一種雙酶解農(nóng)作物下腳料雙菌株發(fā)酵產(chǎn)l-乳酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及L-乳酸制備領(lǐng)域，具體涉及一種雙酶解農(nóng)作物下腳料雙菌株發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]L-乳酸是一種重要的有機(jī)酸，在化工、食品、醫(yī)藥等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用.近年來(lái)，聚乳酸類生物降解塑料的開發(fā)使L-乳酸的需求量猛增。L-乳酸以其具有的獨(dú)特構(gòu)型優(yōu)勢(shì)展示了其廣泛的應(yīng)用前景。隨著石油資源的枯竭和新型環(huán)保材料一一聚乳酸需求量的大幅度增加，人們正在努力尋找替代石油燃料的新能源和降低L-乳酸生產(chǎn)成本的新原料
[0003]以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)L-乳酸受到越來(lái)越多的關(guān)注和研究，木質(zhì)纖維素主要是由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素混合的材料。在植物纖維素中，纖維素、半纖維素占木質(zhì)纖維素質(zhì)量的70 %，纖維素和半纖維素必須經(jīng)過水解分別形成六碳糖和五碳糖后，才能被微生物利用而發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸。天然半纖維素水解產(chǎn)物的85%?90%是木糖。因此，為降低L-乳酸的生產(chǎn)成本，開發(fā)更為高效、經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)工藝，實(shí)現(xiàn)利用纖維素生產(chǎn)L-乳酸的工業(yè)化已成為當(dāng)務(wù)之急。
[0004]酶工程的發(fā)展使人們對(duì)纖維素酶解技術(shù)有了了解，纖維素的酶解技術(shù)開始有了進(jìn)一步的發(fā)展。纖維素酶水解可在常溫下進(jìn)行，對(duì)設(shè)備的要求簡(jiǎn)單，不產(chǎn)生對(duì)后續(xù)發(fā)酵有害的物質(zhì)，這可大大節(jié)約能源和減少設(shè)備投資。纖維素的酶解技術(shù)世界上許多工業(yè)國(guó)家以及科研機(jī)構(gòu)都在積極開發(fā)，工業(yè)化進(jìn)展正在進(jìn)行。但是酶解纖維素轉(zhuǎn)化率低，酶活性不穩(wěn)定極大地限制了纖維素酶解的生產(chǎn)利用。近年來(lái)，多種纖維素酶混合使用，酶的超濾膜回收以及纖維素酶基因克隆與表達(dá)為解決這些問題提供了很好地借鑒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種雙酶解農(nóng)作物下腳料雙菌株發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的方法，增加了酶解糖化液的利用率，提高了 L-乳酸產(chǎn)量。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:
[0007]一種雙酶解農(nóng)作物下腳料雙菌株發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的方法，包括如下步驟:
[0008]S1、將甘蔗渣打碎后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的NaOH溶液對(duì)蔗渣粉末進(jìn)行噴灑，噴灑均勻后揉搓5min，置于45°C的環(huán)境中12h，每隔4h噴灑揉搓一次，每次5min，得蔗渣；
[0009]S2、取2g所得的蔗渣添加30ml蒸餾水后調(diào)整pH至4.8后，添加纖維素酶和木聚糖酶各lmL，置于50°C搖床上酶解糖化8h，過濾，得糖化液；
[0010]S3、將步驟S2所得的糖化液在0.09個(gè)大氣壓條件下，水浴加熱至53°C，轉(zhuǎn)速60-80濃縮到一定糖濃度的糖化液；
[0011]S4、取蛋白胨 10，酵母膏 5g，MgSO4.7H20 0.5，(NH)4SO4 4，KH2PO4 0.4，NaCl 0.lg，CaCO4 3g，步驟S3所得的糖化液50ml配備發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0012]S5、取5mL干酪乳桿菌的種子液接種于步驟S4配備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖床培養(yǎng)溫度35°C，速率150r/min ;培養(yǎng)24h后，取出發(fā)酵瓶，接種5mL米根霉的種子液，置于搖床培養(yǎng)60h，溫度32 °C，速率200r/min。
[0013]其中，干酪乳桿菌的種子培養(yǎng)液包含以下成分(g/L):葡萄糖50，蛋白胨10，牛肉膏 5，酵母膏 5，無(wú)水乙酸鈉 5，MgSO4.7H20 20mL，Mn SO4.7H20 20mL，碳酸鈣 20g，pH 6.8，吐溫 ImL0
[0014]其中，米根霉的種子培養(yǎng)液包含以下成分(g/L):葡萄糖80，(NH)4S044，KH2PO40.3，ZnSO4.7H20 0.44，MgSO4.7H20 0.25。
[0015]其中，本申請(qǐng)中壓縮成一定的糖濃度是為了微生物發(fā)酵所需的糖濃度，如果糖濃度過低，則乳酸產(chǎn)量過低。
[0016]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0017]通過揉搓處理使纖維素酶與木質(zhì)纖維素底物直接接觸的更徹底，一方面提高了纖維素酶對(duì)木質(zhì)纖維素的反應(yīng)性，另一方面提高了纖維素酶的活力，同時(shí)加入纖維素酶和木聚糖酶使甘蔗渣水解更加完全，通過干酪乳桿菌與米根霉的合理添加，提高了糖化液的利用率，提高了 L-乳酸的產(chǎn)量。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為本發(fā)明實(shí)施例一種雙酶解農(nóng)作物下腳料雙菌株發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的方法的流程圖。
