一種愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種愈創(chuàng)木燒型倍半祗化合物及其制備 方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 瓜薇木(Fissistigma 〇1化amiKHemsl. )Me;r;r.)，別名小香花藤、藤龍眼、降香藤， 是番慕枝科(Annonaceae)瓜薇木屬植物。該植物可做藥用，莖、葉可W治骨折水腫，全株可 W治療風(fēng)濕骨痛、手足麻木等。從瓜薇木分離得到的愈創(chuàng)木燒型倍半祗類(lèi)化合物未見(jiàn)報(bào)道， 也未見(jiàn)該類(lèi)化合物在抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖中的應(yīng)用中的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種從瓜薇木中提取分離的愈創(chuàng)木燒型倍半 祗化合物。
[0004] 本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述愈創(chuàng)木燒型倍半祗化合物的制備方法。
[0005] 本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供上述愈創(chuàng)木燒型倍半祗化合物的應(yīng)用。
[0006] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種愈創(chuàng)木燒型倍半祗化合物，其結(jié)構(gòu)通式如下：
[0008]
[0009] 其中Ri、R2、R3、R4分別獨(dú)立選自為-OH或-C也OH或-C也或-H。
[0010] 上述愈創(chuàng)木焼型倍半祗化合物，優(yōu)選結(jié)構(gòu)式如下：
[0011]
[0012] 上述優(yōu)選愈創(chuàng)木燒型倍半祗化合物的制備方法，它包括如下步驟：
[0013] (1)制備瓜薇木提取物
[0014] 將瓜薇木干燥的莖用30~95%v/v的乙醇冷浸或者是熱提，得到提取液，減壓濃縮 成膏狀，即為瓜薇木提取物；
[00巧](2)分離純化
[0016] 將上述瓜薇木提取物用水稀釋制成懸浮液后，依次用石油酸、乙酸乙醋進(jìn)行萃取， 將乙酸乙醋萃取液濃縮成浸膏，經(jīng)柱層析、薄層層析、分子篩層析分離得到，該化合物為新 化合物且命名為Fissistigmate;rpene A。
[0017] 步驟（1)中，減壓濃縮，溫度為30~70°C，壓力為-0.06~-0.15MPa，優(yōu)選溫度為45 °C，優(yōu)選壓力為-0.0 95MPa。
[001引步驟(2)中，所述濃縮，溫度為30~70°C，壓力為-0.06~-0.15MPa，優(yōu)選溫度為45 °C，優(yōu)選壓力為-0.095MPa。
[0019] 步驟（2)中，柱層析的條件為：用200~300目硅膠上柱，乙酸乙醋體積百分?jǐn)?shù)為 20 %的乙酸乙醋-石油酸混合溶劑為洗脫劑。
[0020] 步驟(2)中，薄層層析條件為：W乙酸乙醋體積百分?jǐn)?shù)為25%的乙酸乙醋-石油酸 混合溶劑為展開(kāi)劑。
[0021] 步驟(2)中，分子篩層析條件為:分子篩為Se地adex LH-20, W氯仿體積百分?jǐn)?shù)為 40%的氯仿-甲醇混合溶劑為洗脫劑。
[0022] 上述愈創(chuàng)木燒型倍半祗化合物在制備抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用也在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0023] 上述愈創(chuàng)木燒型倍半祗化合物在制備抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖藥物中的 應(yīng)用也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之類(lèi)。
[0024] 其中，所述的滑膜細(xì)胞為原代大鼠滑膜細(xì)胞。
[0025] 有益效果:本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了愈創(chuàng)木燒型倍半祗化合物在抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜 細(xì)胞增殖中的活性，可用于制備抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 根據(jù)下述實(shí)施例，可W更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0027] 實(shí)施例1:倍半祗類(lèi)化合物的制備。
[00%]瓜薇木干燥的莖IOKg按常規(guī)用75%v/v的乙醇浸提3次每次7天，得到提取液，將提 取液減壓濃縮成膏狀，得到瓜薇木提取物1200g。將提取物用蒸饋水(3L)稀釋成懸浮液，依 次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋萃取(化X3次），將乙酸乙醋萃取液濃縮成浸膏（約250邑）， 進(jìn)行硅膠柱層析，W石油酸-乙酸乙醋混合溶劑（100:0-0 :100, V/V)及乙酸乙醋-甲醇 (100:0-0:100，￥八)按極性遞增進(jìn)行硅膠柱層析，并按每次約4001111收集饋分。通過(guò)化(：檢 測(cè)合并相似流分分成8個(gè)組分，目陽(yáng)r. 1-8 Jr. 3用200~300目硅膠上柱，乙酸乙醋體積百分 數(shù)為20%的乙酸乙醋-石油酸混合溶劑為洗脫劑進(jìn)行洗脫，W乙酸乙醋體積百分?jǐn)?shù)為25% 的乙酸乙醋-石油酸混合溶劑為展開(kāi)劑進(jìn)行薄層層析，根據(jù)層析效果合并流分得到3個(gè)組分 化.3-1 ,Fr.3-2W及Fr.3-3。化.3-2W氯仿體積百分?jǐn)?shù)為40%的氯仿-甲醇混合溶劑為洗脫 劑進(jìn)行分子篩S邱hadex LH-20柱層析除去色素后得到組分化.3-2-1，化.3-2-1用高效液相 進(jìn)行分析制備，洗脫劑為乙臘和水其體積配比為2: 3得到愈創(chuàng)木燒型倍半祗化合物 Fissistigmaterpene Ad
