專利名稱：成花素激活復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及成花素通過14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而形成的成花素激活復(fù)合物的晶體、和由該晶體得到的成花素激活復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)信息以及成花素激活復(fù)合物的功能的利用。本申請要求通過參考而援引于此的日本申請?zhí)卦?010-061562號的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
對于穩(wěn)定的糧食生產(chǎn)或者有效利用了植物生物量等的循環(huán)型經(jīng)濟(jì)社會系統(tǒng)的構(gòu)建的實現(xiàn)來說，認(rèn)為各種環(huán)境下的植物的開花的調(diào)節(jié)是有效的。為了構(gòu)建調(diào)節(jié)植物開花的技術(shù)，需要弄清楚植物環(huán)境響應(yīng)的信息傳達(dá)的分子基礎(chǔ)。 作為誘導(dǎo)植物開花的因素，成花素的存在在70年前就被提倡，近年來，已經(jīng)明確了其實體為高等植物中普遍存在的FT基因的產(chǎn)物。成花素是在達(dá)到最適于花芽形成的日長時在葉子中合成，并向莖頂端移動從而使成花開始的分子。在水稻中，Hd3a被認(rèn)為相當(dāng)于成花素而促進(jìn)抽穗，從而提出了將水稻Hd3a基因用于植物的開花調(diào)節(jié)中(專利文獻(xiàn)I、非專利文獻(xiàn)I)。有報告稱水稻Hd3a與水稻14_3_3蛋白GF14c相互作用，由此抑制性地控制成花(非專利文獻(xiàn)2)。在非專利文獻(xiàn)2中，使用酵母雙雜交法對與Hd3a相互作用的蛋白質(zhì)進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)水稻的14-3-3蛋白GF14c與Hd3a相互作用。GF14c主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，這暗示Hd3a與GF14c的復(fù)合物主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。由當(dāng)過量表達(dá)GF14c時成花延遲的情況等可以認(rèn)為，GF14c是抑制成花的因素。在鼠耳芥中，認(rèn)為作為成花素的實體的FT蛋白質(zhì)在細(xì)胞核內(nèi)與bZIP轉(zhuǎn)錄因子FD等相互作用，從而有助于花分生組織確定基因(flower meristem identity gene)的表達(dá)(非專利文獻(xiàn)3、4)。有報告將bZIP轉(zhuǎn)錄因子使用于成花控制中(專利文獻(xiàn)2)。雖然關(guān)于成花素的研究報告有很多，但是，開花誘導(dǎo)中的成花素的作用機(jī)制仍不明確。在先技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本公開公報、特開2002-153283號專利文獻(xiàn)2 :日本公開公報、特開2003-274972號非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :Tamaki S et al. Science (2007) vol. 316 (5827) pp. 1033-6非專利文獻(xiàn)2 :Purwestri YA et al. Plant and Cell Physiology 2009 50(3)429-438非專利文獻(xiàn)3 ffigge et al. Science (2005) vol. 309 (5737) pp. 1056-9非專利文獻(xiàn)4 Abe et al. Science (2005) vol. 309 (5737) pp. 1052-
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于，提供成花素通過14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而形成的成花素激活復(fù)合物的晶體，并且，利用該晶體而將上述蛋白質(zhì)間的相互作用機(jī)制明確，并對該相互作用進(jìn)行控制，由此來調(diào)節(jié)植物的成花。為了解決上述課題，本發(fā)明者們進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果在成花素通過14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而形成的成花素激活復(fù)合物的晶化上獲得成功，并且發(fā)現(xiàn)利用由該成花素激活復(fù)合物的晶體得到的立體結(jié)構(gòu)信息來控制相互作用機(jī)制，能夠調(diào)節(jié)植物的成花，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明由以下內(nèi)容構(gòu)成。I. 一種植物的成花的調(diào)節(jié)方法，其包括在由成花素、14-3-3蛋白以及bZIP轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)合物構(gòu)成的成花素激活復(fù)合物中，對成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位施加影響，由此來促進(jìn)和/或抑制成花素激活復(fù)合 物的形成，成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號I中的D62、M63、R64、P96、T98、F103及R132的成花素的部位和相當(dāng)于序列編號2中的F200、D201、1204、E212、Y215、R226及D227的14_3_3蛋白的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位，14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號2中的K51、R58、F121、R131、L224及D227的14-3-3蛋白的部位和相當(dāng)于序列編號3中的R189 F195的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位。2.上述I中所述的植物的成花的調(diào)節(jié)方法，其中，促進(jìn)和/或抑制成花素激活復(fù)合物的形成是指制備含有以下的(A) (C)中的任一種以上的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體，(A)成花素與14-3-3蛋白的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的成花素，(B)成花素與14-3-3蛋白的I個以上的結(jié)合部位和/或14_3_3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的14-3-3蛋白，(C) 14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的bZIP轉(zhuǎn)錄因子。3. 一種轉(zhuǎn)化體，其是含有以下的(A) (C)中的任一種以上的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體(A)成花素與14-3-3蛋白的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的成花素，(B)成花素與14-3-3蛋白的I個以上的結(jié)合部位和/或14_3_3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的14-3-3蛋白，(C) 14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的bZIP轉(zhuǎn)錄因子；其中，成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號I中的D62、M63、R64、P96、T98、F103及R132的成花素的部位和相當(dāng)于序列編號2中的F200、D201、I204、E212、Y215、R226及D227的14_3_3蛋白的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位，14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號2中的K51、R58、F121、R131、L224及D227的14-3-3蛋白的部位和相當(dāng)于序列編號3中的R189 F195的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位。
4. 一種多核苷酸，其編碼以下的⑷ (C)中的任一種以上的蛋白質(zhì)(A)成花素與14-3-3蛋白的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的成花素，(B)成花素與14-3-3蛋白的I個以上的結(jié)合部位和/或14_3_3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的14-3-3蛋白，(C) 14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的bZIP轉(zhuǎn)錄因子；在此，成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號I中的D62、M63、R64、P96、T98、F103及R132的成花素的部位和相當(dāng)于序列編號2中的F200、D201、1204、E212、Y215、R226及D227的14_3_3蛋白的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位，14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號2中的K51、 R58、F121、R131、L224及D227的14_3_3蛋白的部位和相當(dāng)于序列編號3中的R189 F195的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位。5. 一種重組載體，其含有上述4中所述的任一種以上的多核苷酸。6. 一種控制植物的成花的物質(zhì)的篩選方法，其包括以下的任一工序(I)使候選物質(zhì)與成花素或14-3-3蛋白中的任一種接觸，然后使候選物質(zhì)與14-3-3蛋白或成花素接觸的工序；或者(2)使候選物質(zhì)與結(jié)合有或未結(jié)合有成花素的14-3-3蛋白或者bZIP轉(zhuǎn)錄因子中的任一種接觸，然后使候選物質(zhì)與bZIP轉(zhuǎn)錄因子或者結(jié)合有或未結(jié)合有成花素的14-3-3蛋白接觸的工序。7.上述6中所述的調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的篩選方法，其還包括以下的工序選擇成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位上的結(jié)合在候選物質(zhì)的存在下被促進(jìn)和/或阻礙的物質(zhì)的工序，其中，成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號I中的D62、M63、R64、P96、T98、F103及R132的成花素的部位和相當(dāng)于序列編號2中的F200、D201、1204、E212、Y215、R226及D227的14_3_3蛋白的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位，14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號2中的K51、R58、F121、R131、L224及D227的14-3-3蛋白的部位和相當(dāng)于序列編號3中的R189 F195的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位。8.上述6或7中所述的調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的篩選方法，其中，成花素是至少含有序列編號I中所示的氨基酸序列中的第62 132位的氨基酸序列，并且含有以第I 6位中的I個氨基酸開始且以第165 177位中的I個氨基酸結(jié)束的氨基酸序列的成花素多肽片段，14-3-3蛋白是至少含有序列編號2中所示的氨基酸序列中的第51 227位的氨基酸序列，并且含有以第I 5位中的I個氨基酸開始且以第230 256位中的I個氨基酸結(jié)束的氨基酸序列的14-3-3蛋白的多肽片段，bZIP轉(zhuǎn)錄因子是至少含有序列編號3中所示的氨基酸序列中的第189 195位的氨基酸序列，并且含有以第182 188位中的I個氨基酸開始且以第195位氨基酸結(jié)束的氨基酸序列的bZIP轉(zhuǎn)錄因子多肽片段。9. 一種多肽片段，其是選自以下的多肽片段
