一種骨組織工程支架材料的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種骨組織工程支架材料的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)材料技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。本發(fā)明所述方法在磁力攪拌下將明膠溶于去離子水中得到明膠水溶膠，并向該水溶膠中加入改性納米羥基磷灰石和硬脂酸微球，攪拌均勻并冷卻一定時間后得到支架泥料；泥料經(jīng)擠壓、固化、干燥、交聯(lián)、酒精浸泡等工藝，最后制備出改性羥基磷灰石骨組織工程支架。該支架的制備具有流程簡單可控、原料成本經(jīng)濟、成品無重金屬污染、生產(chǎn)周期短等優(yōu)勢。經(jīng)該方法制備出的改性羥基磷灰石骨組織工程支架，細胞實驗表明：細胞毒性合格；降解實驗表明：支架具有良好的降解性能，并具有一定的生物活性；力學(xué)實驗表明：支架具有優(yōu)良的力學(xué)性能。所以有望實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，達到臨床應(yīng)用。
【專利說明】
一種骨組織工程支架材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種骨組織工程支架材料的制備方法，屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)運用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]因骨質(zhì)疏松、骨壞死等疾病以及交通事故等所導(dǎo)致的骨缺損在臨床上是一種很普遍的疾病。骨缺損后骨移植的來源主要有自體骨和同種異體骨。自體骨取材有限、增加病人痛苦，而且往往引起取材部位的并發(fā)癥。同種異體骨在材料篩選、儲存等方面相當困難，而且往往產(chǎn)生排斥反應(yīng)。為了克服自體骨和同種異體骨在植入骨缺損部位存在的上述問題，骨組織工程支架材料應(yīng)運而生。
[0003]目前用于制備骨組織工程支架材料的方法主要有有機泡沫浸漬法、添加造孔劑、發(fā)泡反應(yīng)法、溶膠-溶膠法及擠壓成型法等單一或聯(lián)合使用的制備方法。有機泡沫浸漬法主要是利用有機泡沫體(如聚氨酯泡沫)固有的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)制備出三維通孔的骨支架材料，這種方法需要反復(fù)掛漿，制備的支架材料力學(xué)性能較差。添加造孔劑法難以得到高的孔隙率，并且易造成支架材料的孔徑分布不均勻;發(fā)泡法則很難控制氣孔的分布，并且多孔材料的機械強度往往不高。擠壓成型法的孔隙大小在一定程度上可控，雖然很難做到三維貫通，但是單向通孔也能作為骨組織生長的空間和血液輸運的通道，而且這種方法制備工藝簡單，成品周期短，孔隙率和孔洞貫通性可以通過添加造孔劑的辦法得到部分改善。
[0004]羥基磷灰石(HAP)是骨組織的主要成分，具有優(yōu)良的生物相容性、無毒、無刺激性、無排斥反應(yīng)、不致敏、不致癌、可與骨組織發(fā)生化學(xué)鍵合等優(yōu)點，使其在骨組織工程中得到廣泛運用。相比于微米HAP粉體，本發(fā)明所用的改性納米HAP與自然骨中HAP在成分和結(jié)構(gòu)上都很相似。
[0005]自然骨中除了主要的無機相HAP外，有機物以膠原為主。明膠是膠原的水解產(chǎn)物，具有良好的生物相容性。本發(fā)明制備的改性納米HAP/明膠骨組織工程支架是一種無機/有機復(fù)合支架，具有與自然骨相似的成分，其中，改性HAP起到提高支架強度的作用，而明膠則能夠增加支架的韌性，二者共同作用，可以使支架獲得優(yōu)良的力學(xué)性能，解決了目前人造骨組織工程支架力學(xué)強度不足的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是:傳統(tǒng)金屬模板擠壓成本昂貴、易造成重金屬污染、支架孔隙尺寸偏大，多孔骨組織工程支架材料力學(xué)強度不高等問題。
[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種骨組織工程支架材料的制備方法，具體包括以下步驟:
(1)按明膠與去離子水的質(zhì)量比為1:100?1:5的比例將明膠溶于去離子水中得到溶膠
A；
(2)按改性羥基磷灰石與明膠質(zhì)量比為7?8:3?2的比例向溶膠A中加入改性羥基磷灰石，同時加入粒徑大小為80?200 Mi的硬脂酸微球作為造孔劑，攪拌均勻，冷卻至4?15°C后得到泥料B;造孔劑的加入量為造孔劑與改性羥基磷灰石總質(zhì)量的40%?50%;
