一種大腸桿菌的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸桿菌的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]大腸桿菌是與我們?nèi)粘Ｉ铌P(guān)系非常密切的一類細(xì)菌，學(xué)名稱作“大腸埃希菌”，屬于腸道桿菌大類中的一種。它是寄生在人體大腸里對(duì)人體無害的一種單細(xì)胞生物，結(jié)構(gòu)簡單，繁殖迅速，培養(yǎng)容易，它是生物學(xué)上重要的實(shí)驗(yàn)材料。在嬰兒剛出生的幾小時(shí)內(nèi)，大腸桿菌就經(jīng)過吞咽在腸道內(nèi)定居了。正常情況下，大多數(shù)大腸桿菌是非常安分守己的，他們不但不會(huì)給我們的身體健康帶來任何危害，反而還能競(jìng)爭性抵御致病菌的進(jìn)攻，同時(shí)還能幫助合成維生素，與人體是互利共生的關(guān)系。只有在機(jī)體免疫力降低、腸道長期缺乏刺激等特殊情況下，大腸桿菌才移居到腸道以外的地方，例如膽囊、尿道、膀胱、闌尾等地，造成相應(yīng)部位的感染或全身播散性感染。因此，大部分大腸桿菌通常被看作機(jī)會(huì)致病菌。
[0003]各種動(dòng)物大腸桿菌滅活疫苗的制備中，首要環(huán)節(jié)就是大腸桿菌的培養(yǎng)。為了獲得理想的活菌濃度，業(yè)界對(duì)大腸桿菌培養(yǎng)工藝進(jìn)行了大量研究。影響大腸桿菌培養(yǎng)菌濃度的因素有很多，如培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)時(shí)間、菌種接種量以及細(xì)菌生長環(huán)境等一般情況下，生物藥物的產(chǎn)率與大腸桿菌發(fā)酵密度密切相關(guān)，大腸桿菌的收率直接關(guān)系到生物藥物的產(chǎn)率。所以在菌體表達(dá)蛋白效率相當(dāng)?shù)那闆r下，大腸桿菌的發(fā)酵密度直接影響到生物藥物的生產(chǎn)成本。特別是在同樣的純化技術(shù)條件下。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種大腸桿菌的培養(yǎng)方法。
[0005]—種大腸桿菌的培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0006]I)將大腸桿菌菌種接種于第一培養(yǎng)基中，36.8?37.5°C條件下培養(yǎng)24?30小時(shí)，在瓊脂平板上劃線接種，37.2?37.8°C條件下培養(yǎng)20?24小時(shí)，得到一級(jí)培養(yǎng)種子。
[0007]具體的，步驟I)中，所述的第一培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、孟加拉紅溶液、瓊脂、蒸餾水、去氧膽酸鈉溶液、鏈霉素溶液和二水氯化鈣。
[0008]2)將步驟I)得到的一級(jí)培養(yǎng)種子接種到第二培養(yǎng)基中，34.5?35.2°C條件下培養(yǎng)12?16小時(shí)，得到二級(jí)培養(yǎng)種子。
[0009]具體的，步驟2)中，所述的第二培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、酵母提取物、甘油、二水鉬酸鈉、七水硫酸鎂、五水硫酸銅、六水氯化鈷和蒸餾水。
[0010]3)將步驟2)得到的二級(jí)培養(yǎng)種子接種到第三培養(yǎng)基中，37.5?38.0°C條件下培養(yǎng)16?18小時(shí)，得到三級(jí)培養(yǎng)種子，至于2?5°C條件下保存。
[0011]具體的，步驟3)中，所述的第三培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、酵母提取物、六水氯化鐵、硼酸、七水硫酸鋅、生物素、硫酸錳、谷氨酸鈉和蒸餾水。
[0012]優(yōu)選的，步驟3)中，低溫保存的時(shí)候滴加適量甘油。
[0013]4)將步驟3)得到的三級(jí)培養(yǎng)種子接種于菌液中，并導(dǎo)入至離心管中，加入10?15%的瓊脂，搖床過夜，再加入氯化鈣溶液，混懸菌液，離心分離，將上層清液去除，即得。
[0014]優(yōu)選的，所述搖床的轉(zhuǎn)速為120?160轉(zhuǎn)/分鐘。
[0015]優(yōu)選的，所述氯化鈣溶液的溫度為3?6°C。
[0016]本發(fā)明所提供的大腸桿菌的培養(yǎng)方法能快速對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)優(yōu)化了微生物發(fā)酵培養(yǎng)條件，培養(yǎng)工藝簡單，能夠獲得理想的高活菌濃度。
【具體實(shí)施方式】
[0017]以下對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0018]實(shí)施例1
[0019]I)將大腸桿菌菌種接種于第一培養(yǎng)基中，37.2°C條件下培養(yǎng)28小時(shí)，在瓊脂平板上劃線接種，37.5°C條件下培養(yǎng)22小時(shí)，得到一級(jí)培養(yǎng)種子。其中，第一培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、孟加拉紅溶液、瓊脂、蒸餾水、去氧膽酸鈉溶液、鏈霉素溶液和二水氯化鈣。