(i)至少含有序列編號I中所示的氨基酸序列中的第62 132位的氨基酸序列，并且含有以第I 6位中的I個氨基酸開始且以第165 177位中的I個氨基酸結(jié)束的氨基酸序列的新型成花素多肽片段；(ii)至少含有序列編號2中所示的氨基酸序列中的第51 227位的氨基酸序列，并且含有以第I 5位中的I個氨基酸開始且以第230 256位中的I個氨基酸結(jié)束的氨基酸序列的新型14-3-3蛋白多肽片段；(iii)至少含有序列編號3中所示的OsFDl的第189 195位的氨基酸序列，并且以第182 188位中的I個氨基酸開始且以第195位的氨基酸結(jié)束的新型bZIP轉(zhuǎn)錄因子多肽片段。10. 一種多核苷酸，其編碼上述9的(i) (iii)中所述的多肽片段。11. 一種成花素激活復(fù)合物，其是成花素多肽片段通過14-3-3蛋白多肽片段與bZIP轉(zhuǎn)錄因子多肽片段結(jié)合而形成的成花素激活復(fù)合物， 其中，成花素多肽片段、14-3-3蛋白多肽片段以及bZIP轉(zhuǎn)錄因子多肽片段分別為上述9的⑴ (iii)中所述的多肽片段。12. 一種成花素激活復(fù)合物的晶體，其是成花素通過14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而形成的。13.上述12中所述的成花素激活復(fù)合物的晶體，其中，晶體的空間群為P1、P6522或者P4,晶格常數(shù)為 a=74 A 158 A、b=64 A 158 A、c=96 A~500 A、α =66° 90°、β = 85° 90°、γ = 75° 120°。14. 一種上述12或13中所述的成花素激活復(fù)合物的晶體的制備方法，其包括使用作為沉淀劑而至少含有容量百分比為5 35的聚乙二醇的沉淀劑溶液,并通過蒸汽擴(kuò)散法而將含有成花素與14-3-3蛋白的復(fù)合物的溶液晶化的工序；回收得到的晶體的工序；以及使用沉淀劑溶液對得到的晶體進(jìn)行培養(yǎng)，從而得到成花素激活復(fù)合物的晶體的工序，其中，上述沉淀劑溶液作為沉淀劑而至少含有容量百分比為5 35的聚乙二醇且含有bZIP轉(zhuǎn)錄因子。15. 一種調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的篩選方法，其是使用計算機(jī)而設(shè)計和/或選擇具有調(diào)節(jié)成花素激活復(fù)合物的活性的功能的候選物質(zhì)，由此來篩選調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的方法，其中，上述篩選方法包括(a)將從上述12或13中所述的成花素激活復(fù)合物的晶體中得到的立體結(jié)構(gòu)信息存儲在存儲手段中的工序，(b)根據(jù)立體結(jié)構(gòu)信息并利用導(dǎo)出手段而導(dǎo)出三維立體結(jié)構(gòu)模型的工序，(C)在導(dǎo)出的三維立體結(jié)構(gòu)模型中，利用計算手段計算出原子間距離的工序，(d)根據(jù)計算出的原子間距離并利用計算手段而計算出候選物質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)信息，從而設(shè)計和/或選擇候選物質(zhì)的工序，其中，上述候選物質(zhì)能夠增強(qiáng)和/或阻礙成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。16. 一種轉(zhuǎn)化體，其是成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合被促進(jìn)和/或抑制的轉(zhuǎn)化體，其中，上述轉(zhuǎn)化體中以能夠表達(dá)的方式導(dǎo)入了上述10中所述的I種以上的多核苷酸。17.上述12或13中所述的成花素激活復(fù)合物的晶體，其中，成花素是至少含有序列編號I中所示的氨基酸序列中的第62 132位的氨基酸序列，并且含有以第I 6位中的I個氨基酸開始且以第165 177位中的I個氨基酸結(jié)束的氨基酸序列的多肽片段，14-3-3蛋白是至少含有序列編號2中所示的氨基酸序列中的第51 227位的氨基酸序列，并且含有以第I 5位中的I個氨基酸開始且以第230 256位中的I個氨基酸結(jié)束的氨基酸序列的多肽片段，bZIP轉(zhuǎn)錄因子是至少含有序列編號3中所示的氨基酸序列中的第189 195位的氨基酸序列，并且含有以第182 188位中的I個氨基酸開始且以第195位的氨基酸結(jié)束的氨基酸序列的多肽片段。
18.上述12、13以及17任一項所述的成花素激活復(fù)合物的晶體，其中，成花素是含有序列編號I中所示的氨基酸序列中的第6 170位的氨基酸序列的多肽，14-3-3蛋白是含有序列編號2中所示的氨基酸序列中的第I 235位的氨基酸序列的多肽，bZIP轉(zhuǎn)錄因子是含有序列編號3中所示的氨基酸序列中的第187 195位的氨基酸序列的多肽。19.上述12、13、17以及18任一項所述的成花素激活復(fù)合物的晶體，其是選自以下的成花素激活復(fù)合物的晶體(I)晶體的空間群為Pl，晶格常數(shù)為a=74 A~79 A、b=94 A 99 A、
c=96A~10lA、a = 66。 70。、β = 85。 90。、γ = 75。 79。的晶體；(2)晶體的空間群為P6522，晶格常數(shù)為a=125 A 135 A、b=125 A 135 A、c=340A 344A、α = 90°、β = 90°、Y =120。的晶體；⑶晶體的空間群為Ρ4，晶格常數(shù)為a=153 Α-158 A、b=153 A 158Α、c=495 A~498 A、α = 90°、β = 90°、γ = 90° 的晶體。20.上述12、13、17 19任一項所述的成花素激活復(fù)合物的晶體，其是選自以下的成花素激活復(fù)合物的晶體(I)晶體的空間群為 P1，晶格常數(shù)為 a=76.7 A、b=96.6 A、c=99.5 A、α =
68. 2°、β = 87. 9°、γ = 77. 9° 的晶體；(2)晶體的空間群為 Ρ1，晶格常數(shù)為 a=76.8 A、b=97.3 A、c=99.8 A、α =
68. 1°、β = 87. 8°、γ = 77. 9° 的晶體；(3)晶體的空間群為 Ρ1，晶格常數(shù)為 a=76.2 A、b=96.1 A、c=99..1 A、α =
68. 2°、β = 88. 6°、γ = 77. 8° 的晶體；(4)晶體的空間群為 Ρ6522,晶格常數(shù)為 a=129.0 A、b=129.0 A、c=342.0 A、α
=90°、β = 90°、γ = 120。的晶體；(5)晶體的空間群為 Ρ4,晶格常數(shù)為 a=l55.9 A、b=l55.9 A、c=496.4 A、α =
90。、β = 90。、γ = 90。的晶體。21.上述14中所述的成花素激活復(fù)合物的晶體的制備方法，其中，含有成花素與14-3-3蛋白的復(fù)合物的溶液的濃度為5mg/mL 40mg/mL，將成花素與14_3_3蛋白的復(fù)合物晶化的工序中的沉淀劑溶液含有O. 05M O. IM HEPES (pH為6. 5 8. 5)、0. OlM O. 4M硫酸銨、以及分子量為2000 4000且容量百分比為15 30的聚乙二醇，得到成花素激活復(fù)合物的晶體的工序中的沉淀劑溶液含有容量百分比為15 30的乙二醇、ImM 5mMbZIP轉(zhuǎn)錄因子、O. 05M O. IM HEPES (pH為6. 5 8. 5)、O. 2M IM硫酸銨、以及分子量為2000 4000且容量百分比為15 30的聚乙二醇。22.上述15中所述的調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的篩選方法，其中，上述立體結(jié)構(gòu)信息為表I或表2中記載的信息。23.上述15或22中所述的調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的篩選方法，其中，成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位是選自由序列編號I中的D62、M63、R64、P96、T98、F103 及 R132 和序列編號 2 中的 F200、D201、I204、E212、Y215、R226 及 D227 構(gòu)成的群中的I個以上的部位，14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位是選自由序列編號2中的K51、R58、F121、R131、L224及D227和序列編號3中的R189 F195構(gòu)成的群中的I個以上的部位。 24.上述15、22、23任一項所述的調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的篩選方法，其中，還包括獲得上述被設(shè)計或選擇的候選物質(zhì)的工序、和為了研究上述候選物質(zhì)的成花素激活復(fù)合物活性調(diào)節(jié)功能而使上述候選物質(zhì)與成花素、14-3-3蛋白和/或bZIP轉(zhuǎn)錄因子接觸的工序。25.上述15、22 24任一項所述的調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的篩選方法，其中，還包括利用上述14或21中所述的成花素激活復(fù)合物的晶體的制備方法來制備成花素激活復(fù)合物的晶體的工序、和通過對該結(jié)晶進(jìn)行X射線晶體結(jié)構(gòu)分析而得到成花素激活復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)信息的工序。(發(fā)明効果)本發(fā)明的晶體能夠帶來對于弄清楚植物的成花調(diào)節(jié)機(jī)制很重要的成花素激活復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)信息，并且，該晶體能夠作為用于對成花調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)一步研究的材料而使用。另外，根據(jù)從本發(fā)明的晶體得到的立體結(jié)構(gòu)信息，能夠人為地調(diào)節(jié)植物的成花。在本發(fā)明中，明確了成花素激活復(fù)合物中的各蛋白質(zhì)的結(jié)合部位，并且，能夠?qū)⒔Y(jié)合部位的信息作為成花調(diào)節(jié)的新型標(biāo)的而使用，從而能夠有效地進(jìn)行成花調(diào)節(jié)。根據(jù)本發(fā)明中得到的立體結(jié)構(gòu)信息，能夠得到可廣泛利用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)物的收量增加或育種的効率化等的轉(zhuǎn)基因植物。