(3)將泥料B經(jīng)過高分子材料模板擠壓成型，在無水乙醇中脫水固化8?12h得到支架C;
(4)將支架C切割成所需長度的柱狀蜂窩支架，室溫下干燥得到支架D，然后將支架D置于質(zhì)量百分比濃度為1%?10%的戊二醛溶液中交聯(lián)24?48 h，清洗后烘干得到支架E，然后用無水乙醇去除支架E中的造孔劑，室溫下干燥后得到改性羥基磷灰石骨組織工程支架。
[0008]優(yōu)選的，本發(fā)明所述改性羥基磷灰石為摻雜明膠的羥基磷灰石，其中明膠的質(zhì)量百分比為20%-30%。
[0009]優(yōu)選的，本發(fā)明所述改性羥基磷灰石的粒度為20-200nm。
[0010]本發(fā)明所述改性羥基磷灰石通過常規(guī)方法制備得到。
[0011]優(yōu)選的，本發(fā)明步驟(4)中用無水乙醇去除支架E中的造孔劑的具體方法為:將支架E置于40?45 °C的無水乙醇中浸泡36?48 h，然后用30?50 °C無水乙醇清洗。
[0012]優(yōu)選的，本發(fā)明所述高分子材料模板為帶孔的PMMA板、PE板、PTFE板等。本發(fā)明采用激光加工高分子材料制備高分子模板，可以通過CAD不斷調(diào)整加工尺寸，加工出能滿足骨組織工程需要的孔隙大小。
[0013]本發(fā)明的有益效果:
(I)本發(fā)明所述方法中HAP是自然骨中的主要無機成分，具有優(yōu)異的生物學(xué)性能，并且改性HAP具有與自然骨中HAP極為相似的成分和結(jié)構(gòu)，具有更好的生物活性；明膠是自然骨中主要有機物膠原的水解產(chǎn)物，與HAP的特定晶面有較強的吸附作用，因此，其水溶膠能夠很好的粘附HAP，起到粘結(jié)劑的作用，并且可以增加支架的韌性;最終制備的無機/有機復(fù)合支架的抗壓強度最高能夠達到30 MPa，相當于甚至超過人松質(zhì)骨的抗壓強度。
[0014](2)本發(fā)明所述方法中經(jīng)模具擠壓的支架遇到無水乙醇后迅速脫水固化，在獲得力學(xué)強度的同時支架會產(chǎn)生一定程度的收縮，從而避免支架孔隙偏大，并且支架的孔隙大小和孔隙率可以通過控制激光的加工工藝進行調(diào)節(jié)。
[0015](3)本發(fā)明所述方法不僅能夠制備出滿足骨組織工程需要的孔隙率和力學(xué)強度的HAP骨組織工程支架，而且具有成本經(jīng)濟、工藝簡單、無重金屬污染、生物相容性良好、生物活性及生物降解性良好等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0016]圖1是實施例1制備的改性HAP骨組織工程支架的SEM照片；
圖2是實施例2制備的改性HAP骨組織工程支架的SEM照片；
圖3是實施例3制備的改性HAP骨組織工程支架的SEM照片；
圖4是實施例3制備的改性HAP骨組織工程支架中改性納米HAP的TEM照片；
圖5是實施例3制備的改性HAP骨組織工程支架的XRD衍射圖譜。
【具體實施方式】
[0017]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于所述內(nèi)容。
[0018]實施例1 本實施例所述骨組織工程支架材料的制備方法，具體包括以下步驟:
(1)在磁力攪拌下，將10g明膠溶于I kg去離子水中得到溶膠A，為了溶解充分將去離子水加熱至35 °C;
(2)改性羥基磷灰石的制備，具體包括以下步驟:
①稱取3.Sg Ca(OH)2溶于2800 mL去離子水中，用磁力攪拌器攪拌過夜，配成堿液備用。
[0019]②用移液管量取1.8 mL濃度為85%的H3PO4于1400 mL去離子水中，稱取1.2 g明膠溶于上述H3PO4溶液中配成酸液備用。
[0020]③劇烈攪拌的條件下，以一定的速率將上述酸液和堿液共滴定，滴定過程中用氨水調(diào)節(jié)控制溶液的pH為8，溫度保持35°C。
[0021]④滴定完畢后繼續(xù)攪拌24h，將燒杯密封好陳化24 ho
[0022]⑤陳化后將上層清液倒入廢液缸，加入去離子水清洗，沉淀后再倒掉上層液，如此清洗數(shù)次，待上清液pH為中性，抽濾，干燥，研磨得到改性HAP粉體。
[0023](3)取40g改性納米羥基磷灰石加于溶膠A中，攪拌均勻，冷卻至4°C后得到泥料B。
[0024](4 )將泥料B經(jīng)過高分子材料PMMA模板擠壓成型，在盛有無水乙醇的燒杯中脫水固化8 h得到支架C;將支架C用美工刀切割成長度約為10 mm的柱狀蜂窩支架，室溫下干燥20h，得到支架D。
[0025](5)將支架D置于質(zhì)量百分比濃度為1%的戊二醛溶液中交聯(lián)24h，再用循環(huán)水清洗數(shù)次，置于烘箱內(nèi)干燥8 h后得到骨組織工程支架。
