本公開一般地涉及植物、植物組織和細(xì)胞系、再生植物、和用于在其中引入和/或重排核酸的方法。提供了用于在玉米雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞中轉(zhuǎn)化(包括位點(diǎn)特異性插入)外源DNA和基因編輯的方法。發(fā)明背景轉(zhuǎn)基因玉米生產(chǎn)通常涉及通過(guò)土壤桿菌(Agrobacterium)共培養(yǎng)或微粒轟擊將轉(zhuǎn)基因遞送到二倍體體細(xì)胞組織，如未成熟合子胚的盾片區(qū)中。這些規(guī)程通常導(dǎo)致整合的轉(zhuǎn)基因在原代轉(zhuǎn)化體(T0)中“半合”并在T1植物世代中分離。將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到其它遺傳背景中需要通過(guò)回交實(shí)現(xiàn)漸滲。因而，此類將轉(zhuǎn)基因遞送到二倍體體細(xì)胞組織或細(xì)胞的基因組中并將轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)移到其它遺傳背景中的方法有可能是費(fèi)力、資源密集且耗時(shí)的。使用編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸將轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)特異性地遞送到二倍體植物基因組中的一個(gè)或多個(gè)預(yù)定位置(基因組編輯)可能造成另外一系列挑戰(zhàn)，這是因?yàn)槎扼w基因組具有兩組相應(yīng)的同源染色體，這些被編碼的位點(diǎn)特異性核酸酶通過(guò)切割一對(duì)同源染色體中的一條或兩條來(lái)修飾靶位點(diǎn)。由于切割位點(diǎn)的修復(fù)不完全造成的突變并不罕見。此外，由于基因組修復(fù)過(guò)程是基于模板的，修復(fù)過(guò)程可以使用外來(lái)的供體多核苷酸，也可以使用相應(yīng)同源染色體上的等位序列作為模板。因此，在二倍體細(xì)胞中，相應(yīng)的同源染色體上的等位序列可能與外來(lái)的供體多核苷酸競(jìng)爭(zhēng)。當(dāng)這一過(guò)程基于相應(yīng)的同源染色體(而不是供體多核苷酸)而意外地修復(fù)了被切割的染色體時(shí)，會(huì)由此降低靶向轉(zhuǎn)基因整合的效率。已經(jīng)描述了幾種植物轉(zhuǎn)化方法，其導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因隨機(jī)整合到玉米的單倍體基因組中。這些方法包括通過(guò)聚乙二醇處理單倍體原生質(zhì)體(Sukhapindaetal.,1993,PlantCellReports,13:63-68；Jardinaudetal.,1995)，小孢子來(lái)源的胚樣結(jié)構(gòu)的微粒轟擊(Protoplasma，187：138-143)和母本來(lái)源的胚的土壤桿菌共培養(yǎng)(美國(guó)專利號(hào)7,572,635)的轉(zhuǎn)基因的隨機(jī)整合。然而，仍然沒(méi)有人探索過(guò)玉米的單倍體基因組中的選定位置的穩(wěn)定的位點(diǎn)特異性(靶向)修飾。因此，對(duì)玉米中的單倍體基因組進(jìn)行穩(wěn)定和靶向修飾的方法是為人期望的。此外，單倍體細(xì)胞中僅有一套染色體，即，對(duì)于每個(gè)給定基因沒(méi)有相應(yīng)的等位序列，外來(lái)的供體多核苷酸作為模板容易為同源指導(dǎo)修復(fù)所獲得，而沒(méi)有相應(yīng)同源染色體被當(dāng)作修復(fù)模板的干擾，并且容易揭示突變。許多突變(例如敲除)的表型是隱性的，使得它們?cè)诙扼w組織中觀察不到，但可以在單倍體中觀察到。因此，在雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系內(nèi)借助位點(diǎn)特異性核酸酶進(jìn)行轉(zhuǎn)化和誘變，隨后切割單倍體基因組DNA，并任選地在雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系(例如小孢子來(lái)源的植物組織培養(yǎng)物的單倍體基因組)內(nèi)靶向整合供體多核苷酸或靶向修飾特定序列(例如突變)，對(duì)用于上述過(guò)程的組合物和方法仍然存在需要。因而，本公開提供了用于在雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系(例如小孢子來(lái)源的植物組織培養(yǎng)物的單倍體基因組)內(nèi)轉(zhuǎn)化和遞送位點(diǎn)特異性核酸酶的新組合物和方法。應(yīng)用小孢子來(lái)源的植物組織培養(yǎng)物轉(zhuǎn)化方法可以提高植物基因組內(nèi)位點(diǎn)特異性核酸酶整合的效率，從而減少篩選大量轉(zhuǎn)化事件的需要，進(jìn)一步可降低完成這些類型的實(shí)驗(yàn)的相關(guān)成本和人員時(shí)間。例如，小孢子來(lái)源的植物的單倍體基因組的轉(zhuǎn)化部署可以用于將供體DNA整合在特定基因組位點(diǎn)內(nèi)，并且獲得純合植物，而不需要耗費(fèi)金錢和人力篩選數(shù)萬(wàn)個(gè)植物事件。此外，使用雄性單倍體細(xì)胞系進(jìn)行位點(diǎn)特異性核酸酶介導(dǎo)的定向誘變可以為隱性突變的高效鑒定和分離創(chuàng)造條件。發(fā)明概述本公開部分基于意外發(fā)現(xiàn)了一種通過(guò)玉米單倍體組織或細(xì)胞中的位點(diǎn)特異性誘變或供體轉(zhuǎn)基因整合來(lái)穩(wěn)定且靶向性地修飾單倍體基因組的方法。公開的基因組修飾方法可以與染色體加倍的方法一起使用，使位點(diǎn)特異性突變或轉(zhuǎn)基因在完全固定的遺傳背景中即時(shí)(instantaneously)變得純合。此外，本文公開的在單倍體組織或細(xì)胞中穩(wěn)定地修飾基因組的方法可以比其它二倍體組織中的方法更高效。在二倍體組織中，在第一條染色體上的每個(gè)基因組序列在第二條染色體上具有相應(yīng)的等位序列，等位序列在同源性指導(dǎo)的修復(fù)作用(homology-directedrepair)中充當(dāng)模板，同源性指導(dǎo)的修復(fù)作用已經(jīng)進(jìn)化為可修復(fù)第一條染色體中插入的任何突變或轉(zhuǎn)基因。相比之下，單倍體組織或細(xì)胞缺失相應(yīng)的第二條染色體，即它們?nèi)鄙偻ㄟ^(guò)同源性指導(dǎo)的修復(fù)作用所用來(lái)去除新引入的突變或轉(zhuǎn)基因的修復(fù)模板。在一些情況下，外來(lái)的供體多核苷酸可以是同源性指導(dǎo)的修復(fù)作用最容易得到的模板，這樣，有助于確保期望的靶向修飾穩(wěn)定整合到單倍體基因組中。此外，公開的方法還可用于揭示具有隱性表型的穩(wěn)定基因組修飾突變，例如敲除和基因失活。在二倍體組織中，隱性表型不明顯，而在單倍體組織中，可以觀察到導(dǎo)致隱性表型的此類靶向基因組修飾。在一個(gè)方面中，本公開涉及用于修飾玉米基因組的方法，所述方法包括：提供玉米小孢子來(lái)源的、包含單倍體組織基因組的轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織；將編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸遞送至所述轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織；并且確認(rèn)所述單倍體組織基因組被編碼的位點(diǎn)特異性核酸酶所修飾。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織是胚或愈傷組織。在公開的方法中，借助植物轉(zhuǎn)化方法將編碼所述位點(diǎn)特異性核酸酶多核苷酸的多核苷酸遞送至轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織。在某些實(shí)施方案中，所述植物轉(zhuǎn)化方法包括下組的任何方法：微粒轟擊轉(zhuǎn)化法，土壤桿菌轉(zhuǎn)化法，磷酸鈣轉(zhuǎn)化法，聚凝胺(polybrene)轉(zhuǎn)化法，電穿孔轉(zhuǎn)化法，超聲轉(zhuǎn)化法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，顯微注射轉(zhuǎn)化法，裸DNA轉(zhuǎn)化法，質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法，病毒載體轉(zhuǎn)化法，碳化硅介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，氣溶膠射束轉(zhuǎn)化法(aerosolbeamingtransformationmethod)、和PEG轉(zhuǎn)化法。在任何公開的方法中，位點(diǎn)特異性核酸酶多核苷酸編碼選擇的核酸酶，包括鋅指核酸酶，TALEN核酸酶，大范圍核酸酶和CRISPR核酸酶。在一些實(shí)施方案中，位點(diǎn)特異性核酸酶優(yōu)先切割單倍體玉米基因組的基因組DNA靶區(qū)域。在具體實(shí)施方案中，切割基因組DNA的兩條鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，切割基因組DNA的單鏈。在另外的實(shí)施方案中，任何前述方法可以進(jìn)一步包括遞送供體多核苷酸，并將供體多核苷酸穩(wěn)定整合在修飾的單倍體組織基因組中。在一些實(shí)施方案中，每個(gè)供體多核苷酸包含至少一個(gè)與單倍體組織基因組的基因組DNA靶區(qū)域至少85％相同的域。在另外的實(shí)施方案中，供體多核苷酸包含與單倍體組織基因組的基因組DNA靶區(qū)域中的兩個(gè)不同序列至少85％相同的兩個(gè)域。在本文中公開的任何用于修飾單倍體玉米基因組的方法的另外的實(shí)施方案中，小孢子來(lái)源的轉(zhuǎn)化感受態(tài)組織來(lái)自具有良種性能特征的玉米。例如，小孢子來(lái)源的轉(zhuǎn)化感受態(tài)組織可以來(lái)自良種玉米系與具有高小孢子培養(yǎng)反應(yīng)的不同玉米系雜交而得來(lái)的雜種玉米。另外，在任何公開的方法中，單倍體組織基因組被修飾的確認(rèn)包括進(jìn)行基于PCR的測(cè)定法，Southern印跡測(cè)定法，Northern印跡測(cè)定法，蛋白質(zhì)表達(dá)測(cè)定法，Western印跡測(cè)定法，ELISA測(cè)定法、或下一代測(cè)序測(cè)定法。來(lái)源于任何公開的方法的玉米小孢子的轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織可以如下獲得：從玉米收獲含有小孢子的雄穗；在約4-12℃的溫度溫育所述雄穗；從所述雄穗分離含有小孢子的花藥；在花藥培養(yǎng)基中培養(yǎng)花藥以生成小孢子來(lái)源的胚；并且在愈傷組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述小孢子來(lái)源的胚，從而生成小孢子來(lái)源的轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以用染色體加倍劑進(jìn)一步處理包含經(jīng)修飾的單倍體組織基因組的單倍體組織，從而生成包含經(jīng)修飾的雙單倍體玉米基因組的雙單倍體玉米組織。可以將雙單倍體玉米組織培養(yǎng)或再生成包含經(jīng)修飾的雙單倍體玉米基因組的雙單倍體玉米植物。此外，此類雙單倍體玉米植物對(duì)于單倍體組織的基因組修飾是純合的。在又一個(gè)方面中，本公開涉及用于靶向整合供體的方法，所述方法包括：提供包含單倍體組織基因組的玉米小孢子來(lái)源的轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織；將一個(gè)或多個(gè)供體多核苷酸和一個(gè)或多個(gè)編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸遞送至所述轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織；以及確認(rèn)一個(gè)或多個(gè)供體多核苷酸整合到單倍體組織基因組中且單倍體組織基因組由此被修飾。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織是胚或愈傷組織。在這些方法中，將一個(gè)或多個(gè)供體多核苷酸和一個(gè)或多個(gè)編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸遞送至轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織可以通過(guò)植物轉(zhuǎn)化方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，所述植物轉(zhuǎn)化方法包括微粒轟擊轉(zhuǎn)化法，土壤桿菌轉(zhuǎn)化法，磷酸鈣轉(zhuǎn)化法，聚凝胺(polybrene)轉(zhuǎn)化法，電穿孔轉(zhuǎn)化法，超聲轉(zhuǎn)化法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，顯微注射轉(zhuǎn)化法，裸DNA轉(zhuǎn)化法，質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法，病毒載體轉(zhuǎn)化法，碳化硅介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，氣溶膠射束轉(zhuǎn)化法和PEG轉(zhuǎn)化法。在另外的實(shí)施方案中，位點(diǎn)特異性核酸酶多核苷酸編碼選自下組的核酸酶：鋅指核酸酶，TALEN核酸酶，大范圍核酸酶和CRISPR核酸酶。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)多核苷酸編碼優(yōu)選切割單倍體組織基因組的基因組DNA靶區(qū)域的位點(diǎn)特異性核酸酶。在另外的實(shí)施方案中，本文中公開的任何方法進(jìn)一步包括一個(gè)或多個(gè)供體多核苷酸在單倍體組織基因組內(nèi)的穩(wěn)定整合。例如，一個(gè)或多個(gè)供體多核苷酸可以經(jīng)由同源性指導(dǎo)的修復(fù)作用或通過(guò)非同源末端連接修復(fù)作用而整合在靶區(qū)域內(nèi)。在本文中公開的任何用于修飾單倍體玉米基因組的方法中，小孢子來(lái)源的轉(zhuǎn)化感受態(tài)組織來(lái)自具有良種性能特征的玉米。例如，小孢子來(lái)源的轉(zhuǎn)化感受態(tài)組織來(lái)自雜種玉米，所述雜種玉米是良種玉米系與具有高小孢子培養(yǎng)反應(yīng)的不同玉米系雜交而得來(lái)的。在本文中公開的用于修飾單倍體玉米基因組的任何方法中，單倍體組織基因組包括確認(rèn)對(duì)單倍體組織基因組的整合包括進(jìn)行基于PCR的測(cè)定法，Southern印跡測(cè)定法，Northern印跡測(cè)定法，蛋白質(zhì)表達(dá)測(cè)定法，ELISA測(cè)定法或下一代測(cè)序測(cè)定法。在任何公開的實(shí)施方案中，進(jìn)入單倍體組織基因組中的一個(gè)或多個(gè)供體多核苷酸可以賦予農(nóng)藝學(xué)性狀(例如，編碼基因，當(dāng)基因表達(dá)時(shí)提供具有農(nóng)藝學(xué)性狀的玉米)。例如，農(nóng)藝性狀可以選自殺蟲抗性性狀，除草劑耐性性狀，氮利用效率性狀，水利用效率性狀，營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量性狀，DNA結(jié)合性狀和選擇標(biāo)志物性狀。在任何公開的實(shí)施方案中，供體多核苷酸可以在玉米植物中穩(wěn)定表達(dá)。此外，任何公開的將供體多核苷酸整合到單倍體組織基因組中的方法可以進(jìn)一步包括用染色體加倍劑處理單倍體組織以產(chǎn)生包含加倍的單倍體組織，該加倍的單倍體組織包含整合的供體多核苷酸，并且該整合的供體多核苷酸是純合的。在另一個(gè)方面中，本公開涉及包含供體多核苷酸的植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，植物包含單倍體基因組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物包含雙單倍體基因組。此類植物可以從組織再生，所述組織包含本文中公開的任何方法的修飾的單倍體組織基因組或修飾的雙單倍體組織基因組。在另一方面，本公開涉及用于在玉米的單倍體基因組內(nèi)引入突變的方法，所述方法包括：提供包含單倍體組織基因組的玉米小孢子來(lái)源的轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織；將編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸遞送至所述轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織；并且確認(rèn)單倍體玉米基因組包含由編碼的位點(diǎn)特異性核酸酶多核苷酸引入的突變。轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織可以是胚或愈傷組織。可以經(jīng)由植物轉(zhuǎn)化方法將一個(gè)或多個(gè)編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸遞送至轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織。植物轉(zhuǎn)化方法可以選自微粒轟擊轉(zhuǎn)化法，土壤桿菌轉(zhuǎn)化法，磷酸鈣轉(zhuǎn)化法，聚凝胺轉(zhuǎn)化法，電穿孔轉(zhuǎn)化法，超聲轉(zhuǎn)化法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，顯微注射轉(zhuǎn)化法，裸DNA轉(zhuǎn)化法，質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法，病毒載體轉(zhuǎn)化法，碳化硅介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，氣溶膠射束轉(zhuǎn)化法和PEG轉(zhuǎn)化法。在任何公開的方法中，位點(diǎn)特異性核酸酶多核苷酸編碼核酸酶，包括鋅指核酸酶、TALEN核酸酶、大范圍核酸酶和CRISPR核酸酶。編碼的位點(diǎn)特異性核酸酶多核苷酸可以是優(yōu)先在單倍體玉米基因組的靶區(qū)域處切割基因組DNA的多核苷酸。在任何公開的方法中，小孢子來(lái)源的轉(zhuǎn)化感受態(tài)組織可以來(lái)自具有良種性能特征的玉米。例如，小孢子來(lái)源的轉(zhuǎn)化感受態(tài)組織是來(lái)自雜種玉米，雜種玉米是良種玉米品系與具有高小孢子培養(yǎng)反應(yīng)的不同玉米系雜交而得來(lái)的。在任何公開的方法中，確認(rèn)單倍體玉米基因組被修飾包括進(jìn)行基于PCR的測(cè)定法，Southern印跡測(cè)定法，Northern印跡測(cè)定法，蛋白質(zhì)表達(dá)測(cè)定法，Western印跡測(cè)定法，ELISA測(cè)定法和下一代測(cè)序測(cè)定法。根據(jù)公開的方法引入的突變可以下調(diào)內(nèi)源基因的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，內(nèi)源基因的下調(diào)導(dǎo)致改變的代謝途徑。此外，由此將供體多核苷酸整合到單倍體組織基因組中的任何公開的方法可以進(jìn)一步包括用染色體加倍劑處理單倍體組織以生成加倍單倍體組織，所述加倍單倍體組織包含整合供體多核苷酸，并且該整合供體多核苷酸是純合的。在一個(gè)方面中，本公開涉及包含引入的突變的植物。在一些實(shí)施方案中，所述植物包含單倍體組織基因組。在其它實(shí)施方案中，植物包含雙單倍體組織基因組。此類植物可以從根據(jù)本文中公開的任何方法生成的經(jīng)修飾的單倍體組織或雙單倍體組織再生。在一個(gè)方面中，本公開涉及用于將一個(gè)或多個(gè)編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸引入雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系中的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括：提供轉(zhuǎn)化感受態(tài)的雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系；將一個(gè)或多個(gè)編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸遞送至該轉(zhuǎn)化感受態(tài)的雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系；并確認(rèn)該一個(gè)或多個(gè)編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸修飾該雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系的基因組。在一個(gè)實(shí)施方案中，雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系是單倍體小孢子細(xì)胞系。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將單倍體小孢子細(xì)胞系繁殖成胚或愈傷組織。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括通過(guò)植物轉(zhuǎn)化方法將一個(gè)或多個(gè)編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸遞送至雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系。多核苷酸可以通過(guò)植物轉(zhuǎn)化方法，如例如生物射彈轉(zhuǎn)化法、土壤桿菌轉(zhuǎn)化法、磷酸鈣轉(zhuǎn)化法、聚凝胺轉(zhuǎn)化法、電穿孔轉(zhuǎn)化法、超聲轉(zhuǎn)化法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、顯微注射轉(zhuǎn)化法、裸DNA轉(zhuǎn)化法、質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法、病毒載體轉(zhuǎn)化法、碳化硅介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法、氣溶膠射束轉(zhuǎn)化法和PEG轉(zhuǎn)化法遞送。每個(gè)位點(diǎn)特異性核酸酶多核苷酸可以編碼選自鋅指核酸酶、TALEN核酸酶、大范圍核酸酶、和CRISPR核酸酶的核酸酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括遞送一個(gè)或多個(gè)編碼優(yōu)先修飾基因組的基因組DNA靶區(qū)域的位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸。在具體實(shí)施方案中，基因組DNA靶區(qū)域的兩條鏈的單鏈被切割。在其它實(shí)施方案中，基因組DNA靶區(qū)域的單鏈被切割。在任何公開的包括遞送一個(gè)或多個(gè)供體多核苷酸的方法中，可以在修飾的基因組中整合穩(wěn)定一個(gè)或多個(gè)供體多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，每個(gè)供體多核苷酸包含至少一個(gè)與基因組的基因組DNA靶區(qū)域至少85％相同的域。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，每個(gè)供體多核苷酸包含與基因組的基因組DNA靶區(qū)域中的兩個(gè)不同序列至少85％相同的兩個(gè)域。供體多核苷酸可以經(jīng)由同源性指導(dǎo)的修復(fù)作用或通過(guò)非同源末端連接修復(fù)作用整合在基因組DNA靶區(qū)域內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)基于PCR的測(cè)定法，Southern印跡測(cè)定法，Northern印跡測(cè)定法，蛋白質(zhì)表達(dá)測(cè)定法，Western印跡測(cè)定法，ELISA測(cè)定法或下一代測(cè)序測(cè)定法確認(rèn)編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸修飾所述基因組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，確認(rèn)將一個(gè)或多個(gè)供體多核苷酸整合到基因組DNA靶區(qū)域中包括進(jìn)行基于PCR的測(cè)定法，Southern印跡測(cè)定法，Northern印跡測(cè)定法，蛋白質(zhì)表達(dá)測(cè)定法，Western印跡測(cè)定法，ELISA測(cè)定法和下一代測(cè)序測(cè)定法。在更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，任何公開的方法可以進(jìn)一步包括獲得包含經(jīng)修飾的雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系的基因組的單倍體組織；用染色體加倍劑處理所述單倍體組織；生成包含經(jīng)修飾的雙單倍體基因組的雙單倍體組織；并且將雙單倍體組織培養(yǎng)成包含經(jīng)修飾的雙單倍體基因組的雙單倍體植物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系獲自玉米植物。在任何公開的實(shí)施方案中，所述修飾的雙單倍體基因組是基因組切割的結(jié)果。附圖說(shuō)明圖1提供了pDAB111879的質(zhì)粒圖。該質(zhì)粒圖是用于靶向基因組修飾的ZFN構(gòu)建體的質(zhì)粒圖。圖2提供了pDAB111845的質(zhì)粒圖。該質(zhì)粒圖是用于在單倍體原生質(zhì)體中靶向整合的供體構(gòu)建體的質(zhì)粒圖。圖3提供了pDAB118783的質(zhì)粒圖。該質(zhì)粒圖是用于在單倍體愈傷組織細(xì)胞的特定基因組基因座內(nèi)靶向aad-1整合的供體構(gòu)建體的質(zhì)粒圖。圖4提供了序列比對(duì)的圖示，顯示在PPL1切割位點(diǎn)處的插入和缺失，證明在轟擊單倍體愈傷組織后的靶向誘變。在比對(duì)中提供了例示缺失和插入的序列SEQIDNO:33至SEQIDNO:45。將這些改變的序列與SEQIDNO:32比較，SEQIDNO:32是鋅指核酸酶意圖結(jié)合并切割的基因組DNA靶序列。圖5提供了在秋水仙堿處理后來(lái)自二倍化愈傷組織的核的直方圖，證明有效的染色體加倍。發(fā)明詳述本公開提供了用于在源自玉米小孢子的轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織中修飾玉米基因組的方法。該方法包括將一個(gè)或多個(gè)編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸遞送至轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織，并確認(rèn)該一個(gè)或多個(gè)編碼的位點(diǎn)特異性核酸酶修飾單倍體玉米基因組。所述雄性來(lái)源的細(xì)胞系可以作為小孢子來(lái)源的植物組織培養(yǎng)物維持。小孢子來(lái)源的植物組織培養(yǎng)生成僅含有一套染色體的單倍體組織培養(yǎng)物。所述雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系從雄性組織如小孢子和花粉或孢子體組織(例如親本單倍體胚)生成，并且可以作為胚或愈傷組織，懸浮液或原生質(zhì)體培養(yǎng)物維持。在玉米中，雄核發(fā)育和單倍體植物生成的報(bào)道可追溯到20世紀(jì)70年代(Kuetal.,1978,Proc.Symp.PlantTissueCult.35-42)，然而，雄性胚的低生成頻率以及與植物再生和染色體加倍相關(guān)的困難使得花藥或小孢子來(lái)源的植物培養(yǎng)物在應(yīng)用育種中無(wú)法廣泛使用。這些基本問(wèn)題中的許多已經(jīng)隨著高反應(yīng)性種質(zhì)(Petolinoetal.,1988,Theor.Appl.Genet.76:157-159)和體外染色體加倍技術(shù)(Wanetal.,1991,Theor.Appl.Genet.77:889-892)的開發(fā)而得以克服，盡管在玉米中，這種技術(shù)已經(jīng)在很大程度上已被棄之不用。本公開還提供了用于將供體多核苷酸靶向整合到來(lái)源于玉米小孢子的轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織中的單倍體玉米基因組中的方法。該方法包括將一個(gè)或多個(gè)供體多核苷酸和一個(gè)或多個(gè)編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸遞送至轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織；并確認(rèn)一個(gè)或多個(gè)供體多核苷酸整合到玉米的單倍體基因組中。本公開進(jìn)一步提供了在來(lái)源于玉米小孢子的轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織中的單倍體玉米基因組內(nèi)引入突變的方法；將編碼一種或多種位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸遞送至所述轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織；以及確認(rèn)所述一個(gè)或多個(gè)編碼的位點(diǎn)特異性核酸酶修飾單倍體玉米基因組，其中通過(guò)切割突變單倍體玉米基因組，如基因組DNA內(nèi)的插入或缺失的存在指示。在另一方面，本公開提供了用于修飾轉(zhuǎn)化感受態(tài)雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系的基因組的方法。該方法包括將編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸遞送至轉(zhuǎn)化感受態(tài)雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系，并確認(rèn)編碼的位點(diǎn)特異性核酸酶修飾所述雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系的基因組，其中雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系的基因組通過(guò)切割而被修飾。定義除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義與本公開相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解相同。在沖突的情況下，應(yīng)當(dāng)以包括定義的本申請(qǐng)為準(zhǔn)。除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括多個(gè)，并且復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括單數(shù)。