專利名稱：一種低強度脈沖超聲波輔助下的旋轉(zhuǎn)管式細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)組織工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種低強度脈沖超聲波輔助下 的旋轉(zhuǎn)管式細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
美國國家自然科學(xué)基金會(NSF)在1987年8月召開的一次學(xué)術(shù)討論會上提出 了“組織工程”這一概念，并于1988年明確界定其內(nèi)涵為“應(yīng)用工程科學(xué)和生命科學(xué)的原 理和方法，來解釋哺乳動物組織的功能_結(jié)構(gòu)關(guān)系，并且發(fā)展具有活性的人工替代物，來恢 復(fù)、維持或提高組織的功能”。其關(guān)鍵在于通過對哺乳動物細胞進行離體培養(yǎng)，形成具有特 定功能的活組織或各種生物替代物并將其應(yīng)用于臨床。組織工程涉及多方面的科學(xué)問題， 三維細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)是其重要技術(shù)之一，它與制藥工業(yè)、乳發(fā)酵工程等現(xiàn)代生物化學(xué) 工程中所采用的生物反應(yīng)系統(tǒng)以及傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法存在本質(zhì)上的不同。如現(xiàn)代生物化 學(xué)工程中所用的搖瓶、搖床等生物反應(yīng)系統(tǒng)借助吹氣或機械攪拌引起強迫對流等方法保持 培養(yǎng)物的懸浮狀態(tài)，進而改善營養(yǎng)供應(yīng)，這在微生物培養(yǎng)(如青霉素生產(chǎn))中是完全可行 的，但并不適合哺乳動物細胞培養(yǎng)。原因如下(1)哺乳動物細胞遠比微生物脆弱，機械攪 拌形成的直接作用及流動剪切力很容易造成細胞損傷甚至死亡；(2)細胞聚集是細胞培養(yǎng) 形成組織的關(guān)鍵一步，然而機械攪拌造成的流動剪切力使得細胞聚集程度降低甚至無法聚 集。另外，在90年代中期以前，醫(yī)學(xué)界利用傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)方法無法培養(yǎng)出功能與在體 組織相同或相似的生物組織，其原因主要在于重力作用導(dǎo)致的細胞沉降以及細胞在培養(yǎng)器 器壁之間的接觸抑制使得所培養(yǎng)的細胞不能實現(xiàn)真正的三維生長，限制了細胞功能分化， 無法長成所需的組織，而空間微重力環(huán)境恰好為細胞創(chuàng)造了三維生長的條件。80年代中期 美國宇航局(NASA)就開始研制空間生物反應(yīng)器。90年代初期，NASA Johnson中心發(fā)展了 旋轉(zhuǎn)管式生物反應(yīng)器(Rotating Wall Vessel, RWV)，并在1995年航天飛機搭載實驗中成 功地培養(yǎng)出結(jié)腸癌組織，組織切片觀察表明其結(jié)構(gòu)與在體組織相似，而且尺寸比傳統(tǒng)方法 培養(yǎng)的組織大30倍，直徑達2cm。又在1997年進行關(guān)節(jié)軟骨組織培養(yǎng)實驗，成功地培養(yǎng)出 與在體軟骨組織結(jié)構(gòu)和功能相似的關(guān)節(jié)軟骨組織，尺寸為厘米量級。這種新型的生物反應(yīng) 器在地面運行時，借助反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的流體力學(xué)效應(yīng)也可以有效避免重力沉降，進而確 保細胞三維生長。RWV在底座上用一個支架支撐培養(yǎng)器的內(nèi)、外筒，其特點在于通過與培養(yǎng)室同軸旋 轉(zhuǎn)的內(nèi)筒利用氣/液交換膜在線供氣，培養(yǎng)液可停機通過端口更新。這種裝置操作簡便，而 且整個培養(yǎng)過程可視化，適宜用于腫瘤組織藥物毒理試驗等，但也有一定的局限性①、只 能在線供氣不能供氧。經(jīng)驗表明，對細胞/組織培養(yǎng)來說，氧供應(yīng)比營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)更為緊 迫，氧的消耗量大，這對于某些組織(如組織工程等)的培養(yǎng)不利；②、現(xiàn)有培養(yǎng)器不能在線 供液。每次更換營養(yǎng)液都必須停機，這會影響細胞的生長；③、現(xiàn)有培養(yǎng)器采用的氣液交換
