專利名稱：用于包括胎兒細(xì)胞的計(jì)算機(jī)所控制的稀少細(xì)胞的基于診斷的方法和裝置的制作方法
本申請(qǐng)要求1998年五月九日提交的美國(guó)臨時(shí)系列申請(qǐng)No.60/84,893的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)完整地包括于此用作引用。
本發(fā)明涉及計(jì)算機(jī)控制方法和裝置，該方法及裝置用于獲得并制備細(xì)胞樣品以及對(duì)細(xì)胞界中感興趣的稀少細(xì)胞進(jìn)行鑒定，從而根據(jù)細(xì)胞界中所選擇出的稀少細(xì)胞的特性進(jìn)行診斷。在一個(gè)重要的實(shí)施例中，本發(fā)明涉及獲得和制備母體的血樣，該血樣含有產(chǎn)前診斷所依據(jù)的胎兒細(xì)胞。
根據(jù)DNA可對(duì)人類遺傳障隘疾病進(jìn)行產(chǎn)前診斷的發(fā)現(xiàn)業(yè)已導(dǎo)致開發(fā)出許多新的診斷方法。這些診斷方法可對(duì)患有遺傳障隘的胎兒進(jìn)行早期檢測(cè)，隨后告知結(jié)論并進(jìn)行手術(shù)干預(yù)。然而，這些方法具有許多缺陷。與得到這些結(jié)論有關(guān)的每種新的診斷方法都要求得到分離的胎兒細(xì)胞樣品，以便可以檢查或檢驗(yàn)作為特殊遺傳障礙標(biāo)志的胎兒的DNA。這些現(xiàn)代化方法的缺陷主要是需要得到胎兒細(xì)胞樣品。目前，利用需要借助羊膜穿刺術(shù)或絨膜絨毛取樣這些產(chǎn)科手術(shù)的侵入方法可得到胎兒細(xì)胞。這些高度專業(yè)化方法對(duì)胎兒用得很少，但是對(duì)其卻有相當(dāng)大的危險(xiǎn)性。在懷孕早期，對(duì)胎兒的危險(xiǎn)程度很高并且所得到的細(xì)胞數(shù)目很少。因此，這些方法在懷孕18-20周時(shí)才適用。
一種可得到胎兒細(xì)胞的現(xiàn)代化方法是依賴于胎兒細(xì)胞泄漏到母體的循環(huán)系統(tǒng)中。通過(guò)簡(jiǎn)單地抽取母親的血樣，就可以得到足量的基于DNA方法進(jìn)行產(chǎn)前診斷所需的胎兒細(xì)胞材料，這在理論上是可行的。從母體的血液循環(huán)系統(tǒng)中得到胎兒細(xì)胞可避免對(duì)胎兒的任何危險(xiǎn)性，并且能夠在懷孕10-12周時(shí)進(jìn)行。
業(yè)已在母體的血液循環(huán)系統(tǒng)中檢測(cè)到的胎兒細(xì)胞包括滋養(yǎng)層、淋巴細(xì)胞及有核紅細(xì)胞。滋養(yǎng)層由于其尺寸較大，因此是第一種在母體的血液循環(huán)系統(tǒng)中被鑒定的胎兒細(xì)胞。然而，有核紅細(xì)胞作為遺傳材料的來(lái)源對(duì)于產(chǎn)前診斷已經(jīng)產(chǎn)生了最高的懷疑程度，這是因?yàn)樗鼈冊(cè)诔扇说难貉h(huán)系統(tǒng)中非常稀少，而在胎兒血液中卻非常豐富并且壽命有限。這些因素一起減小了區(qū)分胎兒細(xì)胞材料和母體細(xì)胞材料的誤差。母體血液中胎兒細(xì)胞的循環(huán)壽命期限從幾個(gè)星期(對(duì)于有核紅細(xì)胞來(lái)說(shuō))到幾年(對(duì)于淋巴細(xì)胞來(lái)說(shuō))。
胎兒細(xì)胞雖然穩(wěn)固存在于母體的血液循環(huán)系統(tǒng)中，但是卻非常稀少，這就嚴(yán)重限制了它們?cè)谠\斷學(xué)上的利用價(jià)值。母體的血液循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的胎兒細(xì)胞濃度范圍據(jù)估計(jì)非常寬，從105個(gè)母體細(xì)胞中有1個(gè)胎兒細(xì)胞的高數(shù)量水平到109個(gè)母體細(xì)胞中有1個(gè)胎兒細(xì)胞的低數(shù)量水平。這樣，10ml的母體血樣中一般含有10-100個(gè)胎兒細(xì)胞。在本說(shuō)明書中，在未經(jīng)過(guò)任何處理的新鮮抽取的母體血樣中發(fā)現(xiàn)的胎兒細(xì)胞濃度被稱為胎兒細(xì)胞的“自然存在濃度”，該濃度一般(卻不是必需的)在以上所述的范圍內(nèi)。還是在本說(shuō)明書中，“非富集的母體血液”應(yīng)該是指只含有自然存在濃度的胎兒細(xì)胞的母體血樣。
由于在非富集母體血液中胎兒細(xì)胞的自然存在濃度相當(dāng)?shù)停灾掠跒榱说玫侥軌蝻@示診斷結(jié)果的胎兒細(xì)胞樣品，所用的現(xiàn)代技術(shù)包括將樣品中的胎兒細(xì)胞從母體細(xì)胞中物理分離出來(lái)。其實(shí)，現(xiàn)代技術(shù)是那些涉及到例如通過(guò)除去多余的母體細(xì)胞而不舍棄胎兒細(xì)胞來(lái)濃縮樣品中的胎兒細(xì)胞即富集樣品的方法。這些方法相當(dāng)難以完成，經(jīng)常分離不出足夠量的能夠顯示診斷結(jié)果的胎兒細(xì)胞，而有時(shí)又不能提供足夠量的其純度適于進(jìn)行后序的可靠診斷的未損壞的胎兒細(xì)胞樣品。
本發(fā)明希望提供一種用于檢測(cè)和診斷組織樣品中稀少細(xì)胞類型的計(jì)算機(jī)控制方法和裝置，所述診斷是基于稀少細(xì)胞的特性進(jìn)行的。本發(fā)明還希望提供一種用于檢測(cè)血液制備中的胎兒細(xì)胞并基于胎兒細(xì)胞進(jìn)行可解決上述鑒定問(wèn)題的產(chǎn)前診斷的計(jì)算機(jī)控制方法和裝置，正如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在閱讀了本發(fā)明的說(shuō)明書之后所顯而易見的，本發(fā)明還克服了其它一些難題并滿足了其它一些諸如此類的目的。
本發(fā)明通常提供了一種處理體液或組織樣品圖象數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法，該方法包括產(chǎn)生代表在第一放大倍數(shù)所攝的體液或組織樣品圖象的第一圖象數(shù)據(jù)子集，該子集表示含有稀少細(xì)胞的候選模糊點(diǎn)(candidate blob)，所述稀少細(xì)胞產(chǎn)生代表在第二放大倍數(shù)所攝的候選模糊點(diǎn)圖象的第二圖象數(shù)據(jù)子集，該第二數(shù)據(jù)子集表示稀少細(xì)胞并將第二數(shù)據(jù)字集貯存到計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中。
一般來(lái)說(shuō)，通過(guò)利用計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察體液或組織樣品中的細(xì)胞單分子層的光場(chǎng)以便檢測(cè)表示稀少細(xì)胞存在的信號(hào)指示可產(chǎn)生第一圖象數(shù)據(jù)子集。
該方法還包括在對(duì)應(yīng)于第一圖象數(shù)據(jù)子集中所表示的每一候選模糊點(diǎn)的部位使體液或組織樣品與一試劑接觸以便產(chǎn)生醫(yī)學(xué)顯示信號(hào)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需再處理那些不產(chǎn)生代表候選模糊點(diǎn)的第一數(shù)據(jù)子集的體液或組織樣品。然后測(cè)定該信號(hào)，從而判斷其是否是顯示信號(hào)水平。第一和/或第二圖象數(shù)據(jù)子集可轉(zhuǎn)換成更適于用此處所描述的計(jì)算機(jī)控制和處理的表示信號(hào)。在一優(yōu)選實(shí)施例中，圖象數(shù)據(jù)由RGB(紅綠藍(lán))信號(hào)轉(zhuǎn)換成HLS(色調(diào)發(fā)光飽和)信號(hào)。利用濾波器和/或屏蔽可區(qū)分那些滿足預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞而去掉那些不能滿足預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞，并因此鑒別出稀少細(xì)胞。
本發(fā)明另一方面提供了一種操縱實(shí)驗(yàn)室服務(wù)的方法，該方法包括以下步驟首先接收體液或組織樣品，其次產(chǎn)生體液或組織樣品模糊點(diǎn)，然后操作計(jì)算機(jī)顯微鏡，從而軟件程序可自動(dòng)鑒別出模糊點(diǎn)中的稀少細(xì)胞并檢測(cè)稀少細(xì)胞中的醫(yī)學(xué)顯示信號(hào)。本發(fā)明的又一方面是提供了一種包括計(jì)算機(jī)讀取存儲(chǔ)介質(zhì)的計(jì)算機(jī)軟件產(chǎn)品，該介質(zhì)中固定有一系列的指令，由計(jì)算機(jī)執(zhí)行這些指令，可指導(dǎo)完成檢測(cè)和診斷稀少細(xì)胞類型這些步驟。這些細(xì)胞包括產(chǎn)生代表在第一放大倍數(shù)所攝的體液或組織樣品圖象的第一圖象數(shù)據(jù)子集，該子集表示含有稀少細(xì)胞的候選模糊點(diǎn)(candidate blob)，所述稀少細(xì)胞產(chǎn)生代表在第二放大倍數(shù)所攝的候選模糊點(diǎn)圖象的第二圖象數(shù)據(jù)子集，該第二數(shù)據(jù)子集表示稀少細(xì)胞并將第二數(shù)據(jù)子集貯存到計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中。
一般來(lái)說(shuō)，可如上所述建立第一圖象數(shù)據(jù)子集。這些步驟還包括在對(duì)應(yīng)于第一圖象數(shù)據(jù)子集中所表示的每一候選模糊點(diǎn)的部位使體液或組織樣品與一試劑接觸以便產(chǎn)生醫(yī)學(xué)顯示信號(hào)。該方法的優(yōu)點(diǎn)是無(wú)需再處理那些不產(chǎn)生代表候選模糊點(diǎn)的第一數(shù)據(jù)子集的體液或組織樣品。該方法具有一光學(xué)步驟，利用該步驟可測(cè)定信號(hào)，從而判斷其是否是顯示水平。另一光學(xué)步驟包括將第一和第二圖象數(shù)據(jù)子集之一或二者都轉(zhuǎn)換成更適于用此處所描述的計(jì)算機(jī)控制和處理的表示信號(hào)。在一優(yōu)選實(shí)施例中，圖象數(shù)據(jù)由RGB(紅綠藍(lán))信號(hào)轉(zhuǎn)換成HLS(色調(diào)發(fā)光飽和)信號(hào)。利用濾波器和/或屏蔽可區(qū)分那些滿足預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞而去掉那些不能滿足預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于診斷過(guò)程中的細(xì)胞樣品的制備方法。得到細(xì)胞樣品并以單層的形式固定到基質(zhì)上，細(xì)胞樣品包括以每10000個(gè)細(xì)胞中有不大于1個(gè)的量(即不大于0.01％)存在的稀少細(xì)胞。利用可信號(hào)指示稀少細(xì)胞的存在的計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察覆蓋至少一部分細(xì)胞樣品的光場(chǎng)。檢測(cè)信號(hào)并鑒定被檢測(cè)信號(hào)所處位置的坐標(biāo)，以便進(jìn)行診斷。在一優(yōu)選實(shí)施例中，稀少細(xì)胞以不大于全體細(xì)胞0.001％的量存在。在另一實(shí)施例中稀少細(xì)胞以不大于0.0001％、0.00001％、甚至0.000001％的量存在。
在一特別重要的實(shí)施例中，稀少細(xì)胞是來(lái)自母體血液的細(xì)胞樣品中的胎兒細(xì)胞。在一優(yōu)選實(shí)施例中，樣品只含有不大于0.001％、0.0001％、0.00001％、0.000001％、甚至0.0000001％的自然存在濃度的胎兒細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一特殊實(shí)施例中，待檢測(cè)和診斷的稀少細(xì)胞類型是從動(dòng)物或病人的細(xì)胞或組織樣品中發(fā)現(xiàn)的癌細(xì)胞。樣品可以是血液或含有細(xì)胞的其它體液或組織活檢。正如對(duì)此實(shí)施例所描述的，在以下第五部分所描述的癌細(xì)胞標(biāo)示物(例如GM4蛋白、末期蛋白或核酸、以及p53蛋白或核酸)可用于以一種本發(fā)明的特殊實(shí)施形式測(cè)定到的方式產(chǎn)生第一或第二信號(hào)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，當(dāng)稀少細(xì)胞存在于樣品中時(shí)，本發(fā)明的方法在不小于80％的頻率下檢測(cè)稀少細(xì)胞類型。在另一實(shí)施例中，檢測(cè)頻率不小于85％、90％、95％和99％。
按照本發(fā)明的一個(gè)特別重要的實(shí)施例，提供了一種用于診斷過(guò)程的血樣的制備方法，該方法包括制備含有自然存在濃度的胎兒細(xì)胞的非富集母體血樣涂片；其次利用可信號(hào)顯示胎兒細(xì)胞的存在的計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察覆蓋部分涂片的光場(chǎng)；檢測(cè)所述信號(hào)；然后鑒定涂片中檢測(cè)信號(hào)所處位置的坐標(biāo)，以便進(jìn)行診斷。
在一實(shí)施例中，還要處理信號(hào)以便表示稀少細(xì)胞的形態(tài)測(cè)定。在另一實(shí)施例中，用標(biāo)記物處理細(xì)胞以便加強(qiáng)稀少細(xì)胞與其它細(xì)胞的光學(xué)區(qū)分。在此實(shí)施例中，信號(hào)例如可來(lái)自于選擇性鍵合到稀少細(xì)胞上的標(biāo)記物。在另一實(shí)施例中，診斷過(guò)程涉及到移動(dòng)被鑒定的坐標(biāo)并放大光場(chǎng)一直到圖象是被分離出的稀少細(xì)胞的圖象為止。
在一些實(shí)施例中，光場(chǎng)逐步移到基本上覆蓋了所有細(xì)胞的連續(xù)細(xì)胞部分之上。例如通過(guò)在計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)的控制下相對(duì)于計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)的透鏡移動(dòng)基質(zhì)上的細(xì)胞來(lái)達(dá)到這一目的。在另一實(shí)施例中，鑒定得到第一信號(hào)的坐標(biāo)，然后在鑒定坐標(biāo)之后專門接觸那些坐標(biāo)處的稀少細(xì)胞。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種從細(xì)胞樣品中得到具有相當(dāng)于細(xì)胞樣品中稀少細(xì)胞的診斷顯示標(biāo)志的信號(hào)的方法。稀少細(xì)胞以每10000個(gè)細(xì)胞中具有不大于1個(gè)細(xì)胞的量存在于樣品中。該方法包括制備固定于基質(zhì)上的單層細(xì)胞樣品。稀少細(xì)胞與一試劑接觸以便產(chǎn)生診斷信號(hào)，該診斷信號(hào)具有診斷顯示標(biāo)志。用計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察單層細(xì)胞，以便得到診斷信號(hào)。在另一實(shí)施例中，所定位的信號(hào)用于鑒定稀少細(xì)胞，并且細(xì)胞定位之后得到檢測(cè)信號(hào)在一實(shí)施例中，稀少細(xì)胞以每10000個(gè)細(xì)胞中具有不大于1個(gè)細(xì)胞的量(即不大于細(xì)胞的0.01％)存在于樣品中。在另一實(shí)施例中，稀少細(xì)胞以不大于0.001％、0.00001％或者甚至0.000001％的量而存在。在一特別重要的實(shí)施例中，稀少細(xì)胞是來(lái)自母體血液的細(xì)胞樣品中的胎兒細(xì)胞。優(yōu)選的是，樣品只含有不大于0.001％、0.0001％、0.00001％、0.000001％、甚至0.0000001％的自然存在濃度的胎兒細(xì)胞。
按照本發(fā)明的一個(gè)重要的實(shí)施例，提供了一種得到含有自然存在濃度的胎兒細(xì)胞的非富集母體血樣和具有相當(dāng)于胎兒細(xì)胞的診斷顯示標(biāo)志的信號(hào)的方法。該方法包括制備非富集母體血樣涂片；利用計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察涂片以便得到指示胎兒細(xì)胞存在的第一信號(hào)；使胎兒細(xì)胞與一試劑接觸，從而產(chǎn)生第二信號(hào)，該第二信號(hào)具有診斷顯示標(biāo)志；以及利用計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察胎兒細(xì)胞以便得到第二信號(hào)。在一實(shí)施例中，涂片可包括至少250μl的非富集母體血液，甚至可包括至少500μl的非富集母體血液。