圖I是表示Hd3a、GF14c以及OsFDl這三者的成花素激活復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)的圖。圖2是表示關(guān)于Hd3a與OsFDl、Hd3a與GF14c、GF14c與OsFDl這三個組合的體外GST pull-down實驗的結(jié)果的圖。(實施例1(1))圖3是表示使用了 NMR的、Hd3a與GF14c的相互作用分析的結(jié)果的圖。(實施例1(2))圖4是表示Hd3a與GF14c的相互作用的詳細(xì)情況的圖。圖4b表示Hd3a R64周邊的放大圖。(實施例3)圖5是表示使用了變異型Hd3a的、與GF14c的體外GST pull-down實驗的結(jié)果(圖5a)和使用了變異型GF14c的、與Hd3a的體外GST pull-down實驗的結(jié)果(圖5b)的圖。(實施例6)圖6是表示Hd3a、GF14c以及OsFDl的成花素激活復(fù)合物與C_box DNA的凝膠遷移實驗的結(jié)果的圖。(實施例7)圖7是表示使用酵母雙雜交法確認(rèn)0sGF14的各同種型與Hd3a的相互作用的結(jié)果的圖。(實施例8)圖8是表示使用酵母雙雜交法確認(rèn)Hd3a、OsGF14b以及OsFDl各組的相互作用的結(jié)果的圖。(實施例9)圖9是表示使用免疫沉淀法確認(rèn)Hd3a、OsGF14b以及OsFDl的各組在水稻莖頂端的相互作用的結(jié)果的圖。(實施例10)圖10是表示Hd3a、0sGF14b以及OsFDl的細(xì)胞內(nèi)定位的確認(rèn)結(jié)果的圖。(實施例11) 圖11是表示Hd3a、0sGF14b以及OsFDl的細(xì)胞內(nèi)定位的確認(rèn)結(jié)果的圖。(實施例11)圖12是表示Hd3a、0sGF14b以及OsFDl的細(xì)胞內(nèi)定位的確認(rèn)結(jié)果的圖。(實施例11)圖13是表示Hd3a、OsGF14b以及OsFDl的瞬時表達(dá)對0sMADS15基因的轉(zhuǎn)錄的影響的確認(rèn)結(jié)果的圖。(實施例12)圖14是表示Hd3a變異對植物的成花的影響的確認(rèn)結(jié)果的圖。(實施例13_1)圖15是表示通過本發(fā)明得到的成花素激活復(fù)合物的作用機(jī)制的圖。圖16是表示Hd3a變異對植物的成花的影響的確認(rèn)結(jié)果的圖。(實施例13_2)
具體實施例方式植物一般具有營養(yǎng)生長期和生殖生長期，并且在生長相從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)換時形成花芽。將該從營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)換現(xiàn)象稱為“成花”。例如單子葉植物的水稻或麥類中的成花為抽穗，所謂的抽穗是指穗下方的節(jié)距(穗頸)急速伸長從而從旗葉的葉鞘露出的現(xiàn)象。在水稻中將芒露出時稱為抽穗，而在麥類中穗出到根部為止時稱為抽穗。在本發(fā)明中，植物是指具有成花素的高等植物，優(yōu)選為在I天的日照時間為一定時間以下的情況下形成花芽的短日照植物，更優(yōu)選為單子葉短日照植物，進(jìn)而更優(yōu)選為禾本科植物，最優(yōu)選為水稻。(成花素激活復(fù)合物)本發(fā)明是由成花素、14-3-3蛋白以及bZIP轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)合物構(gòu)成的成花素激活復(fù)合物，并且涉及由成花素通過14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而形成的成花素激活復(fù)合物。在本發(fā)明中，成花素沒有特別限定，可以例舉出水稻的Hd3a、RFTI (GenbankAccession No. AB062676)、擬南芥的 FT (Genbank Accession No. AB027504)、TSF (GenbankAccession No. AB027506)、西紅柿的 SFT (Genbank Accession No. AY186735)、小麥的VRN3 (Genbank Accession No. L0C100037541)等，優(yōu)選為水稻 Hd3a。水稻 Hd3a 中含有序列編號 I 所不的氛基酸序列(0s06g0157700) (Genbank Accession No. BAB61028 :源自 Oryzasativa Japonica group cultivar Nipponbare)所表示的蛋白質(zhì)、或者由在序列編號I的氨基酸序列中缺失、取代、附加和/或插入了 I個 數(shù)個氨基酸殘基后的氨基酸序列構(gòu)成且作為成花素發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中的水稻Hd3a優(yōu)選為至少含有序列編號I中的第62 132位氨基酸序列，并且以第I 6位中的I個氨基酸開始且以第165 177位中的I個氨基酸結(jié)束的成花素多肽片段，更優(yōu)選為由序列編號I中的第6 170位氨基酸序列構(gòu)成的多肽片段。另外，特別優(yōu)選該多肽片段具有序列編號I中的C43L/C109S/C166S的變
巳在本發(fā)明中，14-3-3蛋白沒有特別限定，優(yōu)選為水稻GF14。水稻GF14中具有 0sGF14a (0s08g0480800)、0sGF14b (0s04g0462500)、0sGF14c (0s08g0430500)、0sGF14d(0sllg0546900)、 0sGF14e(0s02g0580300)、 0sGF14f(0s03g0710800)、0sGF14g(0s01g0209200)、0sGF14h (0sllg0609600)這八個同種型(isoform)，在本發(fā)明中，優(yōu)選為6 1仙、6 14(、6 146、6 14乜更優(yōu)選6 14(3或6 1413。需要說明的是，在本說明書中，以O(shè)s開始的編號只要沒有特別說明，便是水稻注釋計劃數(shù)據(jù)庫(Rice annotation project database,RAP-DB)中被特定的基因座的編號?？梢愿鶕?jù)這些編號來特定各GF14等的蛋白質(zhì)的氨基酸序列和堿基序列。水稻GF14c中含有序列編號2所示的氨基酸序列(0s08g0430500) (Genbank Accession No. AAB07457. I :源自 Oryza sativa Japonica group cultivar Nipponbare)所表示的蛋白質(zhì)、或者由在序列編號2的氨基酸序列中缺失、取代、附加和/或插入了 I個 數(shù)個氨基酸殘基后的氨基酸序列構(gòu)成，并且具有作為14-3-3蛋白與成花素結(jié)合的功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中的14-3-3蛋白優(yōu)選為至少含有序列編號2中的第51 227位的氨基酸序列，并且以第I 5位中的I個氨基酸開始且以第230 256位中的I個氨基酸結(jié)束的多肽片段，更優(yōu)選為由序列編號2中的第I 235位的氨基酸序列構(gòu)成的多肽片段。另外，水稻GF14b含有序列編號4所示的氨基酸序列(0s04g0462500) (GenbankAccession No. AK071822 :源自 Oryza sativa Japonica group cultivar Nipponbare)所表示的蛋白質(zhì)、或者由在序列編號4的氨基酸序列中缺失、取代、附加和/或插入了 I個 數(shù)個的氨基酸殘基后的氨基酸序列構(gòu)成，并具有作為14-3-3蛋白與成花素結(jié)合的功能的蛋白質(zhì)。水稻GF14b的氨基酸序列與GF14c的氨基酸序列相比較有六個殘基發(fā)生偏離。序列編號2中的第51 227位的氨基酸序列相當(dāng)于序列編號4中的第57 233位的氨基酸序列，序列編號2中的以第I 5位中的I個氨基酸開始并以第230 256位中的I個氨基酸結(jié)束的氨基酸序列，相當(dāng)于序列編號4中的以第7 11位中的I個氨基酸開始并以第236 262位中的I個氨基酸結(jié)束的氨基酸序列。在本發(fā)明中，bZIP轉(zhuǎn)錄因子沒有特別限定，可以例舉出水稻OsFDl或者擬南芥的FD (Genbank Accession No. AB105823)，優(yōu)選水稻OsFDl。水稻OsFDl含有序列編號3所示的氨基酸序列(0s09g0540800 :源自 Oryza Sativa Japonica group cultiva r Nipponbare)(TIGR水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫中被特定的Rice genome annotation locus No. L0C_0s09g36910. I)所表示的蛋白質(zhì)、或者由在序列編號3的氨基酸序列中缺失、取代、附加和/或插入了 I個 數(shù)個氨基酸殘基后的氨基酸序列構(gòu)成且作為bZIP轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中的bZIP轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)選為至少含有序列編號3中的第189 195位的氨基酸序列，且以第182 188位中的I個氨基酸開始并以第195位的氨基酸結(jié)束的多肽片段，更優(yōu)選為由序列編號3中的第187 195位的氨基酸序列構(gòu)成的多肽片段。另外，優(yōu)選在該多肽片段中第192位的絲氨酸被磷酸化。該絲氨酸的磷酸化被認(rèn)為是14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合所必需的。上述成花素、14-3-3蛋白以及bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而形成成花素激活復(fù)合物。對于成花素和14-3-3蛋白的結(jié)合而言，認(rèn)為序列編號I中的第62 132位的氨基酸序列的區(qū)域或者具有序列編號I以外的氨基酸序列的成花素的與上述區(qū)域相當(dāng)?shù)膮^(qū)域，和/或序列編號2中的第200 227位的氨基酸序列的區(qū)域或者具有序列編號2以外的氨基酸序列的14-3-3蛋白的與上述區(qū)域相當(dāng)?shù)膮^(qū)域很重要。另外，對于14-3-3蛋白和bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而言，序列編號2中的第51 227位的氨基酸序列的區(qū)域或者具有序列編號2以外的氨基酸序列的14-3-3蛋白的與上述區(qū)域相當(dāng)?shù)膮^(qū)域，和/或序列編號3中的第189 195位的氨基酸序列的區(qū)域或者具有序列編號3以外的氨基酸序列的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的與上述區(qū)域相當(dāng)?shù)膮^(qū)域很重要，這在本發(fā)明中是顯而易見的。