人類骨髓細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)，特別是一種人類骨髓細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，用于人類血液細(xì)胞的分離技術(shù)也得到了長(zhǎng)足的發(fā) 展，目前主要有W下幾種處理方法；免疫磁珠法、流式細(xì)胞儀法、血細(xì)胞分離機(jī)法和培養(yǎng)擴(kuò) 增法，上述方法存在造價(jià)高，中低收入患者不適用，對(duì)細(xì)胞本身活性有損傷，影響細(xì)胞治療 療效，患者承擔(dān)一定的生命危險(xiǎn)，污染率高，干細(xì)胞向未知方向分化為未知干細(xì)胞，時(shí)間長(zhǎng) 等缺陷。
[0003] CN1948467A公開了一種用于分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞的試劑盒，其缺點(diǎn)是由于使用該 專利直接分離血液中的干細(xì)胞，數(shù)量不足W臨床治療使用，所W該專利進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)，培 養(yǎng)的細(xì)胞污染率高，體外模擬體內(nèi)環(huán)境使細(xì)胞擴(kuò)增，導(dǎo)致培養(yǎng)出的細(xì)胞有形態(tài)沒(méi)功能，不能 用于臨床治療；CN101144070A公開了一種骨髓廝帶血干細(xì)胞體外分離試劑盒及其應(yīng)用方 法，其缺點(diǎn)是該專利試劑中添加了 lin抗體，導(dǎo)致成本大大提高，投入到臨床使用中后，給 中低收入患者造成負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致患者看不起病，接受不起細(xì)胞治療，并且使用了 lin抗體對(duì)細(xì) 胞清洗造成了較大負(fù)擔(dān)，此種物質(zhì)進(jìn)入人體后會(huì)發(fā)生何種變化還是未知數(shù)，還有待進(jìn)一步 研究。
[0004] 綜上，現(xiàn)有細(xì)胞分離技術(shù)主要存在W下幾方面問(wèn)題；1、治療成本高。完成細(xì)胞分離 工作的儀器設(shè)備(如；血細(xì)胞分離機(jī)及流式細(xì)胞儀）價(jià)格昂貴，導(dǎo)致治療成本升高，增加了患 者的治療費(fèi)用，不利于項(xiàng)目的推廣和普及；2、細(xì)胞活性低。免疫磁珠法和流式細(xì)胞儀法篩 選出來(lái)的均是被標(biāo)記了的細(xì)胞，送些分選方法均存在篩選細(xì)胞范圍小、細(xì)胞負(fù)重后活性降 低W及標(biāo)記物留在人體內(nèi)會(huì)變成什么還是未知等問(wèn)題；3、細(xì)胞液體積大。使用血細(xì)胞分離 機(jī)分離的一般為外周血，且需要采集前打2-7天動(dòng)員劑，將骨髓中干細(xì)胞動(dòng)員到外周血里， 經(jīng)血細(xì)胞分離機(jī)處理后篩選出的細(xì)胞液體積較大，一般都超過(guò)50ml，且紅細(xì)胞去除不干凈。 最后得到的細(xì)胞懸液體積大、質(zhì)量不佳，只能用于自體皮下注射；4、獲取細(xì)胞時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。培 養(yǎng)擴(kuò)增一周后才能用于臨床治療，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)延誤治療的最佳時(shí)機(jī)，影響治療效果，培養(yǎng)期 間造成污染率提高；5、傳統(tǒng)的分離方法僅限于實(shí)驗(yàn)室及科研使用。許多分離方法操作過(guò)程 繁瑣，對(duì)人員的專業(yè)要求較高，既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。從實(shí)驗(yàn)方法到臨床應(yīng)用還需要技術(shù)改進(jìn)；6、 不能產(chǎn)業(yè)化。