黃酮類化合物在制備抗乙肝病毒藥物中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及從藥用植物山芝麻中分離得到的黃酮類化合物在制備 抗乙肝病毒藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)有關(guān)統(tǒng)計顯示，全世界大約有3億多人為慢性乙肝病毒（HBV)攜帶者，我國約占 半數(shù)。乙肝病毒感染已成為全球性的影響人類健康的主要疾病之一，由于HBV感染可以導(dǎo) 致慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌，因此成為影響人類壽命的九大疾病之一。由于慢性HBV 感染者較非攜帶者發(fā)生肝癌的相對危險率為217,因此在全世界每年大約有200萬人死于 乙肝引起的肝硬化和肝癌，而我國又是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，每年約有25萬人死于與乙肝相 關(guān)的慢性肝?。ǜ斡不c肝癌）。上述疾病給人民健康和國民經(jīng)濟帶來巨大損失。因此，尋 求高效低毒的抗HBV藥物已成為刻不容緩的問題。
[0003] 藥物化學(xué)工作者在篩選抗HBV藥物的過程中進行了不懈的努力，但到目前為止能 治愈HBV感染的特效藥還在尋找。臨床上已獲得FDA正式批準(zhǔn)使用的α-干擾素和核苷類 藥物拉米呋啶只能在某種程度上獲得治療效果，對大多數(shù)病人還達不到治愈的目的，停止 治療后的"反跳"現(xiàn)象是醫(yī)藥工作者最感棘手的問題，所以開發(fā)研制高效、低毒、不"反跳"的 抗HBV新藥向藥物化學(xué)工作者提出了挑戰(zhàn)。在篩選抗HBV新藥的過程中，越來越多的藥物 化學(xué)工作者把注意力轉(zhuǎn)向了植物來源豐富、價廉易得、毒副作用小、分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的天 然化合物。
[0004] 山芝麻（Helicteres angustifolia L.)為梧桐科植物，主要分布于嶺南地區(qū)，其 根或全株藥用，具有解表清熱、消腫解毒的功能，常用于治療感冒發(fā)熱、肺熱咳嗽、咽喉腫 痛、頭痛、腸炎、癰腫等癥，在涼茶配方中也常出現(xiàn)。藥理研究表明山芝麻具有抗菌、抗炎、抗 病毒及抗腫瘤等活性。我們的研究表明山芝麻粗提物具有很好的抗HBV活性，但對其抗HBV 的藥效物質(zhì)卻缺乏研究，而本發(fā)明涉及的黃酮類化合物尚未見抗HBV活性報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供從山芝麻中分離得到的黃酮類化合物在制備抗乙肝病毒藥 物中的用途。
[0006] 本發(fā)明應(yīng)用現(xiàn)代藥理篩選方法，從梧桐科山芝麻屬（Helicteres)植物山芝麻 (H. angustifolia)中提取分離得到黃酮類化合物：5, 7, 8-三羥基-4' -甲氧基黃酮（1)和 翻白葉苷A (2)，并經(jīng)試驗證實所述化合物具有抗HBV活性。
[0007] 本發(fā)明所述的活性化合物具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0008]
[0009] 本發(fā)明中，
[0010] 化合物 5, 7, 8-三羥基-4' -甲氧基黃酮（1)，其中，R1 = 0H，R2 = H，R3 = OCH3 ;
[0011] 化合物翻白葉苷A (2)，其中，R1 = H，R2 = 0A，R3 = 0H，且取代基R2中的基團A為：
[0012]
[0013] 本發(fā)明的化合物通過下述方法制備：
[0014] 取山芝麻干燥地上部分15kg，95%乙醇回流提取，濃縮后分別用石油醚、乙酸乙酯 和正丁醇萃取，共得I. 05kg，取乙酸乙酯萃取物160g進行硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇梯 度洗脫，所得流份以不同洗脫劑進行反復(fù)硅膠柱色譜、MPLC和Sephadex LH-20凝膠柱色譜 等分離純化手段分離得到化合物5, 7, 8-三羥基-4'-甲氧基黃酮（1)和翻白葉苷A (2)。
[0015] 本發(fā)明所述的黃酮類化合物5, 7,8_三羥基_4'_甲氧基黃酮（1)和翻白葉苷A(2) 進行了體外抗HBV實驗，結(jié)果證實，所述化合物具有顯著的抗HBV活性，且有效濃度低，其 中5, 7, 8-三羥基-4' -甲氧基黃酮⑴對HBsAg的IC5。值為49. 3 μ g/ml，對HBeAg的IC5q 值為68. 4 μ g/ml ;翻白葉苷A(2)對HBsAg的IC5。值為14. 6 μ g/ml，對HBeAg的IC5。值為 41. 5 μ g/ml，顯著高于陽性對照拉米呋啶；所述化合物可作為活性成分用于制備抗HBV的 藥物。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1提取、分離、制得黃酮類化合物