3膜不耐高溫，不便于消毒；④、現(xiàn)有培養(yǎng)器沒有采用低強度脈沖超聲波等輔助手段為細胞/ 組織的增殖分化營造良好的微環(huán)境，不能很好地誘導(dǎo)細胞定向分化，形成組織。；⑤、供氧濃 度不可測定和控制；⑥、價格昂貴。超聲是一種在人類聽力頻率之外的聲壓波，可進入生物組織。傳導(dǎo)入人體的超聲 波可引起局部微環(huán)境應(yīng)力的改變，導(dǎo)致機體組織產(chǎn)生細胞水平的生物學(xué)反應(yīng)，其中超聲強 度在 100mW/cm2 以下屬低強度脈沖式超聲波(Low intensity pulsed ultrasound, Lipus) Lipus是一種使用頻率較低和劑量較小的脈沖式超聲波，其傳遞給組織的機械壓能量一般 < 3mg/cm2，不會引起組織致熱效應(yīng)，從而避免了熱副作用。1952年，意大利學(xué)者在對兔橈 骨骨折的研究中發(fā)現(xiàn)超聲波治療可刺激骨痂形成，加快骨折愈合。Lipus最先于1983年應(yīng) 用于骨不連合中的臨床治療，治愈率達68%。由于大量動物實驗以及臨床試驗的驗證，美 國食品和藥物管理局(FDA)對低強度超聲波在加速新鮮骨折愈合及治療骨折不愈合中的 作用予以了認可。Lipus目前主要用于骨折治療，特別是骨延遲愈合、骨不連或放射性骨 壞死的治療。近年來Lipus逐漸被應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨、韌帶的創(chuàng)傷治療。另外，Lipus應(yīng)用 于細胞培養(yǎng)方面的研究越來越受到重視，并逐漸取得了矚目的成果(Takakura Y，Matsui N, Yoshiya S, et al. Low-intensity pulsed ultrasound enhances early healing of medial collateral ligament injuries in rats. Ultrasound Med,2002,21 (3) 283-288. Jia XL, Chen WZ, Zhou K, et al. Effects oflow-intensity pulsed ultra sound in repairing injured articular cartilage[J]. Chin JTraumatol,2005,8(3) :175_178·)。目前，應(yīng)用于細胞培養(yǎng)增殖的Lipus大都采用以下參數(shù)頻率1. 5MHz，強度30mW/ cm2,重復(fù)頻率1kHz，脈寬200 μ S。國內(nèi)外研究表明Lipus對多種細胞如干細胞、軟骨細胞、 成纖維細胞等的培養(yǎng)有顯著促進效果，其可能是通過調(diào)節(jié)細胞的增殖，促進膠原及非膠原 蛋白的合成，影響細胞因子的分泌，從而加速細胞增殖，并在一定條件下誘導(dǎo)細胞分化。Lipus對細胞增殖的調(diào)控與細胞類型、作用條件和環(huán)境因素的影響有關(guān)。Warden等人用低強度脈沖超聲單次作用于成骨樣細胞UMR-106細胞株20min， 發(fā)現(xiàn)其可提高轉(zhuǎn)錄早期反應(yīng)基因c-f0S、C0X-2、BMP以及ALP的表達，促進骨折的愈合。 Zhang等報道用1. 5MHz，脈沖頻率1 kHz，占空比20 %的脈沖超聲30mW/cm2可使軟骨細胞 合成II型膠原和聚合蛋白多糖基因表達增加(Zhang ZJ, Huckle J，F(xiàn)rancomano CA, et al. The effects of pulsed low-intensity ultrasound on chondrocyte viability, proliferation, gene expression and matrix production[J]. Ultrasound Med Biol, 2003,29(11) :1645-1651.)。Schumann也在對骨髓間充質(zhì)干細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，Lipus 作用后其細胞夕卜基質(zhì)明顯增力口(Schumann D, Kujat R, Zellner J, et al. Treatment of human mesenchymal stem cells with pulsed low intensity ultrasound enhances the chondrogenic phenotype in vitro[J].Biorheology,2006,43 (3-4) :431_443.)。 Li JK用低強度脈沖超聲作用于造骨細胞，發(fā)現(xiàn)其不僅增加了造骨細胞的數(shù)量，還增加了 TGF-β 1、IL-6、TNF-α的分泌。Lipus可增加NO合成酶的活性，提高NO水平，促進血管 內(nèi)皮生長因子-Avascular endothelial growth factor，VEGF-A)基因表達，從而有利 于血管內(nèi)皮細胞的生成，促進血管再生(Wang FS, Kuo YR, Wang CJ, et al. Nitric oxide mediates ultrasound-induced hypoxia-inducible factor-lalpha activation and vascular endothelial growth factor-Α expression in human osteoblasts[J]. Bone,