實(shí)驗(yàn)成本高、操作環(huán)節(jié)中污染機(jī)率大、細(xì)胞液的保存運(yùn)輸條件不備，導(dǎo)致提取 的細(xì)胞液數(shù)量有限，滿足不了臨床治療的大量需求；另外，上述相關(guān)專利還存在原料來(lái)源復(fù) 雜、配制繁瑣、對(duì)于分離哪種血液針對(duì)性不強(qiáng)（因?yàn)槿祟愌蛣?dòng)物血細(xì)胞存在一定差異)，原 料用到質(zhì)量難W控制的生物制品等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為了提供一種可操作性強(qiáng)、臨床安全性高、便于臨床推廣的人類 骨髓細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法，該試劑盒易于存儲(chǔ)運(yùn)輸、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、使用方便快 捷。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案是： 一種人類骨髓細(xì)胞處理試劑盒，其特征在于，含有W下Η種試劑： 1號(hào)試劑為稀釋劑；〇. 5%-20%氯化鋼注射液或PBS液， 2號(hào)試劑為沉淀劑；0. 5%-20%居己基淀粉或甲基纖維素， 3號(hào)試劑為分層液：由聚藏糖和泛影葡胺配制成的密度為1. 0-1. 2的分層液。
[0007] -種人類骨髓細(xì)胞處理方法，其特征在于：將含有構(gòu)稼酸鋼抗凝液的骨髓加入到 含有20-350毫升1號(hào)試劑的大容量培養(yǎng)液瓶中，再加入4-200毫升2號(hào)試劑搖勻，后靜置 待分層后吸取上層細(xì)胞液W 500-4000rpm離必1-20分鐘，離必濃縮后用生理鹽水稀釋到 10-150毫升鋪到1-100毫升3號(hào)液上層，然后W 500-4000巧m離必1-60分鐘使分出干細(xì)胞 層，收集干細(xì)胞層后用生理鹽水清洗細(xì)胞備用。
[0008] 本發(fā)明的有益效果是： 1、將試劑盒中1號(hào)2號(hào)3號(hào)試劑組合應(yīng)用，利用人類各種血細(xì)胞密度不同，通過(guò)2號(hào) 試劑結(jié)合血液中紅細(xì)胞等不能起到臨床治療效果的細(xì)胞，使其重量增加，沉淀到細(xì)胞培養(yǎng) 液瓶的底部，再利用各種細(xì)胞密度差異將它們分散于自上而下的試劑層次中去除人類骨髓 中的紅細(xì)胞，血漿，血小板，血紅蛋白，粒細(xì)胞等，經(jīng)過(guò)本發(fā)明分離的干細(xì)胞回收率能夠達(dá)到 90% W上，由于干細(xì)胞等細(xì)胞沒(méi)有標(biāo)記物等負(fù)重，使細(xì)胞存活率檢測(cè)大于98%。
[0009] 2、1-3號(hào)試劑原料便宜，配置過(guò)程簡(jiǎn)單質(zhì)量可控，具有造價(jià)低，無(wú)任何標(biāo)記物，保留 原有細(xì)胞活性，細(xì)胞液體積小，干細(xì)胞種類齊全，分離操作時(shí)間短1小時(shí)左右即可完成，細(xì) 胞數(shù)量能夠滿足臨床治療的需要等優(yōu)點(diǎn)。
[0010] 3、本發(fā)明試劑盒中原料簡(jiǎn)單易得，成本低廉，不使用質(zhì)量難W控制的生物制品。能 夠?qū)崿F(xiàn)在最低的價(jià)格，最簡(jiǎn)便的分離方法下分離出治療所需要的細(xì)胞的目的。
[0011] 4、本明可配有大容量培養(yǎng)液瓶，免除了臨床現(xiàn)有少量多次處理細(xì)胞的繁瑣過(guò)程， 大大降低了污染機(jī)率，對(duì)環(huán)境及細(xì)胞本身不會(huì)造成任何污染，是臨床上迫切需要的一種分 離細(xì)胞的試劑盒及方法。
【具體實(shí)施方式】 [001引 實(shí)施例1 該人類骨髓細(xì)胞處理試劑盒，其中包含W下Η種試劑： 1號(hào)試劑為稀釋劑；0. 9%氯化鋼注射液或PBS液， 2號(hào)試劑為沉淀劑；6%居己基淀粉或甲基纖維素， 3號(hào)試劑為分層液：由聚藏糖和泛影葡胺配制成的密度為1. 075±0. 001的分層液。
[0013] 其中，1號(hào)試劑(稀釋劑）;選用PBS液，其配制過(guò)程是先用少量水溶解下述試劑：氯 化鋼4g，氯化鐘0.1 g，12水磯酸氨二鋼1. 445g，磯酸二氨鐘0.1 g，然后加水至500ml，即得。 使用前利用5. 6%的碳酸鋼調(diào)節(jié)抑至7. 2 ;2號(hào)試劑(沉淀劑);6%居己基淀粉(市售);3號(hào)試 劑(分層液）；將聚藏糖與泛影葡胺配制成比重為1. 075的分層液；將上述1號(hào)液經(jīng)過(guò)10分 鐘滅菌，檢測(cè)其內(nèi)毒素含量《0.祀U(xiǎn)/ml，裝瓶，4°C保存。3號(hào)液經(jīng)過(guò)10分鐘滅菌，檢測(cè)其內(nèi) 毒素含量《祀U(xiǎn)/ml，裝瓶。
