專利名稱：對(duì)化學(xué)合成多肽進(jìn)行折疊的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)化學(xué)合成多肽進(jìn)行折疊的方法。另外，本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)生物活性蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
自從成功地對(duì)全活性HIV-蛋白酶進(jìn)行了化學(xué)合成后，近幾十年，對(duì)合成蛋白質(zhì)的需求在逐步增加，所述HIV-蛋白酶是通過高度優(yōu)化的固相肽合成(SPPS)的方法制備的一種由99個(gè)殘基組成的酶，該方法以標(biāo)準(zhǔn)的Boc/Bzl方法為基礎(chǔ)。
1994年對(duì)晶狀遍在蛋白質(zhì)的合成進(jìn)一步表明高純度蛋白質(zhì)可通過基于Fomc/t-Bu方案的SPPS方法來合成，該方法在操作上比Boc/Bzl方法簡(jiǎn)單而且在化學(xué)方面沒Boc/Bzl方法復(fù)雜，其中所述晶狀遍在蛋白質(zhì)是一種由76個(gè)殘基組成的小分子蛋白質(zhì)。
到2000年為止，大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明借助肽合成儀通過化學(xué)合成可快速、可靠和經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)含有60至100個(gè)氨基酸殘基的單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)，生產(chǎn)量足以進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能的研究。
通過化學(xué)合成制備的含二硫鍵的蛋白質(zhì)一旦進(jìn)行了折疊，就具有與天然和基因工程形式的蛋白質(zhì)相同的特性。蛋白質(zhì)的二硫鍵可形成單個(gè)或多個(gè)鏈內(nèi)和/或鏈間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，該環(huán)狀結(jié)構(gòu)給予分子大量的構(gòu)象限制，因此對(duì)穩(wěn)定生物活性構(gòu)象起著決定性的作用。
結(jié)構(gòu)已知的單結(jié)構(gòu)域折疊蛋白可通過半胱氨酸殘基的區(qū)域選擇性配對(duì)來制備。已經(jīng)對(duì)適合于常用保護(hù)方案的多種組合形式的半胱氨酸保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行了研究從而使得半胱氨酸殘基以分步和成對(duì)的方式進(jìn)行完全選擇性的去保護(hù)和/或共氧化。
然而，最近對(duì)一種胰島素樣肽，即人松弛素進(jìn)行的合成表明在含有多個(gè)半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)中進(jìn)行的半胱氨酸殘基的區(qū)域選擇性配對(duì)所涉及的化學(xué)過程是多么的復(fù)雜。利用SPPS方法、Fmoc/t-Bu方法和對(duì)-烷氧基苯甲醇基的樹脂來合成A鏈前體，同時(shí)利用PAM樹脂(與聚苯乙烯基的樹脂連接的4-羧基酰氨基甲基芐基酯)按照Boc/Bzl方法來合成B鏈前體。將A鏈前體的四個(gè)半胱氨酸殘基中的兩個(gè)半胱氨酸殘基以S-Trt(S-三苯基甲基)衍生物的形式保護(hù)起來，同時(shí)將另外兩個(gè)半胱氨酸殘基分別以S-Acm(S-乙酰氨基甲基)和S-Meb(S-對(duì)-甲基芐基)的形式保護(hù)起來。B鏈前體中的兩個(gè)半胱氨酸被S-Acm和S-Meb保護(hù)基團(tuán)保護(hù)起來。首先通過在AcOH中進(jìn)行碘氧化來形成A鏈的分子內(nèi)的S-S鍵。然后，通過以下兩個(gè)步驟來形成兩個(gè)連接A和B鏈的分子間二硫鍵在第一個(gè)步驟中，通過對(duì)A鏈前體中的S-Meb保護(hù)基團(tuán)進(jìn)行HF去保護(hù)而獲得的游離巰基與B鏈中的被活化的Cys(Npys)(S-3-硝基-2-吡啶亞磺?；?殘基進(jìn)行反應(yīng)(目的在于形成分子間的異源二硫鍵)，以及在第二個(gè)步驟中，通過與碘發(fā)生共氧化反應(yīng)來去除S-Acm基團(tuán)從而獲得其余的S-S鍵。
SPPS方法為化學(xué)合成制備各種含有用相同保護(hù)基團(tuán)保護(hù)的半胱氨酸殘基的多肽提供了可能性。一旦利用多種氧化試劑去除了保護(hù)基團(tuán)，就能直接形成二硫鍵。通過對(duì)溶劑、pH和反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行精心調(diào)控從而將對(duì)氧化反應(yīng)敏感的Tyr、Met和Trp發(fā)生改變的程度降到最低以及避免半胱氨酸的巰基被過氧化成相應(yīng)的磺酸，在這種條件下利用碘、N-碘代琥珀酰亞胺和碘化氰進(jìn)行處理，結(jié)果含有被S-Trt或S-Acm保護(hù)的半胱氨酸的多肽和/或蛋白質(zhì)都能進(jìn)行有效的折疊。
有時(shí)三氟乙酸鉈(III)可替代上述氧化劑從而得到較高產(chǎn)率的二硫鍵。該試劑的主要缺陷在于它的毒性、從靶多肽中去除鉈的難度以及需要對(duì)Met和Trp殘基進(jìn)行保護(hù)以避免被氧化。
含有亞砜/甲硅烷基化合物與三氟乙酸的混合物的氧化試劑已被成功地用來將含有S-Acm、S-But、S-Met和S-Mob(S-對(duì)-甲氧基芐基)半胱氨酸殘基的多肽前體直接氧化形成二硫鍵。然而，為了避免在氧化條件下的氯化作用需要利用甲?；鶎?duì)Trp的吲哚環(huán)進(jìn)行保護(hù)，這一點(diǎn)嚴(yán)重制約了該混合物的應(yīng)用。