[0019]圖2為本發(fā)明實(shí)施例用HPLC檢測(cè)乳酸純度的結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0021]本發(fā)明實(shí)施例所使用的菌干酪乳桿菌CICC6028 (Lactobacillus caseiCICC6028)，購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生種保藏中心(CICC);米根霉M12 (Rhizopus oryzae M12)由實(shí)驗(yàn)室誘變選育得到。保藏培養(yǎng)基為PDA斜面，最適培養(yǎng)溫度28°C ;所使用的干酪乳桿菌的種子培養(yǎng)液成分為(g/L):葡萄糖50，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏5，無(wú)水乙酸鈉5，MgSO4.7H20 20mL，Mn SO4.7H20 20mL，碳酸鈣 20g，pH 6.8，吐溫 ImL ;所使用的米根霉的種子培養(yǎng)液成分為(g/L):葡萄糖 80，(NH)4SO4 4，KH2PO4 0.3，ZnSO4.7H20 0.44, MgSO4.7H200.25，米根霉利用的是糖化液的五碳糖產(chǎn)L-乳酸；干酪乳桿菌利用糖化液的六碳糖產(chǎn)L-乳酸。
[0022]實(shí)施例
[0023]如圖1所示，S1、將甘蔗渣打碎后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的NaOH溶液對(duì)蔗渣粉末進(jìn)行噴灑，噴灑均勻后揉搓5min，置于45°C的環(huán)境中12h，每隔4h噴灑揉搓一次，每次5min，
得鹿渣；
[0024]S2、取2g所得的蔗渣添加30ml蒸餾水后調(diào)整pH至4.8后，添加纖維素酶和木聚糖酶各lmL，置于50°C搖床上酶解糖化8h，過濾，得糖化液；
[0025]S3、將步驟S2所得的糖化液在0.09個(gè)大氣壓條件下，水浴加熱至53°C，轉(zhuǎn)速60-80濃縮到一定糖濃度的糖化液；
[0026]S4、取蛋白胨 10，酵母膏 5g，MgSO4.7H20 0.5，(NH)4SO4 4，KH2PO4 0.4，NaCl 0.lg,CaCO4 3g，步驟S3所得的糖化液50ml配備發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0027]S5、取5mL干酪乳桿菌的種子液接種于步驟S4配備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖床培養(yǎng)溫度35°C，速率150r/min ;培養(yǎng)24h后，取出發(fā)酵瓶，接種5mL米根霉的種子液，置于搖床培養(yǎng)60h，溫度32 °C，速率200r/min。
[0028]將實(shí)施例所得的產(chǎn)物取出進(jìn)行乳酸含量的檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示，高效液相色譜分析，色譜柱為迪馬公司的C18反相(4.6mmX 250mm, 5 μ m);流動(dòng)相為0.01mol/L的磷酸氫二銨溶液，用磷酸調(diào)PH值至2.6，經(jīng)0.45 μ m孔徑合成纖維素酯膜過濾后，超聲脫氣Ih ;流速0.8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，進(jìn)樣量20 μ L，柱溫為室溫。
[0029]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種雙酶解農(nóng)作物下腳料雙菌株發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，包括如下步驟: 51、將甘蔗渣打碎后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的NaOH溶液對(duì)蔗渣粉末進(jìn)行噴灑，噴灑均勻后揉搓5min，置于45°C的環(huán)境中12h，每隔4h噴灑揉搓一次，每次5min，得蔗渣； 52、取2g所得的蔗渣添加30ml蒸餾水后調(diào)整pH至4.8后，添加纖維素酶和木聚糖酶各lmL，置于50°C搖床上酶解糖化8h，過濾，得糖化液； 53、將步驟S2所得的糖化液在0.09個(gè)大氣壓條件下，水浴加熱至53°C，轉(zhuǎn)速60-80濃縮到一定糖濃度的糖化液；54、取蛋白胨10，酵母膏 5g，MgSO4.7H20 0.5，(NH)4SO4 4，KH2PO4 0.4，NaCl 0.lg，CaCO43g，步驟S3所得的糖化液50ml配備發(fā)酵培養(yǎng)基； 55、取5mL干酪乳桿菌的種子液接種于步驟S4配備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于搖床培養(yǎng)溫度35°C，速率150r/min ;培養(yǎng)24h后，取出發(fā)酵瓶，接種5mL米根霉的種子液，置于搖床培養(yǎng)60h，溫度 32 °C，速率 200r/min。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙酶解農(nóng)作物下腳料雙菌株發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，干酪乳桿菌的種子培養(yǎng)液包含以下成分(g/L):葡萄糖50，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母膏 5，無(wú)水乙酸鈉 5，MgSO4.7H20 20mL，Mn SO4.7H20 20mL，碳酸鈣 20g，pH 6.8，吐溫 ImL03.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種雙酶解農(nóng)作物下腳料雙菌株發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的方法，其特征在于，米根霉的種子培養(yǎng)液包含以下成分(g/L):葡萄糖80，(NH)4SO4 4，KH2PO4 0.3，ZnSO4.7H20 0.44，MgSO4.7H20 0.25。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙酶解農(nóng)作物下腳料雙菌株發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸的方法，首先將兩種酶加入木質(zhì)纖維素中酶解得到糖化液，先后將兩種能夠分別利用五碳糖和六碳糖產(chǎn)L-乳酸的菌株，比單菌發(fā)酵的效率更高，提高了L-乳酸產(chǎn)量。本發(fā)明提高了木質(zhì)纖維素的酶解程度，并且提高了糖化液的利用率，增加了L-乳酸產(chǎn)量具有較大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。
【IPC分類】C12P7/56, C12P39/00
【公開號(hào)】CN105177067
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】古紹彬, 王延凱, 李曉林, 王大紅, 盧佳琪
【申請(qǐng)人】河南科技大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年10月9日