進(jìn)而，在這些區(qū)域中，對于成花素和14-3-3蛋白的結(jié)合而言，認(rèn)為序列編號I中的 D62、M63、R64、P96、T98、F103、R132的氨基酸或者具有序列編號I以外的氨基酸序列的成花素的與上述氨基酸相當(dāng)?shù)陌被?，?或序列編號2中的F200、D201、1204、E212、Y215、R226、D227的氨基酸或者具有序列編號2以外的氨基酸序列的14_3_3蛋白的與上述氨基酸相當(dāng)?shù)陌被岷苤匾Ａ硗?，對?4-3-3蛋白和bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合而言，序列編號2中的K51、R58、F121、R131、L224、D227的氨基酸或者具有序列編號2以外的氨基酸序列的14-3-3蛋白的與上述氨基酸相當(dāng)?shù)陌被岷苤匾?，這在本發(fā)明中是顯而易見的。在本發(fā)明中，所謂的“相當(dāng)于序列編號X中的特定的氨基酸(例如D62等)的蛋白質(zhì)的部位”，是以除了序列編號X中的特定的氨基酸(例如D62)的部位以外，還包括在具有序列編號X以外的氨基酸序列且具有與序列編號X的蛋白質(zhì)等價的功能的蛋白質(zhì)中的、相當(dāng)于上述特定的氨基酸(例如D62)的部位的含義進(jìn)行使用。例如，所謂的“相當(dāng)于序列編號2中的F200、D201、I204、E212、Y215及R226的14-3-3蛋白的部位”，是指除了序列編號2中的F200、D201、I204、E212、Y215及R226的部位以外，還包括具有序列編號2以外的氨基酸序列的14-3-3蛋白的與上述氨基酸相當(dāng)?shù)陌被帷⒗缢綠F14b的F206、D207、I210、E218、Y221 及 R232(相當(dāng)于水稻 GF14c 的 F200、D201、1204、E212、Y215 及 R226)。對成花素激活復(fù)合物在成花中的作用機(jī)制進(jìn)行說明(參照圖15)。14-3-3蛋白作為從葉子輸送到莖頂端的成花素的銜接物(adaptor)而發(fā)揮作用。一般認(rèn)為當(dāng)成花素進(jìn)入莖頂端的細(xì)胞內(nèi)時，成花素首先在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)與14-3-3蛋白結(jié)合。在此階段，OsFDl在莖頂端細(xì)胞中被表達(dá)，該成花素和14-3-3蛋白的復(fù)合物從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入核內(nèi)，并與bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合從而形成成花素激活復(fù)合物，并且，該成花素激活復(fù)合物停留在核內(nèi)。當(dāng)這一系列的工序開始時，成花素激活復(fù)合物在核內(nèi)積累。之后，成花素激活復(fù)合物將引起成花誘導(dǎo)的成花相關(guān)基因(例如0sMADS15基因)的轉(zhuǎn)錄激活。在上述作用機(jī)制中，成花素在莖頂端細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)被14-3-3蛋白捕獲，并且，通過bZIP轉(zhuǎn)錄因子而使成花素和14-3-3蛋白的復(fù)合物被高效地輸送至核內(nèi)，以便將成花誘導(dǎo)所需的基因的轉(zhuǎn)錄激活。另外，本發(fā)明中的基于成花素激活復(fù)合物的成花相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活，被認(rèn)為是通過成花素激活復(fù)合物向C-box DNA的結(jié)合而進(jìn)行的。所謂的“C-box DNA”由GACGTC(序列編號10)的堿基序列所表示，并且存在于成花相關(guān)基因的啟動子區(qū)中。推測成花素激活復(fù)合物是在成花相關(guān)基因的C-box上形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而將成花相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活。在本發(fā)明中，成花素、14-3-3蛋白、bZIP轉(zhuǎn)錄因子、它們的變異型蛋白質(zhì)、成花素與14-3-3蛋白的復(fù)合物、14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)合物、以及作為這三者的復(fù)合物的成花素激活復(fù)合物，既可以是從細(xì)胞、組織等分離提純后的狀態(tài)，也可以是將編碼蛋白質(zhì)的基因?qū)虢湍富虼竽c桿菌等的宿主細(xì)胞而將該蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的狀態(tài)。另外，本發(fā)明還涉及編碼這些蛋白質(zhì)的多核苷酸。也可以根據(jù)宿主細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)而對這些蛋白質(zhì)附加不影響蛋白質(zhì)的功能程度的肽片段。例如在使用大腸桿菌的表達(dá)系統(tǒng)的情況下，源自大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒的肽片段(GPGHM)被附加在蛋白質(zhì)的N末端。成花素和14-3-3蛋白的復(fù)合物或者14-3-3蛋白和bZIP轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)合物可以通過使兩種蛋白質(zhì)以分離提純后的狀態(tài)接觸、或者在生物體內(nèi)接觸來制備。同樣地，作為三者的復(fù)合物的成花素激活復(fù)合物，也可以通過使三種蛋白質(zhì)或者上述兩者的復(fù)合物中的任一種與剩余的蛋白質(zhì)以分離提純后的狀態(tài)接觸、或者在細(xì)胞等的生物體內(nèi)接觸來制備。
(成花素激活復(fù)合物或者成花素的晶體的制備方法) 首先，制備蛋白質(zhì)溶液。使蛋白質(zhì)存在于由緩沖液、鹽、還原劑等制成的溶液中。緩沖液、鹽、還原劑只要是對蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)沒有影響的物質(zhì)，便可以是任何物質(zhì)，例如，緩沖液可以例舉出ImM 500mM的Na-HEPES、磷酸鈉、磷酸鉀、Tris-HCl等，鹽可以例舉出ImM IM的氯化鈉、氯化鋰、氯化鎂等,還原劑可以例舉出O. ImM IOmM的β -巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)等。另外，蛋白質(zhì)溶液中還可以含有二甲亞砜(DMSO)或者乙二醇。含蛋白質(zhì)的溶液的pH為4 11,優(yōu)選pH為6 9。該蛋白質(zhì)溶液或成花素溶液既可以直接使用于晶化中，也可以根據(jù)需要進(jìn)一步添加防腐劑或者穩(wěn)定劑、表面活性劑等之后使用于晶化中。作為將蛋白質(zhì)(多肽)晶化的方法，可以使用蒸汽擴(kuò)散法、分批法(batchmethod)、透析法等通常的蛋白質(zhì)晶化方法。另外，在蛋白質(zhì)的晶化中，蛋白質(zhì)的濃度、鹽濃度、pH、沉淀劑的種類、溫度等的物理和化學(xué)因素的確定很重要。所謂的“蒸汽擴(kuò)散法”，是將含有沉淀劑的蛋白質(zhì)溶液的液滴放置于裝有含更高濃度的沉淀劑的緩沖液(外液)的容器中并密封后靜置的方法。根據(jù)液滴的放置方式，有懸滴法(hanging drop method)和坐滴法(sitting drop method),本發(fā)明中可以采用任一種方法。懸滴法是將蛋白質(zhì)溶液的小液滴配置于蓋玻片上，并且，使蓋玻片在儲液器內(nèi)倒置并將儲液器密封的方法。另一方面，坐滴法是在儲液器內(nèi)部設(shè)置適宜的液滴座，將蛋白質(zhì)溶液的小液滴配置在液滴座上，并利用蓋玻片等將儲液器密封的方法。在任一方法中，均在儲液器中的溶液(儲液器溶液)中含有沉淀劑。也可以在蛋白質(zhì)的小液滴中適當(dāng)?shù)睾猩倭康某恋韯?。蒸汽擴(kuò)散法中使用的儲液器溶液(也稱為“沉淀劑溶液”)是由緩沖液、沉淀劑、鹽等制成的溶液。緩沖液、沉淀劑、鹽只要是能夠有効地制備晶體的物質(zhì)，便可以是任何物質(zhì)，例如，緩沖液可以從PH4 10、5mM 200mM的Na_HEPES、磷酸鈉、磷酸鉀、Tris_HCl、乙酸鈉、檸檬酸、卡可基酸(cacodylic acid)等中進(jìn)行選擇，沉淀劑可以從分子量為550 20000且容量百分比為5 35的聚乙二醇(PEG)、0. 2M 2M的硫酸銨、容量百分比為5 35的MPD(甲基戊二醇)、0. 2M 2M的酒石酸銨或容量百分比為5 35的異丙醇、或者這些物質(zhì)的組合中進(jìn)行選擇，鹽可以從0. 2M 4M的氯化鈉、氯化鋰、氯化鎂等中進(jìn)行選擇。儲液器溶液的成分并不限于上述情況。本發(fā)明的成花素激活復(fù)合物的晶體可以如下那樣進(jìn)行制備。將成花素和14-3-3蛋白加以混合，并透析至含有IOmM 50mM NaCl的ImM 50mM Tris-HCl緩沖液(pH為6. 5 8. 5)中，由此來調(diào)制復(fù)合物試樣。將蛋白質(zhì)溶液(蛋白質(zhì)濃度為5mg/mL 40mg/mL)和沉淀劑溶液(O. 05M O. IM HEPES (pH為6. 5 8. 5)、O. OlM O. 4M硫酸銨、容量百分比為15 30的PEG (分子量為2000 4000))進(jìn)行混合，并使用坐滴法在4°C 20°C的條件下進(jìn)行成花素和14-3-3蛋白的復(fù)合物的晶化。在約I 3周后得到成花素和14-3-3蛋白的復(fù)合物的單晶體。將得到的單晶體進(jìn)行回收，并在含有容量百分比為15 30的乙二醇、ImM 5mM的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的沉淀劑溶液(O. 05M O. IM HEPES (pH為6. 5 8. 5)、O. OlM O. 4M(優(yōu)選為O. 15M O. 25M)硫酸銨、容量百分比為15 30 (優(yōu)選為23 27)