對(duì)合成的線性多巰基前體(多肽的還原形式)進(jìn)行氧化折疊的方法比較普遍而且使用的頻率最高。通過該最簡(jiǎn)單的方法，可在有空氣或一些其它溫和氧化劑存在的條件下自然形成合適的二硫鍵。而且，在有被還原形式的(RSH)和被氧化形式的(R-S-S-R)低分子量的巰基化合物同時(shí)存在的條件下完成折疊和半胱氨酸的配對(duì)。
對(duì)于由單結(jié)構(gòu)域組成的合成多肽和小分子蛋白質(zhì)來說，由于H-鍵合、離子配對(duì)和疏水性作用的聯(lián)合效應(yīng)而造成折疊所需的熱力學(xué)推動(dòng)力顯然足以在隨機(jī)變性氧化反應(yīng)過程中自然產(chǎn)生天然的異構(gòu)體。
通過對(duì)含有多個(gè)半胱氨酸的小分子蛋白質(zhì)如酶、抑制劑、毒素或激素進(jìn)行氧化折疊研究，獲得了有關(guān)特定結(jié)構(gòu)基元如被半胱氨酸穩(wěn)定的β-轉(zhuǎn)角、被半胱氨酸穩(wěn)定的聚(Pro)-II螺旋折疊和被半胱氨酸穩(wěn)定的α-β-結(jié)構(gòu)折疊的有用信息，其中所述特定結(jié)構(gòu)基元的穩(wěn)定作用是形成正確二硫鍵的主要推動(dòng)力，即使在較小的肽分子中也如此。如果注意選擇對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)基元起穩(wěn)定作用的緩沖液、溫度和添加劑，那么即使在體外也能對(duì)部分折疊的或不規(guī)則的(錯(cuò)折疊的)蛋白質(zhì)進(jìn)行完全正確的折疊。
為了將分子內(nèi)半胱氨酸的錯(cuò)誤配對(duì)減到最少以及盡可能地避免分子間二硫鍵的隨機(jī)形成，已經(jīng)設(shè)計(jì)了多種適用于多巰基多肽種類的折疊方案，所述分子內(nèi)半胱氨酸的錯(cuò)誤配對(duì)導(dǎo)致錯(cuò)折疊的非天然異構(gòu)體的產(chǎn)生，所述分子間二硫鍵的隨機(jī)形成促使發(fā)生聚集和沉淀。
因此，一般是在中性或弱堿性條件下對(duì)高稀釋度(1mg/ml或低于1mg/ml)的多巰基形式的前體進(jìn)行空氣氧化。在反應(yīng)過程中通常需要持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間而且還產(chǎn)生一種無害的副產(chǎn)物，即水。然而，由于痕量金屬離子對(duì)空氣氧化速率影響很大，所以很難對(duì)空氣氧化進(jìn)行控制。更重要的是，折疊過程中在或接近它們的堿性或中性等電點(diǎn)時(shí)，堿性和疏水性前體分子容易發(fā)生聚集作用并從溶液中沉淀出來。而且，由于Met發(fā)生氧化而產(chǎn)生的副產(chǎn)物在折疊過程中蓄積。盡管將折疊多巰基前體所需的化學(xué)操作步驟減至最少，但是在許多情況下由空氣的分子氧促進(jìn)的二硫鍵的形成產(chǎn)率非常低，有時(shí)根本就不能形成二硫鍵。
DMSO和鐵氰化鉀也已被用作氧化劑。然而，鐵氰化鉀必須在暗處使用并且，如果多肽鏈中含有Met和Trp，那么在折疊過程中積累氧化副產(chǎn)物。由于在酸性條件下能有效進(jìn)行氧化折疊同時(shí)在反應(yīng)中不生成有害的產(chǎn)物，所以使用DMSO通常能夠獲得較好的結(jié)果。由于進(jìn)行氧化的堿性和疏水性多肽前體在酸性緩沖液中具有較高的溶解特性，所以該方法特別適用于堿性和疏水性多肽前體的折疊。然而，常常有這樣的報(bào)道，即從終產(chǎn)物中去除DMSO存在著難度以及對(duì)二硫鍵形成的選擇性很低。而且，即使對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行精心的調(diào)控，也總是不能避免形成無規(guī)則二硫鍵，該無規(guī)則二硫鍵導(dǎo)致錯(cuò)折疊的異構(gòu)體的產(chǎn)生和低聚反應(yīng)的發(fā)生。
通過利用氧化還原緩沖液如被氧化的(GSSG)和被還原的(GSH)谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸(Cys/Cys)大都能夠以較高的產(chǎn)率獲得小分子蛋白質(zhì)的多巰基前體中的半胱氨酸的正確配對(duì)和折疊。
因此，在由GSSG/GSH或Cys/Cys誘導(dǎo)的核糖核酸酶A(R.R.Hantgan等，生物化學(xué)(Biochemistry)13，613，1974)，水蛭素的49個(gè)氨基酸核心結(jié)構(gòu)域(B.Chatrenet和J.Y.Chang，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem).267，3038，1992)和牛胰蛋白酶抑制劑(BPTI)(T.E.Creighton，酶學(xué)方法(Methods Enzymol).131，83，1986)的氧化折疊過程中，形成游離巰基和二硫基并且在整個(gè)折疊過程中不斷地進(jìn)行改構(gòu)。由于通過硫醇鹽中間體進(jìn)行的巰基/二硫基交換反應(yīng)可促進(jìn)非天然二硫鍵向天然二硫鍵的改組，所以總的速率和產(chǎn)率通常高于在空氣中進(jìn)行氧化折疊的速率和產(chǎn)率。對(duì)于在空氣中進(jìn)行氧化折疊的情況，為了避免聚集和低聚物和聚合物的形成以及最大限度地提高靶蛋白的產(chǎn)率，高稀釋度的多巰基前體是必需的。