如上所述，還要處理第一信號(hào)，以便表示稀少細(xì)胞的形態(tài)測(cè)定。同理，利用標(biāo)記物處理細(xì)胞以便加強(qiáng)稀少細(xì)胞與其它細(xì)胞(例如母體細(xì)胞)的光學(xué)區(qū)分。為了達(dá)到這一目的，第一信號(hào)來(lái)自于選擇性鍵合到稀少細(xì)胞(例如胎兒細(xì)胞)上的標(biāo)記物。同樣，如上所述，觀察步驟涉及到將光場(chǎng)逐步移到連續(xù)細(xì)胞部分之上，例如通過(guò)在計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)的控制下相對(duì)于計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)的透鏡移動(dòng)細(xì)胞或基質(zhì)來(lái)達(dá)到這一目的。
在上述任一實(shí)施例中，在基質(zhì)上制備細(xì)胞并相對(duì)于基質(zhì)校正坐標(biāo)系統(tǒng)，以便使在一個(gè)步驟中所鑒定的稀少細(xì)胞的坐標(biāo)可返回到隨后的另一步驟中。同樣，在某些重要的實(shí)施例中，基質(zhì)的長(zhǎng)度是其寬度的10倍，基質(zhì)基本上在一個(gè)方向上延長(zhǎng)。其長(zhǎng)度甚至是寬度的20倍。基質(zhì)可以是彈性膜，在一重要實(shí)施例中，基質(zhì)是能夠承載相當(dāng)大體積細(xì)胞(例如來(lái)自于相當(dāng)大體積的涂覆母體血液)的加長(zhǎng)彈性膜。
在上述任一實(shí)施例中，可選擇第一信號(hào)和第二信號(hào)，由此使得當(dāng)這兩個(gè)信號(hào)都存在時(shí)不會(huì)互相屏蔽。同樣，在上述任一實(shí)施例中，可利用原位PCR或PCR原位或熒光原位雜化法(FISH)產(chǎn)生第二信號(hào)。
在一重要實(shí)施例中，基質(zhì)是其上制備有細(xì)胞樣品的許多個(gè)基質(zhì)例如多個(gè)母體血液涂片，每一涂片包括至少5μl的樣品。鑒定含有稀少細(xì)胞的基質(zhì)(其中可得到第一信號(hào))。然后，只處理已經(jīng)鑒定的含有稀少細(xì)胞的基質(zhì)或多個(gè)基質(zhì)，以便產(chǎn)生第二信號(hào)。
按照本發(fā)明的又一方面，提供了一種利用含有自然存在的胎兒細(xì)胞的非富集母體血樣進(jìn)行胎兒診斷的方法。該方法包括制備至少250μl非富集母體血樣的涂片；鑒定涂片中的胎兒細(xì)胞；使胎兒細(xì)胞與一產(chǎn)生診斷信號(hào)的試劑接觸；以及觀察診斷信號(hào)。在一重要實(shí)施例中，鑒定步驟包括觀察涂片中的細(xì)胞、利用計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)以及測(cè)定由指示胎兒細(xì)胞存在的可觀察細(xì)胞標(biāo)志產(chǎn)生的信號(hào)。這些重要實(shí)施例指示出母體血液的體積、基質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及如上所述的那些因素。
按照本發(fā)明的再一方面，提供了一種從含有自然存在濃度的胎兒細(xì)胞的非富集母體血樣中得到基本上分離開的胎兒細(xì)胞的圖象的方法。該方法包括制備至少250μl的非富集母體血樣涂片；利用可顯示胎兒細(xì)胞存在的信號(hào)標(biāo)志的計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察涂片；鑒定所觀察信號(hào)處的坐標(biāo)；將被鑒定的坐標(biāo)移動(dòng)到包含胎兒細(xì)胞圖象的光場(chǎng)中；以及放大光場(chǎng)一直到圖象是被分離出的胎兒細(xì)胞的圖象為止。這些重要實(shí)施例指示出母體血液的體積、基質(zhì)的結(jié)構(gòu)以及如上所述的那些因素。
按照本發(fā)明的又一方面，提供了一種篩選含有自然存在濃度的胎兒細(xì)胞的非富集母體血樣中的胎兒細(xì)胞的裝置，該裝置包括其上具有至少250μl母體血液涂片的彈性膜。在一實(shí)施例中，彈性膜上具有至少500μl的母體血液涂片。在一實(shí)施例中，彈性膜是一加長(zhǎng)膜，其長(zhǎng)度至少是寬度的10倍。特別優(yōu)選的是，彈性膜包括標(biāo)記坐標(biāo)，此處所描述的計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)由此可將細(xì)胞定位成相當(dāng)于膜上的一個(gè)點(diǎn)，如果需要的話，隨后還可使細(xì)胞返回。
按照本發(fā)明的另一方面，提供了一種細(xì)胞樣品中所含的稀少細(xì)胞的篩選裝置，細(xì)胞樣品中每10000個(gè)細(xì)胞中含有不大于1個(gè)的稀少細(xì)胞。該裝置是一其上固定有細(xì)胞樣品的彈性膜，其中彈性膜至少有5英寸長(zhǎng)。在一優(yōu)選實(shí)施例中，彈性膜的長(zhǎng)度至少是其寬度的10倍。在另一重要實(shí)施例中，彈性膜包括標(biāo)記坐標(biāo)，此處所描述的計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)由此可將細(xì)胞定位成相當(dāng)于膜上的一個(gè)點(diǎn)，如果需要的話，隨后還可使細(xì)胞返回。
按照本發(fā)明的又一方面，提供了一種用于將材料分配到載玻片的一個(gè)特定位置上的裝置。該裝置包括用于檢測(cè)指示細(xì)胞樣品中存在稀少細(xì)胞的信號(hào)的微觀系統(tǒng)。該裝置還包括用于鑒定光場(chǎng)中稀少細(xì)胞的坐標(biāo)的裝置。該裝置還附帶有用于分配一定體積材料的分配器和用于使分配器向坐標(biāo)移動(dòng)的裝置，由此使材料可分配到稀少細(xì)胞上。所分配的材料是諸如標(biāo)記物、PCR、引物等試劑。
按照本發(fā)明的另一重要實(shí)施例，通過(guò)使用可提供“合成”圖象的裝置或系統(tǒng)可滿足在盡可能短的時(shí)間內(nèi)篩分大面積的顯微制樣的需要。這是基于同時(shí)使用了一排設(shè)置在一支撐系統(tǒng)上并且能夠在顯微制樣上聚焦的計(jì)算機(jī)控制的物鏡。每一物鏡與電荷耦合攝像器件相連(此處稱作CCD攝像機(jī))，該攝像機(jī)與安裝在主機(jī)中的圖象獲取硬件相連。圖象貯存在計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中并以適當(dāng)?shù)淖笥曳绞胶铣?，從而在?jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中形成了“合成”圖象。利用任何種類的成象方法還可將此“合成”圖象處理成一體，以便檢測(cè)有異議的特殊性質(zhì)。所述系統(tǒng)的顯著優(yōu)點(diǎn)在于其能夠同時(shí)從許多物鏡中獲取圖象，這樣就以與所用的物鏡數(shù)成反比的方式將處理大面積樣品所需的時(shí)間減為最小。
“合成”系統(tǒng)利用透射或反射光可處理任何種類的顯微制樣。尤其有用的是，例如為了處理大量用于篩分和/或診斷目的等的顯微生物制樣，可對(duì)大量樣品強(qiáng)制進(jìn)行顯著的時(shí)間限制。
在附圖中，相同的數(shù)字符號(hào)表示相同的部件。


圖1是總結(jié)本發(fā)明的一個(gè)方法的流程圖；圖2是本發(fā)明的一個(gè)方面的實(shí)施例中所用的分析系統(tǒng)的方框圖；圖3是可檢測(cè)第一信號(hào)的階段I的流程圖；圖4A和圖4B一起表示可檢測(cè)第一信號(hào)的階段II的流程圖；圖5是檢測(cè)第二信號(hào)的流程圖；圖6是實(shí)施本發(fā)明的各種不同裝置的示意圖，利用了連續(xù)涂片技術(shù)；圖7是本發(fā)明的一個(gè)方面的實(shí)施例中所用的分析和時(shí)間分配系統(tǒng)的方框圖；圖8是多個(gè)物鏡顯微系統(tǒng)的草圖；以及圖9是圖象“合成”方法。
以下通過(guò)結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的詳細(xì)描述及其不同的實(shí)施例，本發(fā)明將更好理解。此處是將胎兒細(xì)胞作為稀少細(xì)胞而將血液作為體液或組織樣品來(lái)詳細(xì)描述本發(fā)明的，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將清楚地意識(shí)到，本發(fā)明事實(shí)上可用于基于任何稀有細(xì)胞類型和任何體液或組織樣品的診斷方法中，而這些樣品可能在基質(zhì)上產(chǎn)生單層細(xì)胞。
本發(fā)明范圍內(nèi)的體液或組織樣品包括但不限于血液、組織活檢、脊液、腦膜液、尿液、牙槽液等。對(duì)于細(xì)胞不是以單層形式自然存在的組織樣品，可利用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)分離細(xì)胞。這些技術(shù)包括但不限于組織的胰蛋白酶、膠原酶或dispase處理。
在一重要的特殊實(shí)施例中，本發(fā)明用于檢測(cè)和診斷胎兒細(xì)胞。我們探討的方法與別人探索的基于胎兒細(xì)胞所進(jìn)行的產(chǎn)前診斷非侵入方法恰恰相反。我們的方法無(wú)需濃縮母體血液中的胎兒細(xì)胞濃度，而涉及到鑒定非富集母體血樣中的胎兒細(xì)胞，隨后基于所鑒定的胎兒細(xì)胞原位實(shí)施診斷程序。
如圖1的流程圖所示，本發(fā)明的新方法總結(jié)如下●用非富集的母體血液101制備一個(gè)或多個(gè)血片；●篩分一個(gè)或多個(gè)血片一直到鑒定出預(yù)定數(shù)量的胎兒細(xì)胞(例如有核紅細(xì)胞)并限定出其坐標(biāo)103為止；以及●處理鑒定出胎兒細(xì)胞的涂片或涂片坐標(biāo)，診斷胎兒細(xì)胞105中某一特定遺傳性質(zhì)的存在和缺乏。
在該方法中，給兩個(gè)信號(hào)進(jìn)行了定義，此后稱作第一信號(hào)和第二信號(hào)。此處所用的“信號(hào)”作為一種能夠被檢測(cè)和鑒定并由此承載信息的物理表現(xiàn)形式，應(yīng)該具有其最寬的含義。一個(gè)簡(jiǎn)單和有用的信號(hào)是由選擇性鍵合到感興趣的結(jié)構(gòu)上的熒光染料發(fā)射的光線。該信號(hào)指示出該結(jié)構(gòu)的存在，而如果沒(méi)有熒光染料，這是很難檢測(cè)的。
篩分(screening)103是基于第一信號(hào)。此第一信號(hào)在本實(shí)施例中指示出細(xì)胞的特性，可由鍵合到例如針對(duì)血紅蛋白e鏈(即胚胎血紅蛋白)的抗體上的熒光染料產(chǎn)生。另外，例如，每一細(xì)胞類似于有核紅細(xì)胞特征形態(tài)學(xué)的度量用細(xì)胞識(shí)別算法來(lái)辨別，可作為第一信號(hào)。在另一實(shí)施例中，第一信號(hào)是利用曙紅和酸性蘇木精染色之后胎兒血紅蛋白特征顏色存在的測(cè)量值?，F(xiàn)在應(yīng)該明顯地意識(shí)到，任何可檢測(cè)到的指示胎兒細(xì)胞存在的標(biāo)志都可作為第一信號(hào)，而并不局限于以下所述的幾種表現(xiàn)形式。
診斷105是基于第二信號(hào)。此第二信號(hào)在本實(shí)施例中指示出所檢驗(yàn)的某一特定遺傳性質(zhì)的存在，可由原位PCR放大或PCR原位雜化或FISH產(chǎn)生。發(fā)射這兩個(gè)信號(hào)的細(xì)胞(即胎兒細(xì)胞并含有被檢驗(yàn)的遺傳性質(zhì))將被記錄。一直堅(jiān)持記下所檢測(cè)的第一和第二信號(hào)的數(shù)目和強(qiáng)度。
在一實(shí)施例中，用FISH檢測(cè)特定的核酸序列。在一實(shí)驗(yàn)例中，F(xiàn)ISH包括使稀少細(xì)胞類型(例如胎兒細(xì)胞)的變性試驗(yàn)DNA與變性二氧(DIG)標(biāo)記的基因探針雜化。洗滌含有試驗(yàn)DNA的樣品并使其鍵合到耦合有熒光團(tuán)的抗DIG抗體上?？扇芜x的是，通過(guò)與結(jié)合有熒光團(tuán)的抗Fab抗體保溫可加入第二層熒光團(tuán)(例如FITC)。在一優(yōu)選實(shí)施例中，F(xiàn)ISH包括使稀少細(xì)胞的變性DNA與含有DNA序列的熒光標(biāo)記探針雜化，其中所述DNA序列與直接用某一熒光團(tuán)標(biāo)記的特定靶DNA區(qū)域同源。
利用在光場(chǎng)中將感興趣的物體與其它物體和背景區(qū)分開來(lái)的裝置和方法進(jìn)行自動(dòng)樣品分析。1994年10月4日公開的美國(guó)專利No.5,352,613中公開了一個(gè)自動(dòng)系統(tǒng)的例子。另外，物體一旦被鑒定，就可測(cè)定和貯存其顏色(即組成物體的象素的紅、綠、藍(lán)成分的合成)或者其它與物體相關(guān)的感興趣的參數(shù)。
以下第6部分的實(shí)施例中尤其是第6.2.1、6.2.2和6.3部分描述了自動(dòng)樣品分析裝置和方法的另一例子，并在附圖3-5中示出。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，包括自動(dòng)顯微樣品檢查系統(tǒng)的系統(tǒng)有●樣品貯存和加載及卸載模塊●來(lái)回傳送樣品于自動(dòng)平臺(tái)上的樣品傳送機(jī)構(gòu)，該平臺(tái)使樣品移動(dòng)到顯微物鏡陣列之下●一排CCD攝像機(jī)●包括硬件、多個(gè)控制顯微系統(tǒng)的所有機(jī)械部件的控制器和連有CCD攝像機(jī)的高速圖象處理單元的處理單元。
計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)的這個(gè)實(shí)施例的創(chuàng)新之處在于一排兩個(gè)或多個(gè)具有相同光學(xué)性質(zhì)的物鏡(如圖8所示)。這些物鏡排成一行，每一物鏡都具有自己的Z軸運(yùn)動(dòng)機(jī)構(gòu)，從而其可以各自聚焦(801)。該系統(tǒng)配有合適的機(jī)構(gòu)，從而使多個(gè)物體支撐件可互換，以便適應(yīng)普通單鏡頭顯微鏡所能覆蓋的同種倍率需求。通常光照顯微鏡物鏡的倍率范圍在1X-100X之間。
每一物鏡與各自的CCD攝像機(jī)(803)相連。攝像機(jī)的視野特性可使其獲得物鏡所提供的光場(chǎng)的整個(gè)區(qū)域。
每一攝像機(jī)與一圖象獲取裝置(804)相連。其安裝在主機(jī)中。對(duì)于所獲得的每個(gè)光場(chǎng)，計(jì)算機(jī)記錄顯微樣品在其上的物理位置。提供利用計(jì)算機(jī)控制的x-y機(jī)械平臺(tái)(805)可達(dá)到此目的。攝像機(jī)提供的圖象被數(shù)字化并貯存在主機(jī)的存儲(chǔ)器中。每一物鏡具有電流系統(tǒng)，可同時(shí)向計(jì)算機(jī)提供圖象，而每一圖象都包括某一部分樣品面積。應(yīng)該適當(dāng)?shù)匦Ｕ镧R的色差，以便使圖象沿其整個(gè)面積具有穩(wěn)定的質(zhì)量特性。
圖象的物理距離相互不同。該距離是物鏡設(shè)置距離的作用結(jié)果并取決于物鏡的物理尺寸。它還決定于物鏡的性質(zhì)即數(shù)值孔徑和放大率規(guī)格，這些性質(zhì)會(huì)影響所獲得的光場(chǎng)面積。因此，由于物鏡的放大率/數(shù)值孔徑不同，所獲得的圖象的物理位置也將不同。
在使用時(shí)計(jì)算機(jī)將保持物鏡陣列的特征磁道以及監(jiān)測(cè)平臺(tái)的位置。可利用每一圖象的貯存特性以使校正位置的圖象與圖9所示的計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中的虛象即“合成”圖象匹配。
例如，當(dāng)主機(jī)啟動(dòng)時(shí)，樣品平臺(tái)移動(dòng)到初始(x1，y1)位置。在該位置獲得圖象之后，平臺(tái)以側(cè)向方式移動(dòng)到一個(gè)新位置(x2，y2)。然后獲得一系列新的圖象并貯存起來(lái)。如圖9所示，在步驟1中，用數(shù)字“1”表示的圖象片段被捕獲并貯存起來(lái)。在步驟2中，片段“2”被貯存。在步驟3中，片段“3”被貯存。當(dāng)獲得連續(xù)的圖象片段時(shí)，在計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中就“合成”了全象。
控制上述結(jié)構(gòu)的主機(jī)系統(tǒng)由通過(guò)合適的裝置驅(qū)動(dòng)器控制系統(tǒng)的所有機(jī)械部件的軟件系統(tǒng)驅(qū)動(dòng)。軟件還包括設(shè)計(jì)得當(dāng)?shù)膱D象組合法，該方法組合計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中的數(shù)字化圖象并將所合成的圖象提供給處理單元以進(jìn)行下一步運(yùn)算。通過(guò)圖象分解，可檢測(cè)到特定樣品的合成與圖象處理特性。