的PEG (分子量為2000 4000))中培養(yǎng)10 20分鐘，由此能夠得到適于X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的成花素激活復(fù)合物的晶體。本發(fā)明的成花素激活復(fù)合物的晶體優(yōu)選可以如下那樣進(jìn)行制備。將成花素和14-3-3蛋白以摩爾比I : I 2 (更優(yōu)選為I : I. 5)進(jìn)行混合，并透析至含有20mM NaCl的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH為7. 5)中，由此來調(diào)制復(fù)合物試樣。將I μ I蛋白質(zhì)溶液(蛋白質(zhì)濃度為10mg/mL)和I μ I沉淀劑溶液(O. IM HEPES (pH為7. 5)、0· 2M硫酸銨、容量百分比為25的PEG 3350)進(jìn)行混合，并使用坐滴法在4°C的條件下進(jìn)行成花素和14_3_3蛋白的復(fù)合物的晶化。在約I 3周后得到成花素和14-3-3蛋白的復(fù)合物的單晶體。將得到的單晶體進(jìn)行回收，并在含有25%乙二醇、2mM bZIP轉(zhuǎn)錄因子的沉淀劑溶液((O. IM HEPES(pH為7. 5)、0. 2M硫酸銨、容量百分比為25的PEG 3350)中培養(yǎng)10 20分鐘(更優(yōu)選為15分鐘)，由此能夠得到成花素激活復(fù)合物的晶體。本發(fā)明中的成花素的晶體可以如下那樣進(jìn)行制備。將提純后的成花素透析至含有IOmM 50mM NaCl的ImM 50mM Tris緩沖液(pH為5. 5 7. 5)中，并濃縮至濃度成為5mg/mL 40mg/mL。將得到的蛋白質(zhì)溶液和沉淀劑溶液(O. OlM O. 5M(優(yōu)選為O. 05M O. 15M)卡可基酸(pH為5. 5 7. 5)、0· OlM O. 5M(優(yōu)選為O. 15M O. 25M)酒石酸銨、容量百分比為10 50 (優(yōu)選為25 35)的PEG (分子量為5000 12000))進(jìn)行混合，并使用坐滴法在4V 20°C的條件下進(jìn)行，由此能夠在約O. 5天 3天(優(yōu)選為約I天)后得到適于X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的成花素激活復(fù)合物的晶體。本發(fā)明中的成花素的晶體優(yōu)選可以如下那樣進(jìn)行制備。將提純后的成花素透析至含有20mM NaCl的IOmM Tris緩沖液(pH為7. 5)中，并濃縮至濃度成為5mg/ml。將得到的I μ I蛋白質(zhì)溶液和I μ I沉淀劑溶液(O. IM卡可基酸(pH為6. 5)、0. 2M酒石酸銨、容量百分比為30的PEG 8000)進(jìn)行混合，并使用坐滴法在4°C的條件下進(jìn)行，由此能夠在約O. 5天 3天(優(yōu)選為約I天)后得到適于X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的成花素激活復(fù)合物的晶體。在本發(fā)明中，優(yōu)選得到具有如下那樣的品質(zhì)的晶體，S卩，在供于X射線晶體結(jié)構(gòu)分析時僅賦予至少IOA以下的分辨率、優(yōu)選為4.0A以下的分辨率、更優(yōu)選為3.4A以下的分辨率、進(jìn)而更優(yōu)選為2.8 A以下的分辨率、尤其優(yōu)選為2.4 A以下的分辨率的品質(zhì)(((Introduction to Protein Structure 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)入門》Carl Brandon&JohnTooze,勝部幸輝等翻譯，教育社，1992年，276-277頁)。(成花素激活復(fù)合物或成花素的晶體)
本發(fā)明的成花素激活復(fù)合物或成花素的晶體實質(zhì)上不含雜質(zhì)，并且即使再次溶解時也具有活性。作為雜質(zhì)，可以舉出GST、成花素或成花素激活復(fù)合物的分解產(chǎn)物、大腸桿菌固有的蛋白質(zhì)等。本發(fā)明的成花素激活復(fù)合 物的晶體的空間群為P1、P6522或者P4，晶格常數(shù)為a=74A 158 A、b=64 A 158 A、c=96 A 500A、α =66。 90。、β =85。 90。、Y =75。 120°。根據(jù)本發(fā)明得到的晶體的分辨率為約I.OA 約3.5 Α，是足以實施X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的品質(zhì)和大小。本發(fā)明的成花素激活復(fù)合物的晶體優(yōu)選為從以下選擇的晶體(I)晶體的空間群為Ρ1，晶格常數(shù)為a=74A 79Α、b=94A 99A、c=96A~10lA、α = 66° 70°、β = 85° 90°、Y = 75° 79° 的晶體；(2)晶體的空間群為Ρ6522,晶格常數(shù)為a=125 A 135 A、b=125 A~135 A、c=340 A-344 A > α = 90°、β =90°、Y =120。的晶體；⑶晶體的空間群為Ρ4，晶格常數(shù)為a=153 A 158 A、b=153 Α~158Α、c=495 Α~498 A、ct =90°、β = 90°、γ =90° 的晶體。本發(fā)明的成花素激活復(fù)合物的晶體更優(yōu)選為從以下選擇的晶體〔成花素激活復(fù)合物I〕晶體的空間群為Ρ1，晶格常數(shù)為a=76.7A、b=96.6A、c 二 99.5 A、α = 68.2°、β = 87.9°、γ = 77.9° 且分辨率為 2.4 A 的晶體；〔成花素激活復(fù)合物2〕晶體的空間群為P1，晶格常數(shù)為a=76.8A、b=97.3 A、c=99.8A, α = 68. 1° , β = 87.8° , y = 77.9° 且分辨率為 2.2 A 的晶體；〔成花素激活復(fù)合物3〕晶體的空間群為Pl，晶格常數(shù)為a=76.2A、b=96.1 A、c=99.1 A, α = 68.2°、β = 88. 6°、γ = 77.8° 且分辨率為 2.8 A 的晶體；〔成花素激活復(fù)合物4〕晶體的空間群為P6522，晶格常數(shù)為a=129.0A、b=129.0A、c=342.0A、α = 90°、β = 90°、Y = 120。且分辨率為 2.85 A的晶體；〔成花素激活復(fù)合物5〕晶體的空間群為P4,晶格常數(shù)為a=l55.9A、b=l55.9A、c=496.4A、α = 90°、β = 90°、Y = 90。且分辨率為 2.96A的晶體。本發(fā)明的成花素的晶體的空間群為P63，晶格常數(shù)為a=65 A 67A、b=65 A 67A、c=58A 61A、α = 90°、β = 90°、Y = 120°。根據(jù)本發(fā)明得到的晶體的分辨率為約1.θΑ 約3.5·Α(優(yōu)選為1.0 A 1.5 A )，是足以實施X射線晶體結(jié)構(gòu)分析的品質(zhì)和大小。本發(fā)明的成花素的晶體優(yōu)選為從以下選擇的晶體〔成花素I〕晶體的空間群為Ρ63,晶格常數(shù)為a=65.9A、b=65.9 A、c二59.8 A、α
=90°、β = 90°、γ = 120°且分辨率為1.3 A的晶體；〔成花素2〕晶體的空間群為P6522,晶格常數(shù)為3=66.(^4=66.(^4=60.21
α =90°、β = 90°、Y = 120°且分辨率為1.4 A的晶體；上述成花素的晶體的分辨率優(yōu)良，并且，對上述晶體進(jìn)行X射線結(jié)構(gòu)分析而得到的立體結(jié)構(gòu)信息適合使用于基于計算機(jī)的對接仿真(docking simulation)等。(X射線晶體結(jié)構(gòu)分析)作為明確蛋白質(zhì)(多肽)的立體結(jié)構(gòu)的方法而最普遍進(jìn)行的是X射線晶體結(jié)構(gòu)分析。其是將蛋白質(zhì)晶化，對其晶體照射單色化后的X射線，從而根據(jù)得到的X射線的衍射像來明確蛋白質(zhì)中的立體結(jié)構(gòu)信息。立體結(jié)構(gòu)信息中包括電子密度圖和原子坐標(biāo)，原子坐標(biāo)可以通過該技術(shù)領(lǐng)域公知的方法進(jìn)行分析而得到(D.E. McRee, Practical ProteinCrystallography, Academic Press, San Diego (1993))。X射線晶體結(jié)構(gòu)分析包括對晶體照射X射線而得到衍射數(shù)據(jù)的工序、通過得到的衍射數(shù)據(jù)的分析而得到蛋白質(zhì)(多肽)的電子密度的工序、以及通過得到的電子密度的分析而得到蛋白質(zhì)(多肽)的原子坐標(biāo)的工序。X射線晶體結(jié)構(gòu)分析是使用實驗室的X射線衍射儀或大型放射光設(shè)施(ESRF，APS，SPring-8, PF, ALS, CHESS, SRS, LLNL, SSRL, Brookhaven 等)，通過振動照相法等并利用成像板或CCD照相機(jī)等的二維檢測器而進(jìn)行衍射數(shù)據(jù)的收集，并根據(jù)該數(shù)據(jù)得到電子密度，由此能夠弄清楚原子坐標(biāo)。由于蛋白質(zhì)的晶體因X射線照射而受到損傷從而衍射能力變差的情況較多，因此，優(yōu)選利用低溫測定來進(jìn)行高分辨率的X射線衍射。所謂的“低溫測定”，是將晶體急劇冷 卻凍結(jié)至-173°C左右并在該狀態(tài)下收集衍射數(shù)據(jù)的方法。一般而言，在蛋白質(zhì)晶體的凍結(jié)中，出于防止因為凍結(jié)而導(dǎo)致晶體損壞的目的，想出了利用含有甘油等保護(hù)劑(防凍劑)的溶液進(jìn)行處理等的方法。凍結(jié)晶體可以通過將浸泡在例如添加了保護(hù)劑的保存液中的晶體直接浸潰于液態(tài)氮中而使之瞬間凍結(jié)來制備。通過利用數(shù)據(jù)處理軟件對根據(jù)X射線衍射實驗收集的衍射圖像進(jìn)行處理，能夠算出由各個衍射斑點(diǎn)的指數(shù)和積分得到的衍射強(qiáng)度。通過使用這些衍射斑點(diǎn)的衍射強(qiáng)度和相位信息進(jìn)行傅里葉逆變換而導(dǎo)出三維空間的電子密度。在衍射實驗中，由于在原理上是無法測量電子密度的計算所需的各衍射斑點(diǎn)的相位信息，因此，為了得到電子密度，而利用分子置換法、重原子同晶置換法、多波長反常散射法(MAD法)或它們的改進(jìn)方法來推定作為失去的信息的相位。由這樣得到的電子密度繪出電子密度圖，根據(jù)該電子密度圖并使用在圖形工作站上運(yùn)行的軟件來構(gòu)建三維模型。在構(gòu)建了該模型之后，利用最小二乘法等進(jìn)行結(jié)構(gòu)的精密化，由此得到最終的蛋白質(zhì)的原子坐標(biāo)(立體結(jié)構(gòu)坐標(biāo))。(成花素激活復(fù)合物或成花素的立體結(jié)構(gòu)信息)原子坐標(biāo)是指將上述蛋白質(zhì)的原子的位置以三維坐標(biāo)的形式進(jìn)行表示的數(shù)學(xué)坐標(biāo)。原子坐標(biāo)實質(zhì)上是指根據(jù)構(gòu)成化學(xué)結(jié)構(gòu)的分子(原子)間的各距離而確定的空間配置。在將空間配置在計算機(jī)上作為信息進(jìn)行處理時，將相對的配置作為某一坐標(biāo)系中的特定坐標(biāo)而數(shù)字信息化(稱為“坐標(biāo)化”)。這是在進(jìn)行計算機(jī)處理時為了方便所必需的處理，原子坐標(biāo)的本質(zhì)如之前所示為根據(jù)各分子(原子)間相互的距離而確定的配置，應(yīng)當(dāng)理解為并非計算機(jī)處理時暫時被特定的坐標(biāo)值。另外，在本說明書中，所謂的“原子坐標(biāo)”是指關(guān)于構(gòu)成物質(zhì)(蛋白質(zhì)、氨基酸等)的各個原子的坐標(biāo)。在本說明書中，將成花素激活復(fù)合物I的原子坐標(biāo)表示于表I中，將成花素I的原子坐標(biāo)表示于表2中。表I和2的數(shù)據(jù)依據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)銀行(PDB)的格式(http://www. wwpdb. org/documentation/format23/v2. 3. html)進(jìn)行記載。另外，在本發(fā)明中，對于與本發(fā)明的多肽具有40%以上的同源性的蛋白質(zhì)，也可以使用由上述電子密度或原子坐標(biāo)所表示的立體結(jié)構(gòu)信息，而以衍生物的形式得到在計算機(jī)上通過同源建模(homologymodeling)等得到的原子坐標(biāo)。
