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快速獲得具有希望的形態(tài)的晶體的方法

文檔序號(hào):8019656閱讀:883來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:快速獲得具有希望的形態(tài)的晶體的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及結(jié)晶作用,特別是獲得具有希望的形態(tài)的蛋白質(zhì)晶體的方法。
在PCT公開(kāi)號(hào)WO89/08703中,描述了一種枯草桿菌蛋白酶的結(jié)晶方法,方法是向至少約40克每升的濃縮枯草桿菌蛋白酶溶液中加入鹵化物鹽,如氯化鈉或氯化鈣。
在EP506,866中,描述了一種酶結(jié)晶的方法,其特征在于使用含有相對(duì)較高酶純度、酶濃度約為至少5克每升的液體的水溶液作為原材料,并加入一種易溶的非鹵化物型鹽作為結(jié)晶劑,至大大低于以非晶形沉淀酶所需的量的濃度。例如某些枯草桿菌蛋白酶在高達(dá)30℃下的結(jié)晶。用硫酸鈉幫助純化蛋白質(zhì)酶產(chǎn)物而不是結(jié)晶。
不管酶結(jié)晶領(lǐng)域的進(jìn)展如何,適于大規(guī)模生產(chǎn)的便宜且有效的蛋白酶結(jié)晶在工業(yè)上仍有問(wèn)題。以工業(yè)規(guī)??焖偕a(chǎn)具有希望的形態(tài)的晶體的能力將意味著大量的節(jié)約,并且對(duì)于工業(yè)是非常重要的。
本發(fā)明的方法特別可用于快速獲得具有希望的形態(tài)的蛋白質(zhì)晶體,如酶。在一個(gè)實(shí)施方案中,用該方法在不到25小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)含酶溶液至少約90%的結(jié)晶,酶晶體具有主要是正方形片狀的形態(tài)。
通過(guò)下列詳述及附圖
和附加的權(quán)利要求書(shū),本發(fā)明的其他特征、方面和優(yōu)點(diǎn)將是明顯的。
圖2是一張顯微照片,顯示在約19.5小時(shí)內(nèi)從保持在約30℃下的溶液結(jié)晶所獲得的蛋白酶晶體。
圖3是一張顯微照片,顯示在約19.5小時(shí)內(nèi)從保持在約15℃下的溶液結(jié)晶所獲得的蛋白酶晶體。
圖4是一張顯示根據(jù)本發(fā)明所述獲得的蛋白酶晶體的顯微照片,其中結(jié)晶在約15℃下開(kāi)始約4小時(shí),然后在溫度改變?yōu)榧s22℃時(shí)再繼續(xù)18小時(shí)。注意到大量的正方形片狀晶體。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供一種結(jié)晶方法,其中選擇起始溫度,如低于室溫,以獲得希望的晶體形態(tài)(例如正方形片狀)。然后進(jìn)行溫度變化,例如至室溫或以上,此時(shí)晶體以希望的方式繼續(xù)生長(zhǎng),但具有不同的動(dòng)力學(xué),例如較高的結(jié)晶速度。因此,該方法以較高的結(jié)晶速度產(chǎn)生具有希望的形態(tài)的結(jié)晶產(chǎn)物。
一旦顯示希望的形態(tài)的晶體在起始溫度下開(kāi)始形成,即可選擇合適的溫度變化來(lái)消除或使進(jìn)一步的成核達(dá)到最小,從而阻止形成具有不希望的形態(tài)的晶體。例如,能在一定時(shí)間內(nèi)以不連續(xù)的步幅升高溫度(例如,在約25分鐘內(nèi),以每5分鐘約4℃的增量)。或者,能確定使進(jìn)一步的成核最小的連續(xù)斜線上升方案。這種斜線上升方案能代表穩(wěn)定速率提高,例如,在約10分鐘的變化期內(nèi)2℃/分鐘,或在變化期內(nèi)速度可能不同,例如,1℃/分鐘10分鐘,改變?yōu)?℃/分鐘5分鐘。
在利用結(jié)晶法回收蛋白質(zhì)過(guò)程中,必須平衡許多因素以產(chǎn)生具有希望的形態(tài)的晶體,包括溫度、pH、所使用的鹽、結(jié)晶時(shí)間長(zhǎng)度、晶體形態(tài)。
在本發(fā)明范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)包括藥學(xué)上重要的蛋白質(zhì),如激素或其他治療蛋白質(zhì),和工業(yè)上重要的蛋白質(zhì),如酶。