在水蛭素1-49進(jìn)行體外折疊的第一階段中，未折疊的還原形式(多巰基)循序而且不可逆地進(jìn)行折疊，形成含有一個(gè)和兩個(gè)二硫鍵的平衡異構(gòu)體并且還形成含有三個(gè)二硫鍵的平衡異構(gòu)體(無規(guī)則異構(gòu)體)(J.Y.Chang，生物化學(xué)雜志(Biochem.J).300，643，1994)。已經(jīng)鑒定出包括天然種類在內(nèi)的幾乎全部75個(gè)可能的蛋白質(zhì)種類15個(gè)具有一個(gè)S-S鍵的異構(gòu)體、45個(gè)具有兩個(gè)S-S鍵的異構(gòu)體和15個(gè)具有三個(gè)S-S鍵的異構(gòu)體。在折疊的第二個(gè)階段中，無規(guī)則種類通過改組非天然二硫鍵進(jìn)行改構(gòu)而獲得天然蛋白質(zhì)種類。主要通過利用被氧化的谷胱甘肽或胱氨酸來加快二硫鍵的形成，而二硫鍵的改組需要一種巰基催化劑如被還原的谷胱甘肽或半胱氨酸或巰基乙醇。
巰基試劑促進(jìn)改組的有效性顯然與它們的氧化還原電勢(shì)有關(guān)并且每種催化劑都具有一個(gè)最佳濃度。在無規(guī)則水蛭素積累的過程中，胱氨酸/半胱氨酸的效力約比GSSG/GSH高10倍。這一差異已經(jīng)通過GSSG/GSH(-0.24V)與Cys-Cys/Cys(-0.22V)系統(tǒng)之間的相對(duì)氧化還原電勢(shì)而得到解釋。通過選擇一組最適條件(溫度、緩沖液、鹽和氧化還原混合物)，將水蛭素1-49的折疊過程加快到15分鐘內(nèi)就能完成的程度。
一般來說，含有數(shù)個(gè)二硫鍵的合成蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象在最適于多巰基形式進(jìn)行折疊的條件下應(yīng)該自然形成。然而，在許多情況下，即使在最適條件下由上述氧化還原緩沖液介導(dǎo)氧化折疊，也產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物和錯(cuò)配形式。這種情況尤其涉及那些僅在特定膜表面或在特定陪伴分子的協(xié)助下易于形成天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)(S.Sakakibara生物聚合物，肽科學(xué)(Biopolymers，Peptide Science)51，279，1999)。
而且，盡管已經(jīng)廣泛使用，但是正如合成趨化因子和趨化因子類似物的折疊實(shí)驗(yàn)所表明的，由空氣或GSSG/GSH和胱氨酸/半胱氨酸氧化還原對(duì)促進(jìn)的多巰基前體的氧化折疊反應(yīng)大都進(jìn)行過反復(fù)試驗(yàn)。事實(shí)上，盡管天然趨化因子及其多種類似物容易折疊，所產(chǎn)生的折疊結(jié)構(gòu)由兩個(gè)或三個(gè)二硫鍵來穩(wěn)定，在與相應(yīng)的天然分子產(chǎn)生部分折疊形式的條件相同的條件下有幾種類似物還是不能完全折疊。這些觀察資料有力地表明多巰基前體的一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變可能會(huì)對(duì)在待折疊多肽鏈中局部進(jìn)行正確折疊(β-轉(zhuǎn)角、聚脯氨酸螺旋基元等)產(chǎn)生不利的影響。因此，許多巰基前體的折疊傾向主要在于多肽鏈的內(nèi)在特性而不在于作用于該分子的特定氧化系統(tǒng)的功能。
通過向低離子強(qiáng)度的緩沖液中添加醇類、乙腈和DMSO來增強(qiáng)二硫鍵的選擇性配對(duì)也已經(jīng)得到報(bào)道。該方案包括將介質(zhì)中的靜電因子調(diào)節(jié)成有利于帶相反電荷氨基酸的并置，該氨基酸鄰接被選半胱氨酸殘基，從而增進(jìn)特定二硫鍵的形成。
酶如肽基二硫鍵異構(gòu)酶(PDI)和脯氨酰基異構(gòu)酶(PPI)也已被用作催化和調(diào)節(jié)二硫鍵轉(zhuǎn)化的添加物。如果將PDI加到重折疊緩沖液中，那么體外折疊水蛭素所需要的時(shí)間就能被縮短到10小時(shí)至30秒鐘。在這種情況下，體外折疊效率與體內(nèi)折疊效率的差別不大。
當(dāng)半胱氨酸殘基被對(duì)酸不穩(wěn)定的基團(tuán)如Trt所保護(hù)時(shí)，通過對(duì)多肽-樹脂進(jìn)行酸解裂解來直接得到多巰基多肽前體。或者優(yōu)選地，首先通過對(duì)多肽-樹脂進(jìn)行酸解裂解將其中全部半胱氨酸都被耐酸基團(tuán)如乙酰氨基甲基基團(tuán)(Acm)所保護(hù)的多肽以S-半胱氨酸衍生物的形式分離出來，然后在乙酸中采用Hg(AcO)2進(jìn)行處理來去掉Acm基團(tuán)，接著在有大大過量巰基乙醇存在的條件下通過凝膠過濾來去除Hg離子。
然而，在兩種情況下，已經(jīng)有關(guān)于半胱氨酸和色氨酸殘基發(fā)生數(shù)種副反應(yīng)的報(bào)道。色氨酸中的吲哚環(huán)可以通過巰基乙醇進(jìn)行衍生化并且半胱氨酸會(huì)產(chǎn)生多種副反應(yīng)，最重要的是在通過酸解使多肽鏈脫離樹脂的過程中利用叔丁基陽離子進(jìn)行的氧化反應(yīng)和烷基化反應(yīng)。
因此，由于現(xiàn)有方法中存在著不足，所以需要更有效和更簡(jiǎn)單的折疊化學(xué)合成多肽和通過化學(xué)合成制備生物活性蛋白質(zhì)的方法。

發(fā)明內(nèi)容
因此本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單有效和快速折疊多肽和/或蛋白質(zhì)的方法，其中特別是含有錯(cuò)配二硫鍵的異構(gòu)體的生成被減到最少，而且可以省去使用昂貴的二硫鍵-改組試劑如谷胱甘肽或酶，并且該方法具有可重復(fù)性、穩(wěn)定性和規(guī)模性。這些以及其它目的對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
本發(fā)明通過提供一種折疊化學(xué)合成多肽的方法來實(shí)現(xiàn)該目的，所述方法包括在一種預(yù)先設(shè)定了pH和溫度的折疊緩沖液中利用還原劑處理含有兩個(gè)或多個(gè)衍生半胱氨酸殘基的多肽。