[0020]2)將步驟I)得到的一級(jí)培養(yǎng)種子接種到第二培養(yǎng)基中，35.0°C條件下培養(yǎng)15小時(shí)，得到二級(jí)培養(yǎng)種子。其中，第二培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、酵母提取物、甘油、二水鉬酸鈉、七水硫酸鎂、五水硫酸銅、六水氯化鈷和蒸餾水。
[0021]3)將步驟2)得到的二級(jí)培養(yǎng)種子接種到第三培養(yǎng)基中，37.8°C條件下培養(yǎng)16小時(shí)，得到三級(jí)培養(yǎng)種子，至于4°C條件下保存。其中，第三培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、酵母提取物、六水氯化鐵、硼酸、七水硫酸鋅、生物素、硫酸錳、谷氨酸鈉和蒸餾水。
[0022]4)將步驟3)得到的三級(jí)培養(yǎng)種子接種于菌液中，并導(dǎo)入至離心管中，加入12%的瓊脂，搖床過夜，再加入4°C的氯化鈣溶液，混懸菌液，離心分離，將上層清液去除，即得。其中，搖床的轉(zhuǎn)速為150轉(zhuǎn)/分鐘。
[0023]所得活菌濃度為4.8 X 109CFU/ml。
[0024]實(shí)施例2
[0025]I)將大腸桿菌菌種接種于第一培養(yǎng)基中，36.8°C條件下培養(yǎng)30小時(shí)，在瓊脂平板上劃線接種，37.2°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，得到一級(jí)培養(yǎng)種子。其中，第一培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、孟加拉紅溶液、瓊脂、蒸餾水、去氧膽酸鈉溶液、鏈霉素溶液和二水氯化鈣。
[0026]2)將步驟I)得到的一級(jí)培養(yǎng)種子接種到第二培養(yǎng)基中，34.5°C條件下培養(yǎng)16小時(shí)，得到二級(jí)培養(yǎng)種子。其中，第二培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、酵母提取物、甘油、二水鉬酸鈉、七水硫酸鎂、五水硫酸銅、六水氯化鈷和蒸餾水。
[0027]3)將步驟2)得到的二級(jí)培養(yǎng)種子接種到第三培養(yǎng)基中，37.5°C條件下培養(yǎng)18小時(shí)，得到三級(jí)培養(yǎng)種子，至于2°C條件下保存。其中，第三培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、酵母提取物、六水氯化鐵、硼酸、七水硫酸鋅、生物素、硫酸錳、谷氨酸鈉和蒸餾水。
[0028]4)將步驟3)得到的三級(jí)培養(yǎng)種子接種于菌液中，并導(dǎo)入至離心管中，加入15%的瓊脂，搖床過夜，再加入3°C的氯化鈣溶液，混懸菌液，離心分離，將上層清液去除，即得。其中，搖床的轉(zhuǎn)速為160轉(zhuǎn)/分鐘。
[0029]所得活菌濃度為4.9 X 109CFU/ml。
[0030]實(shí)施例3
[0031]I)將大腸桿菌菌種接種于第一培養(yǎng)基中，37.5°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，在瓊脂平板上劃線接種，37.8°C條件下培養(yǎng)20小時(shí)，得到一級(jí)培養(yǎng)種子。其中，第一培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、孟加拉紅溶液、瓊脂、蒸餾水、去氧膽酸鈉溶液、鏈霉素溶液和二水氯化鈣。
[0032]2)將步驟I)得到的一級(jí)培養(yǎng)種子接種到第二培養(yǎng)基中，35.2°C條件下培養(yǎng)12小時(shí)，得到二級(jí)培養(yǎng)種子。其中，第二培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、酵母提取物、甘油、二水鉬酸鈉、七水硫酸鎂、五水硫酸銅、六水氯化鈷和蒸餾水。
[0033]3)將步驟2)得到的二級(jí)培養(yǎng)種子接種到第三培養(yǎng)基中，38.0°C條件下培養(yǎng)16小時(shí)，得到三級(jí)培養(yǎng)種子，至于5°C條件下保存。其中，第三培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、酵母提取物、六水氯化鐵、硼酸、七水硫酸鋅、生物素、硫酸錳、谷氨酸鈉和蒸餾水。
[0034]4)將步驟3)得到的三級(jí)培養(yǎng)種子接種于菌液中，并導(dǎo)入至離心管中，加入10%的瓊脂，搖床過夜，再加入6°C的氯化鈣溶液，混懸菌液，離心分離，將上層清液去除，即得。其中，搖床的轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)/分鐘。
[0035]所得活菌濃度為5.2 X 109CFU/ml。