在本發(fā)明的所有自動(dòng)樣品實(shí)施例中，如果首先測(cè)定第一信號(hào)的產(chǎn)生，其次鑒定細(xì)胞的特性，那么將利用自動(dòng)光學(xué)顯微鏡觀察一個(gè)或多個(gè)涂片，以便勾畫出所需數(shù)目的胎兒細(xì)胞的坐標(biāo)圖。只有那些發(fā)現(xiàn)有胎兒細(xì)胞的涂片才需要處理，以便產(chǎn)生第二信號(hào)，來(lái)鑒定所試驗(yàn)的特定遺傳性質(zhì)的存在。自動(dòng)圖象分析法用于搜索在胎兒細(xì)胞的預(yù)定坐標(biāo)處以及控制母體細(xì)胞的預(yù)定坐標(biāo)處是否存在第二信號(hào)。該過(guò)程也可反過(guò)來(lái)，即首先觀察遺傳異常的信號(hào)，然后觀察細(xì)胞發(fā)射的信號(hào)以判定其是否是胎兒細(xì)胞。甚至可同時(shí)觀察這兩個(gè)信號(hào)，搜索在一個(gè)坐標(biāo)處是否同時(shí)存在兩個(gè)信號(hào)或者甚至只存在一個(gè)信號(hào)，而該信號(hào)是兩個(gè)分量交叉的結(jié)果(例如第一信號(hào)與配對(duì)‘信號(hào)’的淬火，第一信號(hào)用于鑒定細(xì)胞類型，而配對(duì)‘信號(hào)’用于鑒定遺傳異常)。
第一和第二信號(hào)產(chǎn)生的要求和限制相對(duì)簡(jiǎn)單。用于產(chǎn)生第一信號(hào)的材料和技術(shù)對(duì)用于產(chǎn)生第二信號(hào)的材料和技術(shù)的不利干擾程度不會(huì)影響診斷。它們對(duì)待測(cè)細(xì)胞的損害或改變程度也不會(huì)影響診斷。最后，對(duì)細(xì)胞需要或要求進(jìn)行的其它任何處理程序?qū)τ糜诋a(chǎn)生第一和第二信號(hào)的材料或技術(shù)的干擾程度都不會(huì)影響診斷。在這個(gè)限制范圍內(nèi)，可使用任何適宜的第一和第二信號(hào)發(fā)生器。
本發(fā)明的實(shí)施例的特征在于(i)無(wú)需富集(或者是如果已經(jīng)部分富集則再進(jìn)一步富集)母體血液中的胎兒細(xì)胞濃度，鑒定非富集母體血樣中的胎兒細(xì)胞并用于下一個(gè)處理程序中；以及(ii)在一些實(shí)施例中只在已經(jīng)染色和處理過(guò)的或者其中已經(jīng)檢測(cè)到胎兒細(xì)胞的涂片或涂片坐標(biāo)上進(jìn)行適當(dāng)?shù)膯蝹€(gè)細(xì)胞檢測(cè)方法例如原位PCR和/或PCR原位雜化法。
雖然在一重要實(shí)施例中所用的母體血液含有自然存在濃度的胎兒細(xì)胞，但是本發(fā)明意指還包括胎兒細(xì)胞已經(jīng)部分富集的母體血液。根據(jù)已有技術(shù)，本發(fā)明的目標(biāo)是得到盡可能多的富集液，以便獲得比每1000母體細(xì)胞中有1個(gè)胎兒細(xì)胞大的胎兒細(xì)胞濃度。本發(fā)明的目標(biāo)尤其是將胎兒細(xì)胞從母體細(xì)胞中完全分離出來(lái)。按照本發(fā)明，所用的細(xì)胞樣品中稀少細(xì)胞以每10000個(gè)細(xì)胞中有不大于1個(gè)(即不大于0.01％)的數(shù)量存在。這樣，可利用簡(jiǎn)單的處理方法例如簡(jiǎn)單的分餾方法(諸如離心或密度梯度)等來(lái)部分富集母體血樣中的胎兒細(xì)胞。當(dāng)使用含有胎兒細(xì)胞的細(xì)胞樣品時(shí)該處理方法在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，此時(shí)胎兒細(xì)胞的濃度不大于0.01％。如上所述，在一些非常重要的實(shí)施例中本發(fā)明所采用的稀少細(xì)胞濃度為0.001％、0.0001％、0.00001％、0.000001％，甚至0.0000001％。母體血液中胎兒細(xì)胞的典型濃度在105個(gè)母體細(xì)胞中有1個(gè)胎兒細(xì)胞至109個(gè)母體細(xì)胞中有1個(gè)胎兒細(xì)胞之間。因此，在母體血液中胎兒細(xì)胞典型自然出現(xiàn)的整個(gè)濃度范圍內(nèi)本發(fā)明都是可用的。
在本發(fā)明的一個(gè)特殊實(shí)施例中，當(dāng)稀少細(xì)胞類型存在于樣品中時(shí)，本發(fā)明的方法以不小于80％的頻率檢測(cè)稀少細(xì)胞類型。在其它實(shí)施例中，檢測(cè)頻率不小于85％、90％、95％和99％。
除了檢測(cè)正發(fā)育胎兒的遺傳異常之外，上述方法還可用于必需檢測(cè)稀少細(xì)胞的任何情形。尤其是，本發(fā)明可用于檢測(cè)來(lái)自稀少細(xì)胞信號(hào)的任何情形，其中稀少細(xì)胞以每10000個(gè)其它細(xì)胞中有不大于1個(gè)的濃度存在。本發(fā)明特別適合用于這樣的條件下，即稀少細(xì)胞與其它細(xì)胞可表型區(qū)分開，由此先利用第一信號(hào)鑒定稀少細(xì)胞，然后利用第二信號(hào)測(cè)定所鑒定細(xì)胞的遺傳性質(zhì)。
利用本發(fā)明的稀少細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)可診斷任何染色體異常和孟德爾遺傳特性。唯一的前提是要知道潛在的分子缺陷。利用單個(gè)熒光團(tuán)標(biāo)記單個(gè)等位基因可產(chǎn)生能夠同時(shí)檢驗(yàn)的突變數(shù)目上限，然而利用組合化學(xué)可大大增加能夠同時(shí)標(biāo)記和檢測(cè)的等位基因特異性突變的數(shù)目。本發(fā)明范圍內(nèi)的染色體異常包括但不限于三染色體21、18、13和六染色體異常例如XXX、XXY、XYY。利用組合化學(xué)，本發(fā)明的方法可用于診斷在遺傳障隘和癌癥中所觀察到的許多移位。本發(fā)明范圍內(nèi)的孟德爾遺傳障隘疾病包括但不限于膀胱纖維變性、血色病、高脂血癥、馬方綜合癥和其它遺傳性障隘疾病(例如結(jié)締組織、血紅蛋白病、家族性黑蒙性綜合癥或突變已知的任何其它遺傳障隘疾病。利用組合化學(xué)染料同時(shí)標(biāo)記和檢測(cè)許多等位基因，由此可檢測(cè)到普通障隘疾病(例如哮喘)的預(yù)布置遺傳和/或針對(duì)癌癥(例如前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、白血病、淋巴瘤等)的幾個(gè)分子標(biāo)記物的存在。
本發(fā)明的一個(gè)特別重要的用途是用于癌癥領(lǐng)域。特殊類型的癌細(xì)胞可從非癌細(xì)胞背景下在形態(tài)上識(shí)別出來(lái)。因此癌細(xì)胞的形態(tài)可用作第一信號(hào)。熱振蕩蛋白還可作為大多數(shù)惡性癌癥的表達(dá)標(biāo)記物?？衫锰禺愑跓嵴袷幍鞍椎臉?biāo)記抗體例如熒光標(biāo)記的抗體來(lái)產(chǎn)生第一信號(hào)。同樣，可利用特異于某些癌癥或某些組織的抗原(例如前列腺特異性抗原)和特異于癌癥或組織抗原(例如前列腺特異性抗原)抗體來(lái)產(chǎn)生指示這些癌細(xì)胞存在的第一信號(hào)。
一旦由第一信號(hào)鑒定出癌細(xì)胞，則產(chǎn)生第二信號(hào)用于提供更多的有關(guān)癌癥的信息。例如，乳腺癌對(duì)壽命的危險(xiǎn)性在BRGA1或BRCA2位發(fā)生起始突變的女人中達(dá)到80-90％。這些基因的各種突變都是公知的并且業(yè)已報(bào)導(dǎo)過(guò)。
前列腺癌在某種程度上對(duì)于病理學(xué)家來(lái)說(shuō)其表現(xiàn)是獨(dú)特的，即由于其組織的紊亂排列而難以確定診斷標(biāo)準(zhǔn)。為了將該疾病的病理學(xué)與其自然歷史相關(guān)聯(lián)起來(lái)，重要的是分析和記錄前列腺癌中發(fā)現(xiàn)的基因異常。這些基因異常包括公知的P53、ras、Rb、循環(huán)(cyclin-dependent)激酶、致癌基因和腫瘤校正基因的突變。已知在大顆粒淋巴細(xì)胞增生中具有T細(xì)胞受體基因重排。已知在急性成淋巴細(xì)胞白血病和非何杰金淋巴瘤中具有T細(xì)胞三角區(qū)基因重排。
這樣，按照本發(fā)明在其它細(xì)胞的背景下可對(duì)稀少癌細(xì)胞進(jìn)行鑒定和定性。其特征在于決定進(jìn)行癌細(xì)胞是否存在的診斷、確定癌癥的類型、通過(guò)測(cè)定是否存在與癌癥的危險(xiǎn)性等有關(guān)的基因變化來(lái)測(cè)定癌癥的危險(xiǎn)。正如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所意識(shí)到的，以下標(biāo)記物中的一些既可用作第一信號(hào)也可用作第二信號(hào)，這取決于本發(fā)明的目的。這些標(biāo)記物包括●人腫瘤特異性抗體GM4。該抗體優(yōu)選的是可與黑瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤反應(yīng)。
●骨形態(tài)蛋白質(zhì)(BMPs)。骨轉(zhuǎn)移是前列腺癌中的普遍現(xiàn)象并且在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)出一些BMPs。
●生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因在結(jié)構(gòu)和表達(dá)形式上的異常可導(dǎo)致惡性變異和腫瘤發(fā)展。
●蛋白酪氨酸激酶。這種激酶在食管癌中過(guò)分表達(dá)并且在增生調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。
●端粒酶(hTRT)。在一些癌組織中出現(xiàn)了hTRT高位表達(dá)。
●p53、c-erbB-2和p2lras。這些基因在卵巢瘤中過(guò)分表達(dá)。卵巢癌的發(fā)展是幾個(gè)癌癥發(fā)生基因作用的最終結(jié)果。
●原始致癌基因中的BCL-2族。這些基因是apoptosisd的臨界調(diào)節(jié)劑，它們的表達(dá)形式在人的癌癥(包括大多數(shù)類型的白血病和淋巴瘤中的某一些)中頻繁地變化。
●eKi-ras和c-myc。這些基因的突變與腫瘤發(fā)起和直腸癌的發(fā)展有關(guān)。
●APC、p53和DCC。這些基因關(guān)系到結(jié)腸直腸腫瘤的致癌作用。處理方法需要與所公知的腫瘤基因圖譜配合。
基因變化的標(biāo)記物能夠評(píng)估癌癥的危險(xiǎn)。它們可提供有關(guān)暴露給致癌劑的信息。還可早期檢測(cè)由暴露給致癌物所引起的變化并鑒定其癌癥發(fā)展具有相當(dāng)高危險(xiǎn)性的個(gè)體。這些標(biāo)記物包括膀胱癌中染色體9上的LOH以及惡性腫瘤發(fā)生中所檢測(cè)到的染色體1p的遺失和染色體7、17和8的增加/損失。
肺癌的發(fā)展要求許多遺傳變化。致癌基因的活化形式包括K-ras和myc。腫瘤校正基因的失活形式包括Rb、p53和CDKN2。產(chǎn)生異常的特異性基因的鑒定對(duì)于早期檢測(cè)預(yù)定要變成惡性的細(xì)胞并鑒定藥物和基于基因療法的潛在目標(biāo)是有用的。
成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤途徑中的基因突變關(guān)系到許多腫瘤類型的形態(tài)。腫瘤發(fā)展期涉及的兩個(gè)臨界成分是p16/CDKN2A和CDK4。前者的異常形式在包括黑素瘤的許多癌癥中都得到了很好的證實(shí)。而后者的異常形式卻很少見。
四個(gè)失配修復(fù)基因(hMSH2、hMLH1、hPMS1和hPMS2)之一的突變占70％的HNPCC。
染色體11p15.5在維爾姆斯瘤、橫紋肌肉瘤、腎上腺皮質(zhì)癌和肺、卵巢及前列腺癌中是顯現(xiàn)LOH的重要腫瘤校正基因區(qū)域。
通過(guò)獨(dú)特的基因融合序列在數(shù)字上少有的白血病細(xì)胞的鑒定包括MLL-AF4和PML/RAR(在急性早幼粒細(xì)胞白血病中)。
已知在大顆粒淋巴細(xì)胞增生中具有T細(xì)胞受體基因重排。
已知在急性成淋巴細(xì)胞白血病和非何杰金淋巴瘤中具有T細(xì)胞三角形基因重排。
FAB是由導(dǎo)致結(jié)腸直腸粘膜的許多腺瘤的APC基因突變引起的。
對(duì)本發(fā)明的描述涉及到觀察“單層”細(xì)胞。單層用在此處具有特殊意義。它不要求群集，但涉及到單個(gè)細(xì)胞懸浮體。它簡(jiǎn)單地指細(xì)胞的排列使其不會(huì)一個(gè)堆積在另一個(gè)的頂部，雖然所有細(xì)胞是彼此分離的。這樣，單層可以是一個(gè)細(xì)胞懸浮體的涂片或一薄層組織?？衫萌魏喂腆w或剝脫細(xì)胞技術(shù)。
對(duì)本發(fā)明的描述還涉及到對(duì)一對(duì)信號(hào)的鑒定，其中一個(gè)信號(hào)可鑒定靶稀少細(xì)胞(例如胎兒細(xì)胞)，而另一信號(hào)有益于評(píng)估諸如具有遺傳缺陷的胎兒細(xì)胞這樣細(xì)胞的狀態(tài)。應(yīng)該理解，按照某些實(shí)施例，只需檢測(cè)一個(gè)信號(hào)。例如，當(dāng)胎兒細(xì)胞承載Y染色體時(shí)，診斷是針對(duì)Y染色體的異常進(jìn)行的，其次鑒定遺傳異常的信號(hào)才與鑒定胎兒細(xì)胞的信號(hào)一致。而在另一例子中，單個(gè)信號(hào)是用于觀測(cè)特性是隱性特性的情形。一對(duì)信號(hào)可用于檢測(cè)兩個(gè)等位基因的存在或者以下情形的存在，即由兩個(gè)或多個(gè)不同基因突變的存在來(lái)進(jìn)行診斷的情形。在這些情形中這對(duì)信號(hào)(甚至幾個(gè)信號(hào))可鑒定表型和具有該表型的細(xì)胞。這樣的實(shí)施例對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的。
6、實(shí)施例部分6.1.涂片的制備由置于玻璃顯微片上的一份10μl全血制備涂片。涂片可由臍帶血和母體循環(huán)血液制備并進(jìn)行空氣干燥。
6.1.1.細(xì)胞固定在利用原位PCR或PCR原位雜化進(jìn)行細(xì)胞滲透之前涂片的固定是在以下三個(gè)條件之一下進(jìn)行的(i)涂片在冰凍甲醇中固定10分鐘-16小時(shí)。(ii)涂片在冰凍10％的緩沖福爾馬林中固定10分鐘-16小時(shí)。(iii)涂片在2％的仲甲醛中固定10分鐘-16小時(shí)。固定之后，涂片在室溫下用磷酸緩沖鹽水沖洗三次、10分鐘。然后對(duì)涂片進(jìn)行空氣干燥。
6.1.2.細(xì)胞染色多色染色涂片用賴特白血球著色劑覆蓋并在室溫下保溫1-2分鐘。然后加入蒸餾水(2.5ml)以便稀釋著色劑并在室溫下繼續(xù)保溫3-6分鐘。然后用流動(dòng)水快速?zèng)_掉著色劑并將1∶10稀釋的吉姆薩染劑加到玻片上。在室溫下保溫5分鐘，然后用流動(dòng)水快速?zèng)_掉染劑。再對(duì)涂片進(jìn)行空氣干燥。
抗體染色用抗胚胎血紅蛋白(血紅蛋白鏈)單克隆抗體覆蓋涂片并在室溫下保溫1-3小時(shí)。然后玻片在室溫下用磷酸緩沖鹽水洗滌兩次、5分鐘。然后加入第二抗體(結(jié)合到藻紅素上的抗鼠抗體)并使玻片在37℃下保溫30分鐘。然后玻片在室溫下用磷酸緩沖鹽水沖洗兩次、5分鐘并進(jìn)行空氣干燥。
胎兒血紅蛋白染色涂片在80％乙醇中固定5-10分鐘，其次用龍頭水沖洗并空氣干燥。在37℃水浴中在科普林缸內(nèi)預(yù)加熱檸檬酸-磷酸鹽緩沖劑(37.7ml、0.1M的檸檬酸，12.3ml、0.2M的Na2HPO4，pH3.3)。然后將所固定的涂片加入到科普林缸內(nèi)并在37℃下保溫5分鐘。然后用龍頭水沖洗涂片并用0.1％蘇木精染色1分鐘。再用龍頭水沖洗涂片并用0.1％曙紅染色1分鐘。用龍頭水最后沖洗涂片并進(jìn)行干燥。
細(xì)胞滲透通過(guò)在蛋白酶K(1-5mg/ml的磷酸緩沖鹽水)或胃蛋白酶(2-5mg/ml 0.01M的鹽酸)中保溫可完成細(xì)胞滲透。保溫是在室溫下進(jìn)行1-30分鐘。滲透之后，涂片在室溫下用磷酸緩沖鹽水洗滌5分鐘，再在室溫下用100％乙醇洗滌1分鐘。然后對(duì)涂片進(jìn)行空氣干燥。
PCR原位雜化為了進(jìn)行PCR原位雜化，用50μl的放大液覆蓋涂片。放大液在含水的封閉劑中包括10mM Tris-鹽酸(pH8.3)、90mM的氯化鉀、1-5mM的氯化鎂、200μM的dATP、200μM的dCTP、200μM的dGTP、200μM的dTTP、1μM前端引物、1μM反向引物和5-10單位的耐熱DNA聚合酶。然后將玻璃蓋板放到放大液上并將玻片轉(zhuǎn)到熱循環(huán)器中。在94℃下完成4分鐘的初始變性步驟之后，使玻片進(jìn)行25-35周期的放大，其中每一周期放大都包括94℃下變性1分鐘、55℃下退火1分鐘以及72℃下拉伸1分鐘。其次通過(guò)在室溫下將玻片在磷酸緩沖鹽水中保溫10分鐘而去掉蓋板，再使玻片進(jìn)行空氣干燥。然后加入熒光素標(biāo)記的低核苷酸探針雜化緩沖劑并用玻璃蓋板覆蓋玻片，在94℃下保溫10分鐘，再在37℃下保溫1小時(shí)。然后通過(guò)在室溫下將玻片在磷酸緩沖鹽水中保溫10分鐘而去掉蓋板，其次玻片在室溫下用磷酸緩沖鹽水洗滌兩次、5分鐘。用蛋白封閉液(1％牛血清白蛋白、2.5％羊血清、0.2％吐溫-20)覆蓋玻片并在室溫下保溫10分鐘。然后去掉蓋板并在室溫下用磷酸緩沖鹽水洗滌玻片3次、5分鐘。用鼠抗熒光素單克隆抗體覆蓋涂片并在室溫下保溫20分鐘。其次倒掉溶液并在室溫下用磷酸緩沖鹽水洗滌玻片3次、5分鐘。然后用生物素化羊抗鼠F(ab)2覆蓋涂片并在室溫下保溫20分鐘。倒掉溶液并在室溫下用磷酸緩沖鹽水洗滌玻片3次、5分鐘。用結(jié)合有抗生蛋白鏈菌素的堿性磷酸酶覆蓋涂片并在室溫下保溫20分鐘。倒掉溶液并在室溫下用磷酸緩沖鹽水洗滌玻片兩次。將堿性磷酸酶底物溶液(50mg/ml BCIP、75mg/ml NBT)加到涂片上并在37℃下保溫10分鐘-2小時(shí)。然后將玻片在室溫下用蒸餾水洗滌兩次并進(jìn)行空氣干燥。