[0014] 利用上述試劑盒對(duì)細(xì)胞處理方法；將含有構(gòu)稼酸鋼抗凝液的人類骨髓200ml加入 至恰有200ml的試劑1號(hào)液中，再加入150ml試劑2號(hào)液中，搖勻3分鐘，放置30分鐘，待 分層后吸取上層細(xì)胞液，分裝至50ml離必管中，W 150化pm離必5分鐘，搜集下層細(xì)胞液， 用生理鹽水稀釋后鋪在試劑3液上，W 2000rpm離必20分鐘，收集中間干細(xì)胞層后，用生理 鹽水清洗3次，再用生理鹽水稀釋至臨床使用體積即得。
[001引表1 ;實(shí)施例1中分離出的干細(xì)胞回收率 實(shí)施例2
試劑盒組成如下： 1號(hào)試劑(稀釋劑）：0. 9%氯化鋼注射液（即生理鹽水）市售。
[0016] 2號(hào)試劑(沉淀劑）；甲基纖維素(進(jìn)口）50克，加入到500毫升4°C生理鹽水中，搖 勻。即得10%甲基纖維素。
[0017] 3號(hào)試劑(分層液）；將聚藏糖與泛影葡胺配制成比重為1. 075的分層液。
[001引將上述2號(hào)液經(jīng)過(guò)10分鐘滅菌，檢測(cè)其內(nèi)毒素含量《0.祀U(xiǎn)/ml，裝瓶，4°C保存。3 號(hào)液經(jīng)過(guò)10分鐘滅菌，檢測(cè)其內(nèi)毒素含量《祀U(xiǎn)/ml，裝瓶。
[0019] 將含有構(gòu)稼酸鋼抗凝液的人類骨髓200ml加入到含有200ml的試劑1號(hào)液中，再 加入150ml試劑2號(hào)液中，搖勻3分鐘，放置30分鐘，待分層后吸取上層細(xì)胞液，分裝至50ml 離必管中，W 1500rpm離必5分鐘，搜集下層細(xì)胞液，用生理鹽水稀釋后鋪在試劑3液上，W 2000rpm離必20分鐘，收集中間干細(xì)胞層后，用生理鹽水清洗3次，再用生理鹽水稀釋至臨 床使用體積即得。
[0020] 表2 ;實(shí)施例2中分離出的干細(xì)胞回收率_
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種人類骨髓細(xì)胞處理試劑盒，其特征在于，含有以下三種試劑： 1號(hào)試劑為稀釋劑：〇. 5%-20%氯化鈉注射液或PBS液， 2號(hào)試劑為沉淀劑：0. 5%-20%羥乙基淀粉或甲基纖維素， 3號(hào)試劑為分層液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1. 0-1. 2的分層液。2. -種人類骨髓細(xì)胞處理方法，其特征在于：將含有枸櫞酸鈉抗凝液的骨髓加入到含 有20-350 _升1號(hào)試劑的大容量培養(yǎng)液瓶中，再加入4-200 _升2號(hào)試劑搖勻，后靜置 待分層后吸取上層細(xì)胞液以500-4000rpm離心1-20分鐘，離心濃縮后用生理鹽水稀釋到 10-150毫升鋪到1-100毫升3號(hào)液上層，然后以500-4000rpm離心1-60分鐘使分出干細(xì)胞 層，收集干細(xì)胞層后用生理鹽水清洗細(xì)胞備用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種人類骨髓細(xì)胞處理試劑盒及細(xì)胞處理方法，其特征在于，含有以下三種試劑：1號(hào)試劑為稀釋劑：0.5%-20%氯化鈉注射液或PBS液；2號(hào)試劑為沉淀劑：0.5%-20%羥乙基淀粉或甲基纖維素；3號(hào)試劑為分層液：由聚蔗糖和泛影葡胺配制成的密度為1.0-1.2的分層液。將含有枸櫞酸鈉抗凝液的骨髓加入到含有1號(hào)試劑的大容量培養(yǎng)液瓶中，再加入2號(hào)試劑搖勻，后靜置待分層后吸取上層細(xì)胞液離心1-20分鐘，離心濃縮后用生理鹽水稀釋并鋪到3號(hào)液上層，然后離心使分出干細(xì)胞層，收集干細(xì)胞層后用生理鹽水清洗細(xì)胞備用。其可操作性強(qiáng)、臨床安全性高、便于臨床推廣，該試劑盒易于存儲(chǔ)運(yùn)輸、可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)、使用方便快捷。
【IPC分類】C12N5/0775
【公開號(hào)】CN105670991
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】楊淑芬
【申請(qǐng)人】楊淑芬
【公開日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2014年11月19日