一種檢測(cè)豬弓形蟲病的引物、試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種檢測(cè)豬弓形蟲病的 引物、試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 弓形蟲?。═oxoplasmosis)是剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii)引起的一種世界 范圍廣泛分布的人獸共患病，宿主范圍十分廣泛，人及大多數(shù)動(dòng)物感染率都較高。弓形蟲病 常導(dǎo)致動(dòng)物流產(chǎn)、弱胎、死胎、生長(zhǎng)受阻及死亡(王金蘋.弓形蟲病PCR和ELISA診斷方法的建 立和初步應(yīng)用.[碩士學(xué)位論文]，2005,華中農(nóng)業(yè)大學(xué);江濤.豬弓形蟲病分子診斷方法的建 立與基因免疫研究.[博士學(xué)位論文]，2006，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)）。
[0003] 豬弓形蟲病是養(yǎng)豬生產(chǎn)中較為常見和多發(fā)的一種傳染性寄生蟲病。臨床上以高熱 稽留、呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)異常為主要發(fā)病特征，發(fā)病急、傳染性強(qiáng)，病死率較高。懷孕母豬感染 發(fā)病后多發(fā)生流產(chǎn)或死胎。
[0004] 目前豬弓形蟲病的檢測(cè)方法主要為病原學(xué)診斷方法，包括病料直接鏡檢和病原分 離。病原學(xué)診斷方法較為簡(jiǎn)單，結(jié)果可靠，但檢出率低，耗時(shí)，容易漏診，一般不能進(jìn)行生前 診斷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種豬弓形蟲病的檢測(cè)方 法，以及該檢測(cè)方法所使用的引物，該引物可特異性擴(kuò)增豬弓形蟲，快速對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢 測(cè) 。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：
[0007] 一種檢測(cè)豬弓形蟲病的引物，所述引物如SEQ ID No:l和SEQ ID No:2所示。
[0008] 上述引物在制備檢測(cè)豬弓形蟲病的試劑盒中的應(yīng)用。
[0009] -種檢測(cè)豬弓形蟲病的試劑盒，所述試劑盒包括上述檢測(cè)豬弓形蟲病的引物。
[0010] -種檢測(cè)豬弓形蟲病的方法，采用上述引物，包括以下步驟：
[0011] 以待檢豬樣本基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，電泳鑒定;所述PCR擴(kuò)增反應(yīng) 的反應(yīng)體系為： Premix EX Taq 12 5μΙ SEQ ID No: 1 liiL
[0012] SEQ ID No:2 IpL 糢板 IpL· 滅菌蒸餾水 加至25pL ;
[0013] 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C 5min進(jìn)行預(yù)變性；然后94°C 30s，55 °C 30s，72 °C40s，35次循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著效果：
[0015] 1、本發(fā)明的檢測(cè)豬弓形蟲病的引物可以特異性地?cái)U(kuò)增豬弓形蟲，對(duì)其他常見病原 如豬附紅細(xì)胞體、豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、副豬 嗜血桿菌等無(wú)反應(yīng)；
[0016] 2、本發(fā)明的檢測(cè)豬弓形蟲病的方法具有很高的靈敏性，靈敏度可達(dá)0.15ng左右， 可以方便、快捷的對(duì)各種臨床豬樣本的豬弓形蟲進(jìn)行檢測(cè)，有利于快速制定針對(duì)性的防控 措施，操作簡(jiǎn)單、實(shí)用。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中豬弓形蟲病的臨床樣品檢測(cè)，其中泳道1為豬弓形蟲陽(yáng)性 對(duì)照，泳道2為豬弓形蟲陰性對(duì)照，泳道3、4、5、6分別為臨床樣品；
[0018] 圖2為本發(fā)明試驗(yàn)例1中豬弓形蟲的PCR檢測(cè)方法的特異性的電泳圖譜，其中：泳道 1為豬弓形蟲陽(yáng)性樣品，泳道2為豬弓形蟲陰性樣品，泳道3-8分別為豬附紅細(xì)胞體、豬肺炎 支原體、豬多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌樣品；
[0019] 圖3為本發(fā)明試驗(yàn)例2中豬弓形蟲病的PCR檢測(cè)方法的靈敏度的電泳圖譜，其中泳 道1、2、3、4、5、6、7的0麻濃度分別為0.14948、0.01494 8、1.49叫、0.149叫、0.0149叫、 1·49pg、0·149pg〇
【具體實(shí)施方式】
[0020] 以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0021] 以下實(shí)施例中涉及的實(shí)驗(yàn)材料如無(wú)特殊說明，均來(lái)源于市售，以下實(shí)施例中所采 用的操作均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)操作。
[0022] 實(shí)施例1檢測(cè)豬弓形蟲病的引物和方法
[0023] 1、引物設(shè)計(jì)
[0024] 根據(jù)NCBI登陸的豬弓形蟲多拷貝B1基因序列（登錄號(hào)：EU340881，KT266796， LN714499，KF413760，EU340874，AF179871)進(jìn)行比對(duì)，并設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性擴(kuò)增豬弓形蟲的 引物，分別為F1、R1。
[0025] F1：CCCTTACTGCAAGAGAAGT(SEQ ID N0:1)
[0026] R1：GCTGCTTGAAGAGAGACGCT(SEQ ID NO:2)
[0027] 2、檢測(cè)方法
[0028] 包括以下步驟：
[0029] (1)待檢豬樣本基因組DNA提取