原位PCR為了進(jìn)行原位PCR，用50μ1放大液覆蓋涂片。放大液在含水的封閉劑中包括10mM Tris-鹽酸(pH8.3)、90mM的氯化鉀、1-5mM的氯化鎂、200μM的dATP、200μM的dCTP、200μM的dGTP、0.5μM的〖R110〗dUTP、1μM前端引物、1μM反向引物和5-10單位的耐熱DNA聚合酶。然后將玻璃蓋板放到放大液上并將玻片轉(zhuǎn)到熱循環(huán)器中。在94℃下完成4分鐘的初始變性步驟之后，使玻片進(jìn)行25-35周期的放大，其中每一周期的放大都包括94℃下變性1分鐘、55℃下退火1分鐘以及72℃下拉伸1分鐘。其次通過(guò)在室溫下將玻片在磷酸緩沖鹽水中保溫10分鐘而去掉蓋板，再使玻片進(jìn)行空氣干燥。
6.2.自動(dòng)涂片分析以上已經(jīng)簡(jiǎn)單總結(jié)了自動(dòng)涂片分析技術(shù)。現(xiàn)在描述本實(shí)施例中所用的裝置和方法。
6.2.1.裝置圖2的方框圖示出了適于實(shí)施本發(fā)明的系統(tǒng)的基本部件。這些系統(tǒng)的基本部件包括X-Y平臺(tái)201、汞光源203、配有電動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)盤(轉(zhuǎn)換盤)207的熒光顯微鏡205、彩色CCD攝像機(jī)209、個(gè)人計(jì)算機(jī)(PC)系統(tǒng)211以及一個(gè)或兩個(gè)監(jiān)測(cè)器213、215。
系統(tǒng)的各個(gè)部件是定制的或者作為標(biāo)準(zhǔn)部件現(xiàn)貨購(gòu)買的?，F(xiàn)在更詳細(xì)地描述每個(gè)部件。
X-Y平臺(tái)201是適于同所選擇的顯微鏡205一起使用的任何電動(dòng)定位平臺(tái)。優(yōu)選的是，X-Y平臺(tái)201可以是能夠與個(gè)人計(jì)算機(jī)相連并利用專門編輯的軟件命令電子控制的電動(dòng)平臺(tái)。當(dāng)使用這樣的電子控制的X-Y平臺(tái)201時(shí)，將一平臺(tái)控制器線路卡插入將平臺(tái)201連接到PC211上的PC211擴(kuò)展總線上。還可人工驅(qū)動(dòng)平臺(tái)201。諸如此處所述的電子控制平臺(tái)可由顯微鏡生產(chǎn)商例如包括奧林巴斯(Tokyo，日本)以及其他生產(chǎn)商例如LUDL(NY，美國(guó))制造。
顯微鏡205可是任何熒光顯微鏡，其配有反射光熒光反光鏡203、具有20x的電動(dòng)物鏡轉(zhuǎn)盤207和油浸60x或63x的物鏡并具有600x的最高放大倍率。電動(dòng)轉(zhuǎn)盤207優(yōu)選地與PC211相連并利用專門編輯的軟件命令在連續(xù)的放大倍率之間可電子開關(guān)。當(dāng)使用電子控制的電動(dòng)轉(zhuǎn)盤207時(shí)，轉(zhuǎn)盤控制器線路卡可插入將平臺(tái)201連到PC211上的PC211擴(kuò)展總線上。設(shè)立的顯微鏡205和平臺(tái)201包括一汞光源203，可提供穩(wěn)定的、甚至是整個(gè)光場(chǎng)的照明度。
顯微鏡205產(chǎn)生攝像機(jī)209所觀察到的圖象。攝像機(jī)209可以是任何3個(gè)單片的CCD攝像機(jī)或其它連有電子輸出并提供高靈敏度和分辨率的攝像機(jī)。攝像機(jī)209的輸出端饋給安裝在PC211內(nèi)的一個(gè)幀接收器和圖象處理器電路板。據(jù)發(fā)現(xiàn)，合適的攝像機(jī)是SONY930(SONY，日本)。
不同的幀接收器系統(tǒng)都可與本發(fā)明一起使用。例如該幀接收器可以是從MATROX(Montreal，CANADA)購(gòu)買的MATROX IM-CLD(彩色圖象捕獲模式)和MATROX IM-640(圖象處理模式)牌的組合產(chǎn)品。MATROX IM-640模式的特性是具有裝載硬件支撐圖象處理的性能。這些性能附合MATROX IMAGING LIBRARY(MIL)軟件包的性能。因此，可相當(dāng)快地執(zhí)行基于MIL的軟件算法。MATROX盤支撐專用的SVGA監(jiān)測(cè)器的顯示器。該專用監(jiān)測(cè)器不是與PC系統(tǒng)211經(jīng)常使用的那種監(jiān)測(cè)器。可使用適于和MATROX圖象處理盤一起使用的任何SVGA監(jiān)測(cè)器。一種與本發(fā)明配合使用的專用監(jiān)測(cè)器是ViewSonic 4E(WalnutCreek，CA)SVGA監(jiān)測(cè)器。
為了具有足夠有價(jià)值的處理和貯存性能，PC211可以是任何至少具有32MB RAM和2GB硬盤驅(qū)動(dòng)貯存空間的基于INTEL PENTIUM的PC。PC211最好還包括一監(jiān)測(cè)器。除了此處所描述的特殊性質(zhì)外，PC211是傳統(tǒng)機(jī)型并可包括鍵盤、打印機(jī)或其它所需的外圍設(shè)備(未示出)。
6.2.2.方法PC211執(zhí)行利用MATROX IMAGING LIBRARY(MIL)在MICROSOFT C++中編輯的涂片分析軟件程序。MIL是功能軟件庫(kù)，包括那些控制幀接收器211的操作的軟件和為了作為磁盤文件隨后貯存到PC211中而處理由幀接收器捕獲的圖象的軟件。MIL包括許多特別適于完成諸如濾波、物鏡選擇和不同的測(cè)量功能這些圖象處理任務(wù)的特殊圖象處理途徑。涂片分析軟件程序可作為WINDOWS95的一種應(yīng)用。在計(jì)算機(jī)監(jiān)測(cè)器上顯示程序提示和測(cè)量結(jié)果，而通過(guò)成象硬件211獲得的圖象顯示在專門的成象監(jiān)測(cè)器215上。
為了利用涂片分析程序處理顯微圖象，首先應(yīng)校正系統(tǒng)。校正可補(bǔ)償隨著一天天流失的性能偏差以及顯微鏡、攝像機(jī)等相互之間的偏差。在該狀態(tài)下可觀察到校正圖象并列出了以下校正參數(shù)●系統(tǒng)的顏色響應(yīng)；●在含有要篩選胎兒細(xì)胞的涂片的玻片上的面積尺寸或界限；●使用20x和60x(或63x)的放大倍率時(shí)的光場(chǎng)的實(shí)際尺寸；以及●使用20x和60x(或63x)的放大倍率時(shí)的最小和最大胎兒核心面積。
6.2.3.第一(鑒定)信號(hào)的檢測(cè)胎兒細(xì)胞檢測(cè)法可分兩個(gè)階段進(jìn)行。第一是如圖3的流程圖所示的預(yù)篩階段I，其中用低倍率和高速度可鑒定出可能存在胎兒細(xì)胞的位置。選擇20x的物鏡并開始搜索胎兒細(xì)胞●程序?qū)⒆詣?dòng)平臺(tái)(圖2，201)移動(dòng)到預(yù)置起點(diǎn)(例如含有涂片的玻片的一角)(步驟301)。
●記錄光場(chǎng)中預(yù)置起點(diǎn)處平臺(tái)的X-Y位置(步驟303)。
●利用CCD攝像機(jī)209獲得光場(chǎng)(步驟305)并以RGB(紅/綠/藍(lán))圖象的形式傳送給PC211。
●將RGB圖象轉(zhuǎn)換成HLS(色調(diào)/發(fā)光/飽和)表示形式(步驟307)。
●色調(diào)分量是作為黑白圖象被二進(jìn)位編碼的，從而將具有190-255色調(diào)值的象素設(shè)置到零(黑)，其表示感興趣的面積(多個(gè)點(diǎn))，而每個(gè)其它象素值設(shè)置到255(白，背景)。這些點(diǎn)代表可能存在的胎兒細(xì)胞的核心面積。
●測(cè)量二進(jìn)位編碼圖象中的每個(gè)點(diǎn)的面積。如果在20x的倍率下，則其尺寸在大約20-200象素的范圍之外，點(diǎn)的象素設(shè)置到值255(背景)；它們被從其它處理步驟中排除出來(lái)(步驟311、313、315和317)。
●然后利用定制的MATROX功能計(jì)算每個(gè)點(diǎn)質(zhì)量中心(CG)的坐標(biāo)(步驟3)。該斑點(diǎn)的質(zhì)量中心是從薄而密度均勻的斑點(diǎn)材料層中切去的部分可在此處得到平衡的那一點(diǎn)。將這些坐標(biāo)貯存到沿電流光場(chǎng)的X-Y位置的數(shù)據(jù)庫(kù)中，從而利用較高的放大倍率斑點(diǎn)又可在下一處理階段定位。
●類似地處理另一光場(chǎng)，記錄每個(gè)連續(xù)光場(chǎng)的X-Y位置，一直到覆蓋整個(gè)玻片為止(步驟321和323)。
圖4A和4B的流程圖示出的階段II包括最終的胎兒細(xì)胞的識(shí)別過(guò)程●選擇63x放大倍率(步驟401)。
●程序移動(dòng)自動(dòng)平臺(tái)(圖2，201)，以便使早期發(fā)現(xiàn)的CG的第一位置坐標(biāo)即可能的胎兒細(xì)胞核心面積位于光場(chǎng)的中心(步驟403)。
●用CCD攝像機(jī)獲得光場(chǎng)(圖2，209)并以RGB圖象形式傳送給計(jì)算機(jī)(步驟405)。
●將RGB圖象轉(zhuǎn)換成HLS模式(步驟407)。
●然后通過(guò)對(duì)其發(fā)光值等于每個(gè)可能的發(fā)光值的虛象進(jìn)行計(jì)數(shù)而使程序產(chǎn)生發(fā)光直方圖(步驟409)。將該數(shù)目作為一個(gè)長(zhǎng)256的陣列貯存起來(lái)，該陣列含有的虛象數(shù)具有對(duì)應(yīng)于陣列中每個(gè)指數(shù)的灰度級(jí)值。
●其次程序分析光度分布曲線(以陣列中所貯存的值表示)(步驟411)，并定位最后的峰值。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，這個(gè)峰包括代表圖象中的等離子面積的虛象值。分析光度分布曲線的作用計(jì)算滑動(dòng)曲線的9點(diǎn)移動(dòng)平均值；計(jì)算由10點(diǎn)灰度級(jí)遠(yuǎn)值所限定的切線；在一定程度上計(jì)算這些線的斜率；找出曲線的斜率是零的連續(xù)點(diǎn)并且如果這些點(diǎn)表示最小值(曲線中的谷值)就將這些點(diǎn)(灰度級(jí))設(shè)置成-1，如果表示最大值(曲線中的峰值)就將其設(shè)置成1；然后通過(guò)找出灰度級(jí)值的陣列中的1或-1的位置而找出曲線中的峰或谷的位置。
●然后將程序設(shè)置成一個(gè)切開值，即虛象的灰度級(jí)值位于在分布曲線的最后峰之前出現(xiàn)的光度分布曲線的谷中(步驟413)。
●然后利用這個(gè)切開值，程序產(chǎn)生第二二進(jìn)制編碼圖象。這是個(gè)黑白圖象，其中與灰度級(jí)值小于切開點(diǎn)的發(fā)光圖象中虛象相對(duì)應(yīng)的虛象被設(shè)置成255(白)，而與灰度級(jí)值大于切開點(diǎn)的發(fā)光圖象中虛象相對(duì)應(yīng)的虛象被設(shè)置成0(黑)。該圖象的白斑點(diǎn)表示細(xì)胞，而黑面積表示非細(xì)胞面積。
●將閉合濾波器施加到第二二進(jìn)制編碼圖象中(步驟417)；以這種方式，白區(qū)域中的洞即黑點(diǎn)被關(guān)閉。
●現(xiàn)在程序測(cè)量細(xì)胞面積。如果這些細(xì)胞中的任一細(xì)胞面積都小于200虛象，則排除這些細(xì)胞即包括這些細(xì)胞的虛象被設(shè)置成255虛象值(黑)(步驟419)。
●在MIL發(fā)現(xiàn)的盲區(qū)充填功能用于剩余的斑點(diǎn)中(步驟412)。處理之后，所得到的二進(jìn)制編碼圖象是其白區(qū)只代表細(xì)胞的掩模。
●現(xiàn)在基于HLS圖象的飽和分量區(qū)分紅細(xì)胞和白細(xì)胞。掩模用于限定只對(duì)細(xì)胞面積進(jìn)行處理。
●現(xiàn)在程序?qū)︼柡椭凳敲總€(gè)可能的飽和值的虛象計(jì)數(shù)。將該數(shù)目作為一個(gè)長(zhǎng)256的陣列貯存起來(lái)，該陣列含有的虛象數(shù)具有對(duì)應(yīng)于陣列中每個(gè)指數(shù)的灰度級(jí)值(步驟423)。
●現(xiàn)在程序分析飽和度分布曲線(以陣列中所貯存的值表示)(步驟425)，并定位最后的峰值。這個(gè)峰包括代表白細(xì)胞中所含的面積的虛象值。
●將與峰值之后的第一最小值(谷值)一致的灰度級(jí)值設(shè)置成切開點(diǎn)(步驟427)。
●利用這個(gè)切開值，程序產(chǎn)生第三二進(jìn)制編碼圖象(步驟429)。與灰度級(jí)值大于切開點(diǎn)的飽和圖象中虛象相對(duì)應(yīng)的虛象被設(shè)置成255(白)。它們構(gòu)成紅細(xì)胞面積。而與灰度級(jí)值小于切開點(diǎn)的發(fā)光圖象中虛象相對(duì)應(yīng)的虛象被設(shè)置成0(黑)。該第三二進(jìn)制編碼圖象的白斑點(diǎn)是紅細(xì)胞面積的根源。
●將閉合濾波器施加到第三二進(jìn)制編碼圖象中；以這種方式，白區(qū)域中的洞即黑點(diǎn)被關(guān)閉(步驟431)。
●在MIL中發(fā)現(xiàn)的盲區(qū)充填功能用于剩余的斑點(diǎn)(步驟433)。處理之后，所得到的二進(jìn)制編碼圖象是只含有白血球的新掩模。
●現(xiàn)在將MIL的消磁邊緣斑點(diǎn)功能施加到剩余的斑點(diǎn)上，去除那些包括與圖象面積邊緣一致的虛象的斑點(diǎn)(步驟435)。這樣的斑點(diǎn)不能包括在下一處理程序中，因?yàn)楫?dāng)其與圖象面積邊緣一致時(shí)不知道其中有多少細(xì)胞丟失了。
●向該掩模施加6次侵蝕濾波器；于是任何相連的斑點(diǎn)(白血球根源)都不連接了(步驟437)。
●“厚”濾波器施加14次(步驟439)。該“厚”濾波器相當(dāng)于膨脹濾波器。即，通過(guò)在斑點(diǎn)的周圍連續(xù)加一排虛象可增加斑點(diǎn)的尺寸。如果生長(zhǎng)斑點(diǎn)遇到相鄰斑點(diǎn)緊挨其生長(zhǎng)，則厚濾波器不連接這兩個(gè)生長(zhǎng)斑點(diǎn)。這樣可分開相鄰的斑點(diǎn)。
●用RECONSTRUCT_FROM_SEED MIL操縱器組合第一二進(jìn)制編碼掩模(含有所有的細(xì)胞)和第三二進(jìn)制編碼掩模(含有分開的白血球根源)。如此構(gòu)成的第四掩模含有從第一掩模復(fù)制的斑點(diǎn)(細(xì)胞)，這些斑點(diǎn)被第三掩模認(rèn)可并因此代表白血球(步驟441)。
●測(cè)量第四掩模中的斑點(diǎn)面積和密度面積(A)是斑點(diǎn)中的虛象數(shù)；密度是從斑點(diǎn)的周長(zhǎng)(P)和面積(A)中衍生出的，它等于p2/4(A)。形狀越盤旋，該值越大。一個(gè)圓具有最小密度值(1.0)。周長(zhǎng)是斑點(diǎn)中邊緣的總長(zhǎng)度，具有用于階梯效應(yīng)的余量，當(dāng)對(duì)角邊被數(shù)字化時(shí)(內(nèi)角計(jì)為1.414，而不是2.0)，就產(chǎn)生了階梯效應(yīng)。只有在以下情況中斑點(diǎn)才能被保留在第四掩模中即斑點(diǎn)的面積在1000-8000象素，具有小于3的密度，由此使圖象具有相當(dāng)粗的輪廓。從下一處理程序中排除觸摸圖象邊緣的斑點(diǎn)(步驟443)。
以下列方式將第四掩模施加到色調(diào)分量中(步驟445、447、449和451)。
●將色調(diào)分量中的虛象復(fù)制到保留其色調(diào)值的新圖象中，并使其坐標(biāo)與“掩?！敝械陌?255)虛象一致；將新圖象中的所有其它虛象都設(shè)置成零(黑)(步驟445)。
●每個(gè)相鄰的非零虛象面積即對(duì)應(yīng)于紅細(xì)胞圖象的那些斑點(diǎn)中的虛象值據(jù)檢查在190-255之間。對(duì)每個(gè)斑點(diǎn)中的這些虛象進(jìn)行計(jì)數(shù)(步驟447)。
●斑點(diǎn)如果具有大于200的虛象，則其代表有核紅血球。貯存每個(gè)這樣細(xì)胞的質(zhì)量中心的坐標(biāo)。掩模被二進(jìn)制編碼，從而將所有具有非零值的虛象設(shè)置成255(白)；將掩模作為分開標(biāo)記的文件格式(TIFF)的文件貯存起來(lái)(步驟449)。
●程序移動(dòng)到可能是胎兒細(xì)胞的下一貯存坐標(biāo)上，這些坐標(biāo)與前一步驟中所貯存的任何坐標(biāo)都不一致。重復(fù)整個(gè)過(guò)程，一直到已經(jīng)鑒定出無(wú)核紅血球的預(yù)置數(shù)目。包括有核紅血球坐標(biāo)和個(gè)別掩模文件名的這些結(jié)果與血片的不同特征碼一起被貯存在文本文件中。坐標(biāo)被貯存起來(lái)的有核紅血球是胎兒細(xì)胞的根源(步驟451)。
鑒定出胎兒細(xì)胞之后，例如利用原位PCR或PCR原位雜化或FISH產(chǎn)生第二信號(hào)(如上所述)。
6.2.4.第二信號(hào)的檢測(cè)將包括原位PCR或PCR原位雜化處理的細(xì)胞的涂片定位在平臺(tái)(圖2，201)上。如果進(jìn)行必需的校正步驟，則如前所述。校正使軟件可補(bǔ)償隨著一天天流失的性能偏差以及顯微鏡、攝像機(jī)等相互之間的偏差。然后如圖5的流程圖所示按以下方式檢測(cè)第二信號(hào)●選擇放大物鏡60x(63x)(步驟501)。