[0036]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施方式，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種大腸桿菌的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將大腸桿菌菌種接種于第一培養(yǎng)基中，36.8?37.5°C條件下培養(yǎng)24?30小時(shí)，在瓊脂平板上劃線接種，37.2?37.8°C條件下培養(yǎng)20?24小時(shí)，得到一級(jí)培養(yǎng)種子； 2)將步驟I)得到的一級(jí)培養(yǎng)種子接種到第二培養(yǎng)基中，34.5?35.2°C條件下培養(yǎng)12?16小時(shí)，得到二級(jí)培養(yǎng)種子； 3)將步驟2)得到的二級(jí)培養(yǎng)種子接種到第三培養(yǎng)基中，37.5?38.0°C條件下培養(yǎng)16?18小時(shí)，得到三級(jí)培養(yǎng)種子，至于2?5°C條件下保存； 4)將步驟3)得到的三級(jí)培養(yǎng)種子接種于菌液中，并導(dǎo)入至離心管中，加入10?15%的瓊脂，搖床過夜，再加入氯化鈣溶液，混懸菌液，離心分離，將上層清液去除，即得。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大腸桿菌的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟I)中，所述的第一培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:葡萄糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、孟加拉紅溶液、瓊脂、蒸餾水、去氧膽酸鈉溶液、鏈霉素溶液和二水氯化鈣。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的大腸桿菌的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟2)中，所述的第二培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、酵母提取物、甘油、二水鉬酸鈉、七水硫酸鎂、五水硫酸銅、六水氯化鈷和蒸餾水。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的大腸桿菌的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟3)中，所述的第三培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分包括:硫酸銨、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸、硫酸鎂、酵母提取物、六水氯化鐵、硼酸、七水硫酸鋅、生物素、硫酸錳、谷氨酸鈉和蒸餾水。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的大腸桿菌的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟3)中，低溫保存的時(shí)候滴加適量甘油。6.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的大腸桿菌的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟4)中，所述搖床的轉(zhuǎn)速為120?160轉(zhuǎn)/分鐘。7.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一所述的大腸桿菌的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟4)中，所述氯化鈣溶液的溫度為3?6°C。
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸桿菌的培養(yǎng)方法。該方法包括步驟：1)將大腸桿菌菌種接種于第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在瓊脂平板上劃線接種，得到一級(jí)培養(yǎng)種子；2)將一級(jí)培養(yǎng)種子接種到第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到二級(jí)培養(yǎng)種子；3)將二級(jí)培養(yǎng)種子接種到第三培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到三級(jí)培養(yǎng)種子，保存；4)將三級(jí)培養(yǎng)種子接種于菌液中，并導(dǎo)入至離心管中，加入10～15％的瓊脂，搖床過夜，再加入氯化鈣溶液，混懸菌液，離心分離，將上層清液去除，即得。本發(fā)明所提供的大腸桿菌的培養(yǎng)方法能快速對(duì)大腸桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，同時(shí)優(yōu)化了微生物發(fā)酵培養(yǎng)條件，培養(yǎng)工藝簡單，能夠獲得理想的高活菌濃度。
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/19
【公開號(hào)】CN105176887
【申請(qǐng)?zhí)枴?br>【發(fā)明人】何正文
【申請(qǐng)人】江蘇大學(xué)
【公開日】2015年12月23日
【申請(qǐng)日】2015年10月22日