盒，所述試劑盒包括：PCR反應緩沖液、dNTP、Taq聚合 酶，以SEQIDN0:4和5所示的上下游引物、SEQIDN0:6所示的的延伸引物、SAP酶、SAP 緩沖液、iPLEX緩沖液、iPLEX終止混合液、iPLEX延伸引物混合液、iPLEX酶、基因芯片。
[0024] 本發(fā)明提供的用于非診斷目的的MPPE1基因點突變的檢測方法能夠快速準確地 鑒定出MPPE1基因chrl8_11897016位點的C/T點突變，可以用于肝癌術(shù)后腫瘤復發(fā)以及術(shù) 前預警復發(fā)的評價指標，這對于肝癌肝移植術(shù)后復發(fā)機制的研宄，解決乙肝相關(guān)性肝癌肝 移植后腫瘤復發(fā)高危人群的術(shù)前篩查、復發(fā)預測以及預防復發(fā)的個體化靶向治療的肝移植 臨床難題提供重要的參考指標。
【附圖說明】
[0025] 圖1. PCR-Sanger測序法中靶序列及引物設計位置圖；
[0026] 圖2.PCR-MassArray法中靶序列及引物設計位置圖；
[0027]圖 3.PCR-MassArray檢測MPPEl/chrl8_l1897016 陰性點突變圖譜；
[0028]圖 4.PCR-MassArray檢測MPPEl/chrl8_l1897016 陽性點突變峰圖；
[0029] 圖5.MPPEl/chrl8_11897016點突變與肝癌術(shù)后腫瘤復發(fā)相關(guān)性分析圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。
[0031] 實施例1.PCR-Sanger測序法對MPPE1基因點突變的檢測
[0032] 1.癌組織提取DNA
[0033] 采用QIAampDNAKit試劑盒抽提組織基因組DNA，具體操作：
[0034] ①將研缽、碾柞和勻漿器等器皿洗凈，DEPC水沖洗，200°C烘干4h，以去除RNA酶；
[0035] ②高溫滅菌后的器皿在室溫冷卻后加入液氮使用具預冷，將組織從液氮中迅速取 出，切取約50-100mg大小，在研缽中快速研碎；
[0036] ③將研磨好的組織碎末移至預先加入180y1bufferATL中的無RNA酶離心管 中，充分混勻；
[0037] ④加入20yl1.25蛋白酶K，充分混勻。56°C水浴，過夜；
[0038] ⑤取出，快速振蕩混勻，加入200y1緩沖液AL，混勻；70°C水浴，lOmin
[0039] ⑥8000rpm離心2分鐘，加入200y1無水乙醇，充分混勻。提取上清液，轉(zhuǎn)移至 DNeasy過濾柱上，13000rpm離心3分鐘，室溫靜置1分鐘，棄去廢液。更換新的收集管。
[0040] ⑦加入500y1緩沖液AW1至過濾柱中，8000rpm離心2分鐘，棄去廢液。更換新的 收集管。
[0041] ⑧加入500y1緩沖液AW2至過濾柱中13000rpm離心3分鐘，棄去管子。
[0042] ⑨將DNeasy過濾柱放置到一個新的1. 5ml離心管上，室溫靜置3分鐘，加入 200y1AE，8000rpm離心2分鐘。棄去DNeasy過濾柱。
[0043] ⑩酶標儀測定DNA濃度及純度0D260/280 (1. 6-1. 8)值；經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳觀 察有無降解后，于_80°C保存。
[0044] 2.PCR反應
[0045] 所檢測的目的基因為MPPE1，其位于人染色體chr18_11897016位點，PCR擴增的引 物序列分別為SEQIDN0:4和5所示，引物在靶序列中的位置如圖1所示。使用上述確定 的引物進行PCR擴增。
[0046] 表1.PCR反應體系
[0047]
【主權(quán)項】
1. 一種用于非診斷目的的MPPEl基因點突變的檢測方法，其特征在于，所述方法包括 鑒定MPPEl基因第chrl8_11897016位點是否發(fā)生了 C/T點突變。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括： (1) 提取待測樣本的DNA ; (2) 以步驟⑴獲取的DNA為模板進行PCR擴增； (3) 鑒定擴增產(chǎn)物在MPPEl基因第chrl8_11897016位點是否發(fā)生了所述C/T點突變。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（1)所述的所述待測樣本為血液、體 液或組織樣本。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（3)的鑒定采用PCR-Sanger測序法。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR的引物序列分別為SEQ ID NO: 1 和2所示，擴增片段的序列為SEQ ID NO: 3所示，所述C/T點突變位于所述SEQ ID NO: 3的 第166堿基位點。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述步驟（3)的判讀方法為PCR-MassArray質(zhì)譜 法，所述方法包括以下步驟： (1) PCR 擴增； (2) SAP酶處理程序； (3) 延伸引物單堿基延伸反應； (4) 純化； (5) 芯片點樣； (6) 質(zhì)譜檢測和分析。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)的PCR擴增的引物序列分別 為SEQ ID N0:4和5所示，所述步驟（3)的延伸引物單堿基延伸反應的引物序列由SEQ ID NO:6所示，擴增片段的序列為SEQ ID NO: 7所示，所述C/T點突變位于SEQ ID NO: 7的第 49堿基位點。
8. -種檢測MPPEl基因第chrl8_l 1897016位點點突變的PCR試劑盒，所述試劑盒含有 PCR反應緩沖液、dNTP、Taq聚合酶、以SEQ ID NO: 1和2所示的上下游引物。
9. 一種用于PCR-MassArray質(zhì)譜法檢測MPPEl基因第chrl8_11897016位點點突變的 試劑盒，所述試劑盒包括：PCR反應緩沖液、dNTP、Taq聚合酶，以SEQ ID N0:4和5所示的 上下游引物、SEQ ID N0:6所示的的延伸引物、SAP酶、SAP緩沖液、iPLEX緩沖液、iPLEX終 止混合液、iPLEX延伸引物混合液、iPLEX酶、基因芯片。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于非診斷目的的MPPE1基因點突變的檢測方法，所述方法包括鑒定位于人染色體18的MPPE1基因第chr18_11897016位點是否發(fā)生了C/T點突變。該方法準確、快速，可以用于非診斷目的的肝癌術(shù)后腫瘤復發(fā)的評價指標。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104830978
【申請?zhí)枴緾N201510202463
【發(fā)明人】張慶, 沈中陽, 陳新國, 陳虹, 尚磊, 王樂天
【申請人】中國人民武裝警察部隊總醫(yī)院
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2015年4月26日