●按照來(lái)自由第一信號(hào)的檢測(cè)結(jié)果編輯的文件中的數(shù)據(jù)將X-Y平臺(tái)移動(dòng)到第一胎兒細(xì)胞的位置上(如上所述)(步驟503)。
●利用CCD攝像機(jī)(圖2，209)獲得光場(chǎng)并以RGB圖象的形式傳送給計(jì)算機(jī)(圖2，211)(步驟505)。
●將RGB圖象轉(zhuǎn)換成HLS模式(步驟507)。
●以分開的圖象形式裝載含有黑白掩模的TIFF文件(步驟509)。
●將不對(duì)應(yīng)掩模中的白面積的色調(diào)分量的虛象設(shè)置成零(黑)(步驟511)。
●搜索代表胎兒細(xì)胞的剩余面積的對(duì)應(yīng)于以下PCR所產(chǎn)生的信號(hào)的虛象值。例如，信號(hào)可以是由于存在堿性磷酸酶而產(chǎn)生的彩色即紅色。在0-30的范圍內(nèi)搜索色調(diào)分量的非黑面積的虛值(步驟513)。
●將平臺(tái)移動(dòng)到下一未處理的胎兒細(xì)胞中并重復(fù)以上過(guò)程(步驟515)。
6.3.變型上述系統(tǒng)和方法的變型數(shù)目包括在本發(fā)明中。現(xiàn)在描述其中一些。該描述也可將其它變型暗示給本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員。
利用每一非富集血樣在許多各自顯微玻片的每一個(gè)上制備涂片。每個(gè)玻片當(dāng)以這種方式制備時(shí)可產(chǎn)生第一信號(hào)的檢測(cè)結(jié)果。然而，只有那些檢測(cè)到第一信號(hào)的玻片還需處理，以便產(chǎn)生第二信號(hào)，隨后進(jìn)行分析以便檢測(cè)第二信號(hào)。按這種方式進(jìn)行的過(guò)程可使用常規(guī)樣品和操縱玻片的設(shè)備。
在圖6示意性示出的變型中，在彈性基質(zhì)603上利用非富集血樣601制備一個(gè)長(zhǎng)涂片?；|(zhì)603的長(zhǎng)度是其寬度的10倍多。例如，將其任一邊具有輸送孔的醋酸纖維素膜條基底用作基質(zhì)。這個(gè)承載涂片的膜條進(jìn)行連續(xù)處理系統(tǒng)中的上述處理步驟(如圖6所示)。通過(guò)檢測(cè)第一信號(hào)測(cè)定胎兒細(xì)胞的位置之后，從連續(xù)膜條上切下包括那些位置的涂片部分，以便產(chǎn)生和檢測(cè)第二信號(hào)。
在利用一彈性基質(zhì)上的單個(gè)長(zhǎng)形涂片進(jìn)行的另一處理過(guò)程中，在產(chǎn)生和檢測(cè)第一信號(hào)之前，膜條被分成與顯微玻片相似的許多單個(gè)部分。按照單個(gè)顯微玻片的形式進(jìn)行處理過(guò)程。
以上變型及類似變型的優(yōu)點(diǎn)是，為了產(chǎn)生和檢測(cè)第二信號(hào)，無(wú)需處理整個(gè)涂片。只需對(duì)那些檢測(cè)到第一信號(hào)的玻片或部分進(jìn)行另外的處理，以便產(chǎn)生和檢測(cè)第二信號(hào)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了一種將試劑只分配到檢測(cè)到稀少細(xì)胞的涂片的那些部分上。參照?qǐng)D7，所示出的本發(fā)明的裝置包括一試劑分配器系統(tǒng)。使試劑分配器系統(tǒng)定位，以便將試劑分配到平臺(tái)的精確位置上。這尤其適用于將試劑只分配到由第一信號(hào)鑒定的坐標(biāo)例如稀少細(xì)胞的坐標(biāo)位置(例如胎兒細(xì)胞和母體血液涂片)上。該系統(tǒng)包括具有一個(gè)或多個(gè)微量吸移管位于腔內(nèi)的試劑分配器701。該試劑分配器在此實(shí)施例中附著到顯微鏡上并相對(duì)于與顯微鏡具有固定關(guān)系的平臺(tái)定位。試劑分配器701的窄尖鄰近平臺(tái)201。試劑分配器701的另一端具有內(nèi)部相通的原料輸送管703，它是一個(gè)承載許多用于將試劑傳送給試劑分配器701的管或腔。原料輸送管703從試劑分配器701處遠(yuǎn)距離連接到第一試劑容器705和第二試劑容器707上。在所示出的實(shí)施例中，原料輸送管703是一個(gè)腔，通過(guò)該腔，可經(jīng)過(guò)與試劑容器705相通的原料輸送管703’和與試劑容器707相通的原料輸送管703’。泵709連接到原料輸送管703上，用于將試劑容器707中的試劑打到試劑分配器701中并從試劑分配器701的窄尖輸送到平臺(tái)的所需位置上。另一泵709’連接到原料輸送管703’上，用于將試劑容器705中的試劑輸送到試劑分配器701中。由PC211利用“試劑控制”所指示的專門編輯的軟件命令控制這些泵。試劑可以是與產(chǎn)生信號(hào)有關(guān)的上述試劑的任一種。
在所示出的實(shí)施例中，試劑分配器連接到顯微鏡上。反之，試劑分配器無(wú)需連接到顯微鏡上，而是連接到相當(dāng)于X-Y平臺(tái)的任何框架上。所示的平臺(tái)相對(duì)于試劑分配器移動(dòng)，以便將試劑分配器的窄尖相對(duì)于平臺(tái)上的玻片定位在精確的位置上?？蓪⑵脚_(tái)上的玻片移動(dòng)到不同的位置上，可以自身轉(zhuǎn)動(dòng)地控制試劑分配器，以便使其相對(duì)于玻片上的一系列坐標(biāo)定位。在自動(dòng)模式中重要的是，相對(duì)于試劑分配器的分配端定位被檢測(cè)稀少細(xì)胞的坐標(biāo)，由此將材料傳送到稀少細(xì)胞坐標(biāo)處的離散位置上。如果試劑分配器由電動(dòng)機(jī)控制并相對(duì)于平臺(tái)或平臺(tái)上的玻片轉(zhuǎn)動(dòng)，那么試劑分配器可配有相對(duì)于玻片或平臺(tái)使其定位的傳感器。這樣，利用先定位稀少細(xì)胞的玻片上的坐標(biāo)的顯微鏡連續(xù)處理平臺(tái)上的玻片。然后將玻片移動(dòng)到第二處理面積上，在該面積中，試劑分配器定位在玻片上以前鑒定的坐標(biāo)處并傳送試劑以便產(chǎn)生第二信號(hào)?？扇芜x的是，將玻片移動(dòng)到第三站例如熱循環(huán)站，然后返回到用于觀察的顯微鏡視野中。
應(yīng)該確定的是，當(dāng)需要鑒定不同的細(xì)胞類型或診斷不同的細(xì)胞特性時(shí)，可對(duì)涂片進(jìn)行不同的處理。上述的生物化學(xué)、形態(tài)學(xué)參數(shù)在已知的方式中每個(gè)都不一樣，從而滿足其它診斷需要。
計(jì)算機(jī)和圖象處理技術(shù)在穩(wěn)定地變化。此處沒(méi)有專門描述的滿足上述方法和裝置的需要的新技術(shù)很顯然是在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，以上提到了某些常規(guī)的虛象和圖象文件格式，但是也可利用其它虛象和圖象文件格式。利用本領(lǐng)域未知的JPEG或GIF或待開發(fā)的其它技術(shù)可壓縮圖象文件。在RGB彩色描繪空間中而不是目前使用的HLS空間中可進(jìn)行這些處理過(guò)程。正如熟練工匠所希望的，也可使用其它彩色空間，尤其是當(dāng)借此加強(qiáng)搜索之后的性質(zhì)檢測(cè)時(shí)。
本文中不僅描述了與非富集母體血樣有關(guān)的本發(fā)明的實(shí)施例，而且也在常規(guī)富集或部分富集的母體血樣中實(shí)施了本發(fā)明。將鑒定和診斷樣品內(nèi)的胎兒細(xì)胞的計(jì)算機(jī)控制的微觀系統(tǒng)用于覆蓋胎兒細(xì)胞的整個(gè)濃度范圍的樣品中。正如以上所述的，利用該系統(tǒng)的顯著優(yōu)點(diǎn)是可使用非富集的母體血樣。
現(xiàn)在已經(jīng)結(jié)合本發(fā)明的許多特例對(duì)其進(jìn)行了描述。其它變型對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)都是顯而易見的并且在后面所附的權(quán)利要求書及其等同物限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種處理體液或組織樣品圖象數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法，該方法包括產(chǎn)生代表在第一放大倍數(shù)所攝的體液或組織樣品圖象的第一圖象數(shù)據(jù)子集，該子集表示含有稀少細(xì)胞的候選模糊點(diǎn)；產(chǎn)生代表在第二放大倍數(shù)所攝的候選模糊點(diǎn)圖象的第二圖象數(shù)據(jù)子集，該第二數(shù)據(jù)子集表示稀少細(xì)胞；以及將第二數(shù)據(jù)子集貯存到計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于還用于處理體液或組織樣品，該方法還包括在對(duì)應(yīng)于第一圖象數(shù)據(jù)子集中所表示的每一候選模糊點(diǎn)的部位使體液或組織樣品與一試劑接觸以便產(chǎn)生生物顯示信號(hào)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于在接觸之前還包括無(wú)需再處理那些不產(chǎn)生代表候選模糊點(diǎn)的第一數(shù)據(jù)子集的體液或組織樣品。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于還包括以下步驟在接觸步驟之后存取所獲得的體液或組織樣品圖象數(shù)據(jù)，該體液或組織樣品圖象數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于表示稀少細(xì)胞的第二數(shù)據(jù)子集；以及測(cè)定所獲取的體液或組織樣品圖象數(shù)據(jù)內(nèi)的生物顯示信號(hào)水平。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于產(chǎn)生代表候選模糊點(diǎn)的第一圖象數(shù)據(jù)子集的步驟還包括收集代表體液或組織樣品圖象的彩色圖象數(shù)據(jù)集；以及將彩色圖象數(shù)據(jù)組從天然彩色空間表現(xiàn)法轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)處理彩色空間表現(xiàn)法，其中通過(guò)分析候選模糊點(diǎn)的一個(gè)坐標(biāo)信號(hào)可容易地鑒別出這些候選模糊點(diǎn)。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于天然彩色空間由其值代表紅、綠和藍(lán)(RGB)強(qiáng)度的坐標(biāo)信號(hào)表示，而數(shù)據(jù)處理彩色空間由其值代表色調(diào)、發(fā)光和飽和(HLS)量的坐標(biāo)信號(hào)表示。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于還包括產(chǎn)生包括第一數(shù)據(jù)組的數(shù)據(jù)的潛在候選模糊點(diǎn)數(shù)據(jù)組，而第一數(shù)據(jù)組的一個(gè)坐標(biāo)信號(hào)值在預(yù)定范圍內(nèi)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于還包括產(chǎn)生代表候選模糊點(diǎn)的第一數(shù)據(jù)組子集，而對(duì)應(yīng)于潛在候選模糊點(diǎn)數(shù)據(jù)群的數(shù)據(jù)具有在預(yù)定范圍內(nèi)的尺寸。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于產(chǎn)生代表稀少細(xì)胞的第二數(shù)據(jù)組子集的步驟還包括收集代表候選模糊點(diǎn)圖象的彩色圖象數(shù)據(jù)組；以及將彩色圖象數(shù)據(jù)組從天然彩色空間表示法轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)處理彩色空間表示法，其中施加有預(yù)定選擇標(biāo)準(zhǔn)的圖象特征在其一個(gè)或多個(gè)坐標(biāo)信號(hào)處出現(xiàn)得更顯著。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于還包括通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第一坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表圖象中的細(xì)胞面積的細(xì)胞掩模數(shù)據(jù)組。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于還包括通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第二坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表含有圖象中的選擇細(xì)胞的面積的選擇細(xì)胞數(shù)據(jù)組。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于還包括通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第三坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表圖象中的稀少細(xì)胞面積的稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于天然彩色空間由其值代表紅、綠和藍(lán)(RGB)強(qiáng)度的坐標(biāo)信號(hào)表示，而數(shù)據(jù)處理彩色空間由其值代表色調(diào)、發(fā)光和飽和(HLS)量的坐標(biāo)信號(hào)表示。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于產(chǎn)生細(xì)胞掩模數(shù)據(jù)組的步驟還包括分析代表候選模糊點(diǎn)的彩色圖象數(shù)據(jù)組的光度值直方圖；為另一處理步驟選擇在直方圖的最后峰值之前的最后谷值之上的光度值數(shù)據(jù)；以及向所選擇的數(shù)據(jù)施加閉合濾波器，然后排除沒(méi)有達(dá)到預(yù)定尺寸標(biāo)準(zhǔn)的面積，然后施加盲區(qū)充填功能，從而產(chǎn)生細(xì)胞掩模數(shù)據(jù)組。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于產(chǎn)生選擇細(xì)胞數(shù)據(jù)組的步驟還包括分析細(xì)胞掩模數(shù)據(jù)組的飽和值直方圖；為另一處理步驟選擇在直方圖的第一峰值之后的第一谷值之上的飽和值數(shù)據(jù)；以及向所選擇的數(shù)據(jù)施加閉合濾波器，然后施加盲區(qū)充填功能，然后排除包括圖象邊緣的面積，然后施加侵蝕濾波器，再施加一個(gè)厚濾波器，從而產(chǎn)生選擇細(xì)胞數(shù)據(jù)組。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于產(chǎn)生稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組的步驟還包括為稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組選擇與選擇細(xì)胞數(shù)據(jù)組一樣的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)包括一預(yù)定尺寸范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)群，該數(shù)據(jù)群還具有預(yù)定色調(diào)值范圍內(nèi)的色調(diào)值。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于還包括實(shí)質(zhì)上只處理稀少細(xì)胞面積，以便產(chǎn)生生物顯示信號(hào)。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于還包括獲得體液或組織涂片的圖象；檢測(cè)所獲得的圖象中的生物顯示信號(hào)；以及當(dāng)與來(lái)自稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組的稀少細(xì)胞面積一致時(shí)，記錄生物顯示信號(hào)的存在。
19.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于還包括獲得體液或組織涂片的稀少細(xì)胞面積圖象，稀少細(xì)胞面積由稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組限定；以及記錄稀少細(xì)胞面積中的生物顯示信號(hào)的存在。