42004，35 (1) 114-123.)，梁國穗教授等人發(fā)現(xiàn)這種效應(yīng)呈劑量依賴性，治療時間越長，VEGF 增加越明顯，且治療后期更明顯，可能與治療后期，細胞分化成熟，需要更多的營養(yǎng)供應(yīng)有 關(guān)，同時Lipus作用后人骨膜細胞合成DNA的能力增加，通過對體外培養(yǎng)的人骨膜細胞的 研究表明，Lipus可促進骨膜細胞向成熟骨細胞分化，且這種效應(yīng)呈劑量依賴性，每天治療 20min連續(xù)4d較每天治療IOmin 2d的效果更好。同時該研究還發(fā)現(xiàn)治療中Lipus對細胞 的增殖影響不大，而對細胞分化效應(yīng)影響更大。Lipus連續(xù)治療28d，與對照組相比骨鈣沉 積明顯增力口(Leung KS, Cheung WH, Zhang C, et al. Low Intensity Pulsed Ultrasound Stimulates Osteogenic Activity of Human Periosteal Cells[J]. Clin Orthop Relat Res, 2004, (418) :253_259.)。Ikeda對間葉來源的多能干細胞的研究發(fā)現(xiàn)，Lipus通過活化 的磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶l/2(ERKl/2)和p38有絲分裂原蛋白激酶(p38_MAPK)，刺激 間葉干細胞向成骨細胞和成軟骨細胞分化(Ikeda K, Takayama T, Suzuki N, et al. Effects of low intensity pulsed ultrasound on the differentiation of C2C12 cells. Life Sci，2006，79 (20) 1956-1943)。因此，若能將Lipus應(yīng)用于細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)，就能為細 胞的增殖、分化營造良好的微環(huán)境，更好的加速細胞增殖與誘導(dǎo)細胞分化，形成組織。此外，新近的研究表明不同氧濃度對各種細胞如干細胞、成骨細胞、軟骨細胞、滑 膜細胞具有重要的影響。適度低氧可促進間充質(zhì)干細胞增殖及凋亡，有利于遷移和趨化，其對分化的影響 因細胞類型不同而有所差異。低氧影響間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs) 的分子機制主要涉及低氧誘導(dǎo)因子1、趨化因子及其受體、基質(zhì)金屬蛋白酶，可形成適合 干細胞存在及生長的微環(huán)境，促進細胞外基質(zhì)降解(鐘啟，曾慧蘭.低氧對間充質(zhì)干細胞 生物學(xué)特性的影響[J]·中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2009，13(40) =7942-7946.)。不 同氧濃度微環(huán)境影響MSCs的分化，高濃度氧有助于MSCs成骨和成脂分化，而低濃度氧 則表現(xiàn)為分化抑制。低氧對人單核細胞來源成熟樹突狀細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MatriX Metalloproteinase, MMP-9)(Tissue Inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP-1)表達的影響，MMP-9和TIMP-I在關(guān)節(jié)疾病中有著重要的作用，低氧微環(huán)境可能 同樣影響關(guān)節(jié)軟骨等結(jié)構(gòu)(李寧，吳桂英，李啟明，等.不同氧濃度微環(huán)境對大鼠骨髓間充 質(zhì)干細胞成骨及成脂肪分化的影響[J].重慶醫(yī)學(xué)，2009，38 (19) =2448-2450.宋海波，楊美 香，孫錦堂，等.低氧對人成熟樹突狀細胞MMP-9/TIMP-1及CCR7表達的影響[J].中國病 理生理雜志，2009，25 (10) 2012-2016)。缺氧可抑制成骨細胞增殖，同時可以誘導(dǎo)細胞VEGF的表達，加強局部血管形成， 從而促進成骨細胞的分化，完成骨創(chuàng)傷的自身修復(fù)，并且缺氧對成骨細胞凋亡的促發(fā)作用 是隨缺氧時間的延長而加重的(姚琦，張元和，姜華，等.缺氧對成人成骨細胞增殖及分 化的影響[J].中國骨傷，2006，19 (7) :417-419.)。缺氧能誘導(dǎo)人滑膜成纖維細胞環(huán)氧合 酶2(CyCla0Xygenase，C0X-2)表達上調(diào)的途徑顯著促進人滑膜成纖維細胞分泌前列腺素 E2 (Prostaglandin E2，PGE2)，從而影響關(guān)節(jié)炎性病變進程(柯金，龍星，劉羽，等.缺氧 狀態(tài)下人顳下頌關(guān)節(jié)滑膜成纖維細胞環(huán)氧合酶2的表達及意義[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2005， 85(25) :1747-1751)。5%左右的低氧濃度相當于軟骨細胞的體內(nèi)生存環(huán)境，有利于單層 和三維培養(yǎng)體系對軟骨細胞的培養(yǎng)，過高或過低的氧濃度都不適合。關(guān)注氧濃度在軟骨細 胞生長不同時期的影響，將有利于調(diào)控好氧濃度，使細胞較長時間處于較好的生長增殖狀