(調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的篩選方法)通過選擇在由成花素、14-3-3蛋白以及bZIP轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成的成花素激活復(fù)合物中能夠?qū)Ω鞯鞍踪|(zhì)的結(jié)合產(chǎn)生影響的物質(zhì)(包括化合物)、具有能夠競爭性地與結(jié)合部位結(jié)合的結(jié)構(gòu)的物質(zhì)(包括化合物)，能夠從大量物質(zhì)中得到能夠調(diào)節(jié)成花的物質(zhì)。作為本發(fā)明的篩選方法的一個形態(tài)，可以舉出使用計算機(jī)設(shè)計和/或選擇具有調(diào)節(jié)成花素激活復(fù)合物的活性的功能的候選物質(zhì)，由此篩選出調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的方法(以下，也簡稱為“使用計算機(jī)的篩選方法”)。該篩選方法包括以下的工序(a)將從本發(fā)明的成花素激活復(fù)合物或成花素的晶體中得到的立體結(jié)構(gòu)信息存儲在存儲手段中的工序，(b)根據(jù)立體結(jié)構(gòu)信息并利用導(dǎo)出手段而將三維立體結(jié)構(gòu)模型導(dǎo)出的工序，
(C)在導(dǎo)出的三維立體結(jié)構(gòu)模型中，利用計算手段計算出原子間距離的工序，(d)根據(jù)計算出的原子間距離，并利用計算手段而計算出能夠增強(qiáng)和/或阻礙成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合、和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合的候選物質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)信息，由此設(shè)計和/或選擇候選物質(zhì)的工序。作為上述成花素激活復(fù)合物等的立體結(jié)構(gòu)信息，可以使用各蛋白質(zhì)的結(jié)合部位的原子坐標(biāo)，可以利用各蛋白質(zhì)的原子坐標(biāo)的整體、包含結(jié)合部位在內(nèi)的其派生物、以及它們的一部分。另外，在本發(fā)明中，也可以利用將結(jié)合部位的原子坐標(biāo)在計算機(jī)上適宜地進(jìn)行了改變后的信息，以便適于篩選。在工序(a)和工序(b)中，通過將成花素激活復(fù)合物或成花素的立體結(jié)構(gòu)信息中的原子坐標(biāo)輸入到表達(dá)分子的原子坐標(biāo)的計算機(jī)程序運(yùn)行的計算機(jī)或該計算機(jī)的存儲介質(zhì)中，能夠詳細(xì)地表達(dá)出各種蛋白質(zhì)的三維化學(xué)相互作用的方式。表達(dá)分子的原子坐標(biāo)的計算機(jī)程序在市場上大量有售，這些程序一般具備分子的原子坐標(biāo)的輸入手段；根據(jù)立體結(jié)構(gòu)信息并通過導(dǎo)出手段而將三維立體結(jié)構(gòu)模型導(dǎo)出，并且將該坐標(biāo)視覺性地表達(dá)在計算機(jī)圖像中的手段；測量或計算被表達(dá)在計算機(jī)圖像中的分子內(nèi)的各原子間的距離或結(jié)合角等的手段；進(jìn)行該坐標(biāo)的追加修正的手段等。進(jìn)而，還可以使用具備根據(jù)分子的坐標(biāo)來計算分子的結(jié)構(gòu)能的手段、考慮到水分子等的溶劑分子后計算自由能的手段的程序。由Accelrys公司市售的計算機(jī)程序InsightII或QUANTA適合用于本發(fā)明的篩選方法,但是，能夠使用于本發(fā)明中的程序并不限于上述程序。候選物質(zhì)可以是公知或新型物質(zhì)中的任一種，其結(jié)構(gòu)、來源、物理性能等也沒有特別限制，可以為天然化合物、合成化合物、高分子化合物、低分子化合物、肽、核酸類似物的任意一種。候選物質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)的坐標(biāo)化只要使用公知的程序即可，例如，作為將低分子化合物的立體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)化的程序，可利用CORINA(http://www2. chemie. uni-erlangen.de/software/corina/index, html)、Concord(http ://www. tripos, com/sciTech/inSilicoDisc/chemlnfo/concord, html)、或者 Converter 等。在工序(c)和(d)中，包括以下階段使候選物質(zhì)的原子坐標(biāo)與具有成花素、14-3-3蛋白、bZIP轉(zhuǎn)錄因子(或者，它們之中二者的復(fù)合物或成花素激活復(fù)合物)的結(jié)合部位的原子坐標(biāo)在同一坐標(biāo)系上重合，從而對兩者的一致狀態(tài)進(jìn)行評價的階段、或者根據(jù)成花素激活復(fù)合物等的原子坐標(biāo)計算出原子間距離，并根據(jù)原子間距離來設(shè)計候選物質(zhì)的階段。這些階段能夠使用上述那樣的市售軟件包和能夠運(yùn)行該軟件的計算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行實施。該計算機(jī)系統(tǒng)適宜地包括例如保存化合物等物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式的存儲手段、將化合物等物質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)坐標(biāo)化的手段、保存化合物等物質(zhì)的原子坐標(biāo)的存儲手段；保存工序(a)中所使用的各蛋白質(zhì)的原子坐標(biāo)的存儲手段、保存評價結(jié)果的存儲手段；顯示各存儲手段中的內(nèi)容的手段；鍵盤等的輸入手段、顯示器等的顯示手段、以及中央處理器等的運(yùn)作目標(biāo)軟件所需的各種手段。作為分析用軟件，只要是能夠在計算機(jī)上進(jìn)行使候選物質(zhì)與蛋白質(zhì)對接(docking)的操作的軟件,便可以使用任何軟件,例如也可以使用DOCK、FlexX(Tripos公司)>LigandFit (Accelrys 公司)、Ludi (Accelrys 公司)等。此外，還可使用 InsightII 等的分子顯示軟件以對話的方式進(jìn)行。此時，作為使用這些程序評價一致狀態(tài)時的指標(biāo)，可以任意選擇使用復(fù)合物整體的自由能計算值、經(jīng)驗打分函數(shù)、形狀的互補(bǔ)性的評價等。通過該指標(biāo)，能夠客觀地評價結(jié)合的良好與否。使用了成花素和成花素激活復(fù)合物等各種蛋白質(zhì)的原子坐標(biāo)的成花調(diào)節(jié)物質(zhì)的設(shè)計或選擇，能夠在計算機(jī)上迅速地進(jìn)行篩選。另外，對于通過利用計算機(jī)的篩選而選擇的候選物質(zhì)群而言，優(yōu)選進(jìn)行實驗性評價?！ぴ谏鲜鍪褂糜嬎銠C(jī)篩選調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的方法中，為了實驗性評價上述候選物質(zhì)的調(diào)節(jié)成花素激活復(fù)合物的作用的功能，候選物質(zhì)優(yōu)選合成或獲得。候選物質(zhì)只要使用公知的方法合成、或通過提純等從生物體獲得即可。進(jìn)而，通過將得到的候選物質(zhì)供給于使用成花素等各種蛋白質(zhì)的生物化學(xué)方法或生物學(xué)方法等而進(jìn)行實驗性評價，從而能夠選擇具有更有效地調(diào)節(jié)成花素激活復(fù)合物的作用的功能的物質(zhì)，進(jìn)一步能夠選擇調(diào)節(jié)成花的物質(zhì)。作為本發(fā)明的篩選方法的其他形態(tài)，可以舉出通過生物化學(xué)方法或生物學(xué)方法來選擇具有調(diào)節(jié)成花素激活復(fù)合物的作用的功能的物質(zhì)(即，具有能夠調(diào)節(jié)成花的功能的物質(zhì))的方法本身(以下，也僅稱為“基于生物化學(xué)方法等的篩選方法”)。候選物質(zhì)是否顯示成花素激活復(fù)合物作用的調(diào)節(jié)功能，只要調(diào)查在向能夠確認(rèn)成花素激活復(fù)合物作用的調(diào)節(jié)功能的系統(tǒng)中添加和未添加該候選物質(zhì)時，成花素激活復(fù)合物的作用是否具有差別、例如形成的成花素激活復(fù)合物的量是否有差別即可。所謂的“能夠確認(rèn)調(diào)節(jié)成花素激活復(fù)合物的作用的功能的系統(tǒng)”，例如是基于使成花素、14-3-3蛋白和/或bZIP轉(zhuǎn)錄因子接觸的工序的系統(tǒng)，進(jìn)一步可具體舉出以下的工序(I)使候選物質(zhì)與成花素或14-3-3蛋白中的任一種接觸，之后使候選物質(zhì)與14-3-3蛋白或成花素接觸的工序；或者(2)使候選物質(zhì)與結(jié)合有或未結(jié)合有成花素的14-3-3蛋白或者bZIP轉(zhuǎn)錄因子中的任一種接觸，之后使候選物質(zhì)與bZIP轉(zhuǎn)錄因子或者結(jié)合有或未結(jié)合有成花素的14-3-3蛋白接觸的工序。所謂的“調(diào)節(jié)成花素激活復(fù)合物的作用的功能”，優(yōu)選為增大和/或抑制成花素激活復(fù)合物的形成的功能。一般認(rèn)為通過增大和/或抑制成花素激活復(fù)合物的形成，能夠調(diào)節(jié)植物的成花，即能夠加快和/或延遲成花。上述使成花素、14-3-3蛋白和/或bZIP轉(zhuǎn)錄因子接觸的工序能夠通過在候選物質(zhì)的存在下或不存在下進(jìn)行酵母雙雜交法、雙分子熒光互補(bǔ)法等確認(rèn)相互作用而進(jìn)行，從而能夠評價成花素激活復(fù)合物作用的調(diào)節(jié)功能?；蛘?，成花素激活復(fù)合物作用的調(diào)節(jié)功能的評價能夠通過下述那樣而進(jìn)行，即，將成花素或bZIP轉(zhuǎn)錄因子固定在平板上，并添加經(jīng)熒光標(biāo)記后的14-3-3蛋白和候選物質(zhì)，從而測量平板的熒光強(qiáng)度。此外，在成花素激活復(fù)合物作用的調(diào)節(jié)功能的評價中，還可使用等溫滴定量熱儀(ITC)、表面等離子共振(SPR)等。在具有成花素激活復(fù)合物作用的調(diào)節(jié)功能的物質(zhì)(進(jìn)而為調(diào)節(jié)成花的物質(zhì))的選擇方法中，優(yōu)選以成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位、和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位上的結(jié)合作為指標(biāo)。所謂的“將這些結(jié)合部位上的結(jié)合作為指標(biāo)”，是指對成花素激活復(fù)合物中的結(jié)合部位的結(jié)合狀態(tài)進(jìn)行確認(rèn)。與候選物質(zhì)的不存在下的情況相比，在候選物質(zhì)的存在下的情況中，當(dāng)結(jié)合被阻礙時能夠?qū)⒃摵蜻x物質(zhì)作為具有抑制成花素激活復(fù)合物的形成的功能的物質(zhì)來選擇，當(dāng)結(jié)合被促進(jìn)時能夠?qū)⒃摵蜻x物質(zhì)作為具有增大成花素激活復(fù)合物的形成的功能的物質(zhì)來選擇。復(fù)合物中的結(jié)合部位上的結(jié)合狀態(tài)的確認(rèn)，能夠通過NMR (核磁共振)法、熒光標(biāo)記法等進(jìn)行。 在NMR法中，例如在候選物質(zhì)的存在下使穩(wěn)定同位素標(biāo)記后的成花素與未標(biāo)記的14-3-3蛋白和bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的情況下，與候選物質(zhì)不存在下的情況相比較，當(dāng)成花素的NMR波譜在結(jié)合部位發(fā)生特異性變化時，能夠確認(rèn)候選物質(zhì)對結(jié)合部位上的結(jié)合產(chǎn)生了影響。