20.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于還包括接收限定出體液或組織樣品的第一面積圖象的第三圖象數(shù)據(jù)組；接收限定出鄰近第一面積的體液或組織樣品的第二面積圖象的第四圖象數(shù)據(jù)組；鑒定限定出兩者之間界限的第三和第四圖象數(shù)據(jù)組中所確定的特性；以及將第三和第四圖象數(shù)據(jù)組匯合到第一圖象數(shù)據(jù)組中，限定出連接到體液或組織樣品的組合第一和第二面積界限上的一個(gè)圖象。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其特征在于還包括各自聚焦多個(gè)物鏡，通過(guò)這些物鏡獲得第一面積圖象和第二面積圖象。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于還包括基本上同時(shí)獲得第三和第四圖象數(shù)據(jù)組。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于獲得步驟還包括通過(guò)多個(gè)CCD裝置上的多個(gè)物鏡接收多個(gè)圖象；將CCD裝置上所接收的圖象信號(hào)顯示傳送給計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。
24.一種處理限定出體液或組織樣品圖象的圖象信號(hào)的計(jì)算機(jī)執(zhí)行方法，該方法包括以下步驟從圖象信號(hào)中消除那些沒(méi)有定義出稀少細(xì)胞可以存留的候選模糊點(diǎn)的部分圖象信號(hào)，從而形成候選模糊點(diǎn)圖象信號(hào)；從候選模糊點(diǎn)圖象信號(hào)中消除那些沒(méi)有定義稀少細(xì)胞的部分候選模糊點(diǎn)圖象信號(hào)，從而形成稀少細(xì)胞圖象信號(hào)；以及將稀少細(xì)胞圖象信號(hào)貯存到計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中。
25.如權(quán)利要求24所述的方法，其特征在于還用于處理體液或組織樣品，該方法還包括在對(duì)應(yīng)于第一圖象數(shù)據(jù)子集中所表示的每一候選模糊點(diǎn)的部位使體液或組織樣品與一試劑接觸以便產(chǎn)生生物顯示信號(hào)。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于還包括如下步驟在接觸步驟之后接收所獲得的體液或組織樣品圖象信號(hào)，該體液或組織樣品圖象信號(hào)對(duì)應(yīng)于稀少細(xì)胞的圖象信號(hào)；以及測(cè)定體液或組織樣品圖象信號(hào)內(nèi)的生物顯示信號(hào)水平。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其特征在于形成候選模糊點(diǎn)信號(hào)的步驟還包括接收代表體液或組織樣品圖象的彩色圖象信號(hào)；以及將彩色圖象信號(hào)從天然彩色空間表現(xiàn)法轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)處理彩色空間表現(xiàn)法，其中通過(guò)分析候選模糊點(diǎn)的一個(gè)坐標(biāo)信號(hào)可容易地鑒別出這些候選模糊點(diǎn)。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于天然彩色空間由其值代表紅、綠和藍(lán)(RGB)強(qiáng)度的坐標(biāo)信號(hào)表示，而數(shù)據(jù)處理彩色空間由其值代表色調(diào)、發(fā)光和飽和(HLS)量的坐標(biāo)信號(hào)表示。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其特征在于還包括產(chǎn)生包括其一個(gè)坐標(biāo)信號(hào)值在預(yù)定范圍內(nèi)的圖象信號(hào)的潛在候選模糊點(diǎn)圖象信號(hào)。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于還包括產(chǎn)生潛在的候選模糊點(diǎn)圖象信號(hào)，而對(duì)應(yīng)于潛在候選模糊點(diǎn)信號(hào)群的圖象信號(hào)具有在預(yù)定范圍內(nèi)的尺寸。
31.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于形成稀少細(xì)胞圖象信號(hào)的步驟還包括接收代表候選模糊點(diǎn)圖象的彩色圖象信號(hào)；以及將彩色圖象信號(hào)從天然彩色空間表示法轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)處理彩色空間表示法，其中施加有預(yù)定選擇標(biāo)準(zhǔn)的圖象特征在其一個(gè)或多個(gè)坐標(biāo)信號(hào)處出現(xiàn)得更顯著。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于還包括通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第一坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表圖象中的細(xì)胞面積的細(xì)胞掩模信號(hào)。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于還包括通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第二坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表含有圖象中的選擇細(xì)胞的面積的選擇細(xì)胞信號(hào)。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于還包括通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第三坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表圖象中的稀少細(xì)胞面積的稀少細(xì)胞信號(hào)。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于天然彩色空間由其值代表紅、綠和藍(lán)(RGB)強(qiáng)度的坐標(biāo)信號(hào)表示，而數(shù)據(jù)處理彩色空間由其值代表色調(diào)、發(fā)光和飽和(HLS)量的坐標(biāo)信號(hào)表示。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于產(chǎn)生細(xì)胞掩模信號(hào)的步驟還包括分析代表候選模糊點(diǎn)的彩色圖象信號(hào)的光度值直方圖；為另一處理步驟選擇在直方圖的最后峰值之前的最后谷值之上的光度值信號(hào)點(diǎn)；以及向所選擇的信號(hào)點(diǎn)施加閉合濾波器，然后排除沒(méi)有達(dá)到預(yù)定尺寸標(biāo)準(zhǔn)的面積，然后施加盲區(qū)充填功能，從而產(chǎn)生細(xì)胞掩模信號(hào)。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于產(chǎn)生選擇細(xì)胞信號(hào)的步驟還包括分析細(xì)胞掩模信號(hào)的飽和值直方圖；為另一處理步驟選擇在直方圖的第一峰值之后的第一谷值之上的飽和值信號(hào)點(diǎn)；以及向所選擇的信號(hào)點(diǎn)施加閉合濾波器，然后施加盲區(qū)充填功能，然后排除包括圖象邊緣的面積，然后施加侵蝕濾波器，再施加一個(gè)厚濾波器，從而產(chǎn)生選擇細(xì)胞信號(hào)。
38.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于產(chǎn)生稀少細(xì)胞信號(hào)的步驟還包括為稀少細(xì)胞信號(hào)選擇與選擇細(xì)胞信號(hào)一樣的信號(hào)點(diǎn)，該信號(hào)點(diǎn)包括一預(yù)定尺寸范圍內(nèi)的信號(hào)點(diǎn)群，該信號(hào)點(diǎn)群還具有預(yù)定色調(diào)值范圍內(nèi)的色調(diào)值。
39.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于還包括實(shí)質(zhì)上只處理稀少細(xì)胞面積，以便產(chǎn)生生物顯示信號(hào)。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于還包括獲得體液或組織涂片的圖象；檢測(cè)所獲得的圖象中的生物顯示信號(hào)；以及當(dāng)與來(lái)自稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組的稀少細(xì)胞面積一致時(shí)，記錄生物顯示信號(hào)的存在。
41.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于還包括獲得體液或組織涂片的稀少細(xì)胞面積圖象，稀少細(xì)胞面積由稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組限定；以及記錄稀少細(xì)胞面積中的生物顯示信號(hào)的存在。
42.一種操縱實(shí)驗(yàn)室服務(wù)的方法，該方法包括以下步驟接收體液或組織樣品；制備體液或組織樣品涂片，其中制備所述涂片的程序是按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的核定協(xié)議進(jìn)行的；操作計(jì)算機(jī)顯微鏡，從而軟件程序可自動(dòng)鑒別出涂片中的稀少細(xì)胞；以及檢測(cè)稀少細(xì)胞中的生物顯示信號(hào)。
43.一種操縱實(shí)驗(yàn)室服務(wù)的方法，該方法包括以下步驟接收體液或組織樣品涂片，其中制備所述涂片的程序是按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的核定協(xié)議進(jìn)行的；操作計(jì)算機(jī)顯微鏡，從而軟件程序可自動(dòng)鑒別出涂片中的稀少細(xì)胞；以及檢測(cè)稀少細(xì)胞中的生物顯示信號(hào)。
44.如權(quán)利要求42或43所述的方法，其特征在于鑒定稀少細(xì)胞的步驟包括產(chǎn)生代表在第一放大倍數(shù)所攝的體液或組織樣品圖象的第一圖象數(shù)據(jù)子集，該子集表示含有稀少細(xì)胞的候選模糊點(diǎn)；產(chǎn)生代表在第二放大倍數(shù)所攝的候選模糊點(diǎn)圖象的第二圖象數(shù)據(jù)子集，該第二數(shù)據(jù)子集表示稀少細(xì)胞；以及將第二數(shù)據(jù)字集貯存到計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中。
45.如權(quán)利要求42或43所述的方法，其特征在于檢測(cè)醫(yī)學(xué)顯示信號(hào)的步驟包括在對(duì)應(yīng)于第一圖象數(shù)據(jù)子集中所表示的每一候選模糊點(diǎn)的部位使體液或組織樣品與一試劑接觸以便產(chǎn)生生物顯示信號(hào)。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其特征在于在接觸之前還包括無(wú)需再處理那些不產(chǎn)生代表候選模糊點(diǎn)的第一數(shù)據(jù)子集的體液或組織樣品。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于還包括以下步驟在接觸步驟之后存取所獲得的體液或組織樣品圖象數(shù)據(jù)，該體液或組織樣品圖象數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于表示稀少細(xì)胞的第二數(shù)據(jù)子集；以及測(cè)定所獲取的體液或組織樣品圖象數(shù)據(jù)內(nèi)的生物顯示信號(hào)水平。
48.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于產(chǎn)生代表候選模糊點(diǎn)的第一圖象數(shù)據(jù)子集的步驟還包括收集代表體液或組織樣品圖象的彩色圖象數(shù)據(jù)組；以及將彩色圖象數(shù)據(jù)組從天然彩色空間表現(xiàn)法轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)處理彩色空間表現(xiàn)法，其中通過(guò)分析候選模糊點(diǎn)的一個(gè)坐標(biāo)信號(hào)可容易地鑒別出這些候選模糊點(diǎn)。
49.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于天然彩色空間由其值代表紅、綠和藍(lán)(RGB)強(qiáng)度的坐標(biāo)信號(hào)表示，而數(shù)據(jù)處理彩色空間由其值代表色調(diào)、發(fā)光和飽和(HLS)量的坐標(biāo)信號(hào)表示。
50.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于還包括產(chǎn)生包括第一數(shù)據(jù)組的數(shù)據(jù)的潛在候選模糊點(diǎn)數(shù)據(jù)組，而第一數(shù)據(jù)組的一個(gè)坐標(biāo)信號(hào)值在預(yù)定范圍內(nèi)。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于還包括產(chǎn)生代表候選模糊點(diǎn)的第一數(shù)據(jù)組子集，而對(duì)應(yīng)于潛在候選模糊點(diǎn)數(shù)據(jù)群的數(shù)據(jù)具有在預(yù)定范圍內(nèi)的尺寸。
52.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于產(chǎn)生代表稀少細(xì)胞的第二數(shù)據(jù)組子集的步驟還包括收集代表候選模糊點(diǎn)圖象的彩色圖象數(shù)據(jù)組；以及將彩色圖象數(shù)據(jù)組從天然彩色空間表示法轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)處理彩色空間表示法，其中施加有預(yù)定選擇標(biāo)準(zhǔn)的圖象特征在其一個(gè)或多個(gè)坐標(biāo)信號(hào)處表現(xiàn)得更顯著。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于還包括通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第一坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表圖象中的細(xì)胞面積的細(xì)胞掩模數(shù)據(jù)組。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于還包括通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第二坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表含有圖象中的選擇細(xì)胞的面積的選擇細(xì)胞數(shù)據(jù)組。
55.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于還包括通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第三坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表圖象中的稀少細(xì)胞面積的稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于天然彩色空間由其值代表紅、綠和藍(lán)(RGB)強(qiáng)度的坐標(biāo)信號(hào)表示，而數(shù)據(jù)處理彩色空間由其值代表色調(diào)、發(fā)光和飽和(HLS)量的坐標(biāo)信號(hào)表示。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于產(chǎn)生細(xì)胞掩模數(shù)據(jù)組的步驟還包括分析代表候選模糊點(diǎn)的彩色圖象數(shù)據(jù)組的光度值直方圖；為另一處理步驟選擇在直方圖的最后峰值之前的最后谷值之上的光度值數(shù)據(jù)；以及向所選擇的數(shù)據(jù)施加閉合濾波器，然后排除沒(méi)有達(dá)到預(yù)定尺寸標(biāo)準(zhǔn)的面積，然后施加盲區(qū)充填功能，從而產(chǎn)生細(xì)胞掩模數(shù)據(jù)組。
58.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于產(chǎn)生選擇細(xì)胞數(shù)據(jù)組的步驟還包括分析細(xì)胞掩模數(shù)據(jù)組的飽和值直方圖；為另一處理步驟選擇在直方圖的第一峰值之后的第一谷值之上的飽和值數(shù)據(jù)；向所選擇的數(shù)據(jù)施加閉合濾波器，然后施加盲區(qū)充填功能，然后排除包括圖象邊緣的面積，然后施加侵蝕濾波器，再施加一個(gè)厚濾波器，從而產(chǎn)生選擇細(xì)胞數(shù)據(jù)組。