[0026]本實施例制備得到的骨組織工程支架，其微觀組織結(jié)構(gòu)圖如圖1(SEM照片)所示，由圖可以看出擠壓成支架后孔大小約440 μπι，孔壁厚度約175 Mi，經(jīng)計算，支架的孔隙率為68%。通過萬能試驗機進行測試，本實施例制備得到的骨組織工程支架抗壓強度為20 MPa。
[0027]實施例2
本實施例所述骨組織工程支架材料的制備方法，具體包括以下步驟:
(1)在磁力攪拌下，將30g明膠溶于150 g去離子水中得到溶膠A，為了溶解充分將去離子水加熱至45 °C;
(2)改性羥基磷灰石的制備，具體包括以下步驟:
①A液:稱取14.169 g Ca(N03)2.4H20溶于1600 mL去離子水中，充分溶解后加入2.58g明膠，加熱到37°C溶解備用。
[0028]②B液:稱取5.282 g (MM)2HPO4溶解于800 mL去離子水中備用。
[0029]③用量筒量取75mL濃度為25%的氨水于750 mL去離子水中，配成氨水溶液備用。
[0030]④先用氨水溶液將A液pH調(diào)至9，再將B液緩慢滴入A液中，滴定過程中保持pH為9，溫度為40°C。
[0031]⑤滴定完畢后繼續(xù)攪拌12h，后密封陳化36 ho
[0032]⑥陳化后將上層清液倒入廢液缸，加入去離子水清洗，沉淀后再倒掉上層液，如此清洗數(shù)次，待上清液pH為中性，抽濾，干燥，研磨得到改性HAP粉體。
[0033](3)取70 g改性納米羥基磷灰石加于溶膠A中，并加入70 g粒徑大小為80?200 μπι的硬脂酸微球作為造孔劑，攪拌均勻，冷卻至15°C后得到泥料B。
[0034](4)將泥料B經(jīng)過高分子材料PE模板擠壓成型，在盛有無水乙醇的燒杯中脫水固化12 h得到支架C;將支架C用美工刀切割成長度約為15 mm的柱狀蜂窩支架，室溫下干燥24h，得到支架D。
[0035](5)將支架D置于質(zhì)量百分比濃度為5%的戊二醛溶液中交聯(lián)48 h，再用循環(huán)水清洗數(shù)次，置于烘箱內(nèi)干燥12 h后得到骨組織工程支架E。
[0036](6)將支架E置于盛有無水乙醇的燒杯中，為了加快硬脂酸微球的溶解速率，將燒杯置于40°C烘箱內(nèi)保溫36 h，然后用30°C的無水乙醇反復(fù)清洗后室溫下干燥24 h得到改性羥基磷灰石骨組織工程支架。
[0037]本實施例制備得到的骨組織工程支架，其微觀組織結(jié)構(gòu)圖如圖2(SEM照片)所示，由圖可以看出擠壓成支架后孔大小約470 μπι，造孔劑成孔大小為80?200 μπι，孔壁厚度約175 Mi，經(jīng)計算，支架的孔隙率為75%。通過萬能試驗機進行測試，本實施例制備得到的骨組織工程支架抗壓強度為30 MPa。
[0038]實施例3
本實施例所述骨組織工程支架材料的制備方法，具體包括以下步驟:
(1)在磁力攪拌下，將20g明膠溶于200 g去離子水中得到溶膠A，為了溶解充分將去離子水加熱至60 °C;
(2)改性羥基磷灰石的制備，具體包括以下步驟:
①A液:稱取28.338g Ca(N03)2.4H20溶于3000 mL去離子水中，充分溶解后加入3.012g明膠，加熱到45°C溶解備用。
[0039]②B液:稱取9.322 g (MM)2HPO4溶解于2000 mL去離子水中備用。
[0040]③用量筒量取50mL濃度為氨水于1000 mL去離子水中，配成氨水溶液備用。
[0041 ]④先用氨水溶液將A液pH調(diào)至11，再將B液緩慢滴入A液中，滴定過程中保持pH為11，溫度為50°(:。
[0042]⑤滴定完畢后繼續(xù)攪拌20h，后密封陳化48 ho
[0043]⑥陳化后將上層清液倒入廢液缸，加入去離子水清洗，沉淀后再倒掉上層液，如此清洗數(shù)次，待上清液pH為中性，抽濾，干燥，研磨得到改性HAP粉體。
[0044](3)取60 g改性納米羥基磷灰石加于溶膠A中，并加入40 g粒徑大小為80?200 μπι的硬脂酸微球作為造孔劑，攪拌均勻，冷卻至10°c后得到泥料B。
[0045](4 )將泥料B經(jīng)過高分子材料PTFE模板擠壓成型，在盛有無水乙醇的燒杯中脫水固化10 h得到支架C;將支架C用美工刀切割成長度約為20 mm的柱狀蜂窩支架，室溫下干燥30h，得到支架D。
[0046](5)將支架D置于質(zhì)量百分比濃度為10%的戊二醛溶液中交聯(lián)36 h，再用循環(huán)水清洗數(shù)次，置于烘箱內(nèi)干燥16 h后得到骨組織工程支架E。
[0047](6)將支架E置于盛有無水乙醇的燒杯中，為了加快硬脂酸微球的溶解速率，將燒杯置于45°C烘箱內(nèi)保溫48 h，然后用50°C的無水乙醇反復(fù)清洗后室溫下干燥36 h得到改性羥基磷灰石骨組織工程支架。