在成花素的NMR信號的全部殘基的歸屬(例如成花素為Hd3a時，鑒別各NMR峰值源自Hd3a的哪個氨基酸)被確認(rèn)的情況下，能夠特定出結(jié)合了候選物質(zhì)的氨基酸。在熒光標(biāo)記法中，只要使用例如使結(jié)合部位附近的氨基酸變異為半胱氨酸殘基，并使其與半胱氨酸特異性作用的熒光試劑反應(yīng)從而導(dǎo)入了熒光標(biāo)記的物質(zhì)即可。由于一般認(rèn)為當(dāng)結(jié)合狀態(tài)發(fā)生變化時導(dǎo)入的熒光的強(qiáng)度也會發(fā)生變化，因此，能夠根據(jù)候選物質(zhì)的有無來確認(rèn)該結(jié)合部位的結(jié)合狀態(tài)。NMR法可以通過將成花素、14-3-3蛋白以及bZIP轉(zhuǎn)錄因子溶解在溶液中并測量NMR波譜而進(jìn)行。作為溶解成花素等的溶液，只要是能夠測量NMR波譜的溶液，便可以是任何溶液，可使用含有DTT (二硫蘇糖醇)、KC1 (氯化鉀),NaCl (氯化鈉)、重水的緩沖液等。作為NMR測量法，優(yōu)選使用同核多維NMR測量或者異核多維NMR測量等。例如，可以利用被稱為1H-15NHSQC的NMR測量法進(jìn)行。該測量是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)。1H-15NHSQC是蛋白質(zhì)的肽鍵中的氫原子和氮原子的相關(guān)波譜，即1H-15N相關(guān)波譜，能夠從源于主鏈的1H-15N信號得到各個殘基的信息。通過該NMR測量方法，能夠分析蛋白質(zhì)等的目標(biāo)高分子物質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，從而能夠分析蛋白質(zhì)的相互作用。在本發(fā)明的篩選方法中，也可以將使用計算機(jī)的篩選方法和基于生物化學(xué)方法等的篩選方法加以組合進(jìn)行使用。進(jìn)而，候選物質(zhì)的調(diào)節(jié)植物的成花的功能、即加快和/或延遲成花的功能的評價，能夠通過將候選物質(zhì)施與植物體(例如從根部吸收候選物質(zhì)、導(dǎo)入編碼候選物質(zhì)的基因等而制備轉(zhuǎn)化體)來進(jìn)行調(diào)查。(調(diào)節(jié)植物的成花的方法)本發(fā)明還涉及調(diào)節(jié)植物的成花的方法。所謂的“調(diào)節(jié)成花”，是指加快和/或延遲成花。更詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及通過對下述I)和/或2)所示的任一個或多個結(jié)合部位施加影響、即調(diào)節(jié)該結(jié)合部位上的結(jié)合，而促進(jìn)(增大)和/或抑制成花素激活復(fù)合物的形成，由此調(diào)節(jié)植物的成花的方法。I)成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位是相當(dāng)于序列編號I中的D62、M63、R64、P96、T98、F103及R132的成花素的部位和相當(dāng)于序列編號2中的F200、D201、I2 04、E212、Y215、R226及D227的14-3-3蛋白的部位。2)14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位是相當(dāng)于序列編號2中的K51、R58、F121、R131、L224及D227的14-3-3蛋白的部位和相當(dāng)于序列編號3中的R189 F195的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的部位。促進(jìn)(增大)和/或抑制成花素激活復(fù)合物的形成的情況，例如可以例舉出使成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位發(fā)生變異的情況、或者將能夠促進(jìn)和/或抑制成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合的物質(zhì)施與植物體的情況等。
作為能夠促進(jìn)成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合的物質(zhì)，可以舉出編碼成花素、14-3-3蛋白或bZIP轉(zhuǎn)錄因子的基因本身。作為編碼成花素、14-3-3蛋白或bZIP轉(zhuǎn)錄因子的基因，例如可以例舉出編碼水稻Hd3a(序列編號11)、水稻GF14b (序列編號14)、水稻GF14c (序列編號12)、水稻FDl (序列編號13)的基因。編碼成花素、14-3-3蛋白或bZIP轉(zhuǎn)錄因子的基因也可以是對相當(dāng)于序列編號I中的D62等的部位、相當(dāng)于序列編號2中的F200等的部位、相當(dāng)于序列編號R189 F195的部位中的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的蛋白質(zhì)(變異型蛋白質(zhì))進(jìn)行編碼的基因。編碼變異型蛋白質(zhì)的基因可以通過使用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員周知的定點(diǎn)突變法等的基因工程方法導(dǎo)入變異而制備。例如，可以通過組合PCR反應(yīng)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、限制酶反應(yīng)、連接反應(yīng)等來制備編碼變異型蛋白質(zhì)的基因，具體而言，可以使用QuikChangeTM定點(diǎn)突變試劑盒(site-directed mutagenesis kit) (STRATAGENE公司)等的試劑盒。通過使上述基因在植物體內(nèi)、優(yōu)選為所期望的植物組織的細(xì)胞內(nèi)、更優(yōu)選為細(xì)胞器內(nèi)(過量地)表達(dá)，能夠促進(jìn)成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而能夠促進(jìn)(加快)成花。使基因(過量地)表達(dá)的方法沒有特別限定，但是，一般采用通過基因工程方法將分離后的基因以能夠表達(dá)的狀態(tài)導(dǎo)入到植物細(xì)胞內(nèi)等的公知方法。公知方法可以例舉出將含有所希望的基因的重組載體(recombinant vector)導(dǎo)入到宿主中的方法。具體而言，可以舉出原生質(zhì)體共培養(yǎng)法或者葉盤法等利用土壤桿菌屬細(xì)菌的感染的方法，聚乙二醇法，電穿孔法，顯微注射法，基因槍法，脂質(zhì)體法，使用適宜的載體系統(tǒng)的導(dǎo)入法等，只要根據(jù)宿主細(xì)胞的種類而選擇最適的方法即可。另外，作為上述載體，可以舉出質(zhì)粒、噬菌體、粘粒等，但是，上述載體并沒有特別限定，只要根據(jù)宿主細(xì)胞的種類適宜地選擇即可。另外，作為宿主細(xì)胞，可以使用廣泛種類的植物，也可以是原生質(zhì)體、細(xì)胞、愈傷組織、器官葉、種子、胚芽、花粉、卵細(xì)胞、接合子等能夠增殖的植物材料，花、果實、葉、根、插枝等植物體的一部分
坐寸ο“促進(jìn)成花”是指縮短營養(yǎng)生長時間而加快花的形成，一般認(rèn)為通過促進(jìn)成花能夠使農(nóng)作物和園藝作物的收獲時期改變(一般是提前)，從而能夠謀求育種的効率化或農(nóng)作物和園藝作物的收量增加。另外，由于可以推測花或種子的形成能力正常，因此，能夠迅速地生產(chǎn)植物的種子。
另外，作為能夠抑制成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合的物質(zhì)，可以舉出例如具有結(jié)合能的成花素、14-3-3蛋白、bZIP轉(zhuǎn)錄因子的多肽片段、或者成花素等的工程蛋白質(zhì)(engineered protein)且阻礙正常蛋白質(zhì)的功能的工程蛋白質(zhì)。通過將表達(dá)上述蛋白質(zhì)的基因?qū)氲街参矬w中，能夠阻礙成花素激活復(fù)合物的形成，從而能夠調(diào)節(jié)成花。此處所謂的“工程”，是指使上述蛋白質(zhì)所具有的特征性氨基酸序列區(qū)域的任意區(qū)域完全缺失的情況、和相對于上述序列區(qū)域的特定部位而缺失、取代和/或插入I個 數(shù)個氨基酸殘基的情況。工程蛋白質(zhì)中包括變異型蛋白質(zhì)。改變編碼各蛋白質(zhì)的基因的方法只要通過現(xiàn)有公知的方法進(jìn)行即可，并沒有特別限定。即，只要通過如上所述那樣利用PCR法向堿基序列導(dǎo)入變異、或者使用公知的定點(diǎn)突變法(Kunkel et al. :Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82. p488_(1985))、市售的試劑盒(例如Quikchange定點(diǎn)突變試劑盒STRATAGENE公司)等進(jìn)行即可。工程蛋白質(zhì)(包括多肽)相對于從野生型基因中得到的蛋白質(zhì)起顯性作用，抑制目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄從而阻礙目標(biāo)基因的表達(dá)。因此，當(dāng)使用改造型基因時，能夠阻礙野生型基因所具有的本來的功能而使其功能缺損，從而能夠生產(chǎn)將成花抑制了的轉(zhuǎn)化體。因此，能夠 減少生產(chǎn)將成花抑制了的轉(zhuǎn)化體所需的工夫。工程蛋白質(zhì)的導(dǎo)入方法能夠通過表達(dá)上述基因的方法而進(jìn)行。另外，使植物體的內(nèi)在性蛋白的結(jié)合部位變異或者將蛋白質(zhì)剔除(knockout)，可以通過利用公知的反義法、基因打靶法、基因破壞型標(biāo)記法等的方法等進(jìn)行(Kem pin etal. Nature389 :802-803. 1997)。反義法是下述那樣的方法，S卩，構(gòu)建含有適當(dāng)?shù)膯幼雍团渲糜谄湎掠蔚姆聪虻哪繕?biāo)基因(反義DNA)的載體，并將該載體導(dǎo)入到植物中，由此來抑制目標(biāo)基因的表達(dá)的方法。基因打靶法是通過同源重組而在目標(biāo)基因的一部分中插入其他的DNA從而將目標(biāo)基因剔除的方法?；诨蚱茐男蜆?biāo)記法的本發(fā)明的方法，是將T-DNA或轉(zhuǎn)座子(transposon)任意地插入基因組中，并利用PCR篩選目標(biāo)基因破壞株的方法?！耙种瞥苫ā笔侵秆娱L營養(yǎng)生長期從而延遲花的形成，一般認(rèn)為通過這樣，與野生型的植物體相比植物體變大(Developmentl35，767-774 (2008) doi :10. 1242/dev. 008631、Fig3E)。即，通過抑制成花，能夠提供每個個體的生物量增產(chǎn)了的植物體。所謂的“生物量增產(chǎn)”，是指與野生型相比每個個體的總重量變大，也包括植物體的一部分組織特異性地變大，而其他的組織與野生型同等的情況。植物生物量由于是使用太陽能而將大氣中的二氧化碳固定而生成，因此，能夠作為所謂的碳中和能量進(jìn)行掌握。增加植物的生物量具有保護(hù)地球環(huán)境、防止地球變暖、降低溫室效應(yīng)氣體排出的效果。另外，對于除了有關(guān)花芽形成的器官(花或種子)以外的其他部分被作為糧食等使用的植物而言，通過抑制成花，能夠使植物體變大，從而能夠謀求增加每個個體的農(nóng)作物和園藝作物的收量。