[00巧]愈創(chuàng)木焼型倍半聰化合物Fissistigmate巧ene A的結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果如下：
[0030] Fissistigmate巧eneA:為淡黃色油狀物。紫外254nm有暗斑，5%硫酸-香草醒顯 色顯紫紅色。旋光度為杉巧十：$5.4(〔==0.2>^(州)，冊(cè)-651-18 111八251.1642^-扣-，結(jié)合 Ih-NMR和"C NMR可知分子式為C礎(chǔ)24〇3,計(jì)算不飽和度為4。根據(jù)Ih-NMR和DEPT可知化合物中 含有 3 個(gè)甲基信號(hào)[M.79(d，J = 6.細(xì)z)、0.81(d，J = 6.細(xì)z)、0.83(s)];根據(jù)l3c-NMR和DEPT 可知化合物中有3個(gè)甲基碳、6個(gè)次甲基，4個(gè)亞甲基2個(gè)季碳。因此，可知化合物1為倍半祗類(lèi) 化合物。根據(jù)Ih-Ih COSY可知:H-2/H-3/H-4/H-5相關(guān)，H-4/H-12/H-13相關(guān)，因此，可W確定 片段 C-2-C-3-C-4--C-5，C-4-C-11-C-12，C-11-C-3; H-8/H-9-H-10 相關(guān)，可 W確定 C-8-C-9-C-IO片段。運(yùn)兩個(gè)片段的連接是通過(guò)HMBC來(lái)確認(rèn)的。在HMBC譜中，H-15與C-2/C-1/C-10/C-5 相關(guān)，H-5與C-6/C-7相關(guān)說(shuō)明運(yùn)兩個(gè)片段分別通過(guò)C-I和C-6-C-7連接的。化合物的相對(duì)構(gòu) 型是通過(guò)N犯SY確定W及禪合常數(shù)來(lái)確定的，H-5的最大禪合常數(shù)為9.2Hz，表明H-4與H-5處 于反軸位置，NOESY譜中H-5與H-IO相關(guān)說(shuō)明運(yùn)兩個(gè)氨處于同一側(cè);H-4與H-15相關(guān)說(shuō)明H-4 與H-15處于同一側(cè)。至此，確定該化合物為愈創(chuàng)木燒型的新倍半祗化合物。
[0031 ] 夫1化會(huì)物n的Ih-NMR前Ur-NMR掀據(jù)
[0032]
123 實(shí)施例2:藥理活性實(shí)驗(yàn) 2 實(shí)驗(yàn)材料 3 細(xì)胞:滑膜細(xì)胞(原代大鼠滑膜細(xì)胞）。
[0036] 細(xì)胞培養(yǎng)液:原代大鼠滑膜細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0037] 試劑：嚷挫藍(lán)（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl )-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT，Sigma生產(chǎn)）。乳酸脫氨酶（lac1:ate dehy化Ogenase，LDH)試劑盒(購(gòu)自碧云天 公司）。甲氨蝶嶺(methot rexate，MTX，上海信宜藥廠有限公司，批號(hào)20140307)。
[003引1.4儀器:96孔細(xì)胞培養(yǎng)板;infinite 200Pro多功能酶標(biāo)儀。
[0039] 實(shí)驗(yàn)方法
[0040] MTT法測(cè)定藥物對(duì)滑膜細(xì)胞的抑制作用
[0041] 取對(duì)數(shù)期的滑膜細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板（1 X IO4個(gè)細(xì)胞/孔），設(shè)置為空白組(不給 予藥物）、甲氨蝶嶺組（給予lyg/mL的甲氨蝶嶺）、給藥組（給予10、50、10化邑/1111^農(nóng)度的藥 物），培養(yǎng)解育過(guò)夜后用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞給予不同濃度的藥物培養(yǎng)4她后，每孔加入10化濃度為 5mg/mL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)地后，小屯、吸棄培養(yǎng)上清液，每孔加入10化L的DMSO溶解甲瑣結(jié)晶，室 溫震搖5min，完全溶解后，用酶標(biāo)儀在57化m處檢測(cè)光密度(OD值）。根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞存活 率。
[0042]
[0043] LDH活性檢測(cè)法測(cè)藥物對(duì)滑膜細(xì)胞細(xì)胞活力的影響
[0044] 取對(duì)數(shù)期的滑膜細(xì)胞接種至96孔培養(yǎng)板（1 X IO4個(gè)細(xì)胞/孔），設(shè)置為空白組(不給 予藥物）、甲氨蝶嶺組（給予lyg/mL的甲氨蝶嶺）、給藥組（給予10、50、lOOiig/mL濃度的藥 物），培養(yǎng)解育過(guò)夜，各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，取細(xì)胞上清液，LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)LD田舌性。LDH 的活力按照下述公式計(jì)算。
[0045]
[0046] 統(tǒng)計(jì)方法
[0047] 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，用單因 素方差(one-way AN0VA)分析組間差異。WP<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