[0017] 取山芝麻干燥根15kg，粉碎，用95%乙醇回流提取3次（50LX3)，每次2h，合 并提取液并濃縮得浸膏l(xiāng).〇5kg，加水（4L)混懸，分別以等體積石油醚、乙酸乙酯和正 丁醇萃取5次，合并萃取液并濃縮至干，得乙酸乙酯萃取物160g。將乙酸乙酯萃取部 位經(jīng)硅膠（200-300目）柱色譜分離，依次以二氯甲烷-甲醇（50:1-0:1)梯度洗脫， 得到11個流份（Fr.l-ΙΙ)，其中流份Fr.3(30g)再經(jīng)硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇， 30: 1，20: 1，10: 1，5: 1，3: 1，I: I)、MPLC (甲醇-水，20:80-80:20 梯度洗脫）和 S印hadex LH-20凝膠柱色譜等手段純化，分離得到化合物5, 7, 8-三羥基-4' -甲氧基黃酮（1);流份 Fr. 4 (25g)再經(jīng)硅膠柱色譜（二氯甲烷-甲醇，30:1，20:1，10:1,5:1,3:1，1:1)、MPLC (甲 醇-水，20:80-80:20梯度洗脫）和S印hadex LH-20凝膠柱色譜等手段純化，分離得到化合 物翻白葉苷A (2)。
[0018] 其中，5, 7, 8-三羥基 _4' -甲氧基黃酮（5, 7, 8-trihydroxy-4' -methoxyflav one，l)為棕黃色無定型粉末，UV(MeOH) λ _ nm (l〇ge) :360 (2.54) ,324(3. 27) ,300(2 .86), 272(3. 11) ；IR(KBr) : unax(cm :3380, 1664, 1616, 1582 ；ESI-MS m/z : 301 [M+H]+ 〇 1H-NMR (400MHz, DMS〇-d6) δ H：6. 81 (1H, s, H-3), 6. 27 (1H, s, H-6), 8. 11 (2H, d, J = 8. 0Hz, H-2'，6'），7. 11 (2H, d, J = 8. 0Hz, H-3'，5'），12. 34 (1H, s, 5-OH)，3. 85 (3H, s, 4' -OC H3);13C-MMR(100MHz，DMS0-d 6)Sc:56.2(-0CH3)，99.1(C-6)，103.4(C-3)，103.8(C-10)，114 ? 5 (C-3'，C-5'），121. 2 (C-8)，122. 7 (C-Γ )，128. 6 (C-2'，C-6'），149. 5 (C-9)，156. 8 (C-5)，I 57. 2 (C-7)，162. 4 (C-4,），163. 3 (C-2)，182. I (C-4)。
[0019] 翻白葉苷 A(potengriffioside A, 2)為黃色無定形粉末，(c 0. 25,Me0H) ；UV (MeOH) Anax nm(log ε ) :360 (3. 21), 315 (3. 47), 302 (2. 95), 276 (3. 43 )；IR(KBr) : υ nax(cm :3385, 1660, 1606, 1512, 1448, 1366, 1167, 1077, 844 ；ESI-MSm/ z: 595 [M+H]+。1H-NMR (400MHz, DMS0-d6) δ H: 8. 07 (2H, d, J = 9. 0Hz, H-2'，6'），7. 49 (1H, d, J =15.6Hz，H-7 " ，），7.38(2H，d，J = 8.4Hz，H-2 " ，，6 " ，），6.90(2H，d，J = 9.0Hz，H-3'，5'），6.88(2H，d，J = 9.0Hz，H-3 " ，，5 " ，），6.36(lH，d，J = 2. 4Hz, H-8)，6. 20 (1H, d, J = 2. 4Hz, H-6)，6. 17 (1H, d, J = 15. 6Hz, H-8 " '），5. 34 (1H, m，J =4. 2Hz, H-I " ), 4. 41 (1H, dd, J = 12. 0, 11. 4Hz, H-6 " b), 4. 30(1H, dd, J = 11·4，12·0Ηζ，Η-6" a) ;13C-NMR(100MHz，DMS0-d6) Sc:158.6(C-2)，135.5(C-3)，179.6(C-4 )，163. 2 (C-5)，100. 2 (C-6)，166. I (C-7)，95. I (C-8)，159. 6 (C-9)，105. 9 (C-IO)，123. 0 (C-l '），132.5(C-2，，6，），116.3(C-3，，5，），161.4(C-4，），104.3(C-1")，76.1(C-2")，78.3(C-3" )，72. 0(C-4" )，76. 0(C-5" )，64. 7(C-6" ),127. 3(C-1" '），131. 5(C-2" '，6" '），117. 0(C-3 "，，5"，），161.8(C-4"，），146.8(C-7"，），115.0(C-8" '），169. I (C-9"，）。