59.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于產(chǎn)生稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組的步驟還包括為稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組選擇與選擇細(xì)胞數(shù)據(jù)組一樣的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)包括一預(yù)定尺寸范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)群，該數(shù)據(jù)群還具有預(yù)定色調(diào)值范圍內(nèi)的色調(diào)值。
60.如權(quán)利要求55所述的方法，其特征在于還包括實(shí)質(zhì)上只處理稀少細(xì)胞面積，以便產(chǎn)生生物顯示信號(hào)。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于還包括獲得體液或組織涂片的圖象；檢測(cè)所獲得的圖象中的生物顯示信號(hào)；以及當(dāng)與來(lái)自稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組的稀少細(xì)胞面積一致時(shí)，記錄生物顯示信號(hào)的存在。
62.如權(quán)利要求60所述的方法，其特征在于還包括獲得體液或組織涂片的稀少細(xì)胞面積圖象，稀少細(xì)胞面積由稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組限定；以及記錄稀少細(xì)胞面積中的生物顯示信號(hào)的存在。
63.如權(quán)利要求44所述的方法，其特征在于還包括接收限定出體液或組織樣品的第一面積圖象的第三圖象數(shù)據(jù)組；接收限定出鄰近第一面積的體液或組織樣品的第二面積圖象的第四圖象數(shù)據(jù)組；鑒定限定出兩者之間界限的第三和第四圖象數(shù)據(jù)組中所確定的特性；以及將第三和第四圖象數(shù)據(jù)組匯合到第一圖象數(shù)據(jù)組中，限定出連接到體液或組織樣品的組合第一和第二面積界限上的一個(gè)圖象。
64.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于還包括各自聚焦多個(gè)物鏡，通過(guò)這些物鏡獲得第一面積圖象和第二面積圖象。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其特征在于還包括基本上同時(shí)獲得第三和第四圖象數(shù)據(jù)組。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其特征在于獲得步驟還包括通過(guò)多個(gè)CCD裝置上的多個(gè)物鏡接收多個(gè)圖象；將CCD裝置上所接收的圖象信號(hào)顯示傳送給計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。
67.一種包括其中固定有一系列指令的計(jì)算機(jī)讀取存儲(chǔ)介質(zhì)的計(jì)算機(jī)軟件產(chǎn)品，當(dāng)由計(jì)算機(jī)指導(dǎo)執(zhí)行這些指令時(shí)，可完成以下步驟的程序產(chǎn)生代表在第一放大倍數(shù)所攝的體液或組織樣品圖象的第一圖象數(shù)據(jù)子集，該子集表示含有稀少細(xì)胞的候選模糊點(diǎn)；產(chǎn)生代表在第二放大倍數(shù)所攝的候選模糊點(diǎn)圖象的第二圖象數(shù)據(jù)子集，該第二數(shù)據(jù)子集表示稀少細(xì)胞；以及將所記錄的數(shù)據(jù)子集貯存到計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中。
68.如權(quán)利要求60所述的產(chǎn)品，其特征在于還可用于處理體液或組織樣品，所述指令還包括以下步驟在對(duì)應(yīng)于第一圖象數(shù)據(jù)子集中所表示的每一候選模糊點(diǎn)的部位使體液或組織樣品與一試劑接觸以便產(chǎn)生生物顯示信號(hào)。
69.如權(quán)利要求68所述的產(chǎn)品，其特征在于接觸步驟之前的指令包括以下步驟無(wú)需再處理那些不產(chǎn)生代表候選模糊點(diǎn)的第一數(shù)據(jù)子集的體液或組織樣品。
70.如權(quán)利要求68所述的產(chǎn)品，其特征在于具有包括以下步驟的的指令在接觸步驟之后存取所獲得的體液或組織樣品圖象數(shù)據(jù)，該體液或組織樣品圖象數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)于表示稀少細(xì)胞的第二數(shù)據(jù)子集；以及測(cè)定所存取的體液或組織樣品圖象數(shù)據(jù)內(nèi)的生物顯示信號(hào)水平。
71.如權(quán)利要求67所述的產(chǎn)品，其特征在于產(chǎn)生代表候選模糊點(diǎn)的第一圖象數(shù)據(jù)子集的步驟還包括收集代表體液或組織樣品圖象的彩色圖象數(shù)據(jù)組；以及將彩色圖象數(shù)據(jù)組從天然彩色空間表現(xiàn)法轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)處理彩色空間表現(xiàn)法，其中通過(guò)分析候選模糊點(diǎn)的一個(gè)坐標(biāo)信號(hào)可容易地鑒別出這些候選模糊點(diǎn)。
72.如權(quán)利要求71所述的產(chǎn)品，其特征在于天然彩色空間由其值代表紅、綠和藍(lán)(RGB)強(qiáng)度的坐標(biāo)信號(hào)表示，而數(shù)據(jù)處理彩色空間由其值代表色調(diào)、發(fā)光和飽和(HLS)量的坐標(biāo)信號(hào)表示。
73.如權(quán)利要求71所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令產(chǎn)生包括第一數(shù)據(jù)組的數(shù)據(jù)的潛在候選模糊點(diǎn)數(shù)據(jù)組，而第一數(shù)據(jù)組的一個(gè)坐標(biāo)信號(hào)值在預(yù)定范圍內(nèi)。
74.如權(quán)利要求73所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令產(chǎn)生代表候選模糊點(diǎn)的第一數(shù)據(jù)組子集，而對(duì)應(yīng)于潛在候選模糊點(diǎn)數(shù)據(jù)群的數(shù)據(jù)具有在預(yù)定范圍內(nèi)的尺寸。
75.如權(quán)利要求67所述的產(chǎn)品，其特征在于產(chǎn)生代表稀少細(xì)胞的第二數(shù)據(jù)組子集的步驟還包括收集代表候選模糊點(diǎn)圖象的彩色圖象數(shù)據(jù)組；以及將彩色圖象數(shù)據(jù)組從天然彩色空間表示法轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)處理彩色空間表示法，其中施加有預(yù)定選擇標(biāo)準(zhǔn)的圖象特征在其一個(gè)或多個(gè)坐標(biāo)信號(hào)處表現(xiàn)得更顯著。
76.如權(quán)利要求75所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第一坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表圖象中的細(xì)胞面積的細(xì)胞掩模數(shù)據(jù)組。
77.如權(quán)利要求76所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第二坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表含有圖象中的選擇細(xì)胞的面積的選擇細(xì)胞數(shù)據(jù)組。
78.如權(quán)利要求77所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第三坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表圖象中的稀少細(xì)胞面積的稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組。
79.如權(quán)利要求78所述的產(chǎn)品，其特征在于天然彩色空間由其值代表紅、綠和藍(lán)(RGB)強(qiáng)度的坐標(biāo)信號(hào)表示，而數(shù)據(jù)處理彩色空間由其值代表色調(diào)、發(fā)光和飽和(HLS)量的坐標(biāo)信號(hào)表示。
80.如權(quán)利要求79所述的產(chǎn)品，其特征在于產(chǎn)生細(xì)胞掩模數(shù)據(jù)組的步驟還包括分析代表候選模糊點(diǎn)的彩色圖象數(shù)據(jù)組的光度值直方圖；為另一處理步驟選擇在直方圖的最后峰值之前的最后谷值之上的光度值數(shù)據(jù)；以及向所選擇的數(shù)據(jù)施加閉合濾波器，然后排除沒(méi)有達(dá)到預(yù)定尺寸標(biāo)準(zhǔn)的面積，然后施加盲區(qū)充填功能，從而產(chǎn)生細(xì)胞掩模數(shù)據(jù)組。
81.如權(quán)利要求78所述的產(chǎn)品，其特征在于產(chǎn)生選擇細(xì)胞數(shù)據(jù)組的步驟還包括分析細(xì)胞掩模數(shù)據(jù)組的飽和值直方圖；為另一處理步驟選擇在直方圖的第一峰值之后的第一谷值之上的飽和值數(shù)據(jù)；向所選擇的數(shù)據(jù)施加閉合濾波器，然后施加盲區(qū)充填功能，然后排除包括圖象邊緣的面積，然后施加侵蝕濾波器，再施加一個(gè)厚濾波器，從而產(chǎn)生選擇細(xì)胞數(shù)據(jù)組。
82.如權(quán)利要求79所述的產(chǎn)品，其特征在于產(chǎn)生稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組的步驟還包括為稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組選擇與選擇細(xì)胞數(shù)據(jù)組一樣的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)包括一預(yù)定尺寸范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)群，該數(shù)據(jù)群還具有預(yù)定色調(diào)值范圍內(nèi)的色調(diào)值。
83.如權(quán)利要求78所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令實(shí)質(zhì)上只處理稀少細(xì)胞面積，以便產(chǎn)生生物顯示信號(hào)。
84.如權(quán)利要求83所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令獲得體液或組織涂片的圖象；檢測(cè)所獲得的圖象中的生物顯示信號(hào)；以及當(dāng)與來(lái)自稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組的稀少細(xì)胞面積一致時(shí)，記錄生物顯示信號(hào)的存在。
85.如權(quán)利要求83所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令獲得體液或組織涂片的稀少細(xì)胞面積圖象，稀少細(xì)胞面積由稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組限定；以及記錄稀少細(xì)胞面積中的生物顯示信號(hào)的存在。
86.如權(quán)利要求67所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令接收限定出體液或組織樣品的第一面積圖象的第三圖象數(shù)據(jù)組；接收限定出鄰近第一面積的體液或組織樣品的第二面積圖象的第四圖象數(shù)據(jù)組；鑒定限定出兩者之間界限的第三和第四圖象數(shù)據(jù)組中所確定的特性；以及將第三和第四圖象數(shù)據(jù)組匯合到第一圖象數(shù)據(jù)組中，限定出連接到體液或組織樣品的組合第一和第二面積界限上的一個(gè)圖象。
87.如權(quán)利要求86所述的方法，其特征在于還具有包括以下步驟的指令各自聚焦多個(gè)物鏡，通過(guò)這些物鏡獲得第一面積圖象和第二面積圖象。
88.如權(quán)利要求87所述的方法，其特征在于還具有包括以下步驟的指令基本上同時(shí)獲得第三和第四圖象數(shù)據(jù)組。
89.如權(quán)利要求88所述的方法，其特征在于獲得步驟還包括通過(guò)多個(gè)CCD裝置上的多個(gè)物鏡接收多個(gè)圖象；將CCD裝置上所接收的圖象信號(hào)顯示傳送給計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。
90.一種包括其中固定有一系列指令的計(jì)算機(jī)讀取存儲(chǔ)介質(zhì)的計(jì)算機(jī)軟件產(chǎn)品，當(dāng)由計(jì)算機(jī)指導(dǎo)執(zhí)行這些指令時(shí)，可完成以下步驟的程序從圖象信號(hào)中消除那些沒(méi)有定義出稀少細(xì)胞可以存留的候選模糊點(diǎn)的部分圖象信號(hào)，從而形成候選模糊點(diǎn)圖象信號(hào)；從候選模糊點(diǎn)圖象信號(hào)中消除那些沒(méi)有定義稀少細(xì)胞的部分候選模糊點(diǎn)圖象信號(hào)，從而形成稀少細(xì)胞圖象信號(hào)；以及將稀少細(xì)胞圖象信號(hào)貯存到計(jì)算機(jī)存儲(chǔ)器中。
91.如權(quán)利要求90所述的產(chǎn)品，其特征在于還用于處理體液或組織樣品，該指令還包括以下步驟無(wú)需再處理那些不產(chǎn)生代表候選模糊點(diǎn)的第一數(shù)據(jù)子集的體液或組織樣品；以及在對(duì)應(yīng)于第一圖象數(shù)據(jù)子集中所表示的每一候選模糊點(diǎn)的部位使體液或組織樣品與一試劑接觸以便產(chǎn)生生物顯示信號(hào)。
92.如權(quán)利要求91所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括如下步驟的指令在接觸步驟之后接收所獲得的體液或組織樣品圖象信號(hào)，該體液或組織樣品圖象信號(hào)對(duì)應(yīng)于稀少細(xì)胞的圖象信號(hào)；以及測(cè)定體液或組織樣品圖象信號(hào)內(nèi)的生物顯示信號(hào)水平。
93.如權(quán)利要求90所述的產(chǎn)品，其特征在于形成候選模糊點(diǎn)信號(hào)的步驟還包括接收代表體液或組織樣品圖象的彩色圖象信號(hào)；以及將彩色圖象信號(hào)從天然彩色空間表現(xiàn)法轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)處理彩色空間表現(xiàn)法，其中通過(guò)分析候選模糊點(diǎn)的一個(gè)坐標(biāo)信號(hào)可容易地鑒別出這些候選模糊點(diǎn)。
94.如權(quán)利要求93所述的產(chǎn)品，其特征在于天然彩色空間由其值代表紅、綠和藍(lán)(RGB)強(qiáng)度的坐標(biāo)信號(hào)表示，而數(shù)據(jù)處理彩色空間由其值代表色調(diào)、發(fā)光和飽和(HLS)量的坐標(biāo)信號(hào)表示。
95.如權(quán)利要求93所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令產(chǎn)生包括其一個(gè)坐標(biāo)信號(hào)值在預(yù)定范圍內(nèi)的圖象信號(hào)的潛在候選模糊點(diǎn)圖象信號(hào)。
96.如權(quán)利要求95所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令產(chǎn)生潛在的候選模糊點(diǎn)圖象信號(hào)，而對(duì)應(yīng)于潛在候選模糊點(diǎn)信號(hào)群的圖象信號(hào)具有在預(yù)定范圍內(nèi)的尺寸。
97.如權(quán)利要求90所述的產(chǎn)品，其特征在于形成稀少細(xì)胞圖象信號(hào)的步驟還包括接收代表候選模糊點(diǎn)圖象的彩色圖象信號(hào)；以及將彩色圖象信號(hào)從天然彩色空間表示法轉(zhuǎn)換成數(shù)據(jù)處理彩色空間表示法，其中施加有預(yù)定選擇標(biāo)準(zhǔn)的圖象特征在其一個(gè)或多個(gè)坐標(biāo)信號(hào)處表現(xiàn)得更顯著。
98.如權(quán)利要求97所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第一坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表圖象中的細(xì)胞面積的細(xì)胞掩模信號(hào)。