5態(tài)(吳華，吳紀饒，王曼瑩.氧濃度對關(guān)節(jié)軟骨細胞體外培養(yǎng)的影響[J].醫(yī)學(xué)綜述，2006， 12(8) :454-456)。目前，很多熱點研究大多需要控制不同氧濃度進行組織、細胞的培養(yǎng)，以研究高 氧、低氧對組織/細胞的生物學(xué)特性的影響，但現(xiàn)有的生物反應(yīng)器雖然能夠初步調(diào)節(jié)供養(yǎng) 濃度，但是不夠精確，且存在可用的培養(yǎng)儀器少、價格昂貴等問題，這就需要在現(xiàn)有生物反 應(yīng)器中增加一種精確的供氧濃度可控部件。隨著培養(yǎng)技術(shù)的成熟、培養(yǎng)規(guī)模擴大和骨與軟骨組織工程的需求，如何更好地快 速擴增干細胞、成骨細胞、軟骨細胞、滑膜細胞等，同時定向調(diào)控細胞的分化方向，以獲得產(chǎn) 量多、質(zhì)量好的骨與軟骨組織工程種子細胞應(yīng)用于臨床，將會開拓應(yīng)用前景，但是現(xiàn)有的生 物反應(yīng)器并不能很好的做到這一點，因此，發(fā)明一種能夠精確監(jiān)測和控制氧濃度的生物反 應(yīng)器，使儀器獲得更好的研究適應(yīng)性能，而且將Lipus應(yīng)用于該系統(tǒng)，就能為細胞/組織的 增殖分化營造良好的微環(huán)境，更好的誘導(dǎo)細胞增殖與分化，形成組織。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有的細胞培養(yǎng)器中存在的不能在線供氧、供液，無法精 確控制供氧濃度，交換膜不耐高溫、不便于消毒，沒有采用輔助手段刺激細胞/組織的增 殖、分化，難以提供良好的生長微環(huán)境，價格昂貴等問題，提供一種Lipus輔助下的旋轉(zhuǎn)管 式細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)本發(fā)明Lipus輔助下、氧氣濃度可控的旋轉(zhuǎn)管式細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)主要由培養(yǎng) 器主體、氣室、Lipus超聲儀和供氧濃度控制部件組成，培養(yǎng)器主體中包括細胞/組織培養(yǎng) 室、培養(yǎng)液流動室和氣室，細胞/組織培養(yǎng)室和培養(yǎng)液流動室連為一體并用軸通過轉(zhuǎn)速調(diào) 節(jié)結(jié)構(gòu)與馬達帶動，可繞軸做變速轉(zhuǎn)動，而氣室則獨立，不隨軸轉(zhuǎn)動，氣室的上端設(shè)置供氧 濃度控制部件。通過繞水平軸旋轉(zhuǎn)模擬微重力環(huán)境以及Lipus的輔助共同營造一個更有利 于細胞、細胞聚集體和組織三維增殖分化的環(huán)境，同時更有利于培養(yǎng)室內(nèi)氧氣、二氧化碳和 代謝物的運輸。具體地，本發(fā)明Lipus輔助下、氧氣濃度可控的旋轉(zhuǎn)管式細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)結(jié) 構(gòu)包括設(shè)置有轉(zhuǎn)軸的培養(yǎng)器主體，轉(zhuǎn)軸設(shè)置在培養(yǎng)器主體的兩端，培養(yǎng)器主體一端設(shè)置有 Lipus超聲儀，Lipus超聲儀的超聲發(fā)射探頭插入培養(yǎng)器主體內(nèi)部。作為一種優(yōu)選方案，所 述Lipus超聲儀的超聲發(fā)射探頭上設(shè)置有用于固定超聲發(fā)射探頭的分離部件，使之不隨著 轉(zhuǎn)軸的轉(zhuǎn)動而轉(zhuǎn)動。其中，所述培養(yǎng)器主體包括設(shè)置在同一軸上的內(nèi)筒和外筒，內(nèi)筒為培養(yǎng)液流動室， 外筒為細胞/組織培養(yǎng)室，在外筒的外面套有氣室，在內(nèi)外筒之間的環(huán)形開口上安裝有 Lipus超聲儀的超聲發(fā)射探頭。所述內(nèi)筒為鏤空金屬，內(nèi)筒外壁上固定有液液交換膜；所述 外筒為鏤空金屬，外筒內(nèi)壁上固定有氣液交換膜。所述氣液交換膜是用白炭黑、聚乙烯、聚 酰胺、玻璃纖維增強的硅橡膠材料，模擬人體肺泡膜，能有效地在線供氣供氧，滿足細胞對 氧氣的需要。聚二甲基硅氧烷(PDMS)即硅橡膠膜，具有極為優(yōu)良的透氣性，室溫下對氮氣、 氧氣和空氣的透過量比天然橡膠高30 40倍，比丁基橡膠則要高600 800倍，是現(xiàn)有氣 體透過率最高的高分子材料。另外，PDMS化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，具有顯著的疏水性，其常溫下