[0020] 實施例2體外抗HBV實驗
[0021] 應(yīng)用!fep G2的2. 2. 15細(xì)胞株（教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點實驗室， 上海），以每孔IOX IO5個細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)基為DMEM，生長液含10 %胎牛血清， 38〇μ8/πι1 G418,0.03%谷胺酰胺，青霉素、鏈霉素各lOOμg/ml，在5% CO2孵箱中37°C培 養(yǎng)，48小時后，換成二甲基亞砜助溶的含藥物的培養(yǎng)液，每種藥物設(shè)3~5個濃度，每個濃度 設(shè)4個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)9天（每3天換液一次），收集上清液用ELISA檢測HBsAg及HBeAg 含量。同樣條件下以不含藥物的培養(yǎng)液上清液作為對照組。同時用上述細(xì)胞株，用MTT法 測定藥物的細(xì)胞毒性。陽性對照為拉米呋啶（3TC)。結(jié)果證實本發(fā)明所述化合物具有顯著 的抗HBV活性，且有效濃度低，其中5, 7, 8-三羥基-4' -甲氧基黃酮（1)對HBsAg的IC5。 值為49. 3 μ g/ml，對HBeAg的IC5。值為68. 4 μ g/ml ;翻白葉苷A(2)對HBsAg的IC5。值為 14. 6 μ g/ml，對HBeAg的IC5。值為41. 5 μ g/ml，顯著高于陽性對照拉米呋啶（表1)。
[0022] 表1.化合物1和2對HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用
[0023]
[0025] / :當(dāng)細(xì)胞毒性> 25%時不進行抑制率測試
[0026] 本發(fā)明中實驗采用的試劑均為本領(lǐng)域公知技術(shù)，可市購。
【主權(quán)項】
1. 具有下列結(jié)構(gòu)的黃麗類化合物在制備抗己肝病毒藥物中的用途，所述的化合物為5, 7, 8-H居基-4'-甲氧基黃麗（1)和翻白葉巧A (2)， 其中， 化合物5, 7, 8- H居基-4' -甲氧基黃麗（1)，其中，Ri = 0H，Rz = H，Rs = 0邸3 ; 化合物翻白葉巧A (2)，其中，Ri = H，Rz = 0A，Rs = 0H，且取代基R2中的基團A為：2. 按權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于，所述的化合物通過下述方法制備：取山芝麻 干燥根，粉碎，用95 %己醇回流提取3次，每次化，合并提取液并濃縮得浸膏，加水混懸，分 別W等體積石油離、己酸己醋和正了醇萃取5次，合并萃取液并濃縮至干，得己酸己醋萃取 物； 將己酸己醋萃取部位經(jīng)硅膠200-300目柱色譜分離，依次W二氯甲焼-甲醇50:1-0:1 梯度洗脫，得到11個流份化.1-11，其中流份化.3再經(jīng)硅膠柱色譜（二氯甲焼-甲醇， 30: 1，20: 1，10: 1，5: 1，3: 1，1:1)、MPLC (甲醇-水，20:80-80:20 梯度洗脫）和 Se5phadex LH-20凝膠柱色譜純化，分離得到化合物5, 7, 8- H居基-4' -甲氧基黃麗（1);流份化.4 再經(jīng)硅膠柱色譜（二氯甲焼-甲醇，30:1，20:1，10:1，5:1，3:1，1:1)、MPLC(甲醇-水， 20:80-80:20梯度洗脫）和Se地adex LH-20凝膠柱色譜純化，分離得到化合物翻白葉巧 A似。
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及黃酮類化合物在制備抗乙肝病毒藥物中的用途。本發(fā)明從山芝麻屬Helicteres植物山芝麻H.angustifolia中提取分離得到黃酮類化合物5,7,8-三羥基-4ˊ-甲氧基黃酮(1)和翻白葉苷A(2)，并經(jīng)試驗證實其具有抗乙肝病毒活性；與陽性對照拉米呋啶藥理試驗結(jié)果顯示，該黃酮類化合物具有顯著的抗乙肝病毒作用，其中5,7,8-三羥基-4ˊ-甲氧基黃酮(1)對HBsAg的IC50值為49.3μg/ml，對HBeAg的IC50值為68.4μg/ml；翻白葉苷A(2)對HBsAg的IC50值為14.6μg/ml，對HBeAg的IC50值為41.5μg/ml，顯著高于陽性對照拉米呋啶，所述的化合物可作為活性成分用于制備抗乙肝病毒的藥物。
【IPC分類】A61K31/352, A61K31/7048, A61P31/20
【公開號】CN105640933
【申請?zhí)枴?br>【發(fā)明人】陳道峰, 殷翔, 史訓(xùn)龍, 朱海燕, 盧燕
【申請人】復(fù)旦大學(xué)
【公開日】2016年6月8日
【申請日】2014年11月18日