[0030]采用愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司DNA/RNA小量試劑盒。200yL待檢豬場(chǎng)采集的 抗凝血(編號(hào)3)、100mg的豬肺臟(編號(hào)4)、淋巴結(jié)(編號(hào)5)、胸腔積液(編號(hào)6)病料分別加入 lmL PBS緩沖液進(jìn)行充分研磨，-20°C反復(fù)凍融3次，8000rpm離心10min，取上清液200yL，轉(zhuǎn) 入1.5mL離心管中。加200yL Buffer V-L，漩渦振蕩混合均勻，靜置5min。加75yL Buffer V-N，漩渦振蕩混合均勻，12000g離心5min。將上清轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管中，加300yL異丙醇 (含1%冰醋酸），上下倒置6-8次混勻。將制備管置于2ml離心管中，將混合液移入制備管中， 8000g離心lmin。棄濾液，將制備管置回到2mL離心管中，加500yL Buf f er W1A，室溫靜置 lmin。12000g離心lmin。棄濾液，將制備管置回到2mL離心管中，加800yL Buf fer W2，12000g 離心lmin。將制備管置回到2mL離心管中，12000g離心lmin。將制備管置于潔凈的1.5mL離心 管中，在制備管膜中央加入40yL Buffer TE，室溫靜置lmirul^OOOg離心lmin，離心下來(lái)的 溶液即為基因組DNA模板。
[0031] (2)、PCR 擴(kuò)增
[0032] 將PCR反應(yīng)液加入PCR反應(yīng)管混合均勻后，加入基因組DNA模板，將PCR管置于PCR儀 上進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)；
[0033] PCR反應(yīng)體系如下，其中Premix EX Taq是PCR反應(yīng)用的DNA Polymerase、Buffer、 dNTP Mixture的2倍濃度的混合物，包含DNA Polymerase 1.25U/25yL、Buffer(Tris-HCl, ρΗ8·3 20mM，KCl 100mM，MgCl2 3mM)、dNTP Mixture各0.4mM:
[0034] Premix EX Taq 12.5μΙ.. FI 叫 R1 IpL
[0035] 模板 lpL 滅菌蒸餾水 加至25μL ;
[0036] 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)?94 °C5min進(jìn)行預(yù)變性;然后94 °C 30s，55 °C 30s，72 °C40s，35次循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0037] (3)、電泳鑒定
[0038] PCR擴(kuò)增后取5yL反應(yīng)產(chǎn)物，在1 % (質(zhì)量比）的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳鑒定，PCR產(chǎn) 物出現(xiàn)431bp條帶，即為豬弓形蟲陽(yáng)性，無(wú)條帶出現(xiàn)的為陰性，本實(shí)施例的豬樣本檢測(cè)結(jié)果 見圖1，豬樣本4、6檢測(cè)為陽(yáng)性;豬樣本3、5檢測(cè)為陰性。
[0039]試驗(yàn)例1特異性試驗(yàn)
[0040] 以豬附紅細(xì)胞體、豬肺炎支原體、豬多殺性巴氏桿菌、豬鏈球菌、豬胸膜肺炎放線 桿菌、副豬嗜血桿菌樣品進(jìn)行特異性檢測(cè)。使用實(shí)施例1中所提供的方法和引物進(jìn)行檢測(cè)， 結(jié)果顯示，除陽(yáng)性對(duì)照組外均沒有擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增結(jié)果見圖2。
[0041] 試驗(yàn)例2靈敏度試驗(yàn)
[0042] 用實(shí)施例1中制備的基因組模板用滅菌蒸餾水做10倍的梯度稀釋，基因組DNA含量 分別為〇 · 149yg、0 · 0149yg、1 · 49ng、0 · 149ng、0 · 0149ng、1 · 49pg、0 · 149pg。每個(gè)稀釋度各取1 yL作為模板，按實(shí)施例l方法進(jìn)行檢測(cè)，觀察陽(yáng)性條帶，以出現(xiàn)陽(yáng)性預(yù)期條帶所用模板量的 最高稀釋度計(jì)算其敏感性，結(jié)果表明最小檢出量為〇.149ng，見圖3。
[0043] 以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)豬弓形蟲病的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID No:l和SEQ ID No:2 所示。2. 權(quán)利要求1所述的引物在制備檢測(cè)豬弓形蟲病的試劑盒中的應(yīng)用。3. -種檢測(cè)豬弓形蟲病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1所述的檢測(cè) 豬弓形蟲病的引物。4. 一種檢測(cè)豬弓形蟲病的方法，其特征在于，采用如SEQ ID No: 1和SEQ ID No:2所示 的引物，包括W下步驟： W待檢豬樣本基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，電泳鑒定;所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反 應(yīng)體系為： Premix 防 Taq 12 5|iL SEQ ID No: 1 IpL SEQID No:2 I陣 模板 l|iL 巧茵蒸鏈水 加至25pL ; 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C5min進(jìn)行預(yù)變性;然后94°C30s，55°C30s，72°C 4〇3,35次循環(huán);最后72°(：延伸1〇111111。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)豬弓形蟲病的引物、試劑盒及方法，所述引物如SEQ？ID？No:1和SEQ？ID？No:2所示，所述方法是以待檢豬樣本基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，電泳鑒定。本發(fā)明的檢測(cè)豬弓形蟲病的引物可以特異性地?cái)U(kuò)增豬弓形蟲，對(duì)其他常見病原無(wú)反應(yīng)；方法具有很高的靈敏性，可以方便、快捷的對(duì)各種臨床豬樣本的豬弓形蟲進(jìn)行檢測(cè)，有利于快速制定針對(duì)性的防控措施，操作簡(jiǎn)單、實(shí)用。
【IPC分類】C12N15/11, C12R1/90, C12Q1/68
【公開號(hào)】CN105648104
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】宋爽, 歐陽(yáng)海平, 王曉飛, 潘永飛, 王東東, 宋延華
【申請(qǐng)人】廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司
【公開日】2016年6月8日
【申請(qǐng)日】2016年4月6日