6的蒸汽壓較低，不容易揮發(fā)，加之燃點和閃點較高，可在-50 180°C溫度范圍內(nèi)長期使用。 雖然均質(zhì)硅橡膠膜存在成膜性和機械強度差等缺點，但是用白炭黑、聚乙烯、聚酰胺、玻璃 纖維增強的硅橡膠膜，其機械強度和透過性均有提高，完全可以滿足氣液交換膜的要求。本 發(fā)明所用PDMS規(guī)格如下厚度約1. 5mm，其孔徑小于1 μ m，最大曝氣量為5m3/h ；氧利用率 > 25%;充氧能力> 0. 145kg02/h。所述液液交換膜為醋酸纖維素濾膜(Acetylcellulose， CA)，CA有很高的流速、熱穩(wěn)定性，以及非常低的吸附性，是水相溶液如緩沖液、血清、培養(yǎng)基 除菌過濾的理想用膜。CA中各組分重量比例醋酸纖維素16 22% ；二氧六環(huán)5 15% ； 丙酮55 75% ；高氯酸鎂1 4% ；生物類酯0.1 6% ；該濾膜pH4 8范圍內(nèi)穩(wěn)定，可 耐受大多數(shù)純類和油類，最高可耐受180°C。本發(fā)明所用CA的規(guī)格如下厚約60 μ m，其孔 徑小于1 μ m，能夠過濾分子量小于1000的物質(zhì)，可采用的滅菌方式為高壓滅菌(121°C或者 134°C)，干熱滅菌180°C)，Y射線或環(huán)氧乙烷熏蒸。作為一種優(yōu)選方案，所述內(nèi)筒一端的端軸上設(shè)置有分離部件，分離部件上設(shè)置有 培養(yǎng)液進口和培養(yǎng)液出口，使培養(yǎng)液進、出口和旋轉(zhuǎn)內(nèi)筒軸分離開來，不隨軸的轉(zhuǎn)動而轉(zhuǎn) 動。所述培養(yǎng)系統(tǒng)還包括用于提供新鮮培養(yǎng)液的供液裝置、用于存儲培養(yǎng)液的培養(yǎng)液 存儲器和用于收集培養(yǎng)液的培養(yǎng)液收集器，供液裝置通過輸液泵液管與培養(yǎng)液存儲器相 連，通過多孔管管道穿過培養(yǎng)器主體內(nèi)筒的培養(yǎng)液出口，直達培養(yǎng)器主體內(nèi)筒的另一端，培 養(yǎng)液均勻進入細胞/組織培養(yǎng)室，細胞/組織培養(yǎng)室的輸出管道與培養(yǎng)液收集器相連。
所述氣室還包括進氣口和出氣口，系統(tǒng)還包括提供氣源的供氣裝置和收集余氣的 余氣收集器，氣室的進氣口通過進氣管與供氣裝置連接，氣室的出氣口通過排氣管與余氣 收集器連接。本發(fā)明系統(tǒng)還可以包括驅(qū)動裝置，驅(qū)動裝置帶動培養(yǎng)器主體以轉(zhuǎn)軸為軸心旋轉(zhuǎn)。 其中，所述驅(qū)動裝置優(yōu)選變速馬達。本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)的工作過程如下1、本發(fā)明使用前需要常規(guī)消毒，以保證生物反應(yīng)器不受污染，本發(fā)明采用的兩種 交換膜均可耐180°C的高溫，因此可以采用高溫消毒，方便重復(fù)使用。2、根據(jù)實際需要加入適當?shù)呐囵B(yǎng)液，同時根據(jù)所培養(yǎng)的細胞/組織或研究目的決 定培養(yǎng)液的供給速度，選擇供氧濃度，同時計算生物反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)速度和調(diào)節(jié)Lipus的參 數(shù)。例如培養(yǎng)軟骨細胞可選擇參數(shù)強度30mW/cm2，頻率1. 5MHz，脈寬200 μ s，重復(fù)頻率 IkHz。生物反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)速度可以近似使用下式確定ω = 1.38951Χ102(Ι^)-1/3(ω-回 轉(zhuǎn)器的最佳轉(zhuǎn)速，單位為r/min ；L0-實驗樣品到轉(zhuǎn)軸的距離，單位為cm ；t_試驗持續(xù)時間， 單位為s)3、本發(fā)明接通電源后，水平旋轉(zhuǎn)，可以模擬微重力環(huán)境，促進細胞三維生長，同時 輔助以Lipus技術(shù)，使細胞更好地增殖分化。在連續(xù)供氣供氧的條件下，可連續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過 一定時間后，便可切斷電源，得到產(chǎn)物。本發(fā)明采用的Lipus參數(shù)如下頻率1. 5MHz，強度30mW/cm2，重復(fù)頻率1kHz，脈寬 200 μ S，可以根據(jù)研究的目的調(diào)節(jié)相應(yīng)的參數(shù)。本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)是綜合考慮了超聲波、氧氣濃度、旋轉(zhuǎn)、液液交換、氣液交換等 多重因素的相互制約和影響，通過多次試驗摸索而開發(fā)出來的，可以適應(yīng)于干細胞、成骨細
7胞、軟骨細胞、滑膜細胞等多類細胞培養(yǎng)的有機系統(tǒng)。。Lipus最先于1983年應(yīng)用于骨不連合中的臨床治療，目前主要用于骨延遲愈合、 骨不連或缺血性骨壞死的治療，且逐漸被應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨、韌帶損傷的治療。另外，Lipus應(yīng) 用于細胞培養(yǎng)方面的研究越來越受到重視，并逐漸取得了矚目的成果(Takakura Y5Matsui N, Yoshiya S，et al. Chin J Traumatol，2005，8 (3) :175_178·)。Lipus 對多種細胞如干細 胞、軟骨細胞、成纖維細胞等的培養(yǎng)有顯著促進效果，其可能是通過調(diào)節(jié)細胞的增殖，促進 膠原及非膠原蛋白的合成，影響細胞因子的分泌，從而加速細胞增殖，并在一定條件下誘導(dǎo) 細胞分化。但如何將現(xiàn)有的Lipus細胞培養(yǎng)原理跟旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)原理結(jié)合起來，需要克服Lipus 的介入問題、動態(tài)刺激和誘導(dǎo)問題、超聲力學(xué)作用問題等一些技術(shù)難題。