本文中提及的所有出版物，專利和其它參考文獻(xiàn)通過(guò)提及整體并入本文用于所有目的，如同每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)具體并且單獨(dú)地指出通過(guò)提及并入一樣，除非僅指出通過(guò)提及并入專利或?qū)＠_文本的特定部分。為了進(jìn)一步闡明本公開，提供以下術(shù)語(yǔ)，縮寫和定義。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“包含”、“包括”、“具有”、或“含有”或其任何其它變型意圖是非排他性的或開放式的。例如，包括列出的多個(gè)要素的組合物，混合物，工藝，方法，制品或裝置不一定僅限于那些要素，而是可以包括未明確列出的或這些組合物，混合物，工藝，方法，制品或裝置內(nèi)在具有的其它元素。此外，除非明確相反指出，“或”是指包括性的或而不是排他性的或。例如，條件A或B由以下任何一個(gè)滿足：A是真(或存在)和B是假(或不存在)，A是假(或不存在)和B是真(或存在)，并且A和B兩者都是真(或存在)。此外，在本公開的實(shí)施方案的元件或組件之前的不定冠詞“一個(gè)”和“一種”意圖關(guān)于實(shí)例的數(shù)量(即，元件或組件的出現(xiàn))是非限制性的。因此，“一個(gè)”或“一種”應(yīng)當(dāng)被理解為包括一個(gè)或至少一個(gè)，并且元素或組件的單數(shù)詞語(yǔ)形式也包括復(fù)數(shù)，除非該數(shù)量明顯意味著是單數(shù)。如本文中所使用，術(shù)語(yǔ)“發(fā)明”或“本發(fā)明”是非限制性術(shù)語(yǔ)，并且不旨在表示特定發(fā)明的任何單個(gè)實(shí)施方案，而是涵蓋如本申請(qǐng)中公開的所有可能的實(shí)施方案。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“植物”包括全植物和植物的任何后代，細(xì)胞，組織或部分。術(shù)語(yǔ)“植物部分”包括植物的任何部分，包括例如但不限于：種子(包括成熟種子和未成熟種子)；植物插枝；植物細(xì)胞；植物細(xì)胞培養(yǎng)；植物器官(例如花粉，胚，花，果實(shí)，芽，葉，根，莖和外植體)。植物組織或植物器官可以是組織成結(jié)構(gòu)或功能單元的種子，原生質(zhì)體，愈傷組織或任何其它組的植物細(xì)胞。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物可以能夠再生具有獲得細(xì)胞或組織的植物的生理和形態(tài)特征的植物，以及再生具有與植物基本相同的基因型的植物。相反，某些植物細(xì)胞不能再生生成植物。植物細(xì)胞或組織培養(yǎng)物中的可再生細(xì)胞可以是胚，原生質(zhì)體，分生細(xì)胞，愈傷組織，花粉，葉，花藥，根，根尖，絲，花，谷粒(kernel)，穗，穗軸，殼或莖。植物部分包括可收獲部分和可用于繁殖后代植物的部分?？捎糜诜敝车闹参锊糠职ɡ绲幌抻冢悍N子；果實(shí)；插枝(cutting)；幼苗；塊莖；和根莖。植物的可收獲部分可以是植物的任何有用部分，包括例如但不限于：花；花粉；幼苗；塊莖；葉；莖；果實(shí)；種子；和根。植物細(xì)胞是植物的結(jié)構(gòu)和生理單位，包括沒(méi)有細(xì)胞壁的原生質(zhì)體細(xì)胞和具有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞。植物細(xì)胞可以是分離的單細(xì)胞或細(xì)胞聚集體(例如，脆弱的愈傷組織和培養(yǎng)的細(xì)胞)的形式，并且可以是高等組織單元(例如植物組織，植物器官，和植物)的一部分。因此，植物細(xì)胞可以是原生質(zhì)體，生成配子的細(xì)胞或可以再生成全植物的細(xì)胞或細(xì)胞集合。因而，在本文的實(shí)施方案中，種子——其包含多個(gè)植物細(xì)胞并能夠再生成全植物——視為“植物細(xì)胞”。如本文中使用，術(shù)語(yǔ)“分離的”是指生物組分(包括核酸或蛋白質(zhì))已經(jīng)與該生物組分天然存在的生物體的細(xì)胞中的其它生物組分(即，其它染色體和染色體外DNA和RNA，和蛋白質(zhì))分開、與上述其他生物組分分別制備。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“純化的”就核酸分子而言，不需要是絕對(duì)純的(比如均質(zhì)的制劑)；而是表明序列相對(duì)于其天然細(xì)胞環(huán)境更純(與天然水平相比，該水平應(yīng)該大至少2-5倍，例如就濃度或基因表達(dá)水平而言)。要求保護(hù)的DNA分子直接從總DNA或從總RNA獲得。另外，cDNA克隆不是天然存在的，而是優(yōu)選通過(guò)對(duì)部分純化的天然存在的物質(zhì)(信使RNA)進(jìn)行人為操作而獲得。從mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)涉及創(chuàng)建文庫(kù)。通過(guò)對(duì)攜帶cDNA文庫(kù)的細(xì)胞克進(jìn)行隆選擇，可以從文庫(kù)中生成單個(gè)cDNA克隆。因此，包括從mRNA構(gòu)建cDNA文庫(kù)和選擇不同cDNA克隆的方法生成天然信使的約106倍的純化。同樣，可以將啟動(dòng)子或基因DNA序列克隆到質(zhì)粒中。此類克隆不是天然存在的，而是優(yōu)選通過(guò)操作部分純化的天然存在的物質(zhì)如基因組DNA文庫(kù)獲得。因此，在這些技術(shù)中有利于純化至少一個(gè)數(shù)量級(jí)，優(yōu)選兩個(gè)或三個(gè)數(shù)量級(jí)，更優(yōu)選四個(gè)或五個(gè)數(shù)量級(jí)。類似地，“合成”代表已經(jīng)發(fā)生組分DNA序列的化學(xué)或功能變化的指示。已經(jīng)“被合成”的核酸分子和蛋白質(zhì)包括通過(guò)PCR擴(kuò)增或通過(guò)重組方法生成的核酸分子和蛋白質(zhì)，其中純化的多核苷酸通過(guò)摻入質(zhì)粒或載體內(nèi)而被進(jìn)一步修飾。術(shù)語(yǔ)“合成的”還包括通過(guò)重組DNA方法在宿主細(xì)胞(例如植物細(xì)胞)中制備的核酸和蛋白質(zhì)，以及化學(xué)合成的核酸分子，蛋白質(zhì)和肽。在工程化改造基因以在植物中表達(dá)的過(guò)程中，可以確定預(yù)期的宿主植物的密碼子偏愛(ài)，例如通過(guò)使用公眾可獲得的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)尋找關(guān)于植物基因組的密碼子分布或者各種植物基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的信息。一旦在紙上或在計(jì)算機(jī)上設(shè)計(jì)了優(yōu)化的(例如植物優(yōu)化的)DNA序列，則可以在實(shí)驗(yàn)室中合成序列上精確地對(duì)應(yīng)于設(shè)計(jì)序列的真實(shí)DNA分子。此類合成核酸分子可以接受分子克隆和以其它方式操作，就像它們來(lái)源于自然或天然來(lái)源一樣。如本文中使用，術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”可互換使用，并且可以包括：?jiǎn)蝹€(gè)核酸；多個(gè)核酸；其核酸片段，變體或衍生物；和核酸構(gòu)建體(例如，信使RNA(mRNA)和質(zhì)粒DNA(pDNA))。多核苷酸或核酸可以含有全長(zhǎng)cDNA序列或其片段的核苷酸序列，包括未翻譯的5'和/或3'序列和編碼序列。多核苷酸或核酸可以由任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸構(gòu)成，其可以包含未修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或修飾的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。例如，多核苷酸或核酸可以由單鏈和雙鏈DNA；作為單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物的DNA；單鏈和雙鏈RNA；和作為單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物的RNA構(gòu)成。包含DNA和RNA的雜合分子可以是單鏈，雙鏈或單鏈和雙鏈區(qū)的混合物。前述術(shù)語(yǔ)還包括多核苷酸或核酸的化學(xué)，酶和代謝修飾形式。應(yīng)當(dāng)理解，特定的DNA還指其互補(bǔ)序列，其序列根據(jù)脫氧核糖核苷酸堿基配對(duì)的規(guī)則確定。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“基因”是指編碼功能產(chǎn)物(RNA或多肽/蛋白質(zhì))的核酸?；蚩梢园ň幋a功能產(chǎn)物的序列之前(5'非編碼序列)和/或之后(3'非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“編碼序列”是指編碼特定氨基酸序列的核酸序列?！罢{(diào)節(jié)序列”是指位于編碼序列的上游(例如，5'非編碼序列)，內(nèi)部或下游(例如3'非編碼序列)，影響相關(guān)的編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列包括例如但不限于：?jiǎn)?dòng)子；翻譯前導(dǎo)序列；內(nèi)含子；多腺苷酸化識(shí)別序列；RNA加工位點(diǎn)；效應(yīng)器結(jié)合位點(diǎn)；和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。如本文中使用，術(shù)語(yǔ)“多肽”包括單個(gè)多肽，復(fù)數(shù)個(gè)多肽及其片段。該術(shù)語(yǔ)是指由通過(guò)酰胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)構(gòu)成的分子。術(shù)語(yǔ)“多肽”是指兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的任何一條或多條鏈，并且不是指產(chǎn)物的特定長(zhǎng)度或大小。因此，肽，二肽，三肽，寡肽，蛋白質(zhì)，氨基酸鏈和用于指兩個(gè)或多個(gè)氨基酸的一條或多條鏈的任何其它術(shù)語(yǔ)包括在“多肽”的定義內(nèi)，并且前述術(shù)語(yǔ)在本文中與“多肽”可互換使用。多肽可以從天然生物來(lái)源純化或通過(guò)重組技術(shù)生成，但特定多肽不一定從特定核酸翻譯。多肽可以以任何適當(dāng)?shù)姆绞缴?，包括例如但不限于通過(guò)化學(xué)合成。如本文中使用，術(shù)語(yǔ)“天然的”是指在自然界中與其自身調(diào)節(jié)序列(若有的話)一起發(fā)現(xiàn)的多核苷酸，基因或多肽的形式。術(shù)語(yǔ)“內(nèi)源的”是指多核苷酸，基因或多肽在生物體中或生物體基因組中在其自然位置中的天然形式。相比之下，術(shù)語(yǔ)“異源”是指通常不在其參照(宿主)生物體中的位置處發(fā)現(xiàn)的多核苷酸，基因或多肽。例如，異源核酸可以是通常在參照生物體中在不同基因組位置處發(fā)現(xiàn)的核酸。作為另一個(gè)實(shí)例，異源核酸可以是在參照生物體中通常不存在的核酸。包含異源多核苷酸、基因或多肽的宿主生物體可以通過(guò)將異源多核苷酸、基因或多肽導(dǎo)入宿主生物體中來(lái)生成。在具體的例子中，異源多核苷酸包括天然編碼序列或其部分，其以不同于相應(yīng)天然多核苷酸的形式被重新導(dǎo)入來(lái)源生物體中。在具體的例子中，異源基因包括天然編碼序列或其部分，其以不同于相應(yīng)天然基因的形式重新導(dǎo)入來(lái)源生物體中。例如，異源基因可以包括作為被重新導(dǎo)入天然宿主的嵌合基因的一部分的天然編碼序列，所述嵌合基因包含非天然調(diào)節(jié)區(qū)。在具體的例子中，異源多肽是以不同于相應(yīng)天然多肽的形式重新導(dǎo)入來(lái)源生物體中的天然多肽。異源基因或多肽可以是這樣的基因或多肽，其包含功能性多肽或編碼功能性多肽的核酸序列，該功能性多肽或編碼功能性多肽的核酸序列與另一種基因或多肽融合，生成嵌合多肽或融合多肽或編碼嵌合多肽或融合多肽的基因。具體實(shí)施方案的基因和蛋白質(zhì)包括具體示例的全長(zhǎng)序列和這些序列的部分、區(qū)段、片段(包括連續(xù)片段，以及與全長(zhǎng)分子相比的內(nèi)部和/或末端缺失)、變體、突變體、嵌合體和融合物?！皟?nèi)源的”是指源自生物體或細(xì)胞內(nèi)的材料?！巴庠吹摹笔侵冈醋陨矬w或細(xì)胞外部的材料。如本文中使用的，“外源”意指來(lái)自除受體細(xì)胞或組織之外的來(lái)源的任何核酸，而不管相似(但不相同)核酸是否可能已經(jīng)存在于受體細(xì)胞或組織中。如本文中使用，術(shù)語(yǔ)“修飾”可以指特定參照多核苷酸的變化，導(dǎo)致由參照多核苷酸編碼的多肽的活性的降低、基本上消除或消除?；蛘?，術(shù)語(yǔ)“修飾”可以指參照多核苷酸的變化，導(dǎo)致由參照多核苷酸編碼的多肽的活性增加或增強(qiáng)，以及參照多肽的變化，導(dǎo)致參照多肽的活性增加或增強(qiáng)。當(dāng)用于描述位點(diǎn)特異性核酸酶的活性時(shí)，“修飾”可意指參照分子的一部分的切割(例如，基因組DNA被切割；基因組DNA的雙鏈或單鏈被切割)。如前所述的變化可以導(dǎo)致例如但不限于：參照分子的一部分被刪除；參照分子突變(例如通過(guò)自發(fā)誘變，通過(guò)隨機(jī)誘變，通過(guò)由增變基因引起的誘變，以及通過(guò)轉(zhuǎn)座子誘變)；參照分子的一部分吧取代；參照分子中插入元件；參照分子的表達(dá)下調(diào)；參照分子的細(xì)胞位置改變；參照分子的狀態(tài)改變(例如，通過(guò)參照多核苷酸的甲基化，以及通過(guò)參照多肽的磷酸化或泛素化)；參照分子的輔因子除去；靶向參照分子的反義RNA/DNA的引入；靶向參照分子的干擾RNA/DNA的引入；參照分子的化學(xué)修飾；參照分子的共價(jià)修飾；用UV輻射或X射線照射參照分子；改變參照分子的同源重組；改變參照分子的有絲分裂重組；參照分子的啟動(dòng)子的置換；和/或任何前述的組合。在具體實(shí)例中，可以通過(guò)比較參照多核苷酸或多肽的序列與同源(例如，同源的酵母或細(xì)菌)多核苷酸或多肽的序列，并且最大化高同源性區(qū)域(保守區(qū)域)或共有序列中進(jìn)行的修飾的數(shù)目，來(lái)尋求哪些核苷酸或氨基酸殘基可以被修飾的指導(dǎo)。術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”是指能夠控制核酸編碼序列或功能性RNA的表達(dá)的DNA序列。在例子中，受控編碼序列位于啟動(dòng)子序列的3'。啟動(dòng)子可以全部來(lái)源自天然基因，啟動(dòng)子可以由來(lái)源于不同的天然存在啟動(dòng)子的不同元件構(gòu)成，或者啟動(dòng)子甚至可以包含合成的DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，不同的啟動(dòng)子可以指導(dǎo)基因在不同組織或細(xì)胞類型中、或在不同的發(fā)育階段、或者響應(yīng)不同的環(huán)境或生理?xiàng)l件表達(dá)。所有上述啟動(dòng)子均有已知的例子，并且在本領(lǐng)域中已被用于控制異源核酸的表達(dá)。在大多數(shù)時(shí)候指導(dǎo)基因在大多數(shù)細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動(dòng)子通常被稱為“組成性(型)啟動(dòng)子”。此外，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員(在許多情況下不成功)嘗試描繪調(diào)節(jié)序列的確切邊界，但是人們已經(jīng)開始理解，不同長(zhǎng)度的DNA片段可以具有相同的啟動(dòng)子活性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的技術(shù)測(cè)定特定核酸的啟動(dòng)子活性。術(shù)語(yǔ)“可操作地連接”是指核酸序列在單個(gè)核酸上的聯(lián)合，其中核酸序列之一的功能受另一個(gè)影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠?qū)崿F(xiàn)編碼序列的表達(dá)(例如，編碼序列在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下)時(shí)，啟動(dòng)子與編碼序列可操作地連接。編碼序列可以以有義或反義方向可操作地連接到調(diào)節(jié)序列。如本文中使用，術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”可以指源自DNA的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累。表達(dá)還可以指mRNA翻譯成多肽。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“過(guò)表達(dá)”是指高于相同基因或相關(guān)基因的內(nèi)源表達(dá)的表達(dá)。因此，如果異源基因的表達(dá)高于可比的內(nèi)源基因的表達(dá)，那么它是“過(guò)表達(dá)的”。如本文中使用，術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)化”是指將核酸或其片段轉(zhuǎn)移和整合到宿主生物體中，導(dǎo)致遺傳上穩(wěn)定的遺傳。含有轉(zhuǎn)化核酸的宿主生物稱為“轉(zhuǎn)基因的”，“重組的”或“經(jīng)轉(zhuǎn)化的”生物體。已知的轉(zhuǎn)化方法包括例如：根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或發(fā)根土壤桿菌(A.rhizogenes)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；磷酸鈣轉(zhuǎn)化；聚凝胺轉(zhuǎn)化；原生質(zhì)體融合；電穿孔；超聲波方法(例如聲致穿孔(sonoporation))；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化；顯微注射；用裸DNA的轉(zhuǎn)化；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化；用病毒載體轉(zhuǎn)化；生物射彈轉(zhuǎn)化(微粒轟擊)；碳化硅WHISKERS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；氣溶膠射束；和PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。如本文中使用，術(shù)語(yǔ)“導(dǎo)入”(在將核酸導(dǎo)入細(xì)胞中的背景下)包括轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以及使包含核酸的植物與第二植物雜交，使得第二植物含有核酸，如可利用常規(guī)植物育種技術(shù)進(jìn)行的。此類育種技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。關(guān)于植物育種技術(shù)的討論，參見Poehlman(1995)BreedingFieldCrops,4thEdition,AVIPublicationCo.,WestportCT?；亟环椒梢杂糜趯⒑怂釋?dǎo)入植物中。該技術(shù)已經(jīng)使用了幾十年來(lái)將性狀引入植物中?；亟?和其它植物育種方法)的描述的例子可以參見例如Poehlman(1995),見上文；及Jensen(1988)PlantBreedingMethodology,Wiley,NewYork,NY。在示例性回交方案中，將感興趣的原始植物(“輪回親本”)與攜帶待導(dǎo)入的核酸的第二植物(“非輪回親本”)雜交。然后將來(lái)自該雜交的所得后代再次與輪回親本雜交，并且重復(fù)該過(guò)程，直到獲得這樣的轉(zhuǎn)化的植物，在該轉(zhuǎn)化的植物中不但有來(lái)自非輪回親本的核酸，還恢復(fù)了輪回親本的基本上所有的期望形態(tài)和生理特征。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“同基因”是指具有基本上相同的基因型(例如，不超過(guò)1個(gè)基因在個(gè)體之間不同)的兩個(gè)植物個(gè)體(或其部分，例如種子，細(xì)胞)。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定整合”或“穩(wěn)定轉(zhuǎn)化”“遺傳穩(wěn)定遺傳”或“穩(wěn)定地”是指在生物體的基因組內(nèi)引入核酸或多核苷酸區(qū)段(通常是異源核酸序列或基因)，所述生物體例如為先前不含有該核酸或多核苷酸區(qū)段的植物、植物組織、植物細(xì)胞器(即質(zhì)體或葉綠體)或植物細(xì)胞。所得的整合固定于植物的基因組中，并且可以傳遞到后代植物中。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)化導(dǎo)致核酸序列穩(wěn)定整合到植物的基因組中。如本文中使用，術(shù)語(yǔ)“基因組”包括核基因組、質(zhì)體基因組和線粒體基因組。相比之下，“瞬時(shí)轉(zhuǎn)化”是指將核酸片段引入宿主生物體的核或含DNA的細(xì)胞器中，導(dǎo)致基因表達(dá)而沒(méi)有遺傳上穩(wěn)定的遺傳?！敖Y(jié)合”是指大分子(例如，蛋白質(zhì)和核酸之間)的序列特異性的、非共價(jià)相互作用。結(jié)合相互作用不需要所有組分都是序列特異性的(例如，與DNA主鏈中的磷酸殘基接觸)，只要整個(gè)相互作用是序列特異性的即可。此類相互作用通常以10-6M-1或更低的解離常數(shù)(Kd)為特征?！坝H和力”是指結(jié)合的強(qiáng)度：增加的結(jié)合親和力與較低的Kd相關(guān)。“切割”是指DNA分子的共價(jià)主鏈的斷裂。切割可以通過(guò)多種方法引發(fā)，包括但不限于磷酸二酯鍵的酶促或化學(xué)水解。單鏈切割和雙鏈切割都是可能的，并且雙鏈切割可以作為兩個(gè)不同的單鏈切割事件的結(jié)果發(fā)生。DNA切割可以導(dǎo)致平末端或交錯(cuò)末端的生成。在某些實(shí)施方案中，融合多肽用于靶向雙鏈DNA切割，使得基因組DNA被修飾。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！焙汀拜d體”是指一種染色體外元件，其可以攜帶一個(gè)或多個(gè)不是細(xì)胞中心代謝的一部分的基因。質(zhì)粒和載體通常是環(huán)狀雙鏈DNA分子。然而，質(zhì)粒和載體可以是單鏈或雙鏈DNA或RNA的線性或環(huán)狀核酸，并且可以源自任何來(lái)源，其中許多核苷酸序列已經(jīng)連接或重組成獨(dú)特的構(gòu)造，該構(gòu)造能夠?qū)?dòng)子片段和編碼DNA序列連同任何合適的3'非翻譯序列一起導(dǎo)入細(xì)胞。在實(shí)例中，質(zhì)粒和載體可以包含自主復(fù)制序列、基因組整合序列和/或噬菌體或核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”表明蛋白質(zhì)包括來(lái)源自超過(guò)一種親本蛋白質(zhì)或多肽的多肽組分。通常，融合蛋白從融合基因表達(dá)，其中編碼來(lái)自一種蛋白質(zhì)的多肽序列的核苷酸序列以符合讀框的方式附加到編碼來(lái)自另一種不同蛋白的多肽序列的核苷酸序列，并且任選地通過(guò)接頭與后者分開。然后，融合基因可以由重組宿主細(xì)胞表達(dá)為單一蛋白質(zhì)?！皢伪扼w”是指具有一套(n)染色體的植物細(xì)胞、組織或植物?！半p單倍體”或“加倍單倍體”或“二倍體”指來(lái)源自單倍體的植物細(xì)胞、組織或植物。雙單倍體具有兩套(2n)染色體，并且通常是純合的。然而，相比于通常在雙二倍體中觀察到的絕對(duì)純合性，DNA中的突變、缺失或插入或其它類似修飾有可能導(dǎo)致一些偏離。類似地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以通過(guò)隨機(jī)或靶向突變、缺失、插入，或通過(guò)改組DNA或其部分，來(lái)有意地修飾雙單倍體DNA。此類“經(jīng)修飾的雙單倍體”包括在本公開內(nèi)容中。如果想要的話，也可以使用本公開的方法獲得多倍體。多倍體將具有三套或更多套染色體，并且除了上面討論的修飾外，也應(yīng)該是純合的?！叭旧w加倍劑”是指使得細(xì)胞中染色體數(shù)目加倍(例如，從單倍體到二倍體或二倍體到四倍體等)的化學(xué)品。此類試劑通常是抗微管劑，如秋水仙堿，神經(jīng)酰胺或APM(甲基胺草磷(amiprophos-methyl))。氧化亞氮也被報(bào)道為加倍劑(美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0005479，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)提及并入本文)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉可以引起染色體加倍(例如通過(guò)阻斷正常細(xì)胞周期分裂等)的化合物。“愈傷組織”是指細(xì)胞或組織的去分化增殖團(tuán)塊?！癐型愈傷組織”是指作為形態(tài)上緊湊的玉米愈傷組織的愈傷組織，其中整株植物可以通過(guò)器官發(fā)生、胚發(fā)生、或兩者的組合而再生?！癐I型愈傷組織”是指形態(tài)學(xué)上脆弱的、高度胚發(fā)生性的玉米愈傷組織(Armstrong和Green,Planta.164:207-214.1985)?！俺墒炫摺笔侵缚梢栽谑诜酆蟠蠹s15天以后獲得，并且當(dāng)在體外培養(yǎng)時(shí)通常不產(chǎn)生可再生的愈傷組織的合子胚。“未成熟胚”是指可以在授粉后約15天以內(nèi)獲得，并且當(dāng)在體外培養(yǎng)時(shí)通?？梢援a(chǎn)生可再生的愈傷組織的合子胚。術(shù)語(yǔ)“合子胚”用于涵蓋種子、從種子提取的成熟胚、成熟胚、或能夠萌芽的未成熟胚?！芭甙l(fā)生培養(yǎng)物”或“胚發(fā)生細(xì)胞”或“胚發(fā)生組織”或“胚”或“胚樣結(jié)構(gòu)”是指能夠經(jīng)培養(yǎng)的再生成植物的植物細(xì)胞和組織?！爸参锷L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或植物激素”是指影響植物生長(zhǎng)的化合物。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括但不限于生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素、ABA、赤霉素、乙烯、油菜素類固醇和多胺。生長(zhǎng)素在低濃度下影響芽和根的延伸，但在更高水平抑制生長(zhǎng)。常用的生長(zhǎng)素包括毒莠定(picloram)(4-氨基-3,5,6-三氯吡啶甲酸)，2,4-D(2,4-二氯苯氧基乙酸)，IAA(吲哚-3-乙酸)，NAA(α-萘乙酸)和麥草畏(dicamba)(3,6-二氯茴香酸)。細(xì)胞分裂素導(dǎo)致細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化和芽分化。常用的細(xì)胞分裂素包括激動(dòng)素、BA(6-芐基氨基嘌呤)、2-ip(2-異戊烯基腺嘌呤)、BAP(6-芐基氨基嘌呤)，噻苯隆(TDZ)，玉米素核苷和玉米素?！皢巫尤~植物”或“單子葉”是指具有單個(gè)子葉的植物。例子包括谷物，如玉米，稻，小麥，燕麥和大麥?！氨硇汀笔侵赣捎谏矬w的基因組(包括非基因組DNA和RNA，如質(zhì)粒和人工染色體)和/或細(xì)胞器中的核酸的表達(dá)(或無(wú)表達(dá))，而由生物體展現(xiàn)出的性狀?！霸偕笔侵笍闹参锛?xì)胞或組織培養(yǎng)出植物的過(guò)程?！斑x擇標(biāo)志物”或“可篩選標(biāo)志物”是指這樣核酸序列，其表達(dá)賦予含有該核酸序列的細(xì)胞，組織或植物的易于鑒定的表型?！版咦芋w”是指生命周期階段中的植物，其特征在于具有雙倍染色體數(shù)目。這與包括小孢子和花粉在內(nèi)的“配子體”相反。來(lái)源于雄性來(lái)源的單倍體細(xì)胞系的組織通常，基因組的倍性水平指存在于細(xì)胞核內(nèi)的染色體套數(shù)。倍性水平可能隨著構(gòu)成生物體的細(xì)胞類型和/或細(xì)胞來(lái)源而變化。單倍體數(shù)(n)是在生物體內(nèi)僅存在一套染色體的指示。雙二倍體或二倍體數(shù)(2n)是在生物體內(nèi)存在兩套染色體的指示。對(duì)于一些生物體，特別是植物物種，含有更大的染色體套數(shù)，例如三倍體(3n)，四倍體(4n)，五倍體(5n)和六倍體(6n)，是常見的。此類增加的染色體套數(shù)的實(shí)例，如三倍體或更多者，通常稱為多倍體。通常在生物體的整個(gè)生命周期中，二倍體(2n)多細(xì)胞階段與單倍體(n)多細(xì)胞期交替出現(xiàn)。生物體生命周期的單倍體(n)階段被認(rèn)為是配子體階段，例如配子生成。相比之下，生物體生命周期的二倍體(2n)階段被視為孢子體階段，例如產(chǎn)孢子。在孢子體階段中，生物體通過(guò)稱作減數(shù)分裂的過(guò)程生成單倍體(n)的小孢子(即孢子)。得到的小孢子可以生成配子，例如精子核，其在受精過(guò)程中與由大孢子生成的其它配子(例如卵子核)融合，生成二倍體合子。在植物中，小孢子在雄性生殖器官中生成。雄性生殖器官稱為花藥?；ㄋ幧蓡伪扼w小孢子，單倍體小孢子成熟成為包含精子核的花粉?；ǚ鄞碇参锷芷谥幸欢味虝旱男坌耘渥芋w階段的開始，該階段中兩個(gè)精子核被遞送到胚珠的胚囊中，用于進(jìn)行雙受精和隨后的胚和胚乳形成。盡管高等植物生命周期的這個(gè)階段通常僅包括幾次細(xì)胞分裂，但是在某些實(shí)驗(yàn)條件下，可以誘導(dǎo)小孢子發(fā)育改變而生成胚樣結(jié)構(gòu)，中間沒(méi)有受精。因而，這些胚樣結(jié)構(gòu)是單倍體(n)。此過(guò)程稱為單雄生殖(androgenesis)，是名為花藥或小孢子培養(yǎng)的體外技術(shù)的生物學(xué)基礎(chǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了轉(zhuǎn)化感受態(tài)雄性來(lái)源的細(xì)胞系。在隨后的實(shí)施方案中，從所述轉(zhuǎn)化感受態(tài)雄性來(lái)源的細(xì)胞系獲得單倍體小孢子細(xì)胞系。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織來(lái)源自玉米小孢子。花藥來(lái)源的培養(yǎng)物提供了在意圖用于生產(chǎn)育種品系的植物中快速誘導(dǎo)純合性的方法。花藥培養(yǎng)包括從植物中分離未成熟的花藥，并將它們置于培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基誘導(dǎo)花藥內(nèi)通常將注定成為花粉粒的細(xì)胞，即小孢子，開始分裂并形成可從中再生植物的細(xì)胞培養(yǎng)物。關(guān)于花藥培養(yǎng)的一般討論，參見J.M.Dunwell,“AntherandOvaryCulture”,于S.W.J.Bright和M.G.K.Jones,(編),CerealTissueandCellCulture,MartinusNijhoffPublisher,1985,Dordrecht,pp.1-44。所得的培養(yǎng)物是單倍體，并且僅含有來(lái)自原始植物的單套染色體。來(lái)源自這些培養(yǎng)物的植物是不育的，除非發(fā)生染色體加倍(自發(fā)地或通過(guò)誘導(dǎo))以創(chuàng)建完全能育且完全近交的雙倍單倍體。在過(guò)去幾十年中已經(jīng)報(bào)道了許多以生成單倍體植物為目標(biāo)的配子體細(xì)胞的體外培養(yǎng)的研究。