[004引實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0049] MTT法測(cè)定藥物對(duì)滑膜細(xì)胞的抑制作用
[0050] 使用不同濃度藥物培養(yǎng)48h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖作用結(jié)果見(jiàn)下表2。結(jié)果表明 Fissistigmate巧ene A對(duì)滑膜細(xì)胞具有很好的抑制作用。
[0051] 表2各藥物對(duì)滑膜細(xì)胞的抑制作用
[0化2]
[0化3]
[0054] 注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。
[0055] LDH活性檢測(cè)法測(cè)藥物對(duì)滑膜細(xì)胞細(xì)胞活力的影響
[0056] 使用不同濃度藥物培養(yǎng)4她后，U)田舌性檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞活力結(jié)果見(jiàn)下表3。結(jié)果顯 示不同濃度的藥物處理后，升高了細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性(P<0.05或P<0.0 l)。
[0057] 表3各藥物對(duì)滑膜細(xì)胞LDH活性的作用 [0化引
[0059] 注：與空白組比較，吁<0.05，*中<0.01。
[0060] W上結(jié)果表明愈瘡木燒型倍半祗化合物Fissistigmate巧ene A對(duì)滑膜細(xì)胞具有 很好的抑制效果，能提高細(xì)胞培養(yǎng)液中L D H活性。實(shí)驗(yàn)表明倍半祗化合物 Fissistigmate巧ene A具有良好的抗風(fēng)濕藥效，可W用于抗風(fēng)濕藥物的制備。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物，其結(jié)構(gòu)通式如下：其中Ri、R2、R3、R4分別獨(dú)立選自為-OH或-CH2OH或-CH3或-H。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物，其特征在于，其結(jié)構(gòu)式如下：3. 權(quán)利要求2所述的愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的制備方法，其特征在于，它包括如下步 驟： (1) 制備瓜馥木提取物 將瓜馥木干燥的莖用30~95%v/v的乙醇冷浸或者是熱提，得到提取液，減壓濃縮成膏 狀，即為瓜馥木提取物； (2) 分離純化 將上述瓜馥木提取物用水稀釋制成懸浮液后，依次用石油醚、乙酸乙酯進(jìn)行萃取，將乙 酸乙酯萃取液濃縮成浸膏，經(jīng)柱層析、薄層層析、分子篩層析分離得到。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的制備方法，其特征在于，步驟（1) 中，減壓濃縮，溫度為30~70 °C，壓力為-0 · 06~-0 · 15MPa。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的制備方法，其特征在于，步驟(2) 中，所述濃縮，溫度為30~70°C，壓力為-0.06~-0· 15MPa。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的制備方法，其特征在于，步驟(2) 中，柱層析的條件為：用200~300目硅膠上柱，乙酸乙酯體積百分?jǐn)?shù)為20%的乙酸乙酯-石 油醚混合溶劑為洗脫劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的制備方法，其特征在于，步驟(2) 中，薄層層析條件為：以乙酸乙酯體積百分?jǐn)?shù)為25%的乙酸乙酯-石油醚混合溶劑為展開(kāi) 劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物的制備方法，其特征在于，步驟(2) 中，分子篩層析條件為:分子篩為Sephadex LH-20，以氯仿體積百分?jǐn)?shù)為40 %的氯仿-甲醇 混合溶劑為洗脫劑。9. 權(quán)利要求2所述的愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物在制備抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。10. 權(quán)利要求2所述的愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物在制備抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增 殖藥物中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物，其結(jié)構(gòu)式如下，本發(fā)明還公開(kāi)了該化合物的制備方法和其在制備抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了愈創(chuàng)木烷型倍半萜化合物在抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞增殖中的活性，可用于制備抗類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥物。
【IPC分類(lèi)】A61K31/122, C07C49/733, A61P19/02, C07C45/78
【公開(kāi)號(hào)】CN105669416
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】陳光英, 周學(xué)明, 韓長(zhǎng)日, 宋小平, 徐偉, 鄭彩娟
【申請(qǐng)人】海南師范大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2015年11月10日