本發(fā)明采用分離 部件，即可獲得Lipus界面與培養(yǎng)液的接觸，也可以讓Lipus部件獨立不隨轉(zhuǎn)軸運轉(zhuǎn)；運用 Lipus連續(xù)發(fā)生和均勻作用等特性，實現(xiàn)培養(yǎng)過程中的動態(tài)刺激和誘導(dǎo)；通過計算Lipus超 聲作用的強度衰減情況，在IOcm內(nèi)超聲強度的衰減可以忽略不計，且同時可以部分抵消普 通生物反應(yīng)器旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)時的“頂端效應(yīng)”，使得引入Lipus后的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)更佳均勻、力學(xué)分 布更好，有利于細胞的增殖和分化。三維動態(tài)的細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)是骨與軟骨組織工程中的重要技術(shù)之一，但現(xiàn)有 生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)存在不能在線供氧、供液，沒有采用輔助手段刺激細胞/組織的增殖、 分化，無法精確地控制供氧濃度，交換膜不耐高溫、不便于消毒，價格昂貴、儀器少等問題， 且隨著培養(yǎng)技術(shù)的成熟、培養(yǎng)規(guī)模擴大和骨組織工程與軟骨組織工程的需求，如何更好地 快速擴增干細胞、成骨細胞、軟骨細胞、滑膜細胞等各類細胞，同時定向調(diào)控細胞的分化方 向，以獲得產(chǎn)量多、質(zhì)量好的骨組織工程與軟骨組織工程種子細胞應(yīng)用于臨床。因此本發(fā)明 針對現(xiàn)有情況，設(shè)計一種能夠精確監(jiān)測和控制氧濃度的生物反應(yīng)器，使儀器獲得更好的研 究適應(yīng)性能，而且將Lipus應(yīng)用于該系統(tǒng)，就能為細胞/組織的增殖分化營造良好的微環(huán) 境，更好的誘導(dǎo)細胞增殖與分化，形成組織。本發(fā)明克服現(xiàn)有生物反應(yīng)器的問題，最終實現(xiàn) 各部件互相彌補，相互促進的統(tǒng)一、有機效果，利于骨與軟骨組織工程的研究和開發(fā)，應(yīng)用 前景廣泛。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果(1)本發(fā)明在細胞培養(yǎng)室的一端添加了 Lipus超聲儀作為輔助裝置，能夠有效地 誘導(dǎo)細胞增殖和/或分化，形成組織；(2)本發(fā)明將氣體流動室設(shè)置在培養(yǎng)室的外部，氣體交換面積更大，交換效率更 尚；(3)本發(fā)明將內(nèi)筒設(shè)置為培養(yǎng)液流動室，提供在線供液，不需停機更換營養(yǎng)液，能 及時、持續(xù)地更新培養(yǎng)液，添加營養(yǎng)物質(zhì)，排除代謝產(chǎn)物，讓培養(yǎng)過程更連續(xù)，效率更高；(4)本發(fā)明的氣液交換膜采用了用白炭黑、聚乙烯，聚酰胺、玻璃纖維增強的硅橡 膠材料，模擬人體肺泡膜，能有效地在線供氣供氧，滿足細胞對氧氣的需要；(5)本發(fā)明增加了氧氣濃度可控部件，通過此種微調(diào)方式可以使培養(yǎng)室內(nèi)的氧氣 濃度得到精確控制，利于在低氧、高氧條件下開展研究工作，儀器的研究適應(yīng)性更好；(6)本發(fā)明使復(fù)雜的生物反應(yīng)器裝置小型化，使用的主體材料，液液和氣液交換膜 均為耐高溫材料，可直接高溫消毒，清洗、消毒方便徹底；
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(7)本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)價格較低廉。


圖1為本發(fā)明的主體結(jié)構(gòu)圖，其中1為氣罩；2為氣室；3為外筒；4為細胞培養(yǎng) 室；5為內(nèi)筒；6為培養(yǎng)液流動室；7為進氣口 ；8為出氣口 ；9為出液口 ；10為進液口 ；11為 分離結(jié)構(gòu)；12為馬達；13為齒輪；14為Lipus超聲儀；15為水平支撐板；16為超聲傳導(dǎo)線； 17為Lipus超聲探頭；圖2為供液系統(tǒng)的示意圖，其中20為鮮培養(yǎng)液存貯器；21為流量、壓力可調(diào)的輸 液泵；22為培養(yǎng)液輸入用的多孔管管道，經(jīng)阻尼器進入培養(yǎng)室至培養(yǎng)室終端，阻尼器用以 調(diào)節(jié)培養(yǎng)室內(nèi)壓力；23為培養(yǎng)液回收器；10為培養(yǎng)液進口 ；9為培養(yǎng)液出口 ；圖3為供氣系統(tǒng)的示意圖，其中24為氣源，用氣管與穩(wěn)壓，調(diào)壓閥相連，氣管出氣 口連接到培養(yǎng)器氣室2 ；25為穩(wěn)壓調(diào)壓閥，安裝載氣路之中；26為進氣管與培養(yǎng)器進氣口 7 相連；27為排氣管與培養(yǎng)器出氣口 8相連；28為余氣收集器；氣室出氣口通過排氣管27連 接余氣收集器28上；29為氧氣濃度傳感器，通過導(dǎo)線30與控制電路31相連，將氣室內(nèi)的氧 氣濃度情況反應(yīng)到控制電路；30為導(dǎo)線，連接氧氣濃度傳感器及控制電路；31為控制電路， 與穩(wěn)壓調(diào)壓閥25相連接，控制氣壓，進而控制氣體濃度。