也已經(jīng)公開了大量的綜述，書章和研討會(huì)會(huì)刊(一般見Chu,“HaploidsinPlantImprovement”,于I.K.Vasil,W.R.Scowcroft,K.J.Frey(eds.),PlantImprovementandSomaticCellGenetics,NewYork:AcademicPress,1982,pp.129-158；Heberle-Bors,1985,“InVitroHaploidFormationofPollen:ACriticalReview”,Theor.Appl.Genet.71:361-374；及Hu和Yang,“HaploidsofHigherPlantsinVitro.”Berlin,Heidelberg,Springer-Verlag,1986)。花藥培養(yǎng)代表了方法，通過(guò)該方法在理論上可以在體外從花藥和/或小孢子直接生成大量的單倍體個(gè)體。參見Kelleretal.,“Haploidsfromgametophyticcells--recentdevelopmentsandfutureprospects”,于C.E.Green,D.A.Somers,W.P.Hackett,D.D.Biesoer(編),PlantTissueandCellCulture,AlanRLiss,NewYork,pp223-241,1986。單倍體可以通過(guò)花藥、小孢子、子房和胚珠的培養(yǎng)從雄性和雌性配子體細(xì)胞中再生。陽(yáng)性體外響應(yīng)將導(dǎo)致胚和/或愈傷組織的發(fā)育，從胚和愈傷組織可以再生植物。體外培養(yǎng)期間的早期事件已經(jīng)在細(xì)胞學(xué)，超微結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)水平上得到了表征(Chenetal.,1984,“SegmentationPatternsandMechanismsofGenomeMultiplicationinCulturedMicrosporesofBarley”,J.Can,Genet.Cytol.,26:475-483；Raghavan,1984,“ProteinSyntheticActivityduringNormalPollenDevelopmentandDuringInducedPollenEmbryogenesisinHyoscyamusniger”,J.CanBot.,62:2493-2513；Huang,“UltrastructuralAspectsofPollenEmbryogenesisinHordeum,TriticumandPaeonia”,1986)。在另外的實(shí)施方案中，來(lái)源自雄性來(lái)源的細(xì)胞系(例如玉米小孢子)的單倍體組織是胚或愈傷組織。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供的方法可以經(jīng)歷，也可以不經(jīng)歷愈傷組織形成階段?？梢詫伪扼w胚置于“非愈傷組織促進(jìn)培養(yǎng)基”上。術(shù)語(yǔ)“非愈傷組織促進(jìn)培養(yǎng)基”是指不支持去分化的細(xì)胞或組織塊增殖的培養(yǎng)基。優(yōu)選的“非愈傷組織促進(jìn)培養(yǎng)基”用于胚搶救，其含有本領(lǐng)域中公知的典型的鹽和維生素配方。此類胚搶救或胚培養(yǎng)物含有很少或不含生長(zhǎng)素(綜述參見Raghaven,V.,1986,Biol.Rev.,41:1-58)。在一些實(shí)施方案中，胚成熟培養(yǎng)基也代表另一種優(yōu)選的“非愈傷組織促進(jìn)培養(yǎng)基”。胚成熟培養(yǎng)基用于促進(jìn)體外培養(yǎng)的胚的發(fā)育，防止過(guò)早萌發(fā)，并且通常含有標(biāo)準(zhǔn)的鹽/維生素配方(取決于物種)，升高的糖水平和/或外源添加的脫落酸，很少或沒(méi)有生長(zhǎng)素。另一種類型的培養(yǎng)基用于芽培養(yǎng)或多芽增殖。此多芽培養(yǎng)基可以同樣含有極少量或減量的生長(zhǎng)素，但含有升高水平的細(xì)胞分裂素，能促進(jìn)分生組織增殖和生長(zhǎng)。已經(jīng)采用花藥培養(yǎng)獲得了超過(guò)200個(gè)物種的小孢子來(lái)源的愈傷組織、胚和植物(Maheshwarietal.,1982,“HaploidsfromPollenGrains-RetrospectandProspect”,Amer.J.Bot.,69:865-879)。然而，花藥培養(yǎng)反應(yīng)性在物種之間變化相當(dāng)大。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)性花藥(每100個(gè)鋪板的花藥中形成胚和/或愈傷組織的花藥)的最高產(chǎn)率在小麥中為87％(A.M.Wei,1982,“PollenCallusCultureinTriticumaertivum”,Theor.Appl.Genet.,63,pp.71-73)，稻中為67％(S.L.Lin和H.S.Tsay,1983,J.Agr.Res.,China，在Dunwell中引用,1985)，玉米中為17％(Tingetal.,1981,“ImprovedAntherCultureofMaize”(ZeamaysL.),PlantScienceLett.,23,pp.139-145)，在大麥中為1％(Z.H.Xu和N.Sunderland,1982,“InnoculationDensityintheCultureofBarleyAnthers”,Scient.Sinic.,25,pp.961-968)。在黑麥中，每100個(gè)花藥觀察到43個(gè)發(fā)育結(jié)構(gòu)(G.Wenzeletal.,1977,“IncreasedInductionandChromosomeDoublingofAndrogeneticHaploidRye”,Theor.Appl.Genet.,51,pp.81-86)。每100個(gè)培養(yǎng)花藥的生成綠色植物的愈傷組織的頻率在小麥中為72％(J.W.Ouyangetal.,1983,“TheResponseofAntherCulturetoTemperatureinTriticumAestivum”,Theor.Appl.Genet.,66,pp.101-109)，在稻中為12％(L.J.Chenetal.,“MediumEvaluationforRiceAntherCulture”,收錄于A.Fujiwara(編),“PlantTissueCulture”,pp.551-551.Jap.Assoc.PlantTissueCultureTokyo,1982)，在大麥中為10％(K.N.Kao,“PlantFormationfromBarleyAntherCultureswithFicollMedia”,Z.Pflanzenzuchtg.,103,1981,pp.437-443)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，小孢子來(lái)自具有優(yōu)良性能特征的玉米。在該實(shí)施方案的一個(gè)方面中，小孢子來(lái)自雜種玉米，所述雜種玉米是優(yōu)良玉米品系與不同的具有高小孢子培養(yǎng)反應(yīng)的玉米品系雜交而得到的。如美國(guó)專利No.5,306,864(在此通過(guò)提及整體并入)美國(guó)專利號(hào)No.5,602,310(本文通過(guò)提及整體并入)中提供的，花藥培養(yǎng)物作為玉米(玉蜀黍(ZeamaysL.))中的單倍體育種手段的應(yīng)用容易推廣到不同的玉米基因型，包括優(yōu)良性能系。能夠用來(lái)鑒定表現(xiàn)出對(duì)花藥培養(yǎng)物增強(qiáng)的應(yīng)答的玉米種質(zhì)的方法可以轉(zhuǎn)用于增加其它挑選的基因型中的花藥可培養(yǎng)性。此類方法是本領(lǐng)域中容易已知的，并且可以用于將玉米種質(zhì)(包括優(yōu)良性能品系)轉(zhuǎn)化成從培養(yǎng)的花藥和/或小孢子生成高水平的單倍體和/或雙單倍體組織培養(yǎng)物的植物。染色體加倍在一個(gè)實(shí)施方案中，任何公開的生成具有經(jīng)修飾的單倍體組織基因組的單倍體植物組織的方法還包括用染色體加倍劑處理經(jīng)修飾的單倍體組織以生成雙單倍體植物組織。在某些實(shí)施方案中，如此生成的雙單倍體組織包含就在單倍體基因組中生成的修飾(例如，整合的供體多核苷酸或突變)而言是純合的基因組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將包含經(jīng)修飾的雙單倍體基因組的玉米組織繁殖成對(duì)基因組修飾而言為純合的成熟植物。染色體加倍的方法公開于Antoine-Michard,S.etat,Plantcell,tissueorgancult.,Cordrecht,theNetherlands,KluwerAcademicPublishers,1907,48(3):203-207；Kato,A.,MaizeGeneticsCooperationNewsletter1897,38-37；及Wan,Y.etal.,Theor.Appl.Genet.,1980,77:889-892,Wan,Y,etal.,Theor.Appl.Genet.,1991,81:205-211。其公開內(nèi)容通過(guò)提及并入本文。典型的方法包括使細(xì)胞與秋水仙素、抗微管劑或抗微管除草劑、拿草特(pronamide)、氧化亞氮或任何有絲分裂抑制劑接觸，以創(chuàng)建純合的雙重單倍體細(xì)胞。其它作用劑可以與有絲分裂抑制劑一起使用以改善加倍效率。此類作用劑可以是二甲亞砜(DMSO)，佐劑，表面活性劑等。另外的染色體加倍劑是本領(lǐng)域中已知的，且在美國(guó)專利號(hào)No.5,866,51(其全部?jī)?nèi)容通過(guò)提及并入本文)中列出的化學(xué)品適合用于生成雙單倍體植物。此外，表1列出了各種已知的染色體加倍劑。表1：染色體加倍劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文中公開的用于幼苗浸泡方法的染色體加倍劑的合適劑量包括例如0.01μM，0.5μM，1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，10μM，15μM，20μM，25μM，30μM，35μM，40μM，45μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，100μM，125μM，150μM，200μM，500μM，和1000μM。合適的范圍還包括例如0.1-10μM，1-100μM，5-125μM，25-200μM，50-500μM，15-150μM和1-10,000μM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，染色體加倍劑的范圍可以為幼苗浸泡方法中使用的溶液的0.01％-0.5％。例如，可以使用0.01％，0.02％，0.025％，0.05％，0.075％，0.1％，0.125％，0.15％，0.175％，0.2％，0.225％，0.25％，0.275％，0.3％，0.325％，0.35％，0.375％，0.4％，0.425％，0.45％，0.475％，或0.5％的染色體加倍劑使染色體加倍。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，當(dāng)與秋水仙堿(例如，在0.025％)相比時(shí)，本文公開的染色體倍加倍劑的低幼苗死亡率的范圍可以例如為處理的幼苗或植物細(xì)胞總數(shù)的小于10％至約40％，或小于約5％至約20％，或小于約15％至約25％或小于50％。在其它實(shí)施方案中，用于本文中公開的幼苗葉施用方法的染色體加倍劑的合適劑量包括例如3.5gai/ha，70gai/ha，140gai/ha，280gai/ha。合適的應(yīng)用率范圍包括例如5gai/ha至1120gai/ha，且更優(yōu)選至2,800gai/ha。短語(yǔ)“接觸”包括提及“直接接觸”和“間接接觸”。例如，包含加倍劑的培養(yǎng)基可以與單倍體細(xì)胞直接接觸，或者包含加倍劑的培養(yǎng)基可以通過(guò)屏障，如濾紙、植物組織或其它細(xì)胞，與單倍體細(xì)胞分開，因此加倍劑透過(guò)濾紙或細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)移到單倍體細(xì)胞。接觸以任何合適的方式實(shí)現(xiàn)，例如根的水培處理，噴霧，注射，浸潤(rùn)，浸泡和潤(rùn)濕?？梢杂萌旧w加倍劑處理單倍體細(xì)胞、單倍體胚、單倍體種子、單倍體幼苗或單倍體植物。可以通過(guò)使單倍體細(xì)胞，如單倍體胚細(xì)胞與染色體加倍劑接觸，從單倍體細(xì)胞再生純合植物。單倍體細(xì)胞可以與加倍劑接觸任何時(shí)間量。在一個(gè)實(shí)施方案中，單倍體細(xì)胞與加倍劑接觸1分鐘，2分鐘，5分鐘，10分鐘，15分鐘，20分鐘，25分鐘，30分鐘，35分鐘，45分鐘，1小時(shí)，2小時(shí)，5小時(shí)，10小時(shí)，24小時(shí)或48小時(shí)。可以分離單倍體胚。它可以包含在籽粒、胚珠或種子內(nèi)，它也可以在穗(ear)上，如玉米穗上，或在穗(spike)上(在其它谷物如小麥的情況下是如此)。穗包括：?jiǎn)伪扼w胚可以在植物上或從植物分離。穗也可以切片。染色體加倍后，雙倍單倍體胚將包含2拷貝的母本來(lái)源的染色體。從單倍體胚中獲得雙倍單倍體植物的方法的效率可以大于10％，20％，30％，50％，60％，70％，80％或90％。植物轉(zhuǎn)化本公開文本所公開的方法包括植物轉(zhuǎn)化方法。可以用于本公開文本的方法的植物轉(zhuǎn)化方法包括但不限于：位點(diǎn)特異性微粒轟擊，土壤桿菌轉(zhuǎn)化法，磷酸鈣轉(zhuǎn)化法，聚凝胺轉(zhuǎn)化法，電穿孔轉(zhuǎn)化法，超聲轉(zhuǎn)化法，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，顯微注射轉(zhuǎn)化法，裸DNA轉(zhuǎn)化法，質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化法，病毒載體轉(zhuǎn)化法，碳化硅介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，氣溶膠射束轉(zhuǎn)化法或PEG轉(zhuǎn)化法。通常，任何植物轉(zhuǎn)化方法均可用于將DNA或任何其它多核苷酸序列插入宿主細(xì)胞的基因組中。因此，可以使用任何可提供有效轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染的方法。已經(jīng)開發(fā)了許多用于植物轉(zhuǎn)化的方法，包括用于雙子葉植物以及單子葉植物的生物和物理轉(zhuǎn)化方案(例如，Goto-Fumiyukietal.,NatureBiotech17:282-286(1999)；Mikietal.,MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick,B.R.和Thompson,J.E.編,CRCPress,Inc.,BocaRaton,pp.67-88(1993))。此外，包含基因表達(dá)盒的載體和用于植物細(xì)胞或組織轉(zhuǎn)化和植物再生的體外培養(yǎng)方法可以在例如Gruberetal.,MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick,B.R.andThompson,J.E.Eds.,CRCPress,Inc.,BocaRaton,pp.89-119(1993)中找到。有許多技術(shù)可供用于將包含基因表達(dá)盒的DNA插入植物宿主細(xì)胞中。這些技術(shù)包括使用根癌土壤桿菌或發(fā)根土壤桿菌作為轉(zhuǎn)化劑用卸甲的(disarmed)T-DNA轉(zhuǎn)化，磷酸鈣轉(zhuǎn)染，聚凝胺轉(zhuǎn)化，原生質(zhì)體融合，電穿孔，超聲方法(例如聲致穿孔)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化，顯微注射，裸DNA，質(zhì)粒載體，病毒載體，生物彈射(微粒轟擊)，碳化硅WHISKERSTM介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，氣溶膠射束或聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化以及其它可能的方法。例如，可以使用諸如電穿孔和顯微注射植物細(xì)胞原生質(zhì)體等技術(shù)將包含基因表達(dá)盒的DNA構(gòu)建體直接引入植物細(xì)胞的基因組DNA中。此類植物轉(zhuǎn)化方法包括例如經(jīng)由氯化鈣沉淀，聚乙二醇(PEG)或電穿孔介導(dǎo)的DNA攝取的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見Paszkowskietal.(1984)EMBOJ3:2717-2722,Potrykusetal.(1985)Molec.Gen.Genet.199:169-177；Frommetal.(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA82:5824-5828；及Shimamoto(1989)Nature338:274-276)和植物組織的電穿孔(D'Halluinetal.(1992)PlantCell4:1495-1505)?？梢允褂蒙锷鋸椃椒ǎ鏒NA顆粒轟擊，將DNA構(gòu)建體直接導(dǎo)入植物組織(參見例如Kleinetal.(1987)Nature327:70-73)。生物射彈方法包括微粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其中DNA攜帶在微射彈的表面上。在該方法中，用生物射彈裝置將表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織中，該生物射彈裝置將微射彈加速至足以穿透植物細(xì)胞壁和膜的速度。Sanfordetal.,Part.Sci.Technol.5:27(1987),Sanford,J.C.,TrendsBiotech.6:299(1988),Sanford,J.C.,Physiol.Plant79:206(1990),Kleinetal.,Biotechnology10:268(1992)。用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的其它方法包括通過(guò)碳化硅WHISKERSTM介導(dǎo)的DNA攝取的顯微注射(Kaeppleretal.(1990)PlantCellReporter9:415-418)?；蛘?，可以經(jīng)由納米顆粒轉(zhuǎn)化將DNA構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞中(參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)No.12/245,685，其通過(guò)提及整體并入本文)。一種廣泛使用的將包含基因表達(dá)盒的載體導(dǎo)入植物中的方法是基于土壤桿菌的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。Horschetal.,Science227:1229(1985)。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌是已知可用于遺傳轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的植物病原性土壤細(xì)菌。根癌土壤桿菌的和發(fā)根土壤桿菌分別由Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒攜帶負(fù)責(zé)植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因。Kado,C.I.,Crit.Rev.Plant.Sci.10:1(1991)。用于土壤桿菌介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的土壤桿菌載體系統(tǒng)和方法的描述也可以從，例如，Gruberetal.,見上文,Mikietal.,見上文，Moloneyetal.,PlantCellReports8:238(1989)，和美國(guó)專利No.4,940,838和5,464,763獲取。當(dāng)土壤桿菌用于植物轉(zhuǎn)化時(shí)，可以將待插入的DNA克隆到稱為中間載體的特殊質(zhì)粒中或克隆到二元載體中。中間載體在不存在輔助質(zhì)粒的情況下無(wú)法在土壤桿菌中復(fù)制(接合)。日本煙草超二元系統(tǒng)是這種系統(tǒng)的一個(gè)例子(參見綜述Komarietal.,(2006)收錄于:MethodsinMolecularBiologyNo.343:AgrobacteriumProtocols(2ndEdition,Vol.1)(K.Wang,ed.)HumanaPressInc.,Totowa,NJ,pp.15-41；及Komorietal.,(2007)PlantPhysiol.145:1155-1160)。二元載體可以在大腸桿菌和土壤桿菌中復(fù)制。它們包含被左右T-DNA邊界區(qū)所框定的選擇標(biāo)志物基因和接頭或多接頭?？梢詫⒍d體直接轉(zhuǎn)化到土壤桿菌中(Holsters，1978)。土壤桿菌可以用作包含質(zhì)粒，例如攜帶vir區(qū)的Ti或RI質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，vir區(qū)對(duì)于T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中而言通常是必需的?？梢岳酶┩寥罈U菌宿主的毒力，指導(dǎo)含有T鏈的供體DNA插入通過(guò)土壤桿菌二元TDNA載體技術(shù)(Bevan(1984)Nuc.AcidRes.12:8711-8721)或共培養(yǎng)規(guī)程(Horschetal.(1985)Science227:1229-1231)感染的單倍體組織或細(xì)胞中。通常，土壤桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)用于工程化雙子葉植物(Bevanetal.(1982)Ann.Rev.Genet16:357-384；Rogersetal.(1986)MethodsEnzymol.118:627-641)。土壤桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也可以用于將DNA轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)移到單子葉植物和植物細(xì)胞。參見美國(guó)專利No.5,591,616；Hernalsteenetal.(1984)EMBOJ3:3039-3041；Hooykass-VanSlogterenetal.(1984)Nature311:763-764；Grimsleyetal.(1987)Nature325:1677-179；Boultonetal.(1989)PlantMol.Biol.12:31-40；和Gouldetal.(1991)PlantPhysiol.95:426-434。在通過(guò)植物轉(zhuǎn)化導(dǎo)入包含基因表達(dá)盒的遺傳構(gòu)建體后，可以培養(yǎng)植物細(xì)胞，并且在分化組織，如芽和根出現(xiàn)后，可以生成成熟的植物。在一些實(shí)施方案中，可以生成多個(gè)植物。用于再生植物的方法是本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的，并且可以參見例如：PlantCellandTissueCulture,1994,Vasil和Thorpe編KluwerAcademicPublishers和PlantCellCultureProtocols(MethodsinMolecularBiology111,1999HallEdsHumanaPress)?？梢栽诎l(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或在合適的培養(yǎng)基如土壤中種植本文中描述的經(jīng)遺傳修飾的植物。在一些實(shí)施方案中，用于高等植物的合適的生長(zhǎng)培養(yǎng)基可以包括用于植物的任何生長(zhǎng)培養(yǎng)基，包括但不限于土壤，沙，支持根生長(zhǎng)的任何其它顆粒培養(yǎng)基(例如蛭石，珍珠巖等)或水培培養(yǎng)，以及適當(dāng)?shù)墓猓蜖I(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，其優(yōu)化高等植物的生長(zhǎng)?？梢耘囵B(yǎng)通過(guò)任何上述植物轉(zhuǎn)化技術(shù)生成的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，以再生擁有經(jīng)轉(zhuǎn)化的基因型、并因此具有期望的表型的全植物。此類再生技術(shù)依賴于在組織培養(yǎng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中操作某些植物激素，通常依賴于與期望的核苷酸序列一起導(dǎo)入的殺生物劑和/或除草劑標(biāo)記物。來(lái)自培養(yǎng)的原生質(zhì)體的植物再生描述于Evans,etal.,“ProtoplastsIsolationandCulture”inHandbookofPlantCellCulture,pp.124-176,MacmillianPublishingCompany,NewYork,1983；和Binding,RegenerationofPlants,PlantProtoplasts,pp.21-73,CRCPress,BocaRaton,1985。再生也可以從植物愈傷組織，外植體，器官，花粉，胚或其部分獲得。此類再生技術(shù)在Kleeetal.(1987)Ann.Rev.ofPlantPhys.38:467-486中有一般性的描述?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)經(jīng)工程化改造的植物材料選擇或篩選由轉(zhuǎn)化DNA上存在的標(biāo)志物基因編碼的性狀來(lái)鑒定并分離經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、愈傷組織、組織或植物。例如，轉(zhuǎn)化基因構(gòu)建體賦予針對(duì)某種抗生素或除草劑的抗性，可以通過(guò)在含有抑制量的該抗生素或除草劑的培養(yǎng)基上培養(yǎng)經(jīng)工程化改造的植物材料，來(lái)進(jìn)行選擇。此外，還可以通過(guò)篩選可以存在于重組核酸構(gòu)建體上的任何可見標(biāo)志物基因(例如，β-葡糖醛酸糖苷酶，螢光素酶或gfp基因)的活性來(lái)鑒定經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物和植物細(xì)胞。選擇和篩選方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)基因“事件”是指通過(guò)用異源DNA(例如，包括感興趣的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)盒)轉(zhuǎn)化和再生單個(gè)植物細(xì)胞生成的重組植物。術(shù)語(yǔ)“事件”指包括異源DNA的轉(zhuǎn)化體的原始轉(zhuǎn)化體和/或轉(zhuǎn)化體的后代。術(shù)語(yǔ)“事件”還指通過(guò)轉(zhuǎn)化體和另一植物之間的有性異型雜交生成的后代。即使在與輪回親本重復(fù)回交后，插入的DNA和來(lái)自經(jīng)轉(zhuǎn)化的親本的側(cè)翼DNA也存在于雜交后代中相同的染色體位置處。通常，植物組織的轉(zhuǎn)化生成多個(gè)事件，每個(gè)事件代表DNA構(gòu)建體在植物細(xì)胞基因組的不同位置中的插入。基于轉(zhuǎn)基因或其它期望的特征的表達(dá)選擇特定的事件。在本公開的實(shí)施方案中，特定事件包括插入在靶定的基因組基因座內(nèi)的供體DNA多核苷酸。如本文中使用，“插入DNA”是指異源DNA，如供體DNA多核苷酸內(nèi)的轉(zhuǎn)基因，其可以包含用于轉(zhuǎn)化植物材料的基因表達(dá)盒，而“側(cè)翼DNA”或“接合部DNA”可以包括天然存在于生物體，如植物中的基因組DNA，或通過(guò)與插入DNA分子無(wú)關(guān)的轉(zhuǎn)化過(guò)程導(dǎo)入的外源(異源)DNA，例如與轉(zhuǎn)化事件相關(guān)聯(lián)的片段。如本文中使用的，“接合部”或“側(cè)翼區(qū)”或“側(cè)翼序列”是指至少20，50，100，200，300，400，1000，1500，2000，2500，或5000個(gè)堿基對(duì)或更大的序列，其位于插入DNA分子的緊鄰上游并與之連續(xù)，或位于插入DNA分子的緊鄰下游并與之連續(xù)。對(duì)于通過(guò)任何上述轉(zhuǎn)化技術(shù)得來(lái)的經(jīng)轉(zhuǎn)化的單倍體胚，可以加以培養(yǎng)以再生擁有經(jīng)轉(zhuǎn)化的基因型的全植物。此類再生技術(shù)稱作胚搶救(embryorescue)。胚搶救培養(yǎng)基可以包含某些植物激素和能源，或僅包含能源。生長(zhǎng)培養(yǎng)基還可以含有選擇劑，如殺生物劑和/或除草劑。此選擇劑可以用于指示經(jīng)由轉(zhuǎn)化過(guò)程導(dǎo)入的標(biāo)志物。玉米的轉(zhuǎn)化和再生已經(jīng)描述在例如Gordon-Kammetal.,ThePlantCell2:603-618(1990)中。從胚生成植物是本領(lǐng)域中公知的。可以用于將未成熟的雙倍單倍體胚生成為植物的胚搶救技術(shù)也是已知的(RecentResearchDevelopmentsinGenetics&Breeding.Vol.1,PartII,237-3032004)。其公開內(nèi)容通過(guò)提及并入本文。載體和供體多核苷酸在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開涉及導(dǎo)入插入靶定的基因組基因座內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)供體DNA多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，供體多核苷酸包含編碼序列。編碼序列可以編碼例如賦予農(nóng)藝性狀的基因(例如轉(zhuǎn)基因)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，農(nóng)藝性狀選自包括殺蟲抗性性狀，除草劑耐性性狀，氮利用效率性狀，水利用效率性狀，營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量性狀，DNA結(jié)合性狀和選擇標(biāo)志物性狀的組。在另外的實(shí)施方案中，在植物內(nèi)表達(dá)供體多核苷酸。本公開的實(shí)施方案包括包含一種或多種供體多核苷酸的植物。在實(shí)施方案的一個(gè)方面中，植物包含單倍體基因組。在實(shí)施方案的另一方面中，所述植物包含雙單倍體基因組。在一些實(shí)施方案中，供體多核苷酸包含基因表達(dá)盒。用于構(gòu)建本文中使用的基因表達(dá)盒的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的，并且描述于例如Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1989)；和Silhavyetal.,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY(1984)；和Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience(1987)出版。可以在供體多核苷酸中采用許多指導(dǎo)基因在植物中表達(dá)的啟動(dòng)子。