優(yōu)選的酶包括那些能水解底物如菌株的酶。這些酶被稱為水解酶,包括但不限于蛋白酶(細(xì)菌、真菌,酸性、中性或堿性)、淀粉酶(α或β)、脂肪酶、纖維素酶及其混合物。特別優(yōu)選的酶是枯草桿菌蛋白酶和纖維素酶。最優(yōu)選的是枯草桿菌蛋白酶,如美國(guó)專利4,760,025、歐洲專利130756 B1和歐洲專利申請(qǐng)WO91/06637所述,在此引用作為參考。能在本發(fā)明中使用的其他酶包括氧化酶、轉(zhuǎn)移酶、脫水酶、還原酶、半纖維素酶和異構(gòu)酶。
由已刪除、替換或另外操作的蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸之DNA序列衍生的遺傳修飾蛋白酶也被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這些修飾蛋白質(zhì)在例如PCT公開(kāi)號(hào)WO95/10615和美國(guó)專利5,185,258中描述。
優(yōu)選地,用本發(fā)明的結(jié)晶法回收的酶保留原始活性的至少80%、更優(yōu)選地至少90%、最優(yōu)選地至少95%。
用于培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)蛋白質(zhì)的發(fā)酵方法在本領(lǐng)域中周知。例如,能通過(guò)固體或浸沒(méi)培養(yǎng)包括分批、分批補(bǔ)料和連續(xù)流動(dòng)方法生產(chǎn)蛋白質(zhì)。從發(fā)酵液中回收和純化蛋白質(zhì)也可通過(guò)本領(lǐng)域周知的方法實(shí)現(xiàn)。
用作根據(jù)本發(fā)明的方法的原材料的水溶液來(lái)源于合適的微生物發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液。發(fā)酵液通常含有細(xì)胞碎片,包括細(xì)胞、多種懸浮固體及其他生物質(zhì)污染物,以及希望的蛋白酶產(chǎn)物,優(yōu)選地通過(guò)本領(lǐng)域周知的方法從發(fā)酵液中除去。進(jìn)行這種去除的合適方法包括常規(guī)固體-液體分離技術(shù),如離心、過(guò)濾、透析、微過(guò)濾、旋轉(zhuǎn)式真空過(guò)濾或其他已知方法,來(lái)生產(chǎn)無(wú)細(xì)胞濾液。盡管預(yù)期直接由發(fā)酵液或無(wú)細(xì)胞濾液結(jié)晶蛋白酶在本發(fā)明范圍之內(nèi),但優(yōu)選地在結(jié)晶前用如超濾、蒸發(fā)或沉淀的技術(shù)濃縮發(fā)酵液或無(wú)細(xì)胞濾液。
至于酶,在本領(lǐng)域中早就已知,某些成分—如果在培養(yǎng)基中含有—將導(dǎo)致成分酶結(jié)晶困難。為此,通過(guò)例如對(duì)濾過(guò)液施行柱純化,進(jìn)一步純化濾過(guò)發(fā)酵液以除去可干擾結(jié)晶的雜質(zhì)通常是有利的。另外,通過(guò)控制培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基能限制這些雜質(zhì)的量。例如,如Northrup等人(1948)《結(jié)晶酶》,哥倫比亞大學(xué)出版社,第254頁(yè)所述,粘蛋白樣物質(zhì)(如多糖)對(duì)結(jié)晶方法通常不利。因此,通過(guò)從預(yù)發(fā)酵培養(yǎng)基中除去這些多糖成分,或從發(fā)酵液中純化這些成分,能提高隨后結(jié)晶的成功率。此外,通過(guò)用強(qiáng)酸、氫氧化銅、醇或丙酮處理濾過(guò)液,也能除去這些物質(zhì)。優(yōu)選地,在純化含蛋白酶發(fā)酵液中使用硫酸鋁以促進(jìn)結(jié)晶。
許多不同的蛋白質(zhì)在不同溫度下顯示不同的形態(tài),包括酶,如某些蛋白酶和葡萄糖異構(gòu)酶。通常優(yōu)選在較低溫度下發(fā)現(xiàn)的晶體形態(tài)。根據(jù)本發(fā)明,能用該因素以較高的結(jié)晶速度生產(chǎn)具有優(yōu)選的晶體形態(tài)的晶體。
優(yōu)選的晶體形態(tài)是在處理晶體時(shí)不易破裂的形態(tài)。桿形比方形、矩形或六邊形晶體更易破裂。
下列實(shí)施例是代表性的,而非意在限制。
實(shí)施例
2.輕輕混合,加入5%NaCl。
3.對(duì)于所有實(shí)驗(yàn),除實(shí)驗(yàn)2之外,溶液均保持在指定溫度下,待4小時(shí)后從實(shí)驗(yàn)#1中提取樣品,并輕輕混合在22℃下溫育。
4.通過(guò)在顯微鏡下檢查樣品,觀察一定時(shí)間的晶體性質(zhì)。
5.測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)上清液中保留的活性,并計(jì)算百分結(jié)晶。
表1