還提供一種制備生物活性蛋白質(zhì)的方法，該方法包括(a)化學(xué)合成一種含有兩個(gè)或多個(gè)衍生半胱氨酸殘基的多肽；(b)在一種預(yù)先設(shè)定了pH和溫度的折疊緩沖液中利用還原劑處理所述多肽；和(c)純化所獲得的折疊蛋白質(zhì)。
優(yōu)選地，所述衍生半胱氨酸殘基相當(dāng)于一種S-丁基-硫代-半胱氨酸(S-t-Bu)殘基。因此，根據(jù)本發(fā)明，出乎意料地發(fā)現(xiàn)S-t-Bu-衍生半胱氨酸可以被去保護(hù)，即去掉S-t-Bu部分，當(dāng)在一種溫度和pH合適的適當(dāng)折疊緩沖液中進(jìn)行溫育時(shí)與其它半胱氨酸形成二硫鍵。
根據(jù)本發(fā)明，所述還原劑優(yōu)選地是游離半胱氨酸。可以將過量的半胱氨酸加到所述緩沖液中(如實(shí)施例1-5所示)或者可以從多肽中衍生得到半胱氨酸(如實(shí)施例6所示)。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述折疊緩沖液含有一種或多種離液序列高的鹽，從而使得所述肽處于能夠發(fā)生自然折疊的平衡狀態(tài)。這一點(diǎn)例如可以通過將所述多肽和/或蛋白質(zhì)置于完全變性的條件下來實(shí)現(xiàn)，例如通過利用高濃度的離液序列高的鹽，然后將離液序列高的鹽稀釋到適于進(jìn)行折疊的較低濃度來實(shí)現(xiàn)。所述離液序列高的鹽優(yōu)選地選自鹽酸胍和尿素，在折疊過程中，優(yōu)選地以0.1-1M的濃度存在。
優(yōu)選地，折疊緩沖液的溫度介于25℃和40℃之間，更優(yōu)選地在27℃和38℃之間，以便當(dāng)相當(dāng)于自然體溫時(shí)，使肽降解的變化程度減弱。最優(yōu)選地是在折疊過程中所述溫度約為37℃。
根據(jù)本發(fā)明方法的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述折疊緩沖液具有弱堿性pH。優(yōu)選地，所述pH介于7和9之間，更優(yōu)選地是，介于7和8.5之間以便促進(jìn)折疊過程。從以上可以清楚地看到，蛋白質(zhì)的折疊取決于一組復(fù)雜的相互作用。例如在酸性pH下不與半胱氨酸發(fā)生反應(yīng)，而且較高的pH值會(huì)增加多肽發(fā)生降解的風(fēng)險(xiǎn)。
折疊后，靶蛋白可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中的已知方法進(jìn)行純化，所述方法包括陰離子和陽離子交換色譜、疏水相互作用色譜、反相色譜、親和色譜、親水相互作用/陽離子交換色譜(HILIC/CEC)、頂替色譜(DC)和樣品頂替色譜(SDM)。最優(yōu)選地是利用洗脫法的(反相)高效色譜以及頂替色譜。
在生產(chǎn)生物活性蛋白質(zhì)方法的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟(a)通過分步鏈延伸的方法將S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽裝配到一種不溶性聚合載體上；(b)通過酸解將所述S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽鏈從所述載體上裂解下來；(c)純化所獲得的S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽；(d)在含有離液序列高的鹽，優(yōu)選地是鹽酸胍，堿性pH和約37℃的折疊緩沖液中利用摩爾過量的半胱氨酸處理所述多肽從而使被純化的S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽進(jìn)行折疊；和(e)利用反相高效液相色譜來純化所獲得的折疊蛋白質(zhì)。
在本發(fā)明方法的一個(gè)有利的實(shí)施方案中，聚合載體是一種被對(duì)酸不穩(wěn)定的羥甲基苯氧基乙酸連接物所官能化的聚酰胺或聚苯乙烯基的樹脂，因?yàn)檫@些載體能夠適用于全自動(dòng)肽合成儀，而且通常能夠合成出長(zhǎng)多肽鏈。
如上所釋，本發(fā)明基于S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽的分步固相裝配和以下發(fā)現(xiàn)通過在有還原劑，優(yōu)選地是半胱氨酸存在、在弱堿性pH以及約37℃的條件下對(duì)所述多肽進(jìn)行折疊能夠產(chǎn)生大量的天然生物活性蛋白質(zhì)。
令人驚奇地發(fā)現(xiàn)在除掉S-叔-丁基保護(hù)基團(tuán)從而形成二硫鍵的過程中利用高度摩爾過量的半胱氨酸可以產(chǎn)生生物活性蛋白質(zhì)。這一操作方法比現(xiàn)有技術(shù)中描述的用于折疊含半胱氨酸多肽的操作方法更簡(jiǎn)單更有效，其中所述含半胱氨酸多肽是通過化學(xué)合成得到的。因此S-叔-丁基的去除是在與多肽折疊相同的步驟中完成的。
或者，還可以通過聯(lián)合使用S-叔-丁基-硫代半胱氨酸和被適當(dāng)對(duì)酸不穩(wěn)定的基團(tuán)保護(hù)的半胱氨酸來獲得相同的折疊物質(zhì)，所述對(duì)酸不穩(wěn)定的基團(tuán)是對(duì)多肽鏈上的選定位點(diǎn)進(jìn)行保護(hù)的從而不需要向折疊緩沖液中另外加入還原劑就能形成適當(dāng)?shù)亩蜴I。在這種情況下，當(dāng)在酸性pH下將肽從樹脂上裂解下來的同時(shí)除掉對(duì)酸不穩(wěn)定的基團(tuán)。因此產(chǎn)生了游離的半胱氨酸，該游離的半胱氨酸又被作為能夠除掉S-叔-丁基和形成二硫鍵的分子內(nèi)“還原劑”(如實(shí)施例6所示)。