此類啟動(dòng)子可以選自組成性，化學(xué)調(diào)節(jié)性，誘導(dǎo)型，組織特異性和種子優(yōu)選性的啟動(dòng)子。用于指導(dǎo)核酸表達(dá)的啟動(dòng)子取決于具體應(yīng)用。例如，適合于宿主細(xì)胞的組成性強(qiáng)啟動(dòng)子通常用于表達(dá)和純化表達(dá)的蛋白質(zhì)。植物啟動(dòng)子的非限制性例子包括源自擬南芥(A.thaliana)泛素-10(ubi-10)的啟動(dòng)子序列(Callis,etal.,1990,J.Biol.Chem.,265:12486-12493)；根癌土壤桿菌甘露氨酸合酶(Δmas)(Petolinoetal.,U.S.PatentNo.6,730,824)；和/或木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)(Verdagueretal.,1996,PlantMolecularBiology31:1129-1139)。其它組成性啟動(dòng)子包括例如核心花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子(Odelletal.(1985)Nature313:810-812)；稻肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroyetal.(1990)PlantCell2:163-171)；玉米泛素啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5,510,474；Christensenetal.(1989)PlantMol.Biol.12:619-632及Christensenetal.(1992)PlantMol.Biol.18:675-689)；pEMU啟動(dòng)子(Lastetal.(1991)Theor.Appl.Genet.81:581-588)；ALS啟動(dòng)子(美國(guó)專利號(hào)5,659,026)；玉米組蛋白啟動(dòng)子(Chaboutéetal.PlantMolecularBiology,8:179-191(1987))；等等。其它有用的植物啟動(dòng)子包括組織特異性和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是能夠響應(yīng)誘導(dǎo)物而直接或間接激活一個(gè)或多個(gè)DNA序列或基因的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。在不存在誘導(dǎo)物的情況下，DNA序列或基因不會(huì)被轉(zhuǎn)錄。通常，與誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件特異性結(jié)合以激活轉(zhuǎn)錄的蛋白因子以無(wú)活性形式存在，然后通過(guò)誘導(dǎo)物直接或間接轉(zhuǎn)化為活性形式。誘導(dǎo)劑可以是化學(xué)劑，例如蛋白質(zhì)，代謝物，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，除草劑或酚類化合物，或通過(guò)熱，冷，鹽或有毒元素直接施加，或在病原體或疾病介質(zhì)(例如病毒)的作用下間接施加的生理應(yīng)激。通常，與誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件特異性結(jié)合以激活轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子以無(wú)活性形式存在，然后通過(guò)誘導(dǎo)物直接或間接轉(zhuǎn)化為活性形式。誘導(dǎo)劑可以是化學(xué)試劑，例如蛋白質(zhì)，代謝物，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，除草劑或酚類化合物，或通過(guò)熱，冷，鹽或有毒元素直接施加的生理應(yīng)激，或通過(guò)病原體或疾病介質(zhì)(如病毒)的作用下間接施加的生理應(yīng)激。通常，與誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件特異性結(jié)合以激活轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)因子以無(wú)活性形式存在，然后通過(guò)誘導(dǎo)物直接或間接轉(zhuǎn)化為活性形式。誘導(dǎo)劑可以是化學(xué)劑，如蛋白質(zhì)，代謝物，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，除草劑或酚類化合物，或通過(guò)熱，冷，鹽或有毒元素直接施加，或經(jīng)由病原體或疾病介質(zhì)，如病毒的作用間接施加的生理應(yīng)激?？梢酝ㄟ^(guò)將誘導(dǎo)物外部施加于細(xì)胞或植物，如通過(guò)噴霧，澆水，加熱或類似方法，而將含有誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件的植物細(xì)胞暴露于誘導(dǎo)物。任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子均可以在本公開的實(shí)施方案中使用。參見Wardetal.,PlantMol.Biol.22:361-366(1993)。示例性誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括蛻皮激素受體啟動(dòng)子(美國(guó)專利No.6,504,082)；響應(yīng)銅的來(lái)自ACE1系統(tǒng)的啟動(dòng)子(Mettetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.90:4567-4571(1993))；響應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑的來(lái)自玉米的In2-1和In2-2基因(美國(guó)專利號(hào)5,364,780；Hersheyetal.,Mol.Gen.Genetics227:229-237(1991)和Gatzetal.,Mol.Gen.Genetics243:32-38(1994))；來(lái)自Tn10的Tet阻遏物(Gatzetal.,Mol.Gen.Genet.227:229-237(1991)；或來(lái)自類固醇激素基因的啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄活性由糖皮質(zhì)激素激發(fā)誘導(dǎo)，Schenaetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:10421(1991)和McNellisetal.,(1998)PlantJ.14(2):247-257；玉米GST啟動(dòng)子，其由用作萌發(fā)前除草劑的疏水性親電子化合物活化(參見美國(guó)專利號(hào)5,965,387和國(guó)際專利申請(qǐng)公開號(hào)WO93/001294)；和煙草PR-1a啟動(dòng)子，其由水楊酸活化(參見OnoS,KusamaM,OguraR,HiratsukaK.,“EvaluationoftheUseoftheTobaccoPR-1aPromotertoMonitorDefenseGeneExpressionbytheLuciferaseBioluminescenceReporterSystem,”BiosciBiotechnolBiochem.2011Sep23；75(9):1796-800)。感興趣的其它化學(xué)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子包括四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素抑制型啟動(dòng)子(參見，例如Gatzetal.,(1991)Mol.Gen.Genet.227:229-237，和美國(guó)專利號(hào)5,814,618和5,789,156)。感興趣的其它可調(diào)節(jié)啟動(dòng)子包括冷響應(yīng)性調(diào)節(jié)元件或熱休克調(diào)節(jié)元件，其轉(zhuǎn)錄可以分別響應(yīng)對(duì)冷或熱的暴露而實(shí)現(xiàn)(Takahashietal.,PlantPhysiol.99:383-390,1992)；醇脫氫酶基因的啟動(dòng)子(Gerlachetal.,PNASUSA79:2981-2985(1982)；Walkeretal.,PNAS84(19):6624-6628(1987))，可由厭氧條件誘導(dǎo)；和自豌豆rbcS基因或豌豆psaDb基因來(lái)源的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Yamamotoetal.,(1997)PlantJ.12(2):255-265)；光誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件(Feinbaumetal.,Mol.Gen.Genet.226:449,1991；Lam和Chua,Science248:471,1990；Matsuokaetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20):9586-9590；Orozcoetal.(1993)PlantMol.Bio.23(6):1129-1138)，植物激素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Yamaguchi-Shinozakietal.,PlantMol.Biol.15:905,1990；Karesetal.,PlantMol.Biol.15:225,1990)等等。誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)元件也可以是玉米In2-1或In2-2基因的啟動(dòng)子，其響應(yīng)苯磺酰胺除草劑安全劑(Hersheyetal.,Mol.Gen.Gene.227:229-237,1991；Gatzetal.,Mol.Gen.Genet.243:32-38,1994)，和轉(zhuǎn)座子Tn10的Tet阻抑物(Gatzetal.,Mol.Gen.Genet.227:229-237,1991)。應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括鹽/水應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如P5CS(Zangetal.,(1997)PlantSciences129:81-89)；冷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如cor15a(Hajelaetal.,(1990)PlantPhysiol.93:1246-1252)，cor15b(Wilhelmetal.,(1993)PlantMolBiol23:1073-1077)，wsc1(Ouelletetal.,(1998)FEBSLett.423-324-328)，ci7(Kirchetal.,(1997)PlantMolBiol.33:897-909)，ci21A(Schneideretal.,(1997)PlantPhysiol.113:335-45)；干旱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如Trg-31(Chaudharyetal.,(1996)PlantMol.Biol.30:1247-57)，rd29(Kasugaetal.,(1999)NatureBiotechnology18:287-291)；滲透誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如Rab17(Vilardelletal.,(1991)PlantMol.Biol.17:985-93)和逆滲透蛋白(Raghothamaetal.,(1993)PlantMolBiol23:1117-28)；和熱誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如熱休克啟動(dòng)子(Barrosetal.,(1992)PlantMol.19:665-75；Marrsetal.,(1993)Dev.Genet.14:27-41)，smHSP(Watersetal.,(1996)J.ExperimentalBotany47:325-338)，和來(lái)自歐芹泛素啟動(dòng)子的熱休克誘導(dǎo)型元件(WO03/102198)。其它應(yīng)激誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括rip2(美國(guó)專利號(hào)5,332,808和美國(guó)公開號(hào)2003/0217393)和rd29a(Yamaguchi-Shinozakietal.,(1993)Mol.Gen.Genetics236:331-340)。某些啟動(dòng)子可由創(chuàng)傷誘導(dǎo)，包括土壤桿菌pMAS啟動(dòng)子(Guevara-Garciaetal.,(1993)PlantJ.4(3):495-505)和土壤桿菌ORF13啟動(dòng)子(Hansenetal.,(1997)Mol.Gen.Genet.254(3):337-343)?？梢岳媒M織優(yōu)選性啟動(dòng)子靶向特定植物組織內(nèi)的增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)。當(dāng)提及優(yōu)先表達(dá)時(shí)，是指在特定植物組織中比在其它植物組織中更高水平的表達(dá)。這些類型的啟動(dòng)子的例子包括種子優(yōu)選的表達(dá)，如由菜豆球蛋白啟動(dòng)子(Bustosetal.,(1989)ThePlantCellVol.1,839-853)，和玉米球蛋白-1基因(Belanger,etal.(1991)Genetics129:863-972)提供的表達(dá)。對(duì)于雙子葉植物，種子優(yōu)選性啟動(dòng)子包括但不限于豆類β-菜豆球蛋白，napin，β-伴大豆球蛋白，大豆凝集素，十字花科素(cruciferin)等。對(duì)于單子葉植物，種子優(yōu)選性啟動(dòng)子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白，22kDa玉米醇溶蛋白，27kDa玉米醇溶蛋白，γ-玉米醇溶蛋白，蠟質(zhì)蛋白(waxy)，皺縮蛋白1(shrunken1)，皺縮蛋白2，球蛋白1等。種子優(yōu)選性啟動(dòng)子還包括那些將大部分基因表達(dá)引導(dǎo)到種子內(nèi)的特定組織的啟動(dòng)子，例如，γ-玉米醇溶蛋白的胚乳優(yōu)選啟動(dòng)子，來(lái)自煙草的隱藏啟動(dòng)子(Fobertetal.,(1994)T-DNAtaggingofaseedcoat-specificcrypticpromoterintobacco.PlantJ.4:567-577)；來(lái)自玉米的P基因啟動(dòng)子(Chopraetal.,(1996)AllelesofthemaizePgenewithdistincttissuespecificitiesencodeMyb-homologousproteinswithC-terminalreplacements.PlantCell7:1149-1158,ErratuminPlantCell.1997,1:109)，來(lái)自玉米的球蛋白-1啟動(dòng)子(Belenger和Kriz(1991)MolecularbasisforAllelicPolymorphismofthemaizeGlobulin-1gene.Genetics129:863-972)，以及指導(dǎo)表達(dá)到玉米籽粒的種皮或外殼的啟動(dòng)子，例如果皮特異性谷氨酰胺合成酶啟動(dòng)子(Muhitchetal.,(2002)IsolationofaPromoterSequenceFromtheGlutamineSynthetase1-2GeneCapableofConferringTissue-SpecificGeneExpressioninTransgenicMaize.PlantScience163:865-872)。除了啟動(dòng)子之外，表達(dá)盒(其可以在例如載體中)通常含有轉(zhuǎn)錄單元或表達(dá)盒，其含有在宿主細(xì)胞(原核或真核)中表達(dá)核酸需要的所有其他元件。因此，典型的表達(dá)盒含有可操作地連接于編碼基因產(chǎn)物(例如蛋白質(zhì))的核酸序列的啟動(dòng)子。表達(dá)盒還可以包括根據(jù)本領(lǐng)域已知方法可操作地連接的別的元件：轉(zhuǎn)錄物的高效多聚腺苷酸化需要的信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止需要的信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、或翻譯終止需要的信號(hào)。另外，表達(dá)盒可以包括增強(qiáng)子和/或異源剪接信號(hào)。可以包括供體多核苷酸或載體的其它組分，這也取決于供體多核苷酸的意圖用途。例子包括選擇標(biāo)志物，靶向或調(diào)節(jié)序列，轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列，如優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列(參見美國(guó)專利號(hào)5,510,471)，穩(wěn)定化序列如RB7MAR(參見Thompson和Myatt,(1997)PlantMol.Biol.,34:687-692和國(guó)際專利公開號(hào)WO9727207)或前導(dǎo)序列，內(nèi)含子等。植物表達(dá)載體和報(bào)告基因的一般描述和例子可見于Gruber,etal.,“VectorsforPlantTransformation”收錄于MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glicketal編；CRCPresspp.89-119(1993)。合適的表達(dá)載體的選擇將取決于宿主和將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主中的方法。表達(dá)盒還將在感興趣的異源核苷酸序列的3’末端處包括在植物中有功能的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)。終止區(qū)可以是本公開的實(shí)施方案的啟動(dòng)子核苷酸序列所固有的，可以是感興趣的DNA序列所固有的，或者可以來(lái)源自其他來(lái)源。方便的終止區(qū)可獲自根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒，如章魚氨酸合酶和胭脂氨酸合酶(nos)終止區(qū)(Depickeretal.,Mol.andAppl.Genet.1:561-573(1982)和Shawetal.(1984)NucleicAcidsResearchvol.12,No.20pp7831-7846(nos))；還參見Guerineauetal.Mol.Gen.Genet.262:141-144(1991)；Proudfoot,Cell64:671-674(1991)；Sanfaconetal.GenesDev.5:141-149(1991)；Mogenetal.PlantCell2:1261-1272(1990)；Munroeetal.Gene91:151-158(1990)；Ballasetal.,NucleicAcidsRes.17:7891-7903(1989)；Joshietal.NucleicAcidRes.15:9627-9639(1987)。另外，表達(dá)盒可以含有5’前導(dǎo)序列。此類前導(dǎo)序列可以起到增強(qiáng)翻譯的作用。翻譯前導(dǎo)序列是本領(lǐng)域中已知的，并且舉例而言，包括細(xì)小核糖核酸病毒(picornavirus)前導(dǎo)，EMCV前導(dǎo)(腦心肌炎5’非編碼區(qū))，Elroy-Steinetal.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA86:6126-6130(1989)；馬鈴薯Y病毒組(potyvirus)前導(dǎo)，例如TEV前導(dǎo)(煙草蝕紋病毒)Carrington和FreedJournalofVirology,64:1590-1597(1990)，MDMV前導(dǎo)物(玉米矮花葉病毒)，Allisonetal.,Virology154:9-20(1986)；人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP)，Macejaketal.,Nature353:90-94(1991)；來(lái)自苜?；ㄈ~病毒的殼體蛋白mRNA(AMVRNA4)的非翻譯前導(dǎo)，Joblingetal.,Nature325:622-625(1987)；煙草花葉病毒前導(dǎo)(TMV)，Gallieetal.,(1989)MolecularBiologyofRNA，第237-256頁(yè)；和玉米褪綠斑駁病毒(maizechloroticmottlevirus)前導(dǎo)(MCMV)Lommeletal.,Virology81:382-385(1991)。還可參見Della-Cioppaetal.,PlantPhysiology84:965-968(1987)。表達(dá)盒構(gòu)建體還可以含有增強(qiáng)翻譯和/或mRNA穩(wěn)定性的序列，例如內(nèi)含子。一個(gè)例子是擬南芥的組蛋白H3.III變體的基因II的第一內(nèi)含子。Chaubetetal.,JournalofMolecularBiology,225:569-574(1992)。在期望表達(dá)盒表達(dá)的基因產(chǎn)物被引導(dǎo)到特定細(xì)胞器，特別是質(zhì)體，造粉體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或在細(xì)胞表面或細(xì)胞外分泌的情況下，表達(dá)盒可以進(jìn)一步包含轉(zhuǎn)運(yùn)肽的編碼序列。此類轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域中公知的，包括但不限于?；d體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽，RUBISCO的小亞基，植物EPSP合酶和向日葵(Helianthusannuus)(美國(guó)專利號(hào)5,510,417)，玉蜀黍Brittle-1葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(Nelsonetal.,PlantPhysiol117(4):1235-1252(1998)；Sullivanetal.,PlantCell3(12):1337-48；Sullivanetal.,Planta(1995)196(3):477-84；Sullivanetal.,J.Biol.Chem.(1992)267(26):18999-9004)等。此外，嵌合葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域中已知的，如優(yōu)化的轉(zhuǎn)運(yùn)肽(美國(guó)專利號(hào)5,510,471)。先前已經(jīng)在美國(guó)專利號(hào)5,717,084和美國(guó)專利號(hào)5,728,925中描述另外的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解可用于將產(chǎn)物表達(dá)到特定細(xì)胞器的許多選擇。例如，大麥α淀粉酶序列經(jīng)常用于將表達(dá)引導(dǎo)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Rogers,J.Biol.Chem.260:3731-3738(1985))。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以使用重組DNA技術(shù)操縱例如宿主細(xì)胞內(nèi)核酸分子的拷貝數(shù)、轉(zhuǎn)錄那些核酸分子的效力、翻譯所得的轉(zhuǎn)錄物的效率、和翻譯后修飾的效率，從而更好地控制轉(zhuǎn)染的核酸分子表達(dá)。另外，與天然啟動(dòng)子相比，可以遺傳工程改造啟動(dòng)子序列以提高表達(dá)水平?？捎糜诳刂坪怂岱肿颖磉_(dá)的重組技術(shù)包括但不限于：將核酸分子穩(wěn)定整合到一個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞染色體中，向質(zhì)粒添加載體穩(wěn)定性序列，取代或修飾轉(zhuǎn)錄控制信號(hào)(例如啟動(dòng)子，操縱子，增強(qiáng)子)，取代或修飾翻譯控制信號(hào)(例如，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，Shine-Dalgarno或Kozak序列)，修飾核酸分子使之對(duì)應(yīng)于宿主細(xì)胞的密碼子選擇，和刪除使轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定的序列。可以在轉(zhuǎn)化載體中包括用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或組織或植物部分或植物的報(bào)告基因或標(biāo)志物基因。選擇標(biāo)志物的例子包括賦予對(duì)抗代謝物，如除草劑或抗生素的抗性的那些，例如二氫葉酸還原酶，其賦予對(duì)甲氨蝶呤的抗性(Reiss,PlantPhysiol.(LifeSci.Adv.)13:143-149,1994；還可見HerreraEstrellaetal.,Nature303:209-213,(1983)；Meijeretal.,PlantMol.Biol.16:807-820,(1991))；新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，其賦予對(duì)新霉素、卡那霉素和巴龍霉素(paromycin)等氨基糖苷的抗性(Herrera-Estrella,EMBOJ.2:987-995,1983及Fraleyetal.,Proc.Natl.Acad.SciUSA80:4803(1983))，和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，其賦予對(duì)潮霉素的抗性(Marsh,Gene32:481-485,(1984)；另見Waldronetal.,PlantMol.Biol.5:103-108,(1985)；Zhijianetal.,PlantScience108:219-227,(1995))；trpB，其允許細(xì)胞利用吲哚代替色氨酸；hisD，其允許細(xì)胞利用組氨醇代替組氨酸(Hartman,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA85:8047,(1988))；甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶，其允許細(xì)胞利用甘露糖(國(guó)際專利申請(qǐng)?zhí)朩O94/20627)；鳥氨酸脫羧酶，其賦予對(duì)鳥氨酸脫羧酶抑制劑2(二氟甲基)-DL鳥氨酸的抗性(DFMO；McConlogue,1987,收錄于:CurrentCommunicationsinMolecularBiology,ColdSpringHarborLaboratoryed.)；和土曲霉(Aspergillusterreus)的脫氨酶，其賦予對(duì)殺稻瘟素S的抗性(Tamura,Biosci.Biotechnol.Biochem.59:2336-2338,(1995))。另外的選擇標(biāo)志物包括例如賦予咪唑啉酮或磺酰脲抗性的突變體乙酰乳酸合酶(Leeetal.,EMBOJ.7:1241-1248,(1988))，突變體psbA，其賦予對(duì)阿特拉嗪的抗性(Smedaetal.,PlantPhysiol.103:911-917,(1993))或突變?cè)策趸?參見美國(guó)專利號(hào)5,767,373)或賦予對(duì)除草劑例如草丁磷(glufosinate)的抗性的其它標(biāo)志物。合適的選擇標(biāo)志物基因的例子包括但不限于編碼對(duì)氯霉素(HerreraEstrellaetal.,EMBOJ.2:987-992,(1983))；鏈霉素(Jonesetal.,Mol.Gen.Genet.210:86-91,(1987))；壯觀霉素(Bretagne-Sagnardetal.,TransgenicRes.5:131-137,(1996))；博萊霉素(Hilleetal.,PlantMol.Biol.7:171-176,(1990))；磺酰胺(Guerineauetal.,PlantMol.Biol.15:127-136,(1990))；溴苯腈(bromoxynil)(Stalkeretal.,Science242:419-423,(1988))；草銨膦(glyphosate)(Shawetal.,Science233:478-481,(1986))；膦絲菌素(phosphinothricin)(DeBlocketal.,EMBOJ.6:2513-2518,(1987))等的抗性的基因。使用選擇性基因的一個(gè)選項(xiàng)是草丁磷抗性編碼DNA，并且在一個(gè)實(shí)施方案中可以是在木薯葉脈花葉病毒啟動(dòng)子控制下的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(pat)、玉米優(yōu)化的pat基因、或bar基因。這些基因賦予對(duì)雙丙氨膦(bialaphos)的抗性。參見，(參見Wohllebenetal.,(1988)Gene70:25-37)；Gordon-Kammetal.,PlantCell2:603；1990；Uchimiyaetal.,BioTechnology11:835,1993；Whiteetal.,Nucl.AcidsRes.18:1062,1990；Spenceretal.,Theor.Appl.Genet.79:625-631,1990；及Anzaietal.,Mol.Gen.Gen.219:492,1989)。pat基因的形式是玉米優(yōu)化的pat基因，記載于美國(guó)專利號(hào)6,096,947中。此外，可以采用便于鑒定含有編碼標(biāo)志物的多核苷酸的植物細(xì)胞的標(biāo)志物?？稍u(píng)分的或可篩選的標(biāo)志物，其中序列的存在產(chǎn)生可測(cè)量的產(chǎn)物并且可以在不破壞植物細(xì)胞的條件下產(chǎn)生產(chǎn)物，是有用的。實(shí)例包括β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，其編碼已知具有各種生色底物的酶(例如，美國(guó)專利號(hào)5,268,463和5,599,670)；氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(Jeffersonetal.TheEMBOJournal，第6卷，第13期，第3901-3907頁(yè))；和堿性磷酸酶。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用的標(biāo)志物是β-胡蘿卜素或維生素原A(Yeetal.,Science287:303-305-(2000))。該基因已經(jīng)用于增強(qiáng)稻的營(yíng)養(yǎng)，但在此情況下，它是用作可篩選標(biāo)志物，并且通過(guò)所提供的金色檢測(cè)與感興趣的基因連接的基因的存在。與該基因用于對(duì)植物的貢獻(xiàn)營(yíng)養(yǎng)的情況不同，用于標(biāo)記目的時(shí)，較少量的蛋白質(zhì)就足夠了。