在實(shí)驗(yàn)2中,不希望被理論所束縛,開(kāi)始時(shí)的低溫似乎產(chǎn)生正方形核,但是一旦置于較高溫度下,某些晶體即按照桿形生長(zhǎng)。這些組合已經(jīng)產(chǎn)生矩形片和某些桿形。
在閱讀本公開(kāi)內(nèi)容后,本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白那些不背離本發(fā)明精神和范圍的其他不同的實(shí)施例和前面描述和實(shí)施例的修改,旨在使所有這些實(shí)施例或修改均包含于附加權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。此處的所有公開(kāi)文本和專利在此均完整引用作為參考。
權(quán)利要求
1.一種蛋白質(zhì)結(jié)晶方法,包括(a)制備一種含有該蛋白質(zhì)的水性溶液;和(b)向該水性溶液中加入鹽形成蛋白質(zhì)/鹽溶液;(c)將該蛋白質(zhì)/鹽溶液置于約4℃-20℃的溫度下;(d)使晶核形成;(e)將(d)的溶液置于約22℃-60℃的溫度下,使得發(fā)生較快速的結(jié)晶。
2.權(quán)利要求1的方法,其在步驟(e)之后進(jìn)一步包括從該溶液中回收具有希望的形態(tài)的蛋白質(zhì)晶體的步驟。
3.權(quán)利要求2的方法,其中該蛋白質(zhì)是一種酶,而回收的晶體酶保留其原始活性的至少約90%。
4.權(quán)利要求1的方法,其中該水性溶液來(lái)源于所選擇的微生物發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液。
5.權(quán)利要求4的方法,其中從發(fā)酵液中除去其中存在的細(xì)胞碎片,以產(chǎn)生無(wú)細(xì)胞濾液。
6.權(quán)利要求4的方法,其中在結(jié)晶之前濃縮該水性溶液。
7.權(quán)利要求4的方法,其中該水性溶液是發(fā)酵液的超濾濃縮液。
8.權(quán)利要求1的方法,其中該蛋白質(zhì)是一種酶。
9.權(quán)利要求8的方法,其中該酶是一種水解酶。
10.權(quán)利要求8的方法,其中該酶選自蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、氧化酶、轉(zhuǎn)移酶、脫水酶、還原酶、半纖維素酶、異構(gòu)酶及其任一混合物。
11.權(quán)利要求1的方法,其中步驟(e)的結(jié)晶產(chǎn)生具有希望的形態(tài)的晶體,該形態(tài)選自正方形、矩形或六角形。
12.權(quán)利要求11的方法,其中至少一部分晶體是正方形片。
13.權(quán)利要求1的方法,其中在步驟(c)中,水性溶液保持于約4℃-20℃下不超過(guò)約5小時(shí)。
14.權(quán)利要求1的方法,其中在步驟(e)中,水性溶液保持于約22℃-60℃下不超過(guò)約20小時(shí)。
15.一種由含酶溶液結(jié)晶該酶的方法,包括(a)將該溶液置于不高于約22℃的第一溫度下;(b)使具有希望的形態(tài)的晶體形成,而該溶液保持于所述第一溫度下;然后(c)將(b)的溶液置于高于所述第一溫度的第二溫度下,使得具有希望的形態(tài)的晶體之結(jié)晶速度提高。
16.權(quán)利要求15的方法,其在步驟(c)之后進(jìn)一步包括回收具有希望的形態(tài)的晶體。
17.權(quán)利要求15的方法,其中該溶液中至少約90%的酶在開(kāi)始步驟(b)之后的約25小時(shí)內(nèi)結(jié)晶。
18.權(quán)利要求15的方法,其中所述第一溫度低于20℃。
19.權(quán)利要求17的方法,其中所述第二溫度至少為20℃。
20.一種按照權(quán)利要求15的方法生產(chǎn)的酶晶體。
全文摘要
本發(fā)明提供一種結(jié)晶方法,其中選擇起始溫度以獲得希望的晶體形態(tài)(例如正方形)。假如溫度變化不足以引起進(jìn)一步的成核,則進(jìn)行溫度變化,此時(shí)晶體以希望的方式繼續(xù)生長(zhǎng),但具有不同的動(dòng)力學(xué),例如較高的結(jié)晶速度。因此,該方法以較高的結(jié)晶速度產(chǎn)生具有希望的形態(tài)的結(jié)晶產(chǎn)物。
文檔編號(hào)C30B7/00GK1342198SQ00804627
公開(kāi)日2002年3月27日 申請(qǐng)日期2000年3月3日 優(yōu)先權(quán)日1999年3月5日
發(fā)明者M·H·亨 申請(qǐng)人:金克克國(guó)際有限公司
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