本發(fā)明的本質(zhì)在于-將S-硫代-叔-丁基化多肽鏈快速裝配到聚合載體上；-在弱堿性條件下半胱氨酸催化所述衍生物進(jìn)行巰基-二硫鍵的交換反應(yīng)，結(jié)果產(chǎn)生半胱氨?；亩嚯模摱嚯氖堑湫偷难趸€原胱氨酸/半胱氨酸對(duì)的氧化的大分子形式(蛋白質(zhì)-S-S-半胱氨酸；多肽-S-S半胱氨酸)；-在整個(gè)折疊過程中，氧化的大分子形式的濃度始終被保持在很低的水平以便將分子間的二硫鍵交換反應(yīng)降低到最低程度；和由于優(yōu)先和迅速地形成具有正確的半胱氨酸配對(duì)的形式(天然結(jié)構(gòu))而不發(fā)生錯(cuò)折疊的中間體的聚集。
按照本發(fā)明的用于折疊多肽的方法，例如，第一步，在室溫下將10mg的S-叔-丁基衍生物溶解在1ml的緩沖液中，將得到的溶液在室溫下保留約20分鐘，所述緩沖液的pH為8.0并且含有6M的鹽酸胍、10mM Tris和0.1M的Na2HPO4。第二步，先用水將所述溶液稀釋10倍以便達(dá)到pH7.2，(0.6M鹽酸胍，1.0mM Tris，10mMNa2HPO4以及多肽衍生物的最終濃度為1mg/ml)，然后在攪拌條件下加入強(qiáng)烈摩爾過量的半胱氨酸(高出多肽或蛋白質(zhì)衍生物的濃度約100倍)。為了使所述多肽發(fā)生折疊，逐漸將溫度升高到37℃并且維持約24小時(shí)恒定不變。
本發(fā)明的折疊方法能夠產(chǎn)生高度均質(zhì)的產(chǎn)物而且只需要進(jìn)行很小改動(dòng)就能適用于由固相化學(xué)合成法生產(chǎn)的任何多肽如半胱氨酸硫代-叔丁基衍生物。另外，與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比，本發(fā)明采用多巰基前體形式的方法還具有許多其它的優(yōu)勢(shì)，諸如-鏈上的半胱氨酸殘基在酸解裂解多肽-樹脂的過程中不被烷基化；-不發(fā)生半胱氨酸轉(zhuǎn)化為磺酸的過氧化反應(yīng)，也不發(fā)生導(dǎo)致分子間二硫鍵形成的氧化反應(yīng)；-避免了Trp的吲哚環(huán)被巰基乙醇衍生化的危險(xiǎn)性，所述巰基乙醇是去除污染物Hg離子所必需的，該污染物Hg離子是利用Hg(AcO)2進(jìn)行Acm去保護(hù)時(shí)產(chǎn)生的。實(shí)際上，在本發(fā)明的折疊混合物中的半胱氨酸硫醇鹽一點(diǎn)也不改變Trp；-對(duì)氧化敏感的Met，Trp和Tyr殘基在折疊過程中不發(fā)生改變；-最終折疊產(chǎn)物的生產(chǎn)成本一般比利用多巰基多肽和氧化還原緩沖液的生產(chǎn)成本低。
本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員很清楚，盡管靶蛋白通常是利用本發(fā)明的方法以高產(chǎn)率制備的，但在某些情況下，例如對(duì)于具有多個(gè)二硫鍵的復(fù)雜蛋白質(zhì)來說，未完全轉(zhuǎn)化為天然結(jié)構(gòu)的特定種類的中間體形式(錯(cuò)折疊種類)以平衡狀態(tài)保留在溶液中。利用RP-HPLC可將錯(cuò)折疊種類從正確折疊種類中方便地分離出來并且在本發(fā)明的所述條件下再次進(jìn)行折疊以便增加所述方法的總產(chǎn)率。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語多肽是指通過酰胺鍵連接在一起的氨基酸聚合物。術(shù)語蛋白質(zhì)是指具有三維結(jié)構(gòu)的多肽種類，如存在于活生物體的細(xì)胞和生物流體中的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)例如可由單個(gè)折疊的多肽鏈組成或可以是由多個(gè)折疊的多肽鏈組成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。
提供下列實(shí)施例和附圖旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明而非限制，本發(fā)明被限制在權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。


圖1表示去除S-叔-丁基以及折疊hu-I-309之前的HPLC曲線圖(實(shí)施例4)。
圖2表示圖1產(chǎn)物的質(zhì)量測(cè)定結(jié)果。
圖3表示被去保護(hù)的折疊hu-I-309的HPLC曲線圖(實(shí)施例4)，表明保留時(shí)間較短。
圖4表示圖3產(chǎn)物的質(zhì)量測(cè)定結(jié)果。
圖5表示利用NEM處理后，圖3所示產(chǎn)物的質(zhì)量測(cè)定結(jié)果。與圖4相比，觀察不到質(zhì)量的變化，表明不存在游離的-SH基團(tuán)。
圖6是重組I-309的生物活性與本發(fā)明合成的折疊I-309的生物活性進(jìn)行比較的曲線圖。生物學(xué)活性通過125I標(biāo)記的趨化因子與人淋巴細(xì)胞之間的結(jié)合來評(píng)定。
圖7表示實(shí)施例5的蛋白質(zhì)折疊以后的分析型HPLC曲線圖。
圖8表示折疊的實(shí)施例5的蛋白質(zhì)的制備型HPLC曲線圖。
圖9表示實(shí)施例5的純化產(chǎn)物的質(zhì)量測(cè)定結(jié)果，表明具有預(yù)期的分子量。
圖10表示實(shí)施例6的多肽在去除S-叔-丁基和折疊之前的HPLC曲線圖。
圖11表示圖10所示多肽的質(zhì)量測(cè)定結(jié)果(M＝H)。
圖12表示實(shí)施例6的蛋白質(zhì)在折疊之后的HPLC曲線圖，表明具有較短的保留時(shí)間。
圖13表示圖12所示蛋白質(zhì)的質(zhì)量測(cè)定結(jié)果(M＝H)，表明具有預(yù)期的分子量。