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例1采用本發(fā)明培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone Marrow Stem Cells,MSCs)分化增殖為 骨細胞。具體步驟如下將MSCs與培養(yǎng)液(其中DMEM與無血清DMEM以1 1體積比混合)混合加入 細胞培養(yǎng)室中，開動培養(yǎng)系統(tǒng)，調(diào)到適合的旋轉(zhuǎn)速度，且將Lipus參數(shù)調(diào)為頻率1. 5MHz，強 度30mW/cm2，重復(fù)頻率1kHz，脈寬200 μ s，在37°C的溫度下開始進行旋轉(zhuǎn)刺激培養(yǎng)。通過 在線供液系統(tǒng)定時向培養(yǎng)室內(nèi)供應(yīng)培養(yǎng)液，通過在線供氣系統(tǒng)實時向氣室內(nèi)供氣，并通過 氧氣濃度傳感系統(tǒng)將氧氣濃度控制在適宜的范圍內(nèi)。培養(yǎng)48h后在供液系統(tǒng)中加入骨細 胞定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基(100ml高糖DMEM誘導(dǎo)液含骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (Bone Morphogenetic Protien, BMP-2) 100ng/L、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF) lOOng/L、維生素C 50 μ g/ml、胰島素10U/ml、甲狀腺素50 μ g/ml、血管內(nèi)皮生長因子 (Vascular endothelial growth factor，VEGF) 20ml/L 以及牛血清白蛋白 1. 25 μ g/ml)，定 向誘導(dǎo)細胞分化為成骨細胞，并進一步分化為骨細胞。連續(xù)培養(yǎng)4d后停機取出培養(yǎng)物。利 用HE染色和掃描電鏡對細胞的分化增殖情況進行觀察。實施例2采用本發(fā)明進行MSCs與“膠原/納米三磷酸鈣/透明質(zhì)酸”(Collagen/nano Tri-calcium Phosphate/Hyaluronic Acid, Col/nano-TCP/HA)骨軟骨支架材料聯(lián)合培養(yǎng)， 構(gòu)建組織工程軟骨。具體步驟如下將Col/nano-TCP/HA生物材料修剪成直徑5mm、厚3mm，取第3代MSCs以1 X 106/ml
9密度接種于支架材料內(nèi)，然后與培養(yǎng)液(其中DMEM與無血清DMEMWl 1比例混合)混合 加入細胞培養(yǎng)室中，開動培養(yǎng)系統(tǒng)，調(diào)到適合的旋轉(zhuǎn)速度，將Lipus參數(shù)調(diào)為頻率1. 5MHz, 強度2mW/cm2，重復(fù)頻率1kHz，脈寬200 μ s，在37°C的溫度下開始進行旋轉(zhuǎn)刺激培養(yǎng)。通過 在線供液系統(tǒng)定時向培養(yǎng)室內(nèi)供應(yīng)培養(yǎng)液，通過在線供氣系統(tǒng)實時向氣室內(nèi)供氣，并通過 氧氣濃度傳感系統(tǒng)將氧氣濃度控制在適宜的范圍內(nèi)。培養(yǎng)48h后在供液系統(tǒng)中加入軟骨細 胞定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基(100ml高糖DMEM誘導(dǎo)液含TGF-β lOOng/ml、地塞米松lOOng/L、維生素 C50 μ g/ml、胰島素10U/ml、甲狀腺素50 μ g/ml、β -甘油磷酸鈉20ml/L以及牛血清白蛋白 1.25 μ g/ml)，定向誘導(dǎo)細胞分化為軟骨組織。連續(xù)培養(yǎng)4天后停機取出培養(yǎng)物。利用相差 倒置顯微鏡觀察和掃描電鏡觀察復(fù)合細胞后的材料結(jié)構(gòu)，對材料的三維立體結(jié)構(gòu)和細胞的 粘附、增殖情況進行觀察，同時實施病理組織學(xué)切片，評估軟骨形成情況。
權(quán)利要求