99.如權(quán)利要求98所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第二坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表含有圖象中的選擇細(xì)胞的面積的選擇細(xì)胞信號(hào)。
100.如權(quán)利要求99所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令通過(guò)處理數(shù)據(jù)處理彩色空間的第三坐標(biāo)信號(hào)產(chǎn)生代表圖象中的稀少細(xì)胞面積的稀少細(xì)胞信號(hào)。
101.如權(quán)利要求100所述的產(chǎn)品，其特征在于天然彩色空間由其值代表紅、綠和藍(lán)(RGB)強(qiáng)度的坐標(biāo)信號(hào)表示，而數(shù)據(jù)處理彩色空間由其值代表色調(diào)、發(fā)光和飽和(HLS)量的坐標(biāo)信號(hào)表示。
102.如權(quán)利要求101所述的產(chǎn)品，其特征在于產(chǎn)生細(xì)胞掩模信號(hào)的步驟還包括分析代表候選模糊點(diǎn)的彩色圖象信號(hào)的光度值直方圖；為另一處理步驟選擇在直方圖的最后峰值之前的最后谷值之上的光度值信號(hào)點(diǎn)；以及向所選擇的信號(hào)點(diǎn)施加閉合濾波器，然后排除沒(méi)有達(dá)到預(yù)定尺寸標(biāo)準(zhǔn)的面積，然后施加盲區(qū)充填功能，從而產(chǎn)生細(xì)胞掩模信號(hào)。
103.如權(quán)利要求101所述的產(chǎn)品，其特征在于產(chǎn)生選擇細(xì)胞信號(hào)的步驟還包括分析細(xì)胞掩模信號(hào)的飽和值直方圖；為另一處理步驟選擇在直方圖的第一峰值之后的第一谷值之上的飽和值信號(hào)點(diǎn)；以及向所選擇的信號(hào)點(diǎn)施加閉合濾波器，然后施加盲區(qū)充填功能，然后排除包括圖象邊緣的面積，然后施加侵蝕濾波器，再施加一個(gè)厚濾波器，從而產(chǎn)生選擇細(xì)胞信號(hào)。
104.如權(quán)利要求101所述的產(chǎn)品，其特征在于產(chǎn)生稀少細(xì)胞信號(hào)的步驟還包括為稀少細(xì)胞信號(hào)選擇與選擇細(xì)胞信號(hào)一樣的信號(hào)點(diǎn)，該信號(hào)點(diǎn)包括一預(yù)定尺寸范圍內(nèi)的信號(hào)點(diǎn)群，該信號(hào)點(diǎn)群還具有預(yù)定色調(diào)值范圍內(nèi)的色調(diào)值。
105.如權(quán)利要求100所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令實(shí)質(zhì)上只處理稀少細(xì)胞面積，以便產(chǎn)生生物顯示信號(hào)。
106.如權(quán)利要求105所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令獲得體液或組織涂片的圖象；檢測(cè)所獲得的圖象中的生物顯示信號(hào)；以及當(dāng)與來(lái)自稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組的稀少細(xì)胞面積一致時(shí)，記錄生物顯示信號(hào)的存在。
107.如權(quán)利要求105所述的產(chǎn)品，其特征在于還具有包括以下步驟的指令獲得體液或組織涂片的稀少細(xì)胞面積圖象，稀少細(xì)胞面積由稀少細(xì)胞數(shù)據(jù)組限定；以及記錄稀少細(xì)胞面積中的生物顯示信號(hào)的存在。
108一種用于診斷過(guò)程中的血樣的制備方法，該方法包括以下步驟制備含有自然存在濃度的胎兒細(xì)胞的非富集母體血樣涂片；利用可信號(hào)顯示胎兒細(xì)胞的存在的計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察覆蓋部分涂片的光場(chǎng)；檢測(cè)所述信號(hào)；以及鑒定涂片中檢測(cè)信號(hào)所處位置的坐標(biāo)，以便進(jìn)行診斷。
109.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于還要處理信號(hào)以便表示稀少細(xì)胞的形態(tài)測(cè)定。
110.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于還包括以下步驟鑒定得到第一信號(hào)處的坐標(biāo)；以及在鑒定坐標(biāo)之后在那些坐標(biāo)處特異性接觸胎兒細(xì)胞。
111.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于還包括以下步驟用標(biāo)記物處理涂片以便加強(qiáng)胎兒細(xì)胞與母體細(xì)胞的光學(xué)區(qū)分。
112.如權(quán)利要求111所述的方法，其特征在于信號(hào)來(lái)自于選擇性鍵合到胎兒細(xì)胞上的標(biāo)記物。
113.如權(quán)利要求108所述的方法，其特征在于將光場(chǎng)逐步移到基本上覆蓋了所有涂片的一系列部分涂片之上。
114.如權(quán)利要求113所述的方法，其特征在于還包括以下步驟在計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)的控制下相對(duì)于計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)的物鏡移動(dòng)涂片。
115.一種從含有自然存在濃度的胎兒細(xì)胞的非富集母體血樣中得到具有相當(dāng)于胎兒細(xì)胞的診斷顯示標(biāo)志的信號(hào)的方法，該方法包括以下步驟制備非富集母體血樣涂片；利用計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察涂片，以便得到指示胎兒細(xì)胞存在的第一信號(hào)指示標(biāo)志；使胎兒細(xì)胞與一試劑接觸，以便產(chǎn)生第二信號(hào)，該第二信號(hào)具有診斷顯示標(biāo)志；以及利用計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察胎兒細(xì)胞，以便得到第二信號(hào)。
116.如權(quán)利要求115所述的方法，其特征在于涂片包括至少2501的所述非富集母體血液。
117.如權(quán)利要求115所述的方法，其特征在于涂片包括至少500l的所述非富集母體血液。
118.如權(quán)利要求115所述的方法，其特征在于還要處理第一信號(hào)以便表示胎兒細(xì)胞的形態(tài)測(cè)定。
119.如權(quán)利要求115所述的方法，其特征在于還包括用標(biāo)記物處理涂片以便加強(qiáng)胎兒細(xì)胞與母體細(xì)胞的光學(xué)區(qū)分。
120.如權(quán)利要求115所述的方法，其特征在于當(dāng)?shù)谝恍盘?hào)和第二信號(hào)都存在時(shí)它們不會(huì)相互屏蔽。
121.如權(quán)利要求115所述的方法，其特征在于利用原位PCR或PCR原位產(chǎn)生第二信號(hào)。
122.如權(quán)利要求115所述的方法，其特征在于在一基質(zhì)上制備涂片，而基質(zhì)的長(zhǎng)度至少是其寬度的10倍，并且基質(zhì)基本上沿一個(gè)方向延長(zhǎng)。
123.如權(quán)利要求122所述的方法，其特征在于基質(zhì)的長(zhǎng)度至少是其寬度的20倍。
124.如權(quán)利要求122所述的方法，其特征在于基質(zhì)是一彈性膜。
125.如權(quán)利要求115所述的方法，其特征在于在一基質(zhì)上制備涂片，并且還包括參照基質(zhì)校正坐標(biāo)系統(tǒng)，以便早期鑒定的胎兒細(xì)胞的坐標(biāo)能夠返回到后一程序中。
126.如權(quán)利要求125所述的方法，其特征在于得到第一信號(hào)的觀察步驟還包括將光場(chǎng)逐步移到基本上覆蓋了所有涂片的一系列部分涂片之上。
127.如權(quán)利要求126所述的方法，其特征在于還包括以下步驟在計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)的控制下相對(duì)于計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)的物鏡移動(dòng)涂片。
128.如權(quán)利要求127所述的方法，其特征在于第一信號(hào)來(lái)自選擇性鍵合到胎兒細(xì)胞上的標(biāo)記物。
129.如權(quán)利要求115所述的方法，其特征在于還包括用所述母體血樣制備多個(gè)涂片，所述的每個(gè)涂片都包括至少5l的樣品；從得到第一信號(hào)的涂片中鑒定出多個(gè)胎兒細(xì)胞；以及只特異性處理所鑒定的含有胎兒細(xì)胞的涂片。
130.如權(quán)利要求129所述的方法，其特征在于這些多個(gè)涂片包括至少250l的所述非富集母體血液。
131.如權(quán)利要求129所述的方法，其特征在于這些多個(gè)涂片包括至少500l的所述非富集母體血液。
132.一種利用含有自然存在的胎兒細(xì)胞的非富集母體血樣對(duì)胎兒進(jìn)行診斷的方法，該方法包括以下步驟制備至少250l的非富集母體血樣涂片；鑒定涂片中的胎兒細(xì)胞；使胎兒細(xì)胞與一產(chǎn)生診斷信號(hào)的試劑接觸；以及觀察診斷信號(hào)。
133.如權(quán)利要求132所述的方法，其特征在于鑒定步驟還包括利用計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察涂片中的細(xì)胞；測(cè)定由所觀察的細(xì)胞產(chǎn)生的指示胎兒細(xì)胞存在的信號(hào)；以及限定出所測(cè)定的信號(hào)指示所述胎兒細(xì)胞存在的位置處的坐標(biāo)。
134.如權(quán)利要求132所述的方法，其特征在于制備步驟還包括制備至少500l的非富集母體血樣涂片。
135.如權(quán)利要求132所述的方法，其特征在于在具有一長(zhǎng)度和一寬度的基質(zhì)上制備涂片，其中涂片的長(zhǎng)度至少是其寬度的10倍。
136.如權(quán)利要求132所述的方法，其特征在于在一加長(zhǎng)的彈性膜基質(zhì)上制備涂片。
137.如權(quán)利要求133所述的方法，其特征在于還包括鑒定涂片上的胎兒細(xì)胞的坐標(biāo)；以及在鑒定所述坐標(biāo)之后在那些坐標(biāo)處特異性接觸胎兒細(xì)胞。
138.一種從含有自然存在濃度的胎兒細(xì)胞的非富集母體血樣中得到基本上分離開的胎兒細(xì)胞圖象的方法，該方法包括以下步驟制備至少250l的非富集母體血樣涂片；利用可信號(hào)顯示胎兒細(xì)胞存在的計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察涂片；鑒定觀察涂片處的坐標(biāo)；將包括由信號(hào)顯示的胎兒細(xì)胞圖象的光場(chǎng)移動(dòng)到所鑒定的坐標(biāo)處；以及放大光場(chǎng)一直到圖象是分離開的胎兒細(xì)胞的圖象。
139.一種用于篩分含有自然存在濃度的胎兒細(xì)胞的非富集母體血樣涂片中所含的胎兒細(xì)胞的裝置，該裝置包括一其上具有至少250l母體血液涂片的彈性膜。
140.如權(quán)利要求139所述的裝置，其特征在于涂片上具有至少500l的母體血液。
141.一種用于診斷過(guò)程的細(xì)胞樣品的制備方法，該方法包括得到以單層形式固定到基質(zhì)上的細(xì)胞樣品，該細(xì)胞樣品包括以每10000個(gè)細(xì)胞中具有不大于1個(gè)細(xì)胞的濃度存在于樣品中的稀少細(xì)胞；利用可信號(hào)顯示稀少細(xì)胞存在的計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察至少覆蓋一部分細(xì)胞樣品的光場(chǎng)；檢測(cè)信號(hào)；以及鑒定檢測(cè)信號(hào)處的坐標(biāo)，用于診斷過(guò)程。
142.如權(quán)利要求139所述的方法，其特征在于稀少細(xì)胞以不大于細(xì)胞樣品的0.001％的濃度存在。
143.如權(quán)利要求139所述的方法，其特征在于稀少細(xì)胞以不大于細(xì)胞樣品的0.0001％的濃度存在。
144.如權(quán)利要求139所述的方法，其特征在于稀少細(xì)胞以不大于細(xì)胞樣品的0.00001％的濃度存在。
145.如權(quán)利要求141所述的方法，其特征在于還要處理信號(hào)以便表示胎兒細(xì)胞的形態(tài)測(cè)定。
146.如權(quán)利要求141所述的方法，其特征在于還包括鑒定得到第一信號(hào)處的坐標(biāo)；以及在鑒定所述坐標(biāo)之后在那些坐標(biāo)處特異性接觸稀少細(xì)胞。
147.如權(quán)利要求141所述的方法，其特征在于還包括用標(biāo)記物處理稀少細(xì)胞以便加強(qiáng)稀少細(xì)胞與其它細(xì)胞的光學(xué)區(qū)分。
148.一種從細(xì)胞樣品中得到具有相當(dāng)于細(xì)胞樣品中的稀少細(xì)胞的診斷顯示信號(hào)的方法，該方法包括如下步驟得到以單層形式固定到基質(zhì)上的細(xì)胞樣品，其中稀少細(xì)胞以每10000個(gè)細(xì)胞中具有不大于1個(gè)細(xì)胞的濃度存在于樣品中；使稀少細(xì)胞與一試劑接觸以便產(chǎn)生一診斷信號(hào)，該診斷信號(hào)具有診斷顯示標(biāo)志；利用計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察該單層細(xì)胞，以便得到診斷信號(hào)；以及利用計(jì)算機(jī)微觀系統(tǒng)觀察稀少細(xì)胞，以便得到第二信號(hào)。
149.如權(quán)利要求148所述的方法，其特征在于稀少細(xì)胞以不大于細(xì)胞樣品的0.001％的濃度存在。
150.如權(quán)利要求148所述的方法，其特征在于稀少細(xì)胞以不大于細(xì)胞樣品的0.0001％的濃度存在。
151.如權(quán)利要求148所述的方法，其特征在于稀少細(xì)胞以不大于細(xì)胞樣品的0.00001％的濃度存在。
152.如權(quán)利要求148所述的方法，其特征在于還包括使樣品與一試劑接觸以便產(chǎn)生一定位信號(hào)，其中還要處理定位信號(hào)以便表示稀少細(xì)胞的形態(tài)測(cè)定。
153.如權(quán)利要求148所述的方法，其特征在于還包括鑒定得到定位信號(hào)處的坐標(biāo)；以及在鑒定所述坐標(biāo)之后在那些坐標(biāo)處特異性接觸稀少細(xì)胞。
154.如權(quán)利要求148所述的方法，其特征在于還包括用標(biāo)記物處理稀少細(xì)胞以便加強(qiáng)稀少細(xì)胞與其它細(xì)胞的光學(xué)區(qū)分。
155.如權(quán)利要求1、24、42或43所述的方法，其特征在于體液是母體血液，稀少細(xì)胞是胎兒細(xì)胞。
156.如權(quán)利要求67所述的方法，其特征在于體液是母體血液，稀少細(xì)胞是胎兒細(xì)胞。
157.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于還包括獲得限定出組織樣品的第一面積圖象的第三圖象數(shù)據(jù)組，第三圖象數(shù)據(jù)組在產(chǎn)生第一圖象數(shù)據(jù)組子集的步驟中用作第一圖象數(shù)據(jù)組；在鄰近第一面積處基本上同時(shí)獲得限定出組織樣品的第二面積圖象的第四圖象數(shù)據(jù)組，第四圖象數(shù)據(jù)組在產(chǎn)生第一圖象數(shù)據(jù)組子集的步驟中用作第一圖象數(shù)據(jù)組；單獨(dú)和平行完成產(chǎn)生第三圖象數(shù)據(jù)組和第四圖象數(shù)據(jù)組上的第一圖象數(shù)據(jù)組子集步驟。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)和診斷組織樣品中稀少細(xì)胞類型的計(jì)算機(jī)控制方法,所述方法包括以下步驟:首先處理組織樣品以便使其產(chǎn)生指示稀少細(xì)胞存在的位置的第一信號(hào),其次檢測(cè)第一信號(hào),處理檢測(cè)到第一信號(hào)的部位,以便產(chǎn)生可指示有益于診斷的細(xì)胞特性的第二信號(hào),然后測(cè)定第二信號(hào)。第一信號(hào)可是形態(tài)學(xué)的或者在染色之前或之后所尋找的細(xì)胞中具有顏色?？衫迷籔CR或PCR原位雜化產(chǎn)生第二信號(hào)。在一優(yōu)選實(shí)施例中,稀少細(xì)胞類型是母體血液組織樣品中的胎兒細(xì)胞,所述樣品包括非富集的母體血樣涂片。在另一實(shí)施例中,該方法用于診斷血液或組織活檢樣品中的遺傳型癌細(xì)胞。
文檔編號(hào)G06T7/00GK1308726SQ99808410
公開日2001年8月15日 申請(qǐng)日期1999年5月7日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月9日
發(fā)明者P·茨普拉斯, T·塔法斯 申請(qǐng)人:伊康尼西斯公司