[0048]本實施例制備得到的骨組織工程支架，其微觀組織結(jié)構(gòu)圖如圖3(SEM照片)所示，由圖可以看出擠壓成支架后孔大小約560 μπι，造孔劑成孔大小為80?200 μπι，孔壁厚度約175 Mi，經(jīng)計算，支架的孔隙率為80%。通過萬能試驗機進行測試，本實施例制備得到的骨組織工程支架抗壓強度為25 MPa。本實施例制備得到的改性納米HAP的TEM照片如圖4所示，可以看出HAP呈納米片狀，與自然骨中的HAP形貌類似。本實施例制備得到的HAP骨組織工程支架的XRD衍射圖譜如圖5所示，可以看出圖中的衍射峰對應(yīng)于HAP的衍射峰，與自然骨的XRD衍射圖譜類似。上述結(jié)果表明，本實施例制備得到的骨組織工程支架在成分、結(jié)構(gòu)及性能上均與自然骨類似。
[0049]從附圖1、2和3中可以看出，本發(fā)明所制備的支架貫通性良好，孔洞結(jié)構(gòu)為規(guī)則直通孔與不規(guī)則三維通孔相結(jié)合，直通孔的孔徑范圍為440?560 Mi之間，不規(guī)則三維通孔的孔徑范圍為80?200 Mi。研究表明，微孔結(jié)構(gòu)有利于組織的滲入，產(chǎn)生局部酸性環(huán)境，促進材料的降解;而大孔結(jié)構(gòu)則有利于發(fā)揮材料的骨傳導(dǎo)性，400?700 Mi的大孔有利于纖維血管組織和骨組織長入，有利于骨組織長入的理想孔徑為150?600 Mi。支架的抗壓強度為20?30MPa，達到甚至超過人松質(zhì)骨的抗壓強度。因此，該支架滿足骨組織工程支架材料對多孔結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能的要求。
[0050]以上對本發(fā)明的【具體實施方式】做了詳細說明，但是本發(fā)明并不限于上述實施方式，在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所具備的知識范圍內(nèi)，還可以在不脫離本發(fā)明宗旨的前提下做出各種變化。
【主權(quán)項】
1.一種骨組織工程支架材料的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)按明膠與去離子水的質(zhì)量比為1:100?1:5的比例將明膠溶于去離子水中得到溶膠A； (2)按改性羥基磷灰石與明膠質(zhì)量比為7?8:3?2的比例向溶膠A中加入改性羥基磷灰石，同時加入粒徑大小為80?200 Mi的硬脂酸微球作為造孔劑，攪拌均勻，冷卻至4?15°C后得到泥料B;造孔劑的加入量為造孔劑與改性羥基磷灰石總質(zhì)量的40%?50%; (3)將泥料B經(jīng)過高分子材料模板擠壓成型，在無水乙醇中脫水固化8?12h得到支架C; (4)將支架C切割成所需長度的柱狀蜂窩支架，室溫下干燥得到支架D，然后將支架D置于質(zhì)量百分比濃度為1%?10%的戊二醛溶液中交聯(lián)24?48 h，清洗后烘干得到支架E，然后用無水乙醇去除支架E中的造孔劑，室溫下干燥后得到改性羥基磷灰石骨組織工程支架。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述骨組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述改性羥基磷灰石為摻雜明膠的羥基磷灰石，其中明膠的質(zhì)量百分比為20%-30%。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述骨組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:所述改性羥基磷灰石的粒度為20-200nmo4.根據(jù)權(quán)利要求1所述骨組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:步驟(4)中用無水乙醇去除支架E中的造孔劑的具體方法為:將支架E置于40?45 °C的無水乙醇中浸泡36?48h，然后用30 °C-50 °C無水乙醇清洗。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述骨組織工程支架材料的制備方法，其特征在于:本發(fā)明所述高分子材料模板為帶孔的PMMA板、PE板、PTFE板。
【文檔編號】A61L27/46GK105963789SQ201610386992
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】陳希亮, 聶達, 陳慶華, 徐靜靜
【申請人】昆明理工大學(xué)