一種低強度脈沖超聲波輔助下的旋轉(zhuǎn)管式細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于所述培養(yǎng)系統(tǒng)包括設(shè)置有轉(zhuǎn)軸的培養(yǎng)器主體，轉(zhuǎn)軸設(shè)置在培養(yǎng)器主體的兩端，培養(yǎng)器主體一端設(shè)置有Lipus超聲儀，Lipus超聲儀的超聲發(fā)射探頭插入培養(yǎng)器主體內(nèi)部，培養(yǎng)器主體的上端設(shè)置有供氧濃度控制部件。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于所述培養(yǎng)器主體包括設(shè)置 在同一軸上的內(nèi)筒和外筒，內(nèi)筒為培養(yǎng)液流動室，外筒為細胞/組織培養(yǎng)室，在外筒的外面 套有氣室，在內(nèi)外筒之間的環(huán)形開口上安裝有Lipus超聲儀的超聲發(fā)射探頭，在氣室上端 內(nèi)壁設(shè)置有供氧濃度控制部件。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于所述內(nèi)筒為鏤空金屬，內(nèi)筒 外壁上固定有液液交換膜；所述外筒為鏤空金屬，外筒內(nèi)壁上固定有氣液交換膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于所述內(nèi)筒一端的端軸 上設(shè)置有分離部件，分離部件上設(shè)置有培養(yǎng)液進口和培養(yǎng)液出口。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于所述培養(yǎng)系統(tǒng)還包括用于 提供新鮮培養(yǎng)液的供液裝置、用于存儲培養(yǎng)液的培養(yǎng)液存儲器和用于收集培養(yǎng)液的培養(yǎng)液 收集器，供液裝置通過輸液泵液管與培養(yǎng)液存儲器相連，通過多孔管管道穿過培養(yǎng)器主體 內(nèi)筒的培養(yǎng)液出口，直達培養(yǎng)器主體內(nèi)筒的另一端，培養(yǎng)液均勻進入細胞/組織培養(yǎng)室，細 胞/組織培養(yǎng)室的輸出管道與培養(yǎng)液收集器相連。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于所述氣室還包括進氣 口和出氣口，系統(tǒng)還包括提供氣源的供氣裝置和收集余氣的余氣收集器，氣室的進氣口通 過進氣管與供氣裝置連接，氣室的出氣口通過排氣管與余氣收集器連接。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于所述系統(tǒng)還包括驅(qū)動 裝置，驅(qū)動裝置帶動培養(yǎng)器主體以轉(zhuǎn)軸為軸心旋轉(zhuǎn)；所述Lipus超聲儀的超聲發(fā)射探頭上 設(shè)置有用于固定超聲發(fā)射探頭的分離部件。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2或6所述的細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于所述供氧濃度控 制部件、氣室的進氣口和出氣口各連接一個氣泵，氣泵與兩位三通電磁閥連接，光感模式的 氧氣濃度傳感器感知氣室內(nèi)的氧氣濃度，將信號傳遞到控制電路，控制三通閥，進而開啟或 關(guān)閉氣泵，調(diào)節(jié)氣室的氧氣濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于所述驅(qū)動裝置為變速馬達。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)，其特征在于所述液/液交換膜為醋酸 纖維素濾膜，濾膜厚度為60 μ m,孔徑小于1 μ m ；所述氣/液交換膜是用白炭黑、聚乙烯、聚 酰胺、玻璃纖維增強的硅橡膠材料，厚度為1. 5mm,孔徑小于1 μ m，最大曝氣量為5m3/h，氧利 用率> 25%，充氧能力> 0. 145kg02/h。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種低強度脈沖超聲波輔助下的旋轉(zhuǎn)管式細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)。本發(fā)明Lipus輔助下的旋轉(zhuǎn)管式細胞/組織培養(yǎng)系統(tǒng)包括設(shè)置有轉(zhuǎn)軸的培養(yǎng)主體，培養(yǎng)主體外面套有氣室，轉(zhuǎn)軸設(shè)置在氣室的兩端，培養(yǎng)器主體一端設(shè)置有Lipus超聲儀，Lipus超聲儀的超聲發(fā)射探頭插入培養(yǎng)器主體內(nèi)部，氣室的內(nèi)壁設(shè)置有氧氣濃度可控部件。本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)可以在線供氧、供液，有利于培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)氧氣、二氧化碳和代謝物的運輸，同時可精確控制氧氣濃度，采用Lipus超聲儀作為輔助手段，為細胞或組織的增殖或分化營造了良好的微環(huán)境，最終模擬微重力環(huán)境進行三維動態(tài)培養(yǎng)，并可實現(xiàn)定向的擴增和誘導(dǎo)分化功能。
文檔編號C12M3/00GK101914438SQ20101021481
公開日2010年12月15日 申請日期2010年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月12日
發(fā)明者吳少旭, 廖威明, 林子洪, 郭曉升, 陳奕春, 陳曉敏, 陳耿東, 黃楚輝 申請人:中山大學(xué)