實(shí)施例實(shí)施例1Cys10，11，34，50(S-t-Bu)-hu-TARC(胸腺和活化調(diào)節(jié)的趨化因子)的合成和折疊利用Fmoc/t-Bu化學(xué)方法和聚苯乙烯基的樹脂將具有71個(gè)氨基酸殘基的趨化因子衍生物裝配到433A肽合成儀(Perkin Elmer/ABI)上，其中所述樹脂被對(duì)酸不穩(wěn)定的羥甲基苯氧基乙酸連接物所官能化(Wang樹脂)，F(xiàn)moc-Ser(t-Bu)通過由DMAP(4-二甲基氨基吡啶)催化的酯化反應(yīng)被連接到所述的樹脂上。取代度是0.57mmole/g。所述合成反應(yīng)是以0.27mmole的規(guī)模通過利用五倍過量的Fmoc-氨基酸和DCI(N，N′-二異丙基碳化二亞胺)/HOBt(1-羥苯并三唑)活化試劑在DMF中進(jìn)行的。在利用分光光度法對(duì)Fmoc去保護(hù)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的條件下，偶聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間大約為60分鐘。
用S-叔-丁基基團(tuán)對(duì)四個(gè)半胱氨酸巰基進(jìn)行保護(hù)并且將最大保護(hù)方案用于所有其它側(cè)鏈Ser(t-Bu)，Thr(t-Bu)，Tyr(t-Bu)，Asp(O-t-bu)，Glu(O-t-Bu)，Lys(Boc)，Trp(Boc)，Asn(Trt)，Gln(Trt)和Arg(Pmc)。每次偶聯(lián)后，在DMF中利用乙酸酐和DIEA進(jìn)行加帽反應(yīng)。
在室溫下利用新制備的TFA/水/TIS(三異丙基硅烷)/苯酚(78∶5∶12∶5，v/v/v/w，10ml/g樹脂)混合物將產(chǎn)生的多肽-樹脂處理2.5-3.0小時(shí)。通過將裂解混合物直接過濾到冷卻甲基-叔-丁基醚(MTBE)中來將所述的裂解多肽衍生物沉淀出來，并通過離心分離出沉淀，用乙醚沖洗兩遍并在空氣中進(jìn)行干燥。
然后將粗產(chǎn)物溶解在被稀釋的乙酸中，凍干，再溶解在50％的乙酸中，然后被加載到以50％乙酸作為流動(dòng)相的Sephadex G-50色譜柱(70×25cm)上。利用MALDI-TOF質(zhì)譜測(cè)定法對(duì)收集的級(jí)分進(jìn)行分析并將含有所需多肽衍生物的那些級(jí)分(MW 8，436.9Da)合并起來，用水稀釋后進(jìn)行凍干。
將被合并的級(jí)分再次溶解到50％的乙酸中并加載到250×10mm的半制備型Vydac C4色譜柱上進(jìn)一步進(jìn)行純化。在60分鐘內(nèi)利用線性梯度為20-80％的B以3ml/分鐘的流速對(duì)樣品進(jìn)行洗脫，其中B是0.1％的TFA乙腈溶液而A是0.1％的TFA水溶液。在280nm下進(jìn)行檢測(cè)，只合并含有靶多肽的級(jí)分并在折疊之前進(jìn)行凍干。
通過RP-HPLC純化的趨化因子衍生物的折疊反應(yīng)按照以下步驟進(jìn)行首先在pH＝8.0和室溫下將10mg的產(chǎn)物溶解在1mg的6MGnHCl、0.1M Na2HPO4和10mM Tris中。20分鐘后，通過加入10ml的水將溶液稀釋到最終濃度為0.6M GnHCl、10mM Na2HPO4、1mM Tris，pH＝7.2以及肽濃度為1mg/ml。通過以約20mM(相對(duì)肽濃度約100倍的摩爾過量)的濃度加入半胱氨酸來啟動(dòng)折疊反應(yīng)并將溫度逐步升高到37℃。
通過利用Waters 2690分離組件對(duì)25微升的溶液等分樣品進(jìn)行RP-HPLC分析來監(jiān)控在37℃的恒定溫度下于空氣當(dāng)中進(jìn)行的折疊反應(yīng)，其中利用乙酸對(duì)所述等分樣品進(jìn)行了酸驟冷，所述組件配備了Waters 996光電二極管陣列檢測(cè)器，所述RP-HPLC分析采用了VydacC4分析柱以及以在0.1％TFA/水中的20-60％乙腈梯度和1.0ml/分鐘的流速進(jìn)行了40分鐘的洗脫。收集1微升每種HPLC峰值洗出液(對(duì)應(yīng)于巰基-二硫鍵交換反應(yīng)的折疊中間體)，然后與芥子酸溶解在1∶2乙腈/1％TFA的水溶液中的1微升飽和溶液進(jìn)行混合，真空干燥后利用Voyager-DE分光計(jì)(Perseptive Biosystem，F(xiàn)ramingham，MA)通過MALDI-TOF質(zhì)譜測(cè)定法進(jìn)行分析，所述分光計(jì)配備了氮?dú)饧す馄鳌?4小時(shí)后形成了78％的折疊多肽。通過與N-乙基馬來酰亞胺(NEM)進(jìn)行反應(yīng)來進(jìn)一步檢驗(yàn)其分子量相當(dāng)于折疊產(chǎn)物分子量的峰從而檢測(cè)游離巰基(對(duì)于每個(gè)SH來說是+125Da)的存在。
通過本發(fā)明的方法獲得的hu-TARC的生物學(xué)活性按照Imai方法(T.Imai等，生物化學(xué)雜志(J.Biol.Chem.)，271，21514，1996)來測(cè)定。
評(píng)定人T細(xì)胞系，即Hut78，Hut102和Jurkat，以及新鮮的單核細(xì)胞，嗜中性白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞響應(yīng)TARC而遷移過聚碳酸酯濾紙的情況。無論是通過化學(xué)合成制備的TARC還是通過重組的TARC在單核細(xì)胞或嗜中性白細(xì)胞中都沒有引發(fā)趨化反應(yīng)。在T細(xì)胞系Hut78和Hut102中，由合成的TARC以及重組的TARC誘導(dǎo)的遷移呈現(xiàn)一種典型的鐘形曲線，在100ng/ml時(shí)的誘導(dǎo)作用最強(qiáng)。
實(shí)施例2Cys10，34，50(S-t-Bu)-hu-TARC和Cys11，34，50(S-t-Bu)-hu-TARC的合成和折疊進(jìn)行Cys10，34，50(S-t-Bu)hu-TARC和Cys11，34，50(S-t-Bu)-hu-TARC衍生物的合成、純化和折疊所采用的條件與Cys10，11，34，50(S-t-Bu)hu-TARC(實(shí)施例1)所采用的條件相同，唯一的區(qū)別在于分別對(duì)Cys10和Cys11進(jìn)行了Trt保護(hù)，該保護(hù)基團(tuán)在將多肽前體從樹脂上裂解下來的同時(shí)被去除。最終的折疊趨化因子的產(chǎn)率分別是80％和79％。