其它可篩選標(biāo)志物一般包括花色素苷/黃酮類基因(參見Taylor和Briggs,ThePlantCell(1990)2:115-127的討論)，包括例如R基因座基因，其編碼的產(chǎn)物調(diào)節(jié)植物組織中花色素苷產(chǎn)物(紅色)生成(Dellaportaetal.,于ChromosomeStructureandFunction,KluwerAcademicPublishers,Appels和Gustafson編,pp.263-282(1988))；控制黃酮類色素的生物合成的基因，如玉米C1基因(Kaoetal.,PlantCell(1996)8:1171-1179；Scheffleretal.,Mol.Gen.Genet.(1994)242:40-48)和玉米C2(Wienandetal.,Mol.Gen.Genet.(1986)203:202-207)；B基因(Chandleretal.,PlantCell(1989)1:1175-1183)，p1基因(Grotewoldetal.,Proc.Natl.Acad.SciUSA(1991)88:4587-4591；Grotewoldetal.,Cell(1994)76:543-553；Sidorenkoetal.,PlantMol.Biol.(1999)39:11-19)；青銅色基因座基因(bronzelocusgenes)(Ralstonetal.,Genetics(1988)119:185-197；Nashetal.,PlantCell(1990)2(11):1039-1049)等。合適的標(biāo)志物的其它例子包括青色熒光蛋白(CYP)基因(Bolteetal.,(2004)J.CellScience117:943-54和Katoetal.,(2002)PlantPhysiol129:913-42)，黃色熒光蛋白基因(來(lái)自Evrogen的PHIYFPTM；參見Bolteetal.,(2004)J.CellScience117:943-54)；lux基因，其編碼螢光素酶，所述螢光素酶的存在可以使用例如X射線膠片，閃爍計(jì)數(shù)，熒光分光光度法，低光攝像機(jī)，光子計(jì)數(shù)照相機(jī)或多孔發(fā)光測(cè)定法檢測(cè)(Teerietal.(1989)EMBOJ.8:343)；綠色熒光蛋白(GFP)基因(Sheenetal.,PlantJ.(1995)8(5):777-84)；和DsRed2，其中用標(biāo)志物基因轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞是紅色的，因此可目視選擇(Dietrichetal.,(2002)Biotechniques2(2):286-293)。另外的例子包括β-內(nèi)酰胺酶基因(Sutcliffe,Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.(1978)75:3737)，其編碼具有已知各種生色底物的酶(例如PADAC，生色頭孢菌素)；xylE基因(Zukowskyetal.,Proc.Nat'l.Acad.Sci.U.S.A.(1983)80:1101)，其編碼可以轉(zhuǎn)化生色兒茶酚的兒茶酚雙加氧酶；α淀粉酶基因(Ikutaetal.,Biotech.(1990)8:241)；和酪氨酸酶基因(Katzetal.,J.Gen.Microbiol.(1983)129:2703)，其編碼的酶能夠?qū)⒗野彼嵫趸蒁OPA和多巴醌，二者繼而縮合以形成可容易檢測(cè)的化合物黑色素。很明顯，許多此類標(biāo)記物可用并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在某些實(shí)施方案中，表達(dá)盒中的編碼基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因的核苷酸序列任選地可以與盒和/或植物中的另一感興趣的核苷酸序列組合。術(shù)語(yǔ)“感興趣的核苷酸序列”是指可以是轉(zhuǎn)錄的RNA分子以及編碼期望的多肽或蛋白質(zhì)的DNA分子的核酸分子(其也可以稱為多核苷酸)，但也可以指不構(gòu)成整個(gè)基因并且不一定編碼多肽或蛋白質(zhì)的核酸分子(例如啟動(dòng)子)。例如，在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因可以與另一種感興趣的核苷酸序列組合或“堆疊”，所述另一種感興趣的核苷酸序列提供對(duì)草甘膦或另一種除草劑的額外的抗性或耐受性，和/或提供對(duì)挑選的昆蟲或疾病的抗性和/或提供營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化，和/或改進(jìn)的農(nóng)藝學(xué)特性，和/或可用于飼料，食物，工業(yè)，藥物或其它用途的蛋白質(zhì)或其它產(chǎn)物。植物基因組內(nèi)兩個(gè)或更多個(gè)感興趣的核酸序列的“堆疊”可以例如通過(guò)使用兩個(gè)或更多個(gè)事件進(jìn)行常規(guī)植物育種、用含有感興趣的序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物、對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的再轉(zhuǎn)化、或通過(guò)同源重組靶向整合添加新性狀等來(lái)實(shí)現(xiàn)。此類感興趣的核苷酸序列包括但不限于下文提供的賦予(1)對(duì)有害生物或疾病的抗性，(2)對(duì)除草劑的抗性，和(3)增值性狀的基因或編碼序列的那些例子：1.賦予對(duì)有害生物或疾病的抗性的基因或編碼序列(例如iRNA)(A)植物疾病抗性基因。通常通過(guò)植物中的疾病抗性基因(R)的產(chǎn)物與病原體中相應(yīng)的無(wú)毒力(Avr)基因的產(chǎn)物之間的特異性相互作用來(lái)激活植物防御?？梢杂每寺〉目剐曰蜣D(zhuǎn)化植物品種以工程化改造對(duì)特定病原體菌株有抗性的植物。此類基因的例子包括：對(duì)黃枝孢霉(Cladosporiumfulvum)(Jonesetal.,1994Science266:789)有抗性的番茄Cf-9基因，編碼蛋白激酶的番茄Pto基因，用于對(duì)丁香假單胞桿菌番茄致病變種(Pseudomonassyringaepv.tomato)的抗性(Martinetal.,1993Science262:1432)和用于對(duì)丁香假單胞菌的抗性的擬南芥RSSP2基因(Mindrinosetal.,1994Cell78:1089)。(B)蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)蛋白，其衍生物或其上模擬的合成多肽，如Btδ-內(nèi)毒素基因的核苷酸序列(Geiseretal.,1986Gene48:109)和營(yíng)養(yǎng)型殺蟲(VIP)基因(參見例如Estruchetal.,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:5389-94)。此外，可以在ATCC保藏號(hào)40098，67136，31995和31998下從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville,Md.)購(gòu)買編碼δ-內(nèi)毒素基因的DNA分子。(C)凝集素，如幾種君子蘭(Cliviaminiata)甘露糖結(jié)合凝集素基因的核苷酸序列(VanDammeetal.,1994PlantMolec.Biol.24:825)。(D)維生素結(jié)合蛋白，如可用作針對(duì)昆蟲有害生物的殺幼蟲劑的親合素和親合素同系物。參見美國(guó)專利號(hào)5,659,026。(E)酶抑制劑，例如蛋白酶抑制劑或淀粉酶抑制劑。此類基因的例子包括稻半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Abeetal.,1987J.Biol.Chem.262:16793)，煙草蛋白酶抑制劑I(Huubetal.,1993PlantMolec.Biol.21:985)和α-淀粉酶抑制劑(Sumitanietal.,1993Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)。(F)昆蟲特異性激素或信息素，如脫皮素和保幼激素，其變體，基于其的模擬物，或其拮抗劑或激動(dòng)劑，例如克隆的保幼激素酯酶的桿狀病毒表達(dá)，保幼激素的滅活劑(Hammocketal.,1990Nature344:458)。(G)昆蟲特異性肽或神經(jīng)肽，其在表達(dá)時(shí)破壞受影響的有害生物的生理學(xué)(J.Biol.Chem.269:9)。此類基因的例子包括昆蟲利尿激素受體(Regan,1994)，太平洋碩蠊(Diplopterapunctata)中鑒定的allostatin(Pratt,1989)和昆蟲特異性麻痹性神經(jīng)毒素(美國(guó)專利號(hào)5,266,361)。(H)由蛇，黃蜂等自然生成的昆蟲特異性毒液，例如蝎子昆蟲毒性肽(Pang,(1992)Gene116:165)。(I)負(fù)責(zé)單萜，倍半萜，類固醇，異羥肟酸，苯丙素(phenylpropanoid)衍生物或另一種具有殺蟲活性的非蛋白質(zhì)分子的高度積累的酶。(J)參與生物活性分子的修飾(包括翻譯后修飾)的酶；例如糖酵解酶，蛋白水解酶，脂肪分解酶，核酸酶，環(huán)化酶，轉(zhuǎn)氨酶，酯酶，水解酶，磷酸酶，激酶，磷酸化酶，聚合酶，彈性蛋白酶，殼多糖酶和葡聚糖酶，無(wú)論是天然的還是合成的。此類基因的例子包括愈傷組織基因(PCT公開申請(qǐng)WO93/02197)，殼多糖酶編碼序列(其可例如從ATCC以保藏號(hào)3999637和67152獲得)，煙草鉤蟲殼多糖酶(Krameretal.,(1993)InsectMolec.Biol.23:691)和歐芹ubi4-2聚泛素基因(Kawallecketal.,(1993)PlantMolec.Biol.21:673)。(K)刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子。此類分子的例子包括綠豆鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Botellaetal.,(1994)PlantMolec.Biol.24:757)和玉米鈣調(diào)蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Griessetal.,(1994)PlantPhysiol.104:1467)。(L)疏水性力矩肽。參見美國(guó)專利號(hào)5,659,026和5,607,914；后者教導(dǎo)了賦予疾病抗性的合成抗微生物肽。(M)膜通透酶，通道形成物或通道阻斷劑，如殺菌肽-β裂解肽類似物(Jaynesetal.,(1993)PlantSci.89:43)，其使轉(zhuǎn)基因煙草植物對(duì)青枯假單胞菌(Pseudomonassolanacearum)有抗性。(N)病毒侵入性蛋白或由其來(lái)源的復(fù)合毒素。例如，轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中病毒殼體蛋白的積累賦予對(duì)病毒感染和/或由來(lái)源殼體蛋白基因的病毒以及相關(guān)病毒實(shí)現(xiàn)的疾病形成的疾病形成的抗性。已經(jīng)對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物賦予針對(duì)苜?；ㄈ~病毒，黃瓜花葉病毒，煙草條紋病毒，馬鈴薯病毒X，馬鈴薯病毒Y，煙草蝕紋病毒，煙草脆裂病毒和煙草花葉病毒的殼體蛋白介導(dǎo)的抗性。參見例如Beachyetal.,(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28:451。(O)昆蟲特異性抗體或由其來(lái)源的免疫毒素。因此，靶向昆蟲腸道中的關(guān)鍵代謝功能的抗體將滅活受影響的酶，殺死昆蟲。例如，Tayloretal.,(1994)Abstract#497,SeventhInt'l.SymposiumonMolecularPlant-MicrobeInteractions顯示經(jīng)由生成單鏈抗體片段在轉(zhuǎn)基因煙草中的酶失活。(P)病毒特異性抗體。參見例如Tavladorakietal.,(1993)Nature266:469，其顯示保護(hù)表達(dá)重組抗體基因的轉(zhuǎn)基因植物免受病毒攻擊。(Q)自然界中由病原體或寄生物生成的發(fā)育阻滯蛋白。因此，真菌內(nèi)切α-1,4-D聚半乳糖醛酸酶)通過(guò)溶解植物細(xì)胞壁同-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶(homo-α-1,4-D-galacturonase促進(jìn)真菌定殖和植物營(yíng)養(yǎng)物釋放(Lambetal.,(1992)Bio/Technology10:1436)。編碼豆多聚半乳糖醛酸內(nèi)切酶抑制蛋白的基因的克隆和表征由(Toubartetal.,(1992)PlantJ.2:367)描述。(R)由植物天然生成的發(fā)育阻遏蛋白，如對(duì)真菌疾病提供增強(qiáng)的抗性的大麥核糖體失活基因(Longemannetal.,(1992).Bio/Technology10:3305)。(S)RNA干擾，其中編碼RNA分子的DNA多核苷酸用于抑制靶基因的表達(dá)。在一個(gè)例子中，RNA分子是部分或完全雙鏈的，其觸發(fā)沉默反應(yīng)，導(dǎo)致dsRNA切割成小的干擾RNA，然后將其摻入到破壞同源mRNA的靶向復(fù)合物中。參見例如，F(xiàn)ireetal.,美國(guó)專利號(hào)6,506,559；Grahametal.,美國(guó)專利號(hào)6,573,099。2.賦予對(duì)除草劑的抗性的基因或編碼序列(A)編碼對(duì)抑制生長(zhǎng)點(diǎn)或分生組織的除草劑(如咪唑啉酮，磺酰苯胺或磺酰脲除草劑)的抗性或耐受性的基因。該類別中的示例性基因編碼突變體ALS酶(Leeetal.,(1988)EMBOJ.7:1241)，其也稱為AHAS酶(Mikietal.,(1990)Theor.Appl.Genet.80:449)。(B)一種或多種其它基因，其編碼對(duì)草甘膦(由突變體EPSP合酶和aroA基因或通過(guò)由基因如GAT(草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶)或GOX(草甘膦氧化酶)的代謝失活賦予)和其它膦酰基(phosphono)化合物，如草丁磷(pat和bar基因；DSM-2)，和芳氧基苯氧基丙酸和環(huán)己烷二酮(ACC酶抑制劑編碼基因)抗性或耐受性。參見例如美國(guó)專利號(hào)4,940,835，其公開了可以賦予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。編碼突變型aroA基因的DNA分子可以在ATCC保藏號(hào)39256下獲得，并且在美國(guó)專利號(hào)4,769,061中公開突變體基因的核苷酸序列。歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?333033和美國(guó)專利號(hào)4,975,374公開了賦予除草劑如L-膦絲菌素抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。在歐洲專利申請(qǐng)?zhí)?242246中提供了膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列。DeGreefetal.,(1989)Bio/Technology7:61描述了表達(dá)嵌合bar基因的轉(zhuǎn)基因植物的生成，所述嵌合bar基因編碼膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶活性。賦予對(duì)芳氧基苯氧基丙酸和環(huán)己二酮類(例如烯禾啶(sethoxydim)和吡氟氯禾靈)抗性的基因的例子是由Marshalletal.,(1992)Theor.Appl.Genet.83:435描述的Accl-S1，Accl-S2和Accl-S3基因。(C)編碼對(duì)抑制光合作用的除草劑例如三嗪(psbA和gs+基因)和芐腈(腈水解酶基因)的抗性或耐受性的基因。Przibillaetal.,(1991)PlantCell3:169描述了使用編碼突變體psbA基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化衣藻(Chlamydomonas)。腈水解酶基因的核苷酸序列公開于美國(guó)專利號(hào)4,810,648中，并且含有這些基因的DNA分子在ATCC保藏號(hào)53435,67441和67442下可獲得。Hayesetal.,(1992)Biochem.J.285:173描述了編碼谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的DNA的克隆和表達(dá)。(D)編碼對(duì)結(jié)合羥基苯丙酮酸雙加氧酶(HPPD)(催化其中對(duì)羥基苯丙酮酸(HPP)轉(zhuǎn)化成尿黑酸的反應(yīng)的酶)的除草劑的抗性或耐受性的基因。這包括除草劑如異惡唑(isoxazoles)(歐洲專利號(hào)418175，歐洲專利號(hào)470856，歐洲專利號(hào)487352，歐洲專利號(hào)527036，歐洲專利號(hào)560482，歐洲專利號(hào)682659，美國(guó)專利號(hào)5,424,276)，特別是異惡唑草酮(其是玉米的選擇性除草劑)，二酮腈(diketonitriles)(歐洲專利號(hào)496630，和歐洲專利號(hào)496631)，尤其是2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-環(huán)丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮，三酮(歐洲專利號(hào)625505，歐洲專利號(hào)625508，美國(guó)專利號(hào)5,506,195)，特別是磺草酮(sulcotrione)和吡唑啉鹽(pyrazolinates)。在植物中生成HPPD過(guò)多的基因可以提供對(duì)此類除草劑的耐受性或抗性，包括例如美國(guó)專利號(hào)6,268,549和6,245,968和美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)20030066102中描述的基因。(E)編碼對(duì)苯氧基生長(zhǎng)素除草劑，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性并且還可賦予對(duì)芳氧基苯氧基丙酸酯(AOPP)除草劑的抗性或耐受性的基因。此類基因的實(shí)例包括美國(guó)專利號(hào)7,838,733中描述的α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶(aad-1)基因。(F)編碼對(duì)苯氧基生長(zhǎng)素除草劑，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性并且還可賦予對(duì)吡啶氧基生長(zhǎng)素除草劑如氟草煙(fluroxypyr)或定草酯(triclopyr)的抗性或耐受性的基因。此類基因的例子包括WO2007/053482A2中描述的α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶基因(aad-12)。(G)編碼對(duì)麥草畏的抗性或耐受性的基因(參見例如美國(guó)專利公開號(hào)20030135879)。(H)提供對(duì)抑制原卟啉原氧化酶(PPO)的除草劑的抗性或耐受性的基因(參見美國(guó)專利號(hào)5,767,373)。(I)提供對(duì)結(jié)合光系統(tǒng)II反應(yīng)中心(PSII)的核心蛋白的尿素衍生物(例如敵草隆(diuron))除草劑和三嗪除草劑(例如阿特拉嗪(atrazine))的抗性或耐受性的基因(Brussianetal.,(1989)EMBOJ.1989,8(4):1237-1245。3.賦予或促成增值性狀的基因(A)經(jīng)修飾的脂肪酸代謝，例如通過(guò)用反義基因或硬脂酰-ACP去飽和酶轉(zhuǎn)化玉米或蕓苔屬(Brassica)以增加植物的硬脂酸含量(Knultzonetal.,(1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA89:2624。(B)降低的肌醇六磷酸含量。(1)肌醇六磷酸酶編碼基因如黑曲霉(Aspergillusniger)肌醇六磷酸酶基因(VanHartingsveldtetal.,(1993)Gene127:87)的引入增強(qiáng)肌醇六磷酸的分解，向經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物添加更多的游離磷酸鹽。(2)可以引入降低肌醇六磷酸含量的基因。在玉米中，例如，這可以通過(guò)克隆并然后重新引入與負(fù)責(zé)以低水平肌醇六磷酸為特征的玉米突變體的單個(gè)等位基因相關(guān)的DNA來(lái)完成(Raboyetal.,(1990)Maydica35:383)。(C)例如通過(guò)用編碼改變淀粉分枝模式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物而實(shí)現(xiàn)的經(jīng)修飾的碳水化合物組成。此類酶的例子包括粘液鏈球菌(Streptococcusmucus)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因(Shirozaetal.,(1988)J.Bacteriol.170:810)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(Steinmetzetal.,(1985)Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶(Penetal.,(1992)Bio/Technology10:292)，番茄轉(zhuǎn)化酶基因(Elliotetal.,(1993)，大麥淀粉酶基因(Sogaardetal.,(1993)J.Biol.Chem.268:22480)和玉米胚乳淀粉分支酶II(Fisheretal.,(1993)PlantPhysiol.102:10450)。位點(diǎn)特異性核酸酶在實(shí)施方案中，本文中描述的方法和組合物利用一種或多種位點(diǎn)特異性核酸酶。公開的方法包括將一種或多種編碼位點(diǎn)特異性核酸酶的多核苷酸遞送至自玉米小孢子來(lái)源的轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織。這些位點(diǎn)特異性核酸酶可以通過(guò)切割DNA或誘導(dǎo)DNA斷裂來(lái)修飾基因組DNA，所述DNA斷裂可以是雙鏈斷裂或單鏈斷裂。位點(diǎn)特異性核酸酶的實(shí)施方案包括TALEN、大范圍核酸酶、CRISPR核酸酶或鋅指核酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，在公開的方法中使用的位點(diǎn)特異性核酸酶是工程化(非天然存在的)TALEN核酸酶。參見例如美國(guó)專利公開號(hào)20110301073，通過(guò)提及將其全部?jī)?nèi)容并入本文。已知黃單胞菌屬(Xanthomonas)的植物病原性細(xì)菌在重要的作物植物中引起許多疾病。黃單胞菌的致病性取決于保守的III型分泌(T3S)系統(tǒng)，其將超過(guò)不同效應(yīng)物蛋白注射到植物細(xì)胞中。這些注射的蛋白質(zhì)之一是轉(zhuǎn)錄激活物樣(TALEN)效應(yīng)物，其可模擬植物轉(zhuǎn)錄激活物并操縱植物轉(zhuǎn)錄組(參見Kayetal(2007)Science318:648-651)。這些蛋白質(zhì)含有TAL效應(yīng)物DNA結(jié)合域和轉(zhuǎn)錄激活域。表征得最充分的TAL效應(yīng)物之一是來(lái)自野油菜黃單胞菌葉斑病致病株(Xanthomonascampestgrispv.Vesicatoria)(參見Bonasetal(1989)MolGenGenet218:127-136和WO2010079430)。TAL效應(yīng)物包含一個(gè)由串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成的中心化域，每個(gè)重復(fù)包含約34個(gè)氨基酸，其是這些蛋白質(zhì)的DNA結(jié)合特異性的關(guān)鍵。此外，它們含有核定位序列和酸性轉(zhuǎn)錄激活域(綜述參見SchornackS,etal(2006)JPlantPhysiol163(3):256-272)。在植物病原菌青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)青枯雷爾氏菌生物變型菌株GMI1000和生物變型4菌株RS1000中稱為brg11和hpx17的兩個(gè)基因與黃單胞菌的AvrBs3家族同源(參見Heueretal(2007)ApplandEnviroMicro73(13):4379-4384)。這些基因在核苷酸序列上彼此是98.9％相同的，但在hpx17的重復(fù)域中由于缺失1575bp而不同。然而，這兩種基因產(chǎn)物與黃單胞菌的AvrBs3家族蛋白具有小于40％的序列同一性。參見例如美國(guó)專利公開號(hào)20110301073，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)提及并入本文。這些TAL效應(yīng)物的特異性取決于串聯(lián)重復(fù)域的序列。在某些實(shí)施方案中，每個(gè)重復(fù)序列包含約102bp；并且重復(fù)通常彼此91-100％同源(Bonas等人，同上)。重復(fù)通常包括多態(tài)性，多態(tài)性通常位于位置12和13，并且在位置12和13處的高變雙殘基的身份與在TAL效應(yīng)物的靶序列中連續(xù)核苷酸的身份之間似乎存在一對(duì)一的對(duì)應(yīng)關(guān)系(參見Moscou和Bogdanove,(2009)Science326:1501及Bochetal(2009)Science326:1509-1512)。實(shí)驗(yàn)上，已經(jīng)確定這些TAL效應(yīng)物的DNA識(shí)別的天然代碼是這樣的：位置12和13處的HD序列導(dǎo)致與胞嘧啶(C)的結(jié)合，NG結(jié)合T，NI結(jié)合A，C，G或T，NN結(jié)合A或G，而ING結(jié)合T。已經(jīng)有人將這些DNA結(jié)合重復(fù)序列裝配成具有新的組合和數(shù)目的重復(fù)序列的蛋白質(zhì)，以制備能夠與新序列相互作用并激活植物細(xì)胞中的非內(nèi)源報(bào)告基因表達(dá)的人工轉(zhuǎn)錄因子(Boch等人，同上)。已經(jīng)有人將工程化的TAL蛋白連接到FokI切割半域以生成TAL效應(yīng)物域核酸酶融合物(TALEN)，在酵母報(bào)道分子測(cè)定法(基于質(zhì)粒的靶標(biāo))中顯示了活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以將本公開方法中使用的位點(diǎn)特異性核酸酶工程化改造為包括(非天然存在的)大范圍核酸酶(也稱為歸巢內(nèi)切核酸酶)。歸巢內(nèi)切核酸酶或大范圍核酸酶如I-SceI，I-CeuI，PI-PspI，PI-Sce，I-SceIV，I-CsmI，I-PanI，I-SceII，I-PpoI，I-SceIII，I-CreI，I-TevI，I-TevII和I-TevIII的識(shí)別序列是已知的。也參見美國(guó)專利號(hào)5,420,032；美國(guó)專利號(hào)6,833,252；Belfortetal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3379–303388；Dujonetal.(1989)Gene82:115–118；Perleretal.(1994)NucleicAcidsRes.22,11127；Jasin(1996)TrendsGenet.12:224–228；Gimbleetal.(1996)J.Mol.Biol.263:163–180；Argastetal.(1998)J.Mol.Biol.280:345–353和NewEnglandBiolabs目錄。此外，可以工程化改造歸巢內(nèi)切核酸酶和大范圍核酸酶的DNA結(jié)合特異性以結(jié)合非天然的靶位點(diǎn)。參見，例如Chevalieretal.(2002)Molec.Cell10:895-905；Epinatetal.(2003)NucleicAcidsRes.531:2952-2962；Ashworthetal.(2006)Nature441:656-659；Paquesetal.(2007)CurrentGeneTherapy7:49-66；美國(guó)專利公開號(hào)20070117128。歸巢內(nèi)切核酸酶和大范圍核酸酶的DNA結(jié)合域可以在整個(gè)核酸酶的背景中改變(即，使得核酸酶包括關(guān)聯(lián)切割域)或可以與異源切割域融合。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，在公開的方法中使用的位點(diǎn)特異性核酸酶是工程化(非天然存在的)CRISPR核酸酶。CRISPR(聚簇規(guī)定散布短回文重復(fù)(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats))/Cas(CRISPR關(guān)聯(lián))核酸酶系統(tǒng)是一種新近工程化的核酸酶系統(tǒng)，以一種可以用于基因組工程的細(xì)菌系統(tǒng)為基礎(chǔ)。它是基于許多細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的一部分。當(dāng)病毒或質(zhì)粒侵入細(xì)菌時(shí)，侵入者的DNA的片段通過(guò)“免疫”應(yīng)答轉(zhuǎn)化為CRISPRRNA(crRNA)。然后，此crRNA通過(guò)部分互補(bǔ)性區(qū)域與稱為tracrRNA的另一種類型的RNA結(jié)合，將Cas核酸酶(例如Cas9)引導(dǎo)至靶DNA中的與crRNA同源的區(qū)域，稱為“原間隔物(protospacer)”。Cas核酸酶在由包含在crRNA轉(zhuǎn)錄物內(nèi)的引導(dǎo)序列規(guī)定的位點(diǎn)處切割DNA，在DSB處生成平端。Cas9的位點(diǎn)特異性DNA識(shí)別和切割需要crRNA和tracrRNA兩者。此系統(tǒng)現(xiàn)在已經(jīng)被工程化，使得crRNA和tracrRNA可以組合成一個(gè)分子(“單引導(dǎo)RNA”)，并且單引導(dǎo)RNA的crRNA等同物可以被工程化改造以引導(dǎo)Cas9核酸酶靶向任何期望的序列(參見Jineketal(2012)Science337,p.816-821,Jineketal,(2013),eLife2:e00471，及DavidSegal,(2013)eLife2:e00563)。因此，可以工程化改造CRISPR/Cas系統(tǒng)以在基因組中的期望靶標(biāo)處生成雙鏈斷裂(DSB)，并且可以通過(guò)使用修復(fù)抑制劑影響DSB的修復(fù)，從而引起易錯(cuò)修復(fù)的增加。在某些實(shí)施方案中，Cas核酸酶可以是天然存在的Cas核酸酶的“功能性衍生物”。天然序列多肽的“功能性衍生物”是具有與天然序列多肽共同的質(zhì)量性生物學(xué)性質(zhì)的化合物?！肮δ苄匝苌铩卑ǖ幌抻谔烊恍蛄械钠魏吞烊恍蛄卸嚯募捌淦蔚难苌?，條件是它們具有與相應(yīng)的天然序列多肽共同的核酸酶活性。本文中考慮的核酸酶活性是功能性衍生物將DNA底物水解成片段的能力。術(shù)語(yǔ)“衍生物”涵蓋：多肽的氨基酸序列變體、共價(jià)修飾、和其融合物。Cas核酸酶或其核酸酶片段的合適衍生物包括但不限于：Cas蛋白或其核酸酶片段的突變體、融合物、共價(jià)修飾。Cas核酸酶或其功能衍生物可以從細(xì)胞獲得，或者可以化學(xué)合成、或者通過(guò)這兩種程序的組合合成。細(xì)胞可以是天然生成Cas核酸酶的細(xì)胞，也可以是天然生成Cas核酸酶、然后經(jīng)過(guò)遺傳工程化改造，從而以更高的表達(dá)水平生成內(nèi)源Cas蛋白或從外源導(dǎo)入的核酸生成Cas核酸酶的細(xì)胞，所述核酸編碼的Cas核酸酶與內(nèi)源Cas可以相同也可以不同。