實(shí)施例3Cys34，50(S-Bu)-hu-TARC的合成和折疊除了利用Trt對(duì)Cys10和Cys11進(jìn)行了保護(hù)之外，進(jìn)行Cys34，50(S-Bu)-hu-TARC衍生物的合成、純化和折疊所采用的條件與實(shí)施例1和實(shí)施例2的衍生物所采用的條件相同，所述Trt在利用TFA進(jìn)行最終樹脂裂解的過程中被除去。折疊產(chǎn)物的產(chǎn)率約為75％。
實(shí)施例4Cys10，11，26，34，68(S-t-Bu)-hu-I-309的合成和折疊在與實(shí)施例1相同的條件下利用Fmoc-Lys(Boc)Wang樹脂(0.61mmol/g的取代度)0.12mmole的規(guī)模合成含有6個(gè)被(S-t-Bu)保護(hù)的半胱氨酸的hu-I-309。將產(chǎn)生的多肽-樹脂按照實(shí)施例1中所述的方法進(jìn)行處理，然后通過將G50純化的物質(zhì)加載到250×10mmVydac C18柱上來進(jìn)一步進(jìn)行純化(如圖1和圖2所示)。
通過將65mg的產(chǎn)物溶解于pH8.0的60ml的0.6M GuHCl，10mM NaHPO4和1mM Tris中并以相對(duì)所述肽是100倍摩爾過量的濃度加入半胱氨酸來對(duì)經(jīng)RP-HPLC純化的趨化因子衍生物進(jìn)行折疊。所述多肽溶液在37℃下保持4天。用TFA酸化后，利用250×10mmVydac C18柱通過RP-HPLC來分離所述的折疊物質(zhì)(如圖3和圖4所示)。與N-乙基馬來酰亞胺(NEM)發(fā)生反應(yīng)后利用質(zhì)譜測(cè)定法檢驗(yàn)完全的半胱氨酸配對(duì)。沒有發(fā)現(xiàn)分子量增大，這表明不存在游離的巰基基團(tuán)(如圖5所示)。折疊的最終趨化因子的產(chǎn)率接近25％。合成的折疊hu-I-309具有等同于重組蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性(圖6)。
按照以下條件進(jìn)行分析型色譜
色譜柱C18250×4.6mm(Vydac#238TP54)流動(dòng)相A＝100％ H2O 0.1％TFAB＝100％ CH3CN 0.1％ TFA梯度B的％組成顯示在色譜圖上。
檢測(cè)器214nm實(shí)施例5間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)C-末端片段的合成和折疊在與實(shí)施例1相同的條件下合成和純化含有4個(gè)被(S-t-Bu)保護(hù)的半胱氨酸的間日瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(PvCS)303-372。
通過將27mg的所述肽加到2.7ml的6M GuHCl的0.1M Tris緩沖液(pH8.5)中來進(jìn)行折疊。將該溶液攪拌10分鐘。然后加入以0.2M Tris緩沖液將pH緩沖在8.8的13.5ml的1mM EDTA，0.2M NaCl。最后，加入以0.2M Tris緩沖液將pH緩沖在8.8的10.8ml的35mM半胱氨酸/1mM EDTA，0.2M NaCl。將所述反應(yīng)混合物升溫到37℃。然后通過反相HPLC來進(jìn)行折疊反應(yīng)(3-6小時(shí))(圖7A)并且通過在4℃下冷卻5分鐘來終止反應(yīng)，然后通過加入4℃的10％TFA來達(dá)到1％TFA的最終濃度(3ml的10％TFA)。接著通過反相HPLC來純化產(chǎn)物(圖8)并確定終產(chǎn)物的質(zhì)量(圖9)。被氧化的最終產(chǎn)物的產(chǎn)率是70-80％。
利用下列條件進(jìn)行分析型色譜色譜柱C4250×4.6mm(Vydac#214TP54)流動(dòng)相A＝100％H2O 0.1％ TFAB＝100％CH3CN 0.1％ TFA梯度B的％組成顯示在色譜圖上。
檢測(cè)器214nm實(shí)施例6惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)C-末端片段的大規(guī)模合成和折疊除了下列條件以外，對(duì)僅含有4個(gè)中的2個(gè)被(S-t-Bu)保護(hù)的半胱氨酸的惡性瘧原蟲環(huán)子孢子蛋白(PfCS 282-383)的大規(guī)模合成和純化是在與實(shí)施例1相同的條件下進(jìn)行的。
通過將1.1g的部分純化的肽溶解在pH8.0的1.0L的0.1MCH3COONH4中來進(jìn)行折疊，不需要向折疊緩沖液中加入游離半胱氨酸。所述反應(yīng)混合物在32℃下維持18小時(shí)。然后通過反相HPLC來純化所述產(chǎn)物(圖12和圖13)。被氧化的最終產(chǎn)物的產(chǎn)率接近37％。
利用下列條件進(jìn)行分析型色譜色譜柱C18250×4.6mm(Vydac#238TP54)流動(dòng)相A＝100％H2O 0.1％ TFAB＝100％CH3CN 0.1％ TFA梯度 B的％組成顯示在色譜圖上。
檢測(cè)器214nm
權(quán)利要求
1.用于折疊化學(xué)合成多肽的方法，包括在一種預(yù)先設(shè)定了pH和溫度的折疊緩沖液中利用還原劑處理含有兩個(gè)或多個(gè)衍生半胱氨酸殘基的多肽和/或蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述衍生半胱氨酸殘基相當(dāng)于S-丁基-硫代-半胱氨酸殘基。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述還原劑是半胱氨酸。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述的方法，其中所述折疊緩沖液含有一種或多種離液序列高的鹽。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中所述離液序列高的鹽選自鹽酸胍和尿素。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其中所述折疊緩沖液中的離液序列高的鹽以0.1-1M的濃度存在。