在一些情況下，細(xì)胞不天然生成Cas蛋白，而是被遺傳工程化改造以生成Cas核酸酶。通過(guò)用引導(dǎo)RNA共表達(dá)Cas核酸酶，將Cas核酸酶部署在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中(而且可推定在植物細(xì)胞內(nèi))。可以使用兩種引導(dǎo)RNA形式促進(jìn)Cas介導(dǎo)的基因組切割，如LeCong,F.,etal.,(2013)Science339(6121):819-823中公開的。在某些實(shí)施方案中，用于細(xì)胞基因組的體內(nèi)切割和/或靶向切割的一種或多種核酸酶的DNA結(jié)合域包含鋅指蛋白。在一些實(shí)施方案中，鋅指蛋白是非天然存在的，并且被工程化改造以結(jié)合選擇的靶位點(diǎn)。參見，例如Beerlietal.(2002)NatureBiotechnol.20:135-141；Paboetal.(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalanetal.(2001)NatureBiotechnol.19:656-660；Segaletal.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Chooetal.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美國(guó)專利No.6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；和美國(guó)專利公開號(hào)2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)提及并入本文。與天然存在的鋅指蛋白相比，經(jīng)工程化改造的鋅指結(jié)合域可以具有新的結(jié)合特異性。工程化方法包括但不限于合理設(shè)計(jì)和各種類型的選擇。合理設(shè)計(jì)包括例如使用包含三聯(lián)體(或四聯(lián)體)核苷酸序列和單個(gè)鋅指氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)，其中每個(gè)三聯(lián)體或四聯(lián)體核苷酸序列與結(jié)合特定三聯(lián)體或四聯(lián)體序列的鋅指的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列相關(guān)聯(lián)。參見例如美國(guó)專利號(hào)6,453,242和6,534,261，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)提及并入本文。靶位點(diǎn)的選擇；用于設(shè)計(jì)和構(gòu)建融合蛋白(和編碼它們的多核苷酸)的ZFP和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且在美國(guó)專利號(hào)6,140,0815；789,538；6,453,242；6,534,261；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；WO95/19431；WO96/06166；WO98/53057；WO98/54311；WO00/27878；WO01/60970WO01/88197；WO02/099084；WO98/53058；WO98/53059；WO98/53060；WO02/016536和WO03/016496中詳細(xì)描述。此外，可以使用任何合適的接頭序列將鋅指域和/或多指鋅指蛋白連接在一起，所述接頭序列包括例如長(zhǎng)度為5個(gè)或更多個(gè)氨基酸的接頭。對(duì)于長(zhǎng)度為6個(gè)或更多個(gè)氨基酸的示例性接頭序列，也參見美國(guó)專利號(hào)6,479,626；6,903,185；和7,153,949。本文中所述的蛋白質(zhì)可以包含蛋白質(zhì)的個(gè)別鋅指之間的合適接頭的任何組合。因此，在整合本文中公開的供體多核苷酸的方法中，位點(diǎn)特異性核酸酶包含特異性結(jié)合玉米基因組中期望插入供體DNA多核苷酸(其可以包含至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因)的基因座處的靶位點(diǎn)的DNA結(jié)合域。可以將任何合適的切割域與DNA結(jié)合域可操作連接以形成核酸酶融合蛋白。例如，已經(jīng)有人將ZFPDNA結(jié)合域與核酸酶域融合以創(chuàng)建ZFN，ZFN是一種功能性實(shí)體，能夠借助其工程化改造的(ZFP)DNA結(jié)合域識(shí)別其意圖的核酸靶標(biāo)，使得DNA在核酸酶活性的作用下在ZFP結(jié)合位點(diǎn)附近被切割。參見，例如，Kimetal.(1996)ProcNatlAcadSciUSA93(3):1156-1160。新近，ZFN已經(jīng)用于多種生物體中的基因組修飾。參見，例如，美國(guó)專利公開20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；和國(guó)際公開WO07/014275。同樣，TALENDNA結(jié)合域已經(jīng)與核酸酶域融合以創(chuàng)建TALEN。參見例如美國(guó)公開號(hào)20110301073。如上所述，切割域可以與DNA結(jié)合域是異源的，例如鋅指DNA結(jié)合域和來(lái)自不同核酸酶的切割域，或TALENDNA結(jié)合域和來(lái)自不同核酸酶的切割域，或大范圍核酸酶DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和來(lái)自不同核酸酶的切割域。異源切割域可以從任何內(nèi)切核酸酶或外切核酸酶獲得?？梢宰鳛榍懈钣騺?lái)源的示例性內(nèi)切核酸酶包括但不限于限制性內(nèi)切核酸酶和歸巢內(nèi)切核酸酶。參見例如2002-2003Catalogue,NewEnglandBiolabs,Beverly,MA；及Belfortetal.(1997)NucleicAcidsRes.25:3379-3388。切割DNA的其它酶是已知的(例如S1核酸酶；綠豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO內(nèi)切核酸酶；也參見Linn等人(編)Nucleases,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1993)。這些酶(或其功能片段)中的一種或多種可以用作切割域和切割半域的來(lái)源。類似地，切割半域可以來(lái)源于任何需要二聚化以產(chǎn)生切割活性核酸酶或其部分，如上文列舉的。通常，如果融合蛋白包含切割半域，則需要兩個(gè)融合蛋白用于切割?；蛘?，可以使用包含兩個(gè)切割半域的單一蛋白質(zhì)。兩個(gè)切割半域可以來(lái)源自相同的內(nèi)切核酸酶(或其功能片段)，或者，每個(gè)切割半域可以來(lái)源于不同的內(nèi)切核酸酶(或其功能片段)。此外，優(yōu)選地，兩個(gè)融合蛋白的靶位點(diǎn)具有這樣的相對(duì)排布，使得兩個(gè)融合蛋白與其各自靶位點(diǎn)的結(jié)合后，各切割半域彼此采取一定的空間取向，使得各切割半域能夠形成功能性切割域，例如通過(guò)二聚化。因此，在某些實(shí)施方案中，各靶位點(diǎn)的近緣相距5-8個(gè)核苷酸或15-18個(gè)核苷酸。然而，兩個(gè)靶位點(diǎn)之間可以插入任何整數(shù)數(shù)目的核苷酸或核苷酸對(duì)(例如，2至50個(gè)核苷酸對(duì)或更多)。通常，切割位點(diǎn)位于靶位點(diǎn)之間。限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)存在于許多物種中，并且能夠與DNA(在識(shí)別位點(diǎn))進(jìn)行序列特異性的結(jié)合，并在結(jié)合位點(diǎn)處或附近切割DNA。某些限制酶(例如IIS型)在與識(shí)別位點(diǎn)遠(yuǎn)離的位點(diǎn)切割DNA，并具有可分離的結(jié)合和切割域。例如，IIS型酶FokI催化DNA的雙鏈切割，在一條鏈上距其識(shí)別位點(diǎn)的9個(gè)核苷酸處切割，在另一條鏈上距其識(shí)別位點(diǎn)的13個(gè)核苷酸處切割。參見，例如，美國(guó)專利號(hào)5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Lietal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279；Lietal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768；Kimetal.(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887；Kimetal.(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白包含來(lái)自至少一種IIS型限制酶的切割域(或切割半域)和一個(gè)或多個(gè)鋅指結(jié)合域，其可以是，也可以不是經(jīng)工程化改造的。一種示例性IIS型限制酶(其切割域與結(jié)合域可分開)是FokI。這種酶是作為二聚體有活性的。Bitinaiteetal.,(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。因此，為了本公開的目的，認(rèn)為公開的融合蛋白中使用的FokI酶的部分是切割半域。因此，為了使用鋅指FokI融合物的靶向雙鏈切割和/或靶向替代細(xì)胞序列，可以使用兩個(gè)融合蛋白(分別包含一個(gè)FokI切割半域)來(lái)重建催化活性切割域?；蛘?，也可以使用含有鋅指結(jié)合域和兩個(gè)FokI切割半域的單個(gè)多肽分子。使用鋅指FokI融合物的靶向切割和靶向序列改變的參數(shù)在本公開內(nèi)容的其它地方提供。切割域或切割半域可以是蛋白質(zhì)中任何保留切割活性或保留多聚化(例如二聚化)形成功能性切割域的能力的部分。示例性的IIS型限制酶描述于國(guó)際專利申請(qǐng)公開WO07/014275中，其全部?jī)?nèi)容并入本文。別的限制酶也含有可分開的結(jié)合域和切割域，并且這些是本公開考慮到的。參見例如Robertsetal.(2003)NucleicAcidsRes.31:418-420。在某些實(shí)施方案中，切割域包含一個(gè)或多個(gè)可極大減少或阻止同二聚化的工程化切割半域(也稱為二聚化域突變體)，例如美國(guó)專利公開號(hào)20050064474；20060188987；20070305346和20080131962中公開的，所有這些的公開內(nèi)容通過(guò)提及以其整體并入本文。FokI的位置446，447，479，483，484，486，487，490，491，496，498，499，500，531，534，537，和538處的氨基酸殘基都是影響FokI切割半域的二聚化的靶標(biāo)。示例性的形成專性異二聚體的FokI的工程化切割半域包括這樣的成對(duì)切割半域，其中第一切割半域包括在FokI的位置490和538處的氨基酸殘基處的突變，并且第二切割半域包括在氨基酸殘基486和499處的突變。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，490處的突變用Lys(K)替換Glu(E)；538處的突變用Lys(K)替代Iso(I)；在486處的突變用Glu(E)替代Gln(Q)；并且位置499處的突變用Lys(K)替代Iso(I)。具體地，本文中描述的工程化切割半域是這樣制備的：在一個(gè)切割半域中突變位置490(E→K)和538(I→K)生成稱為“E490K:I538K”的工程化切割半域，并且在另一切割半域中突變位置486(Q→E)和499(I→L)以生成稱為“Q486E:I499L”的工程化切割半域。本文中描述的工程化切割半域是專性的異二聚體突變體，其中極大減少或者消除了異常切割。參見例如美國(guó)專利公開號(hào)2008/0131962，其公開內(nèi)容通過(guò)提及整體并入本文用于所有目的。在某些實(shí)施方案中，工程化的切割半域包含在位置486，499和496(相對(duì)于野生型FokI編號(hào))處的突變，例如用Glu(E)殘基替換位置486處的野生型Gln(Q)殘基，用Leu(L)殘基替換位置499處的野生型Iso(I)殘基，用Asp(D)或Glu(E)殘基替換位置496處的野生型Asn(N)殘基的突變(也分別稱為“ELD”和“ELE”域)。在其它實(shí)施方案中，工程化切割半域包含在位置490，538和537(相對(duì)于野生型FokI編號(hào))處的突變，例如在位置490處用Lys(K)替換野生型Glu(E)殘基，用Lys(K)殘基替換位置538處的野生型Iso(I)殘基和用Lys(K)殘基或Arg(R)殘基替換位置537處的野生型His(H)殘基(也分別稱為“KKK”和“KKR”域)。在其它實(shí)施方案中，工程化切割半域包含在位置490和537(相對(duì)于野生型FokI編號(hào))處的突變，例如用Lys(K)殘基替換位置490處的野生型Glu(E)殘基和用Lys(K)殘基或Arg(R)殘基替換位置537處的野生型His(H)殘基的突變(也分別稱為“KIK”和“KIR”域)。(參見美國(guó)專利公開號(hào)20110201055)。在其它實(shí)施方案中，工程化切割半域包含“Sharkey”和/或“Sharkey”突變(參見Guoetal,(2010)J.Mol.Biol.400(1):96-107)?？梢允褂萌魏魏线m的方法制備本文中描述的工程化切割半域，例如通過(guò)野生型切割半域(FokI)的定點(diǎn)誘變，如美國(guó)專利公開號(hào)20050064474；20080131962；和20110201055中描述的。或者，可以使用所謂的“分裂酶(split-enzyme)”技術(shù)(參見例如美國(guó)專利公開號(hào)20090068164)在核酸靶位點(diǎn)處在體內(nèi)裝配核酸酶。此類分裂酶的構(gòu)件可以在分別的表達(dá)構(gòu)建體上表達(dá)，或者可以連接在一個(gè)可讀框中，其中各個(gè)構(gòu)件例如通過(guò)自切割2A肽或IRES序列分開。構(gòu)件可以是單個(gè)鋅指結(jié)合域或大范圍核酸酶核酸結(jié)合域的域。可以在使用前篩選核酸酶的活性，例如在如WO2009/042163和20090068164中描述的基于酵母的染色體系統(tǒng)中?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的方法容易地設(shè)計(jì)核酸酶表達(dá)構(gòu)建體。參見例如美國(guó)專利公開20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；和國(guó)際公開WO07/014275。核酸酶的表達(dá)可以在組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。“靶標(biāo)”或“靶位點(diǎn)”或“靶定基因組基因座”或“基因組DNA靶區(qū)域”是限定核酸中會(huì)與結(jié)合分子(例如位點(diǎn)特異性核酸酶)結(jié)合的一部分的核酸序列，只要存在足夠的結(jié)合條件。在一個(gè)實(shí)施方案中，基因組基因座序列包括存在于染色體，附加體，細(xì)胞器基因組(例如線粒體，葉綠體)，人工染色體和細(xì)胞中存在的任何其它類型的核酸中的那些，如例如擴(kuò)增的序列，雙重微小染色體和內(nèi)源性或感染性細(xì)菌和病毒的基因組?；蚪M基因座序列可以是正常(即野生型)或突變體；突變體序列可以包括例如插入(例如，先前插入的外源多核苷酸)，缺失，易位，重排和/或點(diǎn)突變?；蚪M基因座序列還可以包含多種不同等位基因中的一種。本文中還描述了用于在基因組基因座內(nèi)插入供體DNA多核苷酸序列的方法作為本公開的實(shí)施方案。報(bào)告和觀察到的靶向基因組修飾的頻率表明，在植物內(nèi)對(duì)基因組基因座的靶向是相對(duì)低效的。此類方法的成功率低，部分是由于同源重組的效率差，以及供體DNA非特異性插入基因組中靶位點(diǎn)之外區(qū)域中的頻率高。本公開提供了用于鑒定被靶定的基因組基因座內(nèi)的供體DNA多核苷酸的方法。本文中公開了使用位點(diǎn)特異性核酸酶(例如，與切割域融合的工程化鋅指結(jié)合域)在細(xì)胞DNA中生成一個(gè)或多個(gè)靶向的雙鏈斷裂的方法。盡管公開的方法不依賴于特定的作用機(jī)制，但是已知細(xì)胞DNA中的雙鏈斷裂在切割位點(diǎn)附近刺激細(xì)胞修復(fù)機(jī)制增加數(shù)千倍，這樣的靶向切割為改變或替換(通過(guò)同源指導(dǎo)性修復(fù))基因組中幾乎任何位點(diǎn)的序列提供了條件。除了使用本文中描述的位點(diǎn)特異性核酸酶外，靶向替換(或插入)選定的基因組序列還需要導(dǎo)入供體DNA多核苷酸。可以在位點(diǎn)特異性核酸酶表達(dá)之前、同時(shí)、或之后將供體DNA多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中。供體DNA多核苷酸含有與基因組序列足夠的同源性以支持供體DNA多核苷酸和同源基因組序列之間的同源重組(或同源性指導(dǎo)修復(fù))。供體DNA多核苷酸和基因組基因座之間的約25，50，100，200，500，750，1,000，1,500，2,000個(gè)核苷酸或更多的序列同源性(或10和2,000個(gè)核苷酸或更多之間的任何整數(shù)值)將支持其間的同源重組。供體DNA多核苷酸序列的長(zhǎng)度范圍可以為10至5,000個(gè)核苷酸(或其間的核苷酸的任何整數(shù)值)或更長(zhǎng)。供體DNA多核苷酸序列不需要與其替換的基因組序列相同。例如，供體DNA多核苷酸的序列相對(duì)于基因組序列可以含有一個(gè)或多個(gè)單堿基改變，插入，缺失，倒位或重排，只要存在與染色體序列的足夠的同源性即可?；蛘撸wDNA多核苷酸序列可以含有由兩個(gè)同源性區(qū)域側(cè)翼的非同源序列。另外，供體DNA多核苷酸序列可以包含載體分子，載體分子含有不與細(xì)胞染色質(zhì)中感興趣的區(qū)域同源的序列。通常，供體DNA多核苷酸序列的同源區(qū)與期望重組的基因組基因座具有至少50％的序列同一性。在某些實(shí)施方案中，供體DNA多核苷酸序列在供體DNA多核苷酸和基因組基因座之間的25個(gè)或更多個(gè)，50個(gè)或更多個(gè)，100個(gè)或更多個(gè)，200個(gè)或更多個(gè)，300個(gè)或更多個(gè)，400個(gè)或更多個(gè)，500個(gè)或更多個(gè)，750個(gè)或更多個(gè)，1,000個(gè)或更多個(gè)，1500個(gè)或更多個(gè)，或2,000個(gè)或更多個(gè)具有序列同源性的核苷酸跨度里具有60％，70％，80％，85％，90％，95％，98％，99％或99.9％序列同一性。供體DNA多核苷酸分子可以含有兩個(gè)或更多個(gè)與細(xì)胞染色質(zhì)同源的不連續(xù)區(qū)域。例如，為了靶向插入通常不存在于感興趣的基因組區(qū)域中的轉(zhuǎn)基因序列，這樣的轉(zhuǎn)基因序列的側(cè)翼可以有與供體DNA多核苷酸中感興趣的基因組區(qū)域具有同源性的區(qū)域。在其它實(shí)施方案中，選定的基因組序列的靶向替換還需要通過(guò)非同源末端連接機(jī)制(NHEJ)在靶定的基因組基因座內(nèi)引入替換或供體DNA多核苷酸序列。隨后，供體鏈整合供體多核苷酸序列不需要用到同源臂。由于靶定的基因組基因座內(nèi)雙鏈斷裂，供體多核苷酸序列整合在染色體內(nèi)。NHEJ修復(fù)途徑提供了在基因組內(nèi)整合供體多核苷酸的另一種備選機(jī)制。參見WO2013169802，通過(guò)提及并入本文。供體多核苷酸可以是單鏈或雙鏈的DNA或RNA，并且可以以線性或環(huán)狀形式導(dǎo)入細(xì)胞中。如果以線性形式導(dǎo)入，那么可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法保護(hù)供體序列的末端(例如，免于核酸外切降解)。例如，將一個(gè)或多個(gè)雙脫氧核苷酸殘基添加到線性分子的3'末端和/或?qū)⒆陨砘パa(bǔ)的寡核苷酸連接到一個(gè)或兩個(gè)末端。參見，例如，Changetal.,(1987)Proc.NatlAcad.Sd.USA84:4959-4963；Nehlsetal.,(1996)Science272:886-889。用于保護(hù)外源多核苷酸免于降解的其它方法包括但不限于添加末端氨基基團(tuán)和使用經(jīng)修飾的核苷酸間連接，如例如硫代磷酸酯，氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脫氧核糖殘基。供體DNA多核苷酸可以以具有額外序列(如例如復(fù)制起點(diǎn)，啟動(dòng)子和編碼抗生素抗性的基因)的載體分子的一部分的形式導(dǎo)入細(xì)胞中。此外，供體DNA多核苷酸可以作為裸核酸，以與諸如脂質(zhì)體或泊洛沙姆(poloxamer)的試劑復(fù)合的核酸導(dǎo)入，或者可以通過(guò)細(xì)菌或病毒(例如土壤桿菌屬物種，根瘤菌屬物種NGR234，苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizoboiummeliloti)，百脈根中間根瘤菌(Mesorhizobiumloti)，煙草花葉病毒，馬鈴薯病毒X，花椰菜花葉病毒和木薯葉脈花葉病毒遞送。參見例如Chungetal.(2006)TrendsPlantSd.11(1):1-4)。在另外的實(shí)施方案中，可以通過(guò)如本文中描述的微粒轟擊轉(zhuǎn)化方法將供體DNA多核苷酸導(dǎo)入細(xì)胞中(例如，在雄激素愈傷組織中)。申請(qǐng)人的方法可以將工程化ZFP的強(qiáng)大的靶向能力與切割域(或切割半域)結(jié)合，以將雙鏈斷裂特異性地靶向到基因組中期望插入外源序列的區(qū)域。盡管對(duì)申請(qǐng)人的方法而言并非必需，但似乎在細(xì)胞序列中雙鏈斷裂的存在，連同與鄰近或圍繞斷裂的區(qū)域具有同源性的外源DNA分子的存在，可激活修復(fù)斷裂的細(xì)胞機(jī)制；所述細(xì)胞基質(zhì)通過(guò)將序列信息從供體分子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞(例如，基因組或染色體)序列中，即通過(guò)同源性指導(dǎo)的修復(fù)(又稱“基因轉(zhuǎn)換”)的過(guò)程，修復(fù)斷裂。為了改變?nèi)旧w序列，不必復(fù)制供體的整個(gè)序列到染色體中，只要足夠的供體序列被復(fù)制以實(shí)現(xiàn)期望的序列改變即可。通過(guò)同源重組插入供體序列的效率與細(xì)胞DNA中雙鏈斷裂和期望重組的位點(diǎn)之間的距離成反比。當(dāng)雙鏈斷裂更接近需要重組的位點(diǎn)時(shí)，通常觀察到更高的同源重組效率。在不需要精確的重組位點(diǎn)的情況下(例如，期望的重組事件可以一段基因組序列內(nèi)發(fā)生)，可以選擇供體核酸的長(zhǎng)度和序列以及切割位點(diǎn)以獲得期望的重組事件。在期望的事件被設(shè)計(jì)為改變基因組序列中單個(gè)核苷酸的序列的情況下，在該核苷酸的任一側(cè)的10,000個(gè)核苷酸內(nèi)切割細(xì)胞染色質(zhì)。例如，切割可發(fā)生在該核苷酸任一側(cè)的2到1,000個(gè)核苷酸之間的任何整數(shù)值內(nèi)。在某些例子中，在基因組序列中改變的核苷酸的任一側(cè)的1,000，500，200，100，90，80，70，60，50，40，30，20，10，5，或2個(gè)核苷酸內(nèi)發(fā)生切割。如上文詳述的，兩個(gè)分別包含鋅指結(jié)合域和切割半域的融合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)可以相距5-8或15-18個(gè)核苷酸，自每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的最接近另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的邊緣處測(cè)量，切割在結(jié)合位點(diǎn)之間發(fā)生。是否在結(jié)合位點(diǎn)之間的單個(gè)位點(diǎn)或在多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生切割是無(wú)關(guān)緊要的，因?yàn)榍懈畹幕蚪M序列會(huì)被供體序列替代。因此，為了通過(guò)靶向重組高效地改變單個(gè)核苷酸對(duì)的序列，結(jié)合位點(diǎn)之間的區(qū)域的中點(diǎn)在距該核苷酸對(duì)的10,000個(gè)核苷酸內(nèi)，優(yōu)選在1,000個(gè)核苷酸，或500個(gè)核苷酸，或200個(gè)核苷酸，或100核苷酸，或50個(gè)核苷酸，或20個(gè)核苷酸，或10個(gè)核苷酸，或5個(gè)核苷酸，或2個(gè)核苷酸，或1個(gè)核苷酸內(nèi)，或在感興趣的核苷酸對(duì)處。在某些實(shí)施方案中，同源染色體可以充當(dāng)供體DNA多核苷酸。因此，例如，雜合子中的突變的校正可以通過(guò)工程化改造融合蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述融合蛋白結(jié)合并切割一條染色體上的突變體序列，但不切割同源染色體上的野生型序列。帶有突變的染色體上的雙鏈斷裂刺激基于同源性的“基因轉(zhuǎn)換”過(guò)程，其中來(lái)自同源染色體的野生型序列被復(fù)制到切割的染色體中，從而恢復(fù)野生型序列的兩個(gè)拷貝。還提供了可以增強(qiáng)靶向重組水平的方法和組合物，包括但不限于使用另外的ZFP功能性域融合物來(lái)激活參與同源重組的基因的表達(dá)，如例如，RAD52上位性組的成員(例如，Rad50，Rad51，Rad51B，RadSIC，RadSID，Rad52，Rad54，Rad54B，Mrell，XRCC2，XRCC3)，其產(chǎn)物與上述基因產(chǎn)物相互作用的基因(例如BRCA1，BRCA2)和/或在NBS1復(fù)合物中的基因。參見，例如Boykoetal.(2006)PlantPhysiology141:488-497和LaFargeetal.(2003)NucleicAcidsRes31(4):1148—1155。類似地，可以使用與本文中公開的方法和組合物組合的ZFP功能域融合抑制參與非同源末端連接的基因的表達(dá)(例如，Ku70/80，XRCC4，聚(ADP核糖)聚合酶，DNA連接酶4)。參見，例如，Rihaetal.(2002)EMBO21:2819-2826；Freisneretal.(2003)PlantJ.34:427-440；Chenetal.(1994)EuropeanJournalofBiochemistry224:135-142。使用鋅指結(jié)合域和功能域之間的融合來(lái)激活和抑制基因表達(dá)的方法公開于例如，與本申請(qǐng)具有共同擁有者的美國(guó)專利6,534,261；6,824,978和6,933,113中。另外的抑制方法包括使用靶向待抑制的基因序列的反義寡核苷酸和/或小干擾RNA(siRNA或RNAi)。檢測(cè)測(cè)定法在某些實(shí)施方案中，本公開涉及一種方法，其包括確認(rèn)基因組DNA的修飾，如靶玉米基因組的切割、供體DNA多核苷酸在靶玉米基因組內(nèi)的整合、或摻入靶玉米基因組內(nèi)的突變。在某些實(shí)施方案中，確認(rèn)基因組的此類修飾的方法包括通過(guò)基于PCR的測(cè)定法、Southern印跡測(cè)定法、Northern印跡測(cè)定法、蛋白質(zhì)表達(dá)測(cè)定法、Western印跡測(cè)定法、ELISA測(cè)定法或下一代測(cè)序測(cè)定法來(lái)確認(rèn)。因此，可以以多種方式，包括使用序列的引物或探針，確認(rèn)基因組中的基因組DNA的修飾，如基因組中的切割、整合的轉(zhuǎn)基因或突變。在某些實(shí)施方案中，穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因可以基于轉(zhuǎn)基因在植物的一些組織中或在某些發(fā)育階段的組成性或選擇性表達(dá)來(lái)檢測(cè)，或者轉(zhuǎn)基因可以基本上沿著其整個(gè)生命周期在基本上所有植物組織中表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)任何合適的擴(kuò)增方法實(shí)施靶向基因組修飾，整合的轉(zhuǎn)基因或突變的確認(rèn)。一般參見Kwohetal.,Am.Biotechnol.Lab.8,14-25(1990)。合適的擴(kuò)增技術(shù)的例子包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，鏈置換擴(kuò)增(一般參見G.Walkeretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89,392-396(1992)；G.Walkeretal.,NucleicAcidsRes.20,1691-1696(1992))，基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增(參見D.Kwohetal.,Proc.Natl.AcadSci.USA86,1173-1177(1989))，自身持續(xù)性序列復(fù)制(或“3SR”)(參見J.Guatellietal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA87,1874-1878(1990))，Qβ復(fù)制酶系統(tǒng)(參見P.Lizardietal.,BioTechnology6,1197-1202(1988))，基于核酸序列的擴(kuò)增(或“NASBA”)(參見R.Lewis,GeneticEngineeringNews12(9),1(1992))，修復(fù)鏈反應(yīng)(或“RCR”)(參見R.Lewis,見上文)，和飛鏢DNA擴(kuò)增(boomerangDNAamplification)(或“BDA”)(參見R.Lewis,見上文)。一般優(yōu)選聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)?！皵U(kuò)增”是核酸復(fù)制的一種特殊情形，涉及模板的特異性。它與非特異性模板復(fù)制(即，模板依賴性但不依賴于特定模板的復(fù)制)形成對(duì)比。模板特異性在這里區(qū)別于復(fù)制的保真性(即正確的多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖或脫氧核糖)的特異性。模板特異性通常用“靶”特異性為度量來(lái)描述。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”和“PCR”通常是指在不克隆或純化的情況下增加基因組DNA混合物中靶序列的區(qū)段的濃度的方法(美國(guó)專利號(hào)4,683,195；4,683,202；和4,965,188；通過(guò)提及并入本文)。用于擴(kuò)增靶序列的此方法包括將過(guò)量的兩種寡核苷酸引物引入含有期望的靶序列的DNA混合物，接著是在DNA聚合酶存在下的精確的熱循環(huán)序列。這兩個(gè)引物與它們各自的雙鏈靶序列的鏈互補(bǔ)。為了實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，使混合物變性，然后將引物退火至其在靶分子內(nèi)的互補(bǔ)序列。退火后，用聚合酶延伸引物以形成新的互補(bǔ)鏈對(duì)。變性，引物退火和聚合酶延伸的步驟可以重復(fù)許多次(即，變性，退火和延伸構(gòu)成一個(gè)“循環(huán)”；可以有許多“循環(huán)”)，以獲得高濃度的期望的靶序列的擴(kuò)增區(qū)段。期望的靶序列的擴(kuò)增區(qū)段的長(zhǎng)度由引物相對(duì)于彼此的相對(duì)位置確定，因此，此長(zhǎng)度是可控參數(shù)。憑借方法的重復(fù)方面，該方法被稱為“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”(下文為“PCR”)。由于靶序列的期望的擴(kuò)增區(qū)段變?yōu)榛旌衔镏械闹饕蛄?就濃度而言)，它們被說(shuō)成是“PCR擴(kuò)增的”。術(shù)語(yǔ)“逆轉(zhuǎn)錄酶”或“RT-PCR”是指一種類型的PCR，其中起始材料是mRNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶將起始mRNA酶促轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA或“cDNA”。然后將cDNA用作“PCR”反應(yīng)的“模板”。在一個(gè)實(shí)施方案中，量化擴(kuò)增反應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，使用標(biāo)簽概況(signatureprofile)定量擴(kuò)增反應(yīng)，其中標(biāo)簽概況從包括解鏈溫度和熒光標(biāo)記概況的組中選擇。本公開的實(shí)施方案的核酸分子或其區(qū)段可以用作PCR擴(kuò)增的引物。在實(shí)施PCR擴(kuò)增中，在引物和模板之間可以容許一定程度的錯(cuò)配。因此，示例性引物的突變，缺失和插入(特別是5’或3’末端的核苷酸的添加)落入本公開的范圍內(nèi)?？梢酝ㄟ^(guò)普通技術(shù)人員已知的方法在給定引物中生成突變，插入和缺失。已經(jīng)描述了用于序列檢測(cè)的分子信標(biāo)。簡(jiǎn)言之，設(shè)計(jì)與側(cè)翼基因組和插入DNA接合部重疊的FRET寡核苷酸探針。FRET探針的獨(dú)特結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其含有一種二級(jí)結(jié)構(gòu)，該二級(jí)結(jié)構(gòu)將熒光和淬滅部分保持得非常接近。在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTP的存在下循環(huán)FRET探針和PCR引物(一個(gè)引物在插入的DNA序列中，一個(gè)引物在側(cè)翼基因組序列中)。在成功的PCR擴(kuò)增后，F(xiàn)RET探針與靶序列的雜交導(dǎo)致探針二級(jí)結(jié)構(gòu)去除，而熒光和淬滅部分在空間上分離。由于成功的擴(kuò)增和雜交，熒光信號(hào)指示側(cè)翼基因組/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。此類用于檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的分子信標(biāo)測(cè)定法是本公開的實(shí)施方案。水解探針測(cè)定法，又稱為(LifeTechnologies,FosterCity,Calif.)，是一種檢測(cè)和量化DNA序列存在的方法。簡(jiǎn)言之，設(shè)計(jì)FRET寡核苷酸探針，其中一個(gè)寡聚物在轉(zhuǎn)基因內(nèi)，并且一個(gè)在側(cè)翼基因組序列中用于事件特異性檢測(cè)。在熱穩(wěn)定聚合酶和dNTP的存在下循環(huán)FRET探針和PCR引物(一個(gè)引物在插入的DNA序列中，一個(gè)引物在側(cè)翼基因組序列中)。FRET探針的雜交導(dǎo)致熒光部分從FRET探針上的淬滅部分切割下來(lái)并釋放出來(lái)。由于成功的擴(kuò)增和雜交，熒光信號(hào)指示側(cè)翼/轉(zhuǎn)基因插入序列的存在。此類用于檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的水解探針測(cè)定法是本公開的實(shí)施方案。KASPar測(cè)定法是一種檢測(cè)和定量DNA序列的存在的方法。簡(jiǎn)言之，使用稱為測(cè)定系統(tǒng)的基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的測(cè)定法篩選包含靶定基因組基因座的基因組DNA樣品。在本公開的實(shí)踐中使用的測(cè)定法可以利用含有多種引物的PCR測(cè)定混合物。在PCR測(cè)定混合物中使用的引物可以包含至少一個(gè)正向引物和至少一個(gè)反向引物。正向引物含有對(duì)應(yīng)于供體DNA多核苷酸的特定區(qū)域的序列，并且反向引物含有對(duì)應(yīng)于基因組序列的特定區(qū)域的序列。此外，PCR測(cè)定混合物中使用的引物可以包含至少一個(gè)正向引物和至少一個(gè)反向引物。例如，PCR測(cè)定混合物可以使用對(duì)應(yīng)于兩個(gè)不同等位基因的兩個(gè)正向引物和一個(gè)反向引物。正向引物之一含有對(duì)應(yīng)于內(nèi)源基因組序列的特定區(qū)域的序列。第二正向引物包含對(duì)應(yīng)于供體DNA多核苷酸的特定區(qū)域的序列。反向引物含有對(duì)應(yīng)于基因組序列的特定區(qū)域的序列。用于檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的此類測(cè)定法是本公開的實(shí)施方案。在一些實(shí)施方案中，熒光信號(hào)或熒光染料選自HEX熒光染料，F(xiàn)AM熒光染料，JOE熒光染料，TET熒光染料，Cy3熒光染料，Cy3.5熒光染料，Cy5熒光染料，Cy5.5熒光染料，Cy7熒光染料和ROX熒光染料。在其它實(shí)施方案中，使用合適的第二熒光DNA染料運(yùn)行擴(kuò)增反應(yīng)，所述第二熒光DNA染料能夠以可被流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)的濃度范圍染色細(xì)胞DNA，并且具有可通過(guò)實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀檢測(cè)的熒光發(fā)射譜。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，其它核酸染料是已知的并且不斷被鑒定出來(lái)?？梢圆捎萌魏尉哂泻线m的激發(fā)和發(fā)射譜的合適的核酸染料，如SYTOXSYBRGreen和在一個(gè)實(shí)施方案中，第二熒光DNA染料是以小于10μM，小于4μM或小于2.7μM使用的在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以利用下一代測(cè)序(NGS)確認(rèn)基因組修飾。如Brautigma等人，2010所述，DNA序列分析可以用于測(cè)定分離和擴(kuò)增的片段的核苷酸序列。可以分離擴(kuò)增的片段并亞克隆到載體中，并使用鏈終止法(也稱為Sanger測(cè)序)或染料終止劑測(cè)序來(lái)測(cè)序。此外，可以用下一代測(cè)序?qū)U(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序。NGS技術(shù)不需要亞克隆步驟，并且可以在單個(gè)反應(yīng)中完成多個(gè)測(cè)序讀取。有三種NGS平臺(tái)已商品化，來(lái)自454LifeSciences/Roche的GenomeSequencerFLX，來(lái)自Solexa的IlluminaGenomeSequencer和AppliedBiosystems的SOLiD(首字母縮寫詞，代表：“寡聚物連接和檢測(cè)測(cè)序(SequencingbyOligoLigationandDetection)”)。此外，目前正在開發(fā)兩種單分子測(cè)序方法。這些包括來(lái)自HelicosBioscience的真實(shí)單分子測(cè)序(tSMS)和來(lái)自PacificBiosciences的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序(SMRT)。由454LifeSciences/Roche推出的GenomeSequencerFLX是長(zhǎng)讀段NGS，其使用乳液PCR和焦磷酸測(cè)序來(lái)生成測(cè)序讀段?？梢允褂?00-800bp的DNA片段或含有3-20kbp片段的文庫(kù)。反應(yīng)每次運(yùn)行可以生成超過(guò)100萬(wàn)個(gè)約250至400個(gè)堿基的讀段，總產(chǎn)量為250至400兆堿基。與其它NGS技術(shù)相比，此技術(shù)生成的讀段最長(zhǎng)，但每次運(yùn)行的總序列輸出較低。由Solexa推出的Illumina基因組分析儀是一種短讀段NGS，其利用熒光染料標(biāo)記的可逆終止劑核苷酸邊合成邊測(cè)序，并且以固相橋式PCR為基礎(chǔ)?？梢允褂煤懈哌_(dá)10kb的DNA片段的配對(duì)末端測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。反應(yīng)生成長(zhǎng)度為35-76個(gè)堿基的超過(guò)1億個(gè)短讀段。此數(shù)據(jù)可以每次運(yùn)行生成3-6千兆堿基。由AppliedBiosystems推出的寡聚物連接和檢測(cè)測(cè)序(SOLiD)系統(tǒng)是一種短讀段技術(shù)。此NGS技術(shù)使用長(zhǎng)度最多可達(dá)10kbp的片段化雙鏈DNA。該系統(tǒng)使用通過(guò)染料標(biāo)記的寡核苷酸引物的連接和乳液PCR測(cè)序以生成10億個(gè)短讀段，其導(dǎo)致每次運(yùn)行高達(dá)30千兆堿基的總序列輸出。HelicosBioscience的tSMS和PacificBiosciences的SMRT應(yīng)用使用單個(gè)DNA分子進(jìn)行序列反應(yīng)的不同方法。tSMSHelicos系統(tǒng)生成高達(dá)8億個(gè)短讀段，每次運(yùn)行導(dǎo)致21千兆堿基。這些反應(yīng)使用熒光染料標(biāo)記的虛擬終止劑核苷酸完成，其被描述為“邊合成邊測(cè)序”方法。由PacificBiosciences銷售的SMRT下一代測(cè)序系統(tǒng)使用通過(guò)合成的實(shí)時(shí)測(cè)序。由于不受可逆終止劑限制，此技術(shù)可以生成長(zhǎng)度高達(dá)1000bp的讀段。使用此技術(shù)每天可以生成相當(dāng)于二倍體人類基因組的一倍覆蓋度的原始讀取通量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用印跡法測(cè)定法完成基因組修飾的確認(rèn)，包括Western印跡，Northern印跡和Southern印跡。此類印跡法測(cè)定法是用于生物樣品的鑒定和量化的生物研究中常用的技術(shù)。這些測(cè)定法包括首先通過(guò)電泳手段分離凝膠中的樣品組分，接著將電泳分離的組分從凝膠轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移膜，諸如用硝化纖維，聚偏二氟乙烯(PVDF)或尼龍的材料制成的轉(zhuǎn)移膜。分析物也可以直接點(diǎn)樣在這些支持物上，或通過(guò)施加真空，毛細(xì)管作用或壓力而定向到支持物上的特定區(qū)域，而不需要在先分離。然后通常對(duì)轉(zhuǎn)移膜進(jìn)行轉(zhuǎn)移后處理，以增強(qiáng)分析物彼此區(qū)分的能力，和通過(guò)檢視或通過(guò)自動(dòng)讀取器檢測(cè)的能力。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可以使用ELISA測(cè)定法來(lái)完成基因組修飾的確認(rèn)，所述ELISA測(cè)定法使用固相酶免疫測(cè)定法檢測(cè)液體樣品或濕樣品中物質(zhì)(通常是抗原)的存在。將來(lái)自樣品的抗原附著于平板的表面。然后，將另外的特異性抗體施加在表面上，使得其可以結(jié)合所述抗原。此抗體是與酶連接的，并且在最后的步驟中，添加含有酶底物的物質(zhì)。隨后的反應(yīng)生成可檢測(cè)的信號(hào)，最常見的是底物中的顏色變化。將轉(zhuǎn)基因漸滲入后代植物中本公開提供了用于將包含轉(zhuǎn)基因的供體多核苷酸從雄性愈傷組織來(lái)源的雙單倍體植物漸滲入后代植物中的方法。本文中描述了雙單倍體植物的生成，包括就轉(zhuǎn)基因而言為純合的雙單倍體植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括以下步驟：i)將雌性親本植物與雄性親本植物雜交，其中所述雄性親本植物是雙單倍體植物，并且其中所述雌性親本植物是能育的親本植物；ii)從(a)的雜交收獲后代種子；iii)種植后代種子；并且iv)種植所述后代種子，其中所述后代種子包含含有所述轉(zhuǎn)基因的供體多核苷酸。在該方法的某些實(shí)施方案中，雌性和雄性親本植物是玉米植物。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，雌性親本植物是良種玉米植物。此類生成后代種子的雜交可以使用常規(guī)植物育種技術(shù)完成。關(guān)于植物育種技術(shù)的討論，參見Poehlman(1995)BreedingFieldCrops.AVIPublicationCo.,WestportConn,第4版。可以使用回交方法將基因?qū)胫参镏?。關(guān)于這種技術(shù)和其它用于將性狀引入植物中的植物育種方法的描述，可以參見參考文獻(xiàn)，如Poehlman，見上文，和PlantBreedingMethodology,NealJensen編,JohnWiley&Sons,Inc.(1988)。在典型的回交方案中，將感興趣的原始品種(輪回親本)與攜帶待轉(zhuǎn)移的感興趣的單個(gè)基因的第二品種(非輪回親本)雜交。然后，將此次雜交得到的后代再次與輪回親本雜交，并重復(fù)該過(guò)程，直到獲得這樣的植物：其中轉(zhuǎn)化的植物不但獲得了來(lái)自非輪回親本的單一轉(zhuǎn)移基因，還恢復(fù)了輪回親本的基本上所有的期望形態(tài)和生理特征。因此，本公開提供了使用根據(jù)本文中的方法生成的雙單倍體植物制備玉米植物的方法，所述方法包括雜交。例如，本主題公開包括生成后代種子的方法，該方法使含有供體多核苷酸的雙單倍體植物(根據(jù)本文中公開的方法制備)與遺傳上不同的第二植物(例如近交親本)雜交，收獲所得的后代種子，并使用實(shí)時(shí)PCR等方法檢測(cè)整合的供體多核苷酸以確定接合性?？梢匀缦掠N玉米植物：(i)將第一親本玉米植物與第二親本玉米植物有性雜交，從而生成多個(gè)第一后代植物，所述第一親本玉米植物是從含有包含轉(zhuǎn)基因的供體多核苷酸的株系的種子種植而來(lái)的；(ii)然后選擇含有包含轉(zhuǎn)基因的供體多核苷酸的第一后代植物；并(iii)使所述第一后代植物自交，由此生成多個(gè)第二后代植物；然后從所述第二后代植物中選擇含有包含農(nóng)藝學(xué)性狀的供體多核苷酸的植物。這些步驟還可以包括(iv)將第一后代植物或第二后代植物與第二親本玉米植物或第三親本玉米植物回交。當(dāng)將本公開的玉米植物與另一近交植物雜交以生成后代或雜種時(shí)，原始親本可以在雜種中充當(dāng)具有基本上相同特征的母本或父本植物。有時(shí)，母本遺傳特征可能差異表達(dá)，取決于決定哪個(gè)親本用作雌性。然而，往往親本植物之一由于種子產(chǎn)率較高和優(yōu)選的生產(chǎn)特性，如最佳種子大小和質(zhì)量或除去雄穗的容易性等，而優(yōu)選作為母本植物。一些植物生成更緊密的穗殼，導(dǎo)致更多的損失，例如由于腐爛，或者穗殼可能太緊以致須不能完全推出尖端，阻礙完全授粉，從而導(dǎo)致種子產(chǎn)率較低。在須形成中可能有延遲，這會(huì)不利地影響一對(duì)親本近交系的繁殖周期的時(shí)機(jī)。在一個(gè)植物中種衣特征可能是優(yōu)選的，這可能影響雜種種子產(chǎn)品的貨架期。一個(gè)植物可能更好地脫落花粉，使得該植物成為優(yōu)選的雄性親本。在一些實(shí)施方案中，將雌性親本植物與雄性雙單倍體親本植物“雜交”的第一步包括種植第一玉米植物和不同的第二雌性近交玉米植物的種子，優(yōu)選在可授粉的附近區(qū)域內(nèi)種植。在一些實(shí)施方案中，可以使用手動(dòng)傳粉雜交雄性和雌性親本。在其它實(shí)施方案中，用于雜交雄性和雌性親本的手動(dòng)傳粉可以借助工具或通過(guò)機(jī)械手段來(lái)實(shí)施。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，如下實(shí)施用于雜交雄性和雌性親本的手動(dòng)傳粉：從雄性植物獲得花粉并將花粉施用于雌性植物的柱頭(通過(guò)花粉管)。進(jìn)一步的步驟包括培育或種植帶有花的雌性親本植物和雄性親本植物的種子。如果親本植物在性成熟的時(shí)間不同，那么可以用技術(shù)獲得適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)，即，確保當(dāng)指定為雌株的親本玉米植物上的須可接受花粉時(shí)，指定為雄株的親本玉米植物的花粉可用?？梢杂糜讷@得期望的時(shí)機(jī)的方法包括延遲較快成熟的植物的開花，例如但不限于推遲較快成熟的種子的種植，切掉或燒掉較快成熟的植物的頂葉(而不殺死植物)或加速較慢成熟植物的開花，如通過(guò)用設(shè)計(jì)成加速萌發(fā)和生長(zhǎng)的膜覆蓋較慢成熟的植物，或通過(guò)切開幼穗芽(earshoot)的尖端以露出須。在某些實(shí)施方案中，用種植者認(rèn)為合適的一種或多種農(nóng)用化學(xué)品處理雌性親本植物和雄性親本植物。進(jìn)一步的步驟包括從接收花粉的植物的穗收獲接近成熟或處于成熟的種子。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，從雌性親本植物收獲種子，并且當(dāng)期望時(shí)，可以種植收獲的種子以生成后代或第一代(F1)雜種玉米植物。又一個(gè)步驟包括將種子干燥和調(diào)理(conditioning)，包括種子的處理/分篩(或分級(jí))，并包裝以出售給種植者以用于生產(chǎn)谷物或草料。與近交種子一樣，可以用組合物處理雜種種子，使得種子和從其生長(zhǎng)的幼苗在暴露于不利條件時(shí)更加耐寒(hardy)?？梢猿鍪鬯玫暮蟠螂s種種子給種植者用于生產(chǎn)谷物和草料，而不用于育種或種子生產(chǎn)。仍進(jìn)一步，本公開提供了通過(guò)種植在雌性親本植物上生成并收獲的種子所生成的后代玉米植物，以及由后代玉米植物生成的谷物。在隨后的實(shí)施方案中，本公開提供了將賦予期望的性狀的供體多核苷酸導(dǎo)入后代植物中的方法。在實(shí)施方案的一個(gè)方面中，期望的性狀選自下組：殺蟲劑抗性性狀，除草劑耐受性性狀，疾病抗性性狀，產(chǎn)量增加性狀，營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量性狀，農(nóng)藝增加性狀、及其組合。期望的性狀的其它例子包括改變的脂肪酸代謝，例如通過(guò)用硬脂酰-ACP去飽和酶的反義基因轉(zhuǎn)化植物以增加植物的硬脂酸含量。參見Knultzonetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:2624(1992)。減少的肌醇六磷酸含量：(i)肌醇六磷酸酶編碼基因的引入將增強(qiáng)肌醇六磷酸鹽的分解，為轉(zhuǎn)化的植物添加更多的游離磷酸鹽。例如，關(guān)于黑曲霉肌醇六磷酸酶基因的核苷酸序列的公開，參見VanHartingsveldtetal.,Gene127:87(1993)。(ii)可以引入降低肌醇六磷酸鹽含量的基因。在玉米中，例如，這可以通過(guò)克隆并然后再導(dǎo)入與單個(gè)等位基因相關(guān)的DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述單個(gè)等位基因造成以低水平的肌醇六磷酸為特征的玉米突變體。參見Raboyetal.,Maydica35:383(1990)。(iii)修飾的碳水化合物組成，例如通過(guò)用編碼改變淀粉分支模式的酶的基因轉(zhuǎn)化植物而實(shí)現(xiàn)。參見Shirozaetal.,J.Bacteriol.170:810(1988)(變異鏈球菌(Streptococcusmutans)果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetzetal.,Mol.Gen.Genet.200:220(1985)(枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)，Penetal.,Bio/Technology10:292(1992)(表達(dá)地衣芽孢桿菌α-淀粉酶的轉(zhuǎn)基因植物的生成)，Elliotetal.,PlantMolec.Biol.21:515(1993)(番茄轉(zhuǎn)化酶基因的核苷酸序列)，Sogaardetal.,J.Biol.Chem.268:22480(1993)(大麥α-淀粉酶基因的定點(diǎn)誘變)和Fisheretal.,PlantPhysiol.102:1045(1993)(玉米胚乳淀粉分支酶II)。潛在期望的特征的其它例子包括更大的產(chǎn)率，更好的莖，更好的根，縮短的作物成熟前時(shí)間，更好的農(nóng)藝質(zhì)量，更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，更高的淀粉可提取性或淀粉發(fā)酵能力，對(duì)殺蟲劑、除草劑、有害生物、熱和干旱、和疾病的抗性和/或耐受性，以及萌發(fā)時(shí)間、建植(standestablishment)、生長(zhǎng)速率、成熟度和籽粒大小的一致性?？梢允褂冒▽?shí)時(shí)PCR測(cè)定法的方法快速檢測(cè)包含玉米種子的玉米作物或其后代以確定接合性，然后種植，所述玉米種子含有包含農(nóng)藝學(xué)性狀的供體多核苷酸。包括實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法以確定接合性的方法可以改善此過(guò)程的效率。本主題的包括實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法以確定接合性的方法可用于例如玉米育種程序以及質(zhì)量控制，特別是用于玉米種子的商業(yè)化生產(chǎn)。此方法也可以幫助產(chǎn)品注冊(cè)和產(chǎn)品管理(stewardship)。可以使用此方法進(jìn)行加速育種漸滲策略。本公開的檢測(cè)技術(shù)尤其可用于與植物育種漸滲結(jié)合，以確定在含有事件的親本植物與另一植物系雜交之后，哪些后代植物包含含有農(nóng)藝學(xué)性狀的供體多核苷酸，以試圖將農(nóng)藝學(xué)性性狀賦予到后代中。包括實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法以確定接合性的公開的方法有益于玉米育種漸滲程序以及質(zhì)量控制，特別是商業(yè)化玉米種子。本公開內(nèi)容可以用于標(biāo)志物輔助育種(MAB)方法。本公開可以與其它用于鑒定包含農(nóng)藝性狀的供體多核苷酸附近的遺傳連鎖標(biāo)志物的方法(例如，AFLP標(biāo)記，RFLP標(biāo)志物，RAPD標(biāo)志物，SNP和SSR)組合使用。包括實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法以確定接合性的方法允許追蹤在植物育種雜交的后代中包含農(nóng)藝學(xué)性狀的供體多核苷酸。本公開的包括實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法以確定接合性的方法可以用于鑒定任何含有包含農(nóng)藝學(xué)性狀的供體多核苷酸的玉米品種。應(yīng)當(dāng)理解，本文中所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于說(shuō)明性目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員參考這些實(shí)施例和實(shí)施方案能夠作出各種修改或改變，這些修改或改變涵蓋在本申請(qǐng)的精神和范圍內(nèi)，并落入所附權(quán)利要求書的范圍。這些實(shí)施例不應(yīng)被解釋為限制性的。實(shí)施例實(shí)施例1：小孢子來(lái)源的單倍體愈傷組織的生成當(dāng)小孢子處于早期雙核發(fā)育階段(花藥長(zhǎng)約3mm，明亮，光澤黃色)時(shí)，從溫室種植的玉米植物(約5-6周齡)收獲玉米基因型139/39-05(美國(guó)專利號(hào)5,306,864)的萌前雄穗(Pre-emergenttassel)。將雄穗包裹在濕紙巾和鋁箔中，并置于設(shè)定在8℃的培養(yǎng)箱中7-14天。在表面滅菌(在0.08％v/vChloroxTM中15分鐘，接著無(wú)菌水漂洗)后，將花藥無(wú)菌分離，在6孔皿中在每孔6mL培養(yǎng)基中以60個(gè)花藥的密度置于液體“花藥培養(yǎng)基培養(yǎng)基”(N6鹽和維生素，60g/L蔗糖，5g/L活性炭，500mg/L酪蛋白水解產(chǎn)物，0.1mg/LTIBA，調(diào)節(jié)至pH5.8)的表面上，并在28℃在黑暗中溫育。將出現(xiàn)在14-28天之間的小孢子來(lái)源的胚樣結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到“愈傷組織培養(yǎng)基”(MS鹽和維生素，30g/L蔗糖，700mg/LL-脯氨酸，500mg/LMES，100mg/L酪蛋白水解產(chǎn)物，15mg/L硝酸銀，3.3mg/L麥草畏和2.5g/LGelriteTM，調(diào)節(jié)至pH5.8)。每14天將結(jié)節(jié)性、胚發(fā)生的愈傷組織傳代培養(yǎng)至新鮮的“愈傷組織培養(yǎng)基”使之長(zhǎng)大，之后進(jìn)行倍性測(cè)定和轉(zhuǎn)化。前述提供了源自玉米小孢子的雄激素轉(zhuǎn)化感受態(tài)單倍體組織的例子，其可以用于修飾單倍體玉米基因組的公開的方法。實(shí)施例2：愈傷組織的倍性測(cè)定為了測(cè)定細(xì)胞倍性水平，將1g實(shí)施例1中制備的愈傷組織轉(zhuǎn)移至無(wú)菌PetriTM皿(FisherScientific，St.Louis，MO)。通過(guò)在1-2mL過(guò)濾的冰冷Gailbraith緩沖液(0.01MMgSO4，0.005MKCl，0.0005MHEPES，1mg/mLDTT)以及“MMG培養(yǎng)基”(4mMMES[pH6.0]，0.6M甘露醇，15mMMgCl2)和0.25％TritonX-100TM存在下用單刃剃刀刀片切碎愈傷組織釋放出核。用另外2mL緩沖液漂洗PetriTM皿，將其與初始核提取物合并以使最終漿液體積為約5mL。然后通過(guò)轉(zhuǎn)移至玻璃組織勻漿器，柱塞上下泵動(dòng)數(shù)次，溫和均化粗制核提取物。然后，勻漿通過(guò)濾茶器過(guò)濾，40μmSteri-flipTM(Millipore；Billerica,Massachusetts,USA)吸出所得的濾液以分離核。使用10μL/200μL樣品用碘化丙啶(Sigma-Aldrich；St.Louis,Missouri,USA)對(duì)分離的核染色并用BeckmanQuantaTM流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter,Brea,CA,USA)分析。對(duì)于每個(gè)樣品，收集至少50,000個(gè)核，并將75μL樣品加到細(xì)胞計(jì)數(shù)器中以使用對(duì)數(shù)標(biāo)度顯示進(jìn)行分析。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示大的單倍體(G0/G1)峰和較小的二倍體(G2)二倍體峰。結(jié)果證實(shí)，根據(jù)實(shí)施例1制備的愈傷組織由適合用于修飾單倍體玉米基因組的公開的方法中的單倍體細(xì)胞組成。實(shí)施例3：用于在從單倍體愈傷組織分離的原生質(zhì)體中的靶向基因組修飾的構(gòu)建體對(duì)于靶向基因組修飾，使用鋅指核酸酶(ZFN)構(gòu)建體pDAB111879(描繪于圖1中)。ZFN的表達(dá)由玉米u(yù)bi1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，并用玉米per53’UTR終止。此表達(dá)盒含有“T2A”構(gòu)造，該構(gòu)造包含兩個(gè)鋅指單體域(zmPPL_1360-r23a1和zmPPL_1360-30a1)，由單獨(dú)一個(gè)編碼區(qū)編碼并表達(dá)。表達(dá)的轉(zhuǎn)錄物包含T2A停頓信號(hào)(stuttersignal)(Mattionetal.,1996,J.Virol.,70:8124-7)以引入核糖體停頓，其在翻譯過(guò)程中釋放第一多肽，并且設(shè)計(jì)為在進(jìn)一步翻譯時(shí)生成等摩爾量的第一和第二多肽。在用于靶向核的兩種ZF單體中包括opaque2核定位序列(NLS)。兩個(gè)NLS-ZF域融合物中都擁有對(duì)表2中所示的玉米基因組的獨(dú)特序列的結(jié)合特異性。鋅指單體還包括FokI核酸酶功能域(Kimetal.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:1156-1160)，利用單子葉優(yōu)選密碼子表對(duì)其進(jìn)行了密碼子偏倚設(shè)置。表2：由設(shè)計(jì)的鋅指蛋白識(shí)別的玉米基因組中的鋅指結(jié)合域和獨(dú)特序列。鋅指蛋白單體SEQIDNO:結(jié)合DNA序列5-3’zmPPL_1360-r23a1SEQIDNO:1ACTCCGTATGCGAAGGCAzmPPL_1360-30a1SEQIDNO:2TTCGCGGTGGGACACTTG使用供體多核苷酸構(gòu)建體pDAB111845(在圖2中描繪)，利用ZFN構(gòu)建體定點(diǎn)雙鏈切割和隨后的DNA修復(fù)，將DNA靶向整合到單倍體愈傷組織來(lái)源的原生質(zhì)體中。該構(gòu)建體含有兩種ZF單體，zmPPL_1360-r23a1和zmPPL_1360-30a1的DNA結(jié)合序列。另外，此構(gòu)建體含有稱為“UZI”的110bp序列，用于經(jīng)由內(nèi)/外PCR對(duì)靶向插入的下游分析，即引物位點(diǎn)設(shè)計(jì)。此質(zhì)粒與pDAB111879(ZFN構(gòu)建體)的共遞送導(dǎo)致當(dāng)ZFN表達(dá)時(shí)，在獨(dú)特的基因組序列處和供體構(gòu)建體pDAB118845內(nèi)發(fā)生切割，促使供體構(gòu)建體通過(guò)非同源末端連接DNA修復(fù)和重組而靶向整合到基因組切割位點(diǎn)中。前文提供了可以用于本公開的修飾單倍體玉米基因組的方法中的構(gòu)建體的例子：用于遞送位點(diǎn)特異性鋅指核酸酶的pDAB111879和用于靶向整合供體多核苷酸的pDAB111845。實(shí)施例4：在從單倍體愈傷組織分離的原生質(zhì)體中的靶向基因組修飾將單倍體愈傷組織(約5克)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌PetriTM皿中，并添加5mL“MMG培養(yǎng)基”。使用單刃剃刀刀片將愈傷組織細(xì)碎成小塊，直到獲得奶油狀漿液。使用無(wú)菌刮刀將漿液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌50mL錐形管(FisherScientific)和20mL“酶溶液”(溶解于“MMG培養(yǎng)基”中的3％CellulaseTM[OnozukaR10，YakultPharmaceuticals，Japan]，0.3％PectolyaseTM[MPBiomedicals,SanDiego,CA])。將管用ParafilmTM包裹并置于Vari-MixTM平臺(tái)搖床(ThermoScientific，Waltham，MA)上，并在24℃在黑暗中劇烈搖動(dòng)約16-18小時(shí)。在無(wú)菌的50mL錐形管中，用100μm細(xì)胞過(guò)濾器(Falcon)緩慢過(guò)濾“酶溶液”。