7.如權(quán)利要求1-6中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述折疊緩沖液具有堿性pH。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中pH介于7和9之間。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其中pH介于7和8.5之間。
10.如權(quán)利要求1-9中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述折疊緩沖液的溫度介于25℃和40℃之間。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述溫度介于27℃和38℃之間。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其中所述溫度約為37℃。
13.用于制備生物活性蛋白質(zhì)的方法，包括(a)化學(xué)合成一種含有兩個(gè)或多個(gè)衍生半胱氨酸殘基的多肽；(b)在一種預(yù)先設(shè)定了pH和溫度的折疊緩沖液中利用還原劑處理所述多肽；和(c)純化所獲得的折疊多肽和/或蛋白質(zhì)。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述衍生半胱氨酸殘基相當(dāng)于S-丁基-硫代-半胱氨酸殘基。
15.如權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述還原劑是半胱氨酸。
16.如權(quán)利要求13、14或15所述的方法，其中所述折疊緩沖液含有一種或多種離液序列高的鹽。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中所述離液序列高的鹽選自鹽酸胍和尿素。
18.如權(quán)利要求15或16所述的方法，其中所述折疊緩沖液中的離液序列高的鹽以0.1-1M的濃度存在。
19.如權(quán)利要求13-18中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述折疊緩沖液具有堿性pH。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中pH介于7和9之間。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中pH介于7和8.5之間。
22.如權(quán)利要求13-21中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述折疊緩沖液的溫度介于25℃和40℃之間。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述溫度介于27℃和38℃之間。
24.如權(quán)利要求22或23所述的方法，其中所述溫度約為37℃。
25.如權(quán)利要求13-24中任一權(quán)利要求所述的方法，包括步驟(a)通過分步鏈延伸的方法將S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽裝配到一種不溶性聚合載體上；(b)通過酸解將所述S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽鏈從所述載體上裂解下來；(c)純化所獲得的S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽；(d)在含有離液序列高的鹽和具有堿性pH以及約37℃的折疊緩沖液中利用摩爾過量的半胱氨酸處理所述多肽衍生物從而使被純化的S-叔-丁基-硫代半胱氨酸多肽處理折疊；和(e)利用反相高效液相色譜來純化所獲得的折疊蛋白質(zhì)。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述離液序列高的鹽是鹽酸胍。
27.如權(quán)利要求25或26所述的方法，其中所述聚合載體是一種被對(duì)酸不穩(wěn)定的羥甲基苯氧基乙酸連接物所官能化的聚酰胺或聚苯乙烯基的樹脂。
28.權(quán)利要求13的方法，其中所述還原劑是由多肽鏈內(nèi)的游離半胱氨酸形成的分子內(nèi)還原劑，當(dāng)在酸性pH下從樹脂上切割所述多肽鏈時(shí)，所述游離半胱氨酸產(chǎn)生于在所述多肽鏈的選定位點(diǎn)用酸不穩(wěn)定基團(tuán)保護(hù)的半胱氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于折疊化學(xué)合成多肽的方法，包括在一種預(yù)先設(shè)定了pH和溫度的折疊緩沖液中利用還原劑處理含有兩個(gè)或多個(gè)衍生半胱氨酸殘基的多肽和/或蛋白質(zhì)，其中所述衍生半胱氨酸殘基相當(dāng)于S－丁基－硫代－半胱氨酸殘基而且所述還原劑是半胱氨酸。
文檔編號(hào)C07K1/04GK1830999SQ20061000475
公開日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2001年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月27日
發(fā)明者A·瓦爾狄尼, G·克拉丁, M·洛戈羅 申請(qǐng)人:Rmf迪克塔吉恩有限公司