漂洗該細(xì)胞過(guò)濾器(具有細(xì)胞)，方法是移取10mL的“W5+培養(yǎng)基”(1.86mMMES[pH6.0],0.5mL0.2MMES[pH6.0],192mMNaCl,6.7mL1.54MNaCl,154mMCaCl2,8.3mL1MCaCl2,4.7mMKCl,1.25mLof0.2MKCl和37mL水)，使之流過(guò)該100μm細(xì)胞過(guò)濾器。使用70μm細(xì)胞過(guò)濾器(Falcon)重復(fù)該步驟以捕獲較小的碎片。然后使用40μm細(xì)胞過(guò)濾器(Falcon)過(guò)篩濾液，并再次用10mL“W5+培養(yǎng)基”漂洗，得到40mL的最終濾液體積。然后，溫和倒轉(zhuǎn)管，將8mL“重梯度溶液”(500mM蔗糖，1mMCaCl2和5mMMES[pH6.0])緩慢添加到管中的原生質(zhì)體/“酶溶液”/“W5+”混合物下的濾液。然后用轉(zhuǎn)臂浮桶式轉(zhuǎn)頭(來(lái)自Eppendorf，Hauppauge，NY)以1500rpm離心該管10分鐘。然后，使用10mL窄孔移液管尖端緩慢移出原生質(zhì)體層(可見于“重梯度溶液”和“酶溶液”/“W5+培養(yǎng)基”之間)，并置于無(wú)菌的50mL錐形管中。然后，使用“W5+培養(yǎng)基”使管達(dá)到35mL的體積，緩慢倒轉(zhuǎn)幾次，并以1000rpm離心10分鐘。然后，除去上清液而不干擾離心沉淀。然后，將含有原生質(zhì)體的離心沉淀重懸于5mL“MMG培養(yǎng)基”中。首先將離心沉淀重懸于5mL“MMG培養(yǎng)基”中，然后在96孔板中添加30μL至270μL“MMG培養(yǎng)基”，使用BeckmanQuantaTM流式細(xì)胞儀測(cè)定每mL原生質(zhì)體的濃度。對(duì)于轉(zhuǎn)染，使用“MMG培養(yǎng)基”將原生質(zhì)體稀釋至每mL167萬(wàn)個(gè)。將300μL的每個(gè)樣品(約500,000個(gè)原生質(zhì)體)轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的2mL管中。向每個(gè)管添加總共40μg的質(zhì)粒DNA(36μg的pDAB111845[供體多核苷酸]+4μg的pDAB111879[編碼ZFN的多核苷酸])，并通過(guò)翻轉(zhuǎn)管緩慢混合，并在室溫溫育5分鐘。將PEG4000TM(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)緩慢添加(300μL)至原生質(zhì)體/DNA混合物中，并溫和倒轉(zhuǎn)直至內(nèi)容物完全混合。將管在室溫下溫育5分鐘，偶爾溫和倒轉(zhuǎn)混合。溫育后，緩慢添加1mL“W5+培養(yǎng)基”，將管溫和倒轉(zhuǎn)5-10次。然后，將管在微量離心機(jī)(Eppendorf)中以1500rpm離心5分鐘。小心地除去上清液，確保不干擾離心沉淀。一旦除去上清液，每個(gè)管加1mL“WI培養(yǎng)基”(4mMMES[pH6.0]，1mL0.2mMMES[pH6.0]，0.6M甘露醇，30mL1M甘露醇，20mMKCl，5mL0.2MKCl和14mL水)，并溫和倒轉(zhuǎn)以重懸離心沉淀。然后用鋁箔覆蓋管以避光，并且將它們側(cè)放過(guò)夜溫育，此后提取基因組DNA并分析靶向基因組修飾。前文演示了本公開的方法用于在從小孢子來(lái)源的愈傷組織分離的原生質(zhì)體中靶向修飾(例如位點(diǎn)特異性整合)單倍體玉米基因組的一個(gè)實(shí)例，所述原生質(zhì)體用供體多核苷酸和編碼鋅指核酸酶(ZFN)的多核苷酸轉(zhuǎn)化。實(shí)施例5：具有靶向基因組修飾的單倍體原生質(zhì)體的分子分析使用不對(duì)稱巢式內(nèi)-外(in-out)PCR(ANIO)(美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/873719)檢測(cè)從實(shí)施例4的轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體提取的基因組DNA中的靶向基因組修飾。表3中顯示用于檢測(cè)的引物對(duì)。一對(duì)引物設(shè)計(jì)用于特異性結(jié)合基因組序列，另一對(duì)引物設(shè)計(jì)用于結(jié)合供體多核苷酸DNA序列。在初始變性后，使用EX-TAQHSTMPCR試劑盒(ClontechLaboratories,Inc.；MountainView,California,USA)，擴(kuò)增程序包括：98℃12秒和66℃30秒，15個(gè)循環(huán)；然后72℃10分鐘，最后保持在4℃。然后，將第一PCR產(chǎn)物用于巢式第二PCR反應(yīng)。在第一PCR產(chǎn)物初始變性后，擴(kuò)增程序包括：98℃12秒、66℃30秒、然后68℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)；然后72℃10分鐘，最后保持在4℃。使用1％E-gelTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)通過(guò)凝膠電泳解析PCR產(chǎn)物。電泳的結(jié)果產(chǎn)生PCR產(chǎn)物的預(yù)期凝膠片段大小(700bp和1053bp，分別為5'和3'接合部)，指示靶向插入的存在。由此，前文表明，本公開的方法導(dǎo)致了供體多核苷酸轉(zhuǎn)基因在玉米單倍體基因組中的靶向插入。表3：用于ANIOPCR反應(yīng)的引物。前文演示了本公開的方法于確認(rèn)供體多核苷酸在玉米小孢子來(lái)源的單倍體組織的基因組中的靶向整合的一個(gè)實(shí)例。實(shí)施例6：用于單倍體愈傷組織的靶向基因組修飾的構(gòu)建體為了對(duì)單倍體愈傷組織的靶向轉(zhuǎn)基因整合，使用供體構(gòu)建體pDAB118783，其含有一條約500bp的序列，該序列與在玉米基因組中的獨(dú)特zmPPL_1360-r23a1和zmPPL_1360-30a1識(shí)別序列的側(cè)翼序列同源(圖3)。這些序列被稱為“同源臂”。此供體構(gòu)建體還含有用于在含有吡氟氯禾靈(haloxyfop)的培養(yǎng)基上進(jìn)行體外選擇的aad-1表達(dá)盒。該aad-1基因表達(dá)受玉米u(yù)bi1啟動(dòng)子控制，并以玉米per53’UTR終止。作為該構(gòu)建體與pDAB111879(ZFN構(gòu)建體)的共遞送的結(jié)果，獨(dú)特基因組序列處的雙鏈基因組DNA由于ZFN表達(dá)而被切割?！巴幢邸碧峁┩葱灾笇?dǎo)的修復(fù)的模板，從而將aad-1表達(dá)盒整合到基因組切割位點(diǎn)中。前文演示了供體多核苷酸(pDAB118783)，其包含選擇標(biāo)志物轉(zhuǎn)基因aad1，并且適合用于本文公開的通過(guò)將轉(zhuǎn)基因靶向整合到單倍體基因組中來(lái)修飾單倍體玉米基因組的方法。實(shí)施例7：在單倍體愈傷組織中的靶向基因組修飾在轟擊前三天，使用一次性解剖刀將單倍體愈傷組織切成約1-2mm的塊，置于新鮮“愈傷組織培養(yǎng)基”的表面上并在28℃在黑暗中溫育。在轟擊之前約4小時(shí)，將愈傷組織塊排列在含有“滲透培養(yǎng)基”(“愈傷組織培養(yǎng)基”中添加山梨糖醇和甘露醇各45.5g/L)的100x15mmPetriTM皿的中心的一個(gè)1cm直徑的圓圈中，并在黑暗中在28℃溫育。使用PDS-1000顆粒加速裝置TM(BioRad；Hercules，California，USA)，在900psi和6cm飛行距離下，用總共0.5μgDNA(僅pDAB111879[ZFN]；或pDAB118783[供體]與pDAB111879[ZFN]的10:1組合)轟擊愈傷組織，所述DNA用2.5μgCaCl2和0.1M亞精胺沉淀到150μg0.6μ金的表面上。前文演示了本公開的方法用于以ZFN和供體多核苷酸對(duì)小孢子來(lái)源的單倍體愈傷組織進(jìn)行微粒轟擊來(lái)靶向修飾單倍體玉米基因組的一個(gè)實(shí)例。實(shí)施例8：具有靶向基因組修飾的單倍體愈傷組織的分子分析將實(shí)施例7中僅用pDAB111879(ZFN)通過(guò)微粒轟擊轉(zhuǎn)化的愈傷組織樣品凍干，使用Qiagen(Germantown，Maryland，USA)植物DNA提取試劑盒TM根據(jù)制造商的說(shuō)明進(jìn)行基因組DNA提取。將基因組DNA重懸浮于200μL水中，并通過(guò)(Invitrogen,Carlsbad,California,USA)測(cè)定濃度。所有樣品在0.8％瓊脂糖E-gelsTM(Invitrogen)上電泳以估計(jì)DNA的完整性。將所有樣品標(biāo)準(zhǔn)化(25ng/μL)用于PCR擴(kuò)增，使用來(lái)自(SanDiego，CA)的系統(tǒng)對(duì)產(chǎn)生的擴(kuò)增子測(cè)序。對(duì)于制備性PCR，合并來(lái)自每個(gè)重復(fù)的5μL，對(duì)每個(gè)模板進(jìn)行5個(gè)單獨(dú)的小規(guī)模PCR反應(yīng)，所述PCR反應(yīng)使用24μL反應(yīng)體系，其中有0.2μM適當(dāng)?shù)膸l碼的引物、AccuprimePfx(Invitrogen)、和25ng模板基因組DNA。循環(huán)參數(shù)包括在95°(5分鐘)初始變性，接著是35個(gè)循環(huán)的變性(95℃，15秒)、退火(55℃，30秒)、延伸(68℃，1分鐘)；和最終延伸(72℃，7分鐘)。將PCR產(chǎn)物合并在一起，使用QiagenMinEluteTM凝膠提取/純化試劑盒在4％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行凝膠純化。測(cè)定凝膠純化的擴(kuò)增子的濃度，并且通過(guò)合并來(lái)自ZFN靶向的和對(duì)應(yīng)的野生型對(duì)照的約200ng的帶條碼的擴(kuò)增子來(lái)制備PCR擴(kuò)增子樣品(表4)。表4：用于擴(kuò)增基因組靶序列的引物。進(jìn)行測(cè)序并使用序列分析腳本進(jìn)行分析。濾出低質(zhì)量序列(質(zhì)量評(píng)分截止<5的序列)，剩余的序列根據(jù)條碼進(jìn)行解析。然后，將條碼目錄與參照序列比對(duì)，并對(duì)插入和/或缺失進(jìn)行打分。切割活性作為具有由易錯(cuò)NHEJ修復(fù)導(dǎo)致的插入和/或缺失的高質(zhì)量序列的函數(shù)來(lái)檢測(cè)。一組有代表性的改變的序列(SEQIDNO:33至SEQIDNO:45)作為與基因組DNA靶序列(SEQIDNO:32)的比對(duì)提供，以顯示得到的缺失和添加(圖4)。在表5中示出了頻率的匯總。表5：在經(jīng)轟擊的愈傷組織對(duì)對(duì)照愈傷組織中PPL1基因座處的插入-缺失(Indel)頻率。因此，上文表明，本公開的方法在玉米單倍體基因組的PPL1基因座處產(chǎn)生了靶向誘變。上文還演示了本公開的方法用于確認(rèn)單倍體基因組的靶向誘變的例子。實(shí)施例9：?jiǎn)伪扼w愈傷組織的染色體加倍、選擇和植物再生次日早晨將經(jīng)過(guò)pDAB118783(供體)和pDAB111879(ZFN)共轟擊的來(lái)自實(shí)施例7的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有新鮮“愈傷組織培養(yǎng)基”的100x25PetriTM皿中，放置在皿表面上的濾紙(Whatman#4)上，用1mL的0.025％秋水仙素溶液浸泡，并且在黑暗中在28℃溫育。48小時(shí)后，使用100μ細(xì)胞過(guò)濾器(Falcon352360)，用4mL液體“愈傷組織培養(yǎng)基”漂洗經(jīng)過(guò)秋水仙素處理的愈傷組織，在無(wú)菌濾紙上吸干，并轉(zhuǎn)移至含有新鮮“愈傷組織培養(yǎng)基”的100x20mmPetriTM皿。在黑暗中在28℃再過(guò)4天(轟擊后8天)后，通過(guò)流式細(xì)胞儀確認(rèn)愈傷組織的加倍單倍體性質(zhì)，其結(jié)果示于圖5中。然后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至“選擇培養(yǎng)基”(具有100μM吡氟氯禾靈TM的“愈傷組織培養(yǎng)基”)。在“選擇培養(yǎng)基”上14天后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到新鮮的“選擇培養(yǎng)基”，再過(guò)14天，并于28℃在低光中放置。在“選擇培養(yǎng)基”上經(jīng)過(guò)總共4周(自轟擊起5周)后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有“預(yù)再生培養(yǎng)基”(MS鹽和維生素，45g/L蔗糖，350L-脯氨酸，250mg/LMES，100mg/L肌醇，2.5mg/LABA，1mg/LBAP，0.5mg/LNAA，1mg/L硝酸銀，2.5g/LGelriteTM，具有100μM的吡氟氯禾靈，調(diào)節(jié)至pH5.8)的100x25mmPetriTM皿，并置于28℃的光照(50μM)中。7天后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有“再生培養(yǎng)基”(MS鹽和維生素，60g/L蔗糖，100mg/L肌醇，2.5g/LGelriteTM，對(duì)于pDAB118873+pDAB111879具有100μM吡氟氯禾靈TM]，調(diào)節(jié)到5.8)的PhytaTrayTMII(Sigma-Aldrich；St.Louis,Missouri,USA)，并在28℃置于光照(160μM)中。14-21天后，將芽轉(zhuǎn)移至“芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基”(MS鹽，N6維生素，30g/L蔗糖，500mg/LMES，5.5g/L瓊脂，具有100μM吡氟氯禾靈TM，調(diào)節(jié)至pH5.8)，和于28℃置于光照(190μM)。將生根的植物移植到含有Pro-MixBXTM(PremierTech；Riviere-du-Loup,Canada)的10cm塑料盆中，并放置在具有16/8小時(shí)光周期和27/24℃溫度的生長(zhǎng)室(Conviron；Winnipeg,Canada)中。然后將植物移植到含有95％Pro-MixBXTM和5％粘土/壤土土壤的混合物的5加侖盆中，并轉(zhuǎn)移到具有由金屬鹵化物和高壓鈉燈提供的補(bǔ)充光照的溫室中，光周期16/8小時(shí)，溫度30/20℃。然后，讓植物生長(zhǎng)至成熟并自花授粉。前文演示了本公開的方法用于從小孢子來(lái)源的單倍體愈傷組織再生加倍單倍體植物的一個(gè)實(shí)例，所述愈傷組織包含整合到其基因組中的靶向轉(zhuǎn)基因。實(shí)施例10：加倍單倍體轉(zhuǎn)基因植物的分子分析將實(shí)施例9的雙單倍體植物的組織樣品收集在96孔收集板中，并凍干2天。使用Genogrinder2010TM(SPEXSamplePrep)和不銹鋼珠進(jìn)行組織浸軟。在組織浸軟后，使用BioSprint試劑盒TM(Qiagen；Germantown,Maryland,USA)根據(jù)制造商建議的方案以高通量形式分離基因組DNA。用Quant-ITPicoGreenDNA測(cè)定試劑盒TM(MolecularProbes；Invitrogen，Carlsbad，California，USA)定量基因組DNA。使用BiomekNXPTM自動(dòng)化液體處理器(BeckmanCoulter；Pasadena,California,USA)將經(jīng)定量的基因組DNA調(diào)整至2ng/μL以便進(jìn)行水解探針測(cè)定法。水解探針測(cè)定法利用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，實(shí)時(shí)PCR使用480系統(tǒng)(RocheAppliedScience；Indianapolis,Indiana,USA)。使用ProbeDesign軟件2.0為aad-1和內(nèi)部參照基因轉(zhuǎn)化酶(Genbank登錄號(hào)：U16123.1)設(shè)計(jì)了測(cè)定法。為了擴(kuò)增，以1X終濃度制備480探針主混合物(RocheAppliedScience)，多重反應(yīng)體積10μL，含有0.4μM的每種引物和0.2μM的每種探針(表6)。對(duì)于aad-1/轉(zhuǎn)化酶進(jìn)行兩步擴(kuò)增反應(yīng)，在60℃延伸40秒，采集熒光。實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)的分析基于ΔΔCt方法，使用軟件版本1.5，使用相對(duì)定量模塊。為此，每次運(yùn)行中包括來(lái)自單拷貝校準(zhǔn)品的gDNA樣品和已知的2拷貝核對(duì)品。表6：用于aad-1和內(nèi)部參照(轉(zhuǎn)化酶)的水解探針測(cè)定法的引物和探針信息。引物名稱SEQIDNO:序列檢測(cè)GAAD1FSEQIDNO:155’TGTTCGGTTCCCTCTACCAA3’---GAAD1RSEQIDNO:165’CAACATCCATCACCTTGACTGA3’---GAAD1PSEQIDNO:175’FAM-CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA3’FAMIVF-TaqSEQIDNO:185’TGGCGGACGACGACTTGT3’---INR-TaqSEQIDNO:195’AAAGTTTGGAGGCTGCCGT3’---IV-ProbeSEQIDNO:205’HEX-CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC3’HEX使用個(gè)別的“內(nèi)-外”PCR反應(yīng)檢測(cè)具有靶向轉(zhuǎn)基因插入的事件。表7中顯示了用于檢測(cè)的引物對(duì)(一個(gè)對(duì)側(cè)翼基因組序列特異性，另一個(gè)對(duì)供體構(gòu)建體特異性)。初始變性后，擴(kuò)增程序包括：94℃30秒、60℃30秒、72℃1分鐘，35個(gè)循環(huán)；然后72℃10分鐘，之后最后保持在4℃。PCR反應(yīng)使用EX-TAQPCR試劑盒TM(ClontechLaboratories，Inc)。使用1％瓊脂糖凝膠解析和鑒定PCR產(chǎn)物。表7：用于內(nèi)-外PCR反應(yīng)的引物。引物名稱SEQIDNO:序列MAS863SEQIDNO:215’AAGCGGTGCGTTGGTATTAG3’MAS872SEQIDNO:225’GCGTTTAACAGGCTGGC3’MAS873SEQIDNO:235’CGATGCTCACCCTGTTGTTTG3’MAS864SEQIDNO:245’TCGCATACGACGGGCAT3’通過(guò)水解探針測(cè)定法測(cè)定切割位點(diǎn)的ZFN介導(dǎo)的破壞，使用480系統(tǒng)(RocheAppliedScience)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。測(cè)定法的設(shè)計(jì)使得引物和探針與位于ZFN結(jié)合位點(diǎn)及內(nèi)部參照轉(zhuǎn)化酶的側(cè)翼的序列退火。為了擴(kuò)增，在10μL體積多重反應(yīng)中以1X終濃度制備480探針主混合物，所述多重反應(yīng)含有0.4μM每種引物和0.2μM每種探針(表8)。進(jìn)行兩步擴(kuò)增反應(yīng)，在60℃延伸30秒，采集熒光。實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)的分析使用軟件版本1.5，使用相對(duì)定量模塊，比較靶標(biāo)參照比(targettoreferenceratio)。在每次運(yùn)行中包括來(lái)自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩参锏幕蚪MDNA的樣品。表8：用于基因組基因座破壞的水解探針測(cè)定法的引物和探針信息。對(duì)于通過(guò)“內(nèi)-外”PCR和基因座破壞qPCR測(cè)定法確定的含有靶向aad-1構(gòu)建體的T0雙倍單倍體玉米植物，選用于進(jìn)行Sothern印跡分析。如先前描述進(jìn)行Southern印跡和探查。然后，用HindIII(NewEnglandBioLabs,Ipswich,MA)在37℃消化樣品過(guò)夜。使用表9中顯示的引物產(chǎn)生探針，這些引物結(jié)合“同源臂”外部的基因組序列。所得的Southern印跡確認(rèn)了轉(zhuǎn)基因事件含有靶向aad-1構(gòu)建體的全長(zhǎng)拷貝。表9：用于生成探針以進(jìn)行Southern印跡分析的引物。引物名稱SEQIDNO:序列MAS864SEQIDNO:305’TCGCATACGACGGGCAT3’MAS865SEQIDNO:315’TGGCAGCCGGTGCGA3’前文演示了本公開的方法用于確認(rèn)加倍單倍體植物(從小孢子來(lái)源的單倍體愈傷組織再生的)展現(xiàn)靶向轉(zhuǎn)基因整合的幾個(gè)例子。序列表<110>美國(guó)陶氏益農(nóng)公司J·F·佩達(dá)利諾T·F·斯特蘭奇J·P·塞繆爾R·C·布盧M·A·辛普森.<120>單倍體玉米轉(zhuǎn)化<130>75428<160>45<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>ZFP單體<400>1actccgtatgcgaaggca18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>ZFP單體<400>2ttcgcggtgggacacttg18<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3cgccacaaatctgaaccagca21<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4ccacgatcgacattgatctggcta24<210>5<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5ccagcatacagttagggccca21<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6gttgccttggtaggtccagc20<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7gcgacatatcaggccaacagg21<210>8<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8gggatatgtgtcctaccgtatcagg25<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9cgaaaactcagcatgcgggaa21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10gagccatcagtccaacactgc21<210>11<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>11tacgtatggcactaatctcaccggct26<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12tacgtaagtcttagaagtacgctaccgt28<210>13<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13acgtactggcactaatctcaccggct26<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14acgtacagtcttagaagtacgctaccgt28<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15tgttcggttccctctaccaa20<210>16<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16caacatccatcaccttgactga22<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>17cacagaaccgtcgcttcagcaaca24<210>18<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>18tggcggacgacgacttgt18<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>19aaagtttggaggctgccgt19<210>20<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>20cgagcagaccgccgtgtacttctacc26<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>21aagcggtgcgttggtattag20<210>22<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>22gcgtttaacaggctggc17<210>23<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>23cgatgctcaccctgttgtttg21<210>24<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>24tcgcatacgacgggcat17<210>25<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>25ataagacatcgagctagtgtaagcgtaggc30<210>26<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>26tcacaactgtttaggcgtgtcctcttaa28<210>27<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>27aaagctgcagctgcctgttccctgtac27<210>28<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>28caaataagacatcgagctagtgtaag26<210>29<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>29ctgtttaggcgtgtcctctt20<210>30<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>30tcgcatacgacgggcat17<210>31<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>31tggcagccggtgcga15<210>32<211>76<212>DNA<213>人工序列<220><223>GenomicDNArecognitiontargetsequence<400>32gctacgtgccttcgcatacggagtagtttattcgcggtgggacacttgatagaaaggcta60cggtagcgtacttcta76<210>33<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶位點(diǎn)處的ZFN切割所致的插入缺失<400>33ctacgtgccttcgcatacggagtttcgcggtgggacacttgatagaaaggctacggtagc60gtacttcta69<210>34<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶位點(diǎn)處的ZFN切割所致的插入缺失<400>34ctacgtgccttcgcatacggagtttcgtggtgggacacttgatagaaaggctacggtagc60gtacttcta69<210>35<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶位點(diǎn)處的ZFN切割所致的插入缺失<400>35ctacgtgccttcgcatacggagtattcgcggtgggacacttgatagaaaggctacggtag60cgtacttca69<210>36<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶位點(diǎn)處的ZFN切割所致的插入缺失<400>36tacgtgccttcgcatacggagtaggcgcggtgggacacttgatagaaaggctacggtagc60gtacttcta69<210>37<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶位點(diǎn)處的ZFN切割所致的插入缺失<400>37tacgtgccttcgcatacggagtattcgcggtgggacacttgatagaaaggctacggtagc60gtacttcta69<210>38<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶位點(diǎn)處的ZFN切割所致的插入缺失<400>38tacgtgccttcgcatacggagtcattcgcggtgggacacttgatagaaaggctacggtag60cgtacttct69<210>39<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶位點(diǎn)處的ZFN切割所致的插入缺失<400>39tacgtgccttcgcatacggagtttcgcggtgggacacttgatagaaaggctacggtagcg60tacttcta68<210>40<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶位點(diǎn)處的ZFN切割所致的插入缺失<400>40tacgtgccttcgcatacggagtcattcgcggtgggacacttgatagaaaggctacggtag60cgtactcta69<210>41<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶位點(diǎn)處的ZFN切割所致的插入缺失<400>41acgtgccttcgcatacggagtcattcgcggtgggacacttgatagaaaggctacggtagc60gtacttcta69<210>42<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶位點(diǎn)處的ZFN切割所致的插入缺失<400>42acgtgccttcgcatacggagtaggcgcggtgggacacttgatagaaaggctacggtagcg60tacttcta68<210>43<211>68<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶位點(diǎn)處的ZFN切割所致的插入缺失<400>43acgtgccttcgcatacggagtattcgcggtgggacacttgatagaaaggctacggtagcg60tacttcta68<210>44<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶位點(diǎn)處的ZFN切割所致的插入缺失<400>44cgtgccttcgcatacggagtagtttcgcggtgggacacttgatagaaaggctacggtagc60gtacttcta69<210>45<211>67<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶位點(diǎn)處的ZFN切割所致的插入缺失<400>45cgtgccttcgcatacggagtaggcgcggtgggacacttgatagaaaggctacggtagcgt60acttcta67當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3