(轉(zhuǎn)化體)本發(fā)明還涉及導(dǎo)入了所希望的基因的轉(zhuǎn)化體、或者所希望的基因被破壞了的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體包括在上述調(diào)節(jié)植物的成花的方法中得到的物質(zhì)。所謂的“轉(zhuǎn)化體”不僅包括植物個體還包括細(xì)胞、組織、器官、原生質(zhì)體。另外，成為轉(zhuǎn)化對象的生物也沒有特別限定，可以舉出各種微生物(包括大腸桿菌等)或植物。另外，在選擇啟動子或載體時，也可以將動物、昆蟲作為轉(zhuǎn)化的對象。另外，此處所說的轉(zhuǎn)化體中還包括導(dǎo)入了本發(fā)明所涉及的基因的植物、或者與其具有相同性質(zhì)的該植物的后代或它們的組織。上述轉(zhuǎn)化體可以使用在上述調(diào)節(jié)植物的成花的方法的項目中說明的方法進(jìn)行制備(生產(chǎn))。實施例以下，為了加深對本發(fā)明的理解，根據(jù)實施例和實驗例具體地進(jìn)行說明，當(dāng)然，這些實施例和實驗例并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定。另外，在以下的實施例中使用的Hd3a、GF14、FDl全部為源自水稻的蛋白質(zhì)。在表示各蛋白質(zhì)時，存在記載為“Os”的情況和不記載為“Os”的情況，但是，在以下的實施例中所使用的蛋白質(zhì)均源自水稻。首先，實施例中所使用的質(zhì)粒的制備方法如下所示。通過RT-PCR 將 Hd3a(0s06g0157700)、0sGF14 (0sGF14a :0s08g0480800、OsGF14b 0s04g0462500、0sGF14c :0s08g0430500、0sGF14d :0sllg0546900、0sGF14e :0s02g0580300、0sGF14f 0s03g0710800, 0sGF14g OsO Ig0209200, 0sGF14h Os 11g0609600)、OsFDl (0s09g0540800)的全長cDNA進(jìn)行克隆(cloning)。利用通常方法將編碼區(qū)域PCR擴(kuò) 增，并導(dǎo)入至pENTR/D-T0P0克隆載體(Invitrogen),由此得到了入門克隆(entry clone)。向0sGF14、OsFDl、Hd3a的氨基酸的取代或缺失的導(dǎo)入，利用KOD FX DNApolymerase (Τ0Υ0Β0)并通過PCR而進(jìn)行。將PCR擴(kuò)增片段導(dǎo)入pENTR/D-TOPO克隆載體，從而得到了入門克隆。將源自玉米的泛素啟動子(ubiquitin promoter)、NOS終止區(qū)(Miki and Shimamoto，Plant Cell Physiol. 45，490 (2004) ·)、以及 T7 標(biāo)簽區(qū)或 HA 標(biāo)簽區(qū)與 attR 重組區(qū)(Nakagawa et al. 2007) 一起插入至pGreen II載體(Hellens et al. Plant Mol. Biol. 42,819(2000).)中，由此制備了 pGII pUbq GW-T7 和 pGII pUbq HA-Gff0根據(jù)文獻(xiàn)記載制備了 pUbq:Hd3a-mCherry表達(dá)載體(非專利文獻(xiàn)2)、pHd3a:Hd3a_GFP 以及 prolC:Hd3a_GFP 雙兀載體(Tamaki et al. , Science316,1033(2007))。按照 Tamaki et al.，Science316，1033 (2007) 2007 且使用變異型 Hd3a cDNA而制備了 pro IC: Hd3a (R64G) -GFP 雙元載體和 pro IC: Hd3a (R64G/R132A) -GFP 雙元載體。為了制備其他的載體，通過基于Gateway BP clonase II (Invitrogen)的Gateway重組法,將pENTR D-T0P0載體中的變異型Hd3a基因、變異型0sGF14基因、變異型OsFDl基因轉(zhuǎn)化成各種載體。這些載體在酵母雙雜交實驗(yeast two-hybrid assay)(實施例8、9)中有時被包含在 pBTM116_GW和 pVP16_GW 中，另外，在瞬時表達(dá)實驗(transient expression assay)(實施例 11、12)中有時被包含在 pGII pUbq GW-T7、pGII pUbq HA-GW、p35S_GFP_GW、p35S-mCerulean-GW、p35S_Vn_GW、p35S-Vc_GW、p35S_GW_Vn、p35S-Gff-Vc 以及 pUbq-GW 中，在轉(zhuǎn)基因植物(實施例10、13-1、13-2)的制備中有時被包含在P2K-GW雙元載體和pANDARNAi 載體(Miki and Shimamoto 2004)中。通過 PCR 而使 SV40NLS 與 GF14b 以及 GF14e 融
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口 ο(實施例I)三種蛋白質(zhì)的相互作用的確認(rèn)(I)通過體外GST pull-down實驗對三種蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)行了確認(rèn)。對插入了編碼序列編號I所示的全長Hd3a(l 179殘基)的cDNA、編碼序列編號2所示的全長GF14c (I 256殘基)的cDNA的質(zhì)粒進(jìn)行限制酶處理，使限制酶處理后的片段與編碼GST的多核苷酸融合并導(dǎo)入到載體中。將該載體導(dǎo)入到大腸桿菌中，在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)了 GST融合GF14c蛋白質(zhì)或者GST融合Hd3a蛋白質(zhì)。在對大腸桿菌進(jìn)行了培養(yǎng)之后，對大腸桿菌進(jìn)行離心并回收，從溶解溶液中將GST融合GF14c蛋白質(zhì)或者GST融合Hd3a蛋白質(zhì)分離提純。將分離提純后的GST融合GF14c蛋白質(zhì)或者GST融合Hd3a蛋白質(zhì)各IOnmol與10 μ I的谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠(Glutathione Sepharose) 4B樹脂(GE Healthcare)進(jìn)行培養(yǎng)，從而使各多肽與樹脂結(jié)合。之后，用含有50mM KClUmM DTT的磷酸緩沖液(pH為6. 8)對樹脂進(jìn)行清洗，將未與樹脂結(jié)合的游離的GST融合蛋白質(zhì)除去。作為陰性對照(negativecontrol)而使用了使分離提純后的GST蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合后的物質(zhì)。向結(jié)合了 GST_GF14c蛋白質(zhì)、GST-Hd3a蛋白質(zhì)或者GST蛋白質(zhì)的3種樹脂中加入Inmol的分離提純后的各蛋白質(zhì)(OsFD I為序列編號3的第147 195位的區(qū)域且被導(dǎo)入了 S192E的變異的蛋白質(zhì)，Hd3a為全長且未融合任何GST)，并在室溫下培養(yǎng)了 15分鐘。之后，用含有50mM KClUmM DTT的磷酸緩沖液(pH為6. 8)對樹脂進(jìn)行清洗，將未與樹脂結(jié)合的游離的GST-GFHc多肽除去。利用含有50mM谷胱甘肽、50mM KClUmM DTT的磷酸緩沖液(pH為6. 8)對結(jié)合后的各蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫，并通過SDS聚丙烯酰胺電泳進(jìn)行了確認(rèn)。 結(jié)果如圖2所示。由于在Hd3a與OsFDl (FDl)之間未發(fā)現(xiàn)相互作用，而在Hd3a與GF14c之間和GF14c與OsFDl之間發(fā)現(xiàn)了相互作用，因此，認(rèn)為Hd3a與OsFDl通過GF14c結(jié)
八
口 ο(2)關(guān)于Hd3a與GF14c的相互作用，使用NMR進(jìn)行了確認(rèn)。利用含有IOOmMKCl、ImM DTT、7%重水的50mM磷酸緩沖液(pH為6. 8)將15N穩(wěn)定同位素標(biāo)記后的Hd3a蛋白質(zhì)調(diào)制成最終濃度為O. 2mM。之后，對于僅調(diào)制好的Hd3a蛋白質(zhì)溶液、和在Hd3a蛋白質(zhì)溶液中以摩爾比I : O. 5加入了未進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記的GF14c蛋白質(zhì)的混合溶液的各溶液，對15N-HSQC NMR波譜進(jìn)行了測量，并對波譜進(jìn)行了比較。NMR測量在溫度30°C下進(jìn)行，并且使用fcuker公司制AV500NMR裝置進(jìn)行。結(jié)果如圖3所示。由于因GF14c的結(jié)合而Hd3a的NMR波譜發(fā)生變化，因此，可以確認(rèn)Hd3a與GF14c發(fā)生結(jié)合。另外，由于局部地觀察到NMR信號的移動(圖3中的放大圖，Hd3a R64、M63等)，因此，確認(rèn)到部位特異性的結(jié)合。(實施例2)成花素激活復(fù)合物的晶體的制備對插入了編碼序列編號I所示全長Hd3a (I 179殘基)中的6 170殘基的cDNA、編碼序列編號2所示全長GF14c (I 256殘基)中的I 235殘基的cDNA的質(zhì)粒進(jìn)行限制酶處理，使限制酶處理后的片段與編碼GST的多核苷酸融合并導(dǎo)入到載體中，并且將該載體導(dǎo)入到大腸桿囷中。在大腸桿囷中表達(dá)GST融合后的Hd3a蛋白質(zhì)、GST融合后的GF14c蛋白質(zhì)。在對大腸桿菌進(jìn)行了培養(yǎng)之后，對大腸桿菌進(jìn)行離心并回收，并從溶解溶液中提純蛋白質(zhì)。之后，利用SDS-聚丙烯酰胺電泳法(SDS-PAGE)進(jìn)行了分析，結(jié)果得知蛋白質(zhì)的純度為95%以上。對于編碼序列編號3中所示的全長OsFDl (I 195殘基)中的187 195殘基的多肽，通過進(jìn)行化學(xué)合成而進(jìn)行了調(diào)制。將得到的Hd3a、GF14c以摩爾比I : 1.5進(jìn)行混合，并將其透析至含有20mMNaCl的IOmM Tris-HCl緩沖液(pH為7. 5)中，由此制備了復(fù)合物試樣。復(fù)合物的晶化是將I μ I蛋白質(zhì)溶液(蛋白質(zhì)濃度為10mg/mL)和I μ I沉淀劑溶液(O. IM HEPES (pH為7. 5)、0· 2M硫酸銨、25% PEG 3350)加以混合，并使用坐滴法在4°C下進(jìn)行。在約2周后得到O. ImmXO. Imm的單晶體。將得到的Hd3a-GF14c復(fù)合物晶體進(jìn)行回收，并利用含有25%乙二醇、2mM OsFDl多肽的上述沉淀劑溶液培養(yǎng)15分鐘，由此制備了 Hd3a、GF14c以及OsFDl的成花素激活復(fù)合物的晶體。得到的晶體為以下5種?！渤苫ㄋ丶せ顝?fù)合物I〕晶體的空間群為P1，晶格常數(shù)為a=76.7A、b=96.6A、c=99.5A, α = 68.2°、β = 87. 9°、Y = 77.9°，分辨率為 2.4 A的晶體；〔成花素激活復(fù)合物2〕晶體的空間群為P1，晶格常數(shù)為a=76.8A，b=97.3 A、c=99.8A, α = 68. 1°、β = 87.8° , γ = 77.9°，分辨率為 2.2A的晶體；〔成花素激活復(fù)合物3〕晶體的空間群為P1，晶格常數(shù)為a=76.2A、b=96.1 A、c-99.1 Α, α = 68.2°、β = 88.6°、Y = 77. 8°，分辨率為 2.8 A 的晶體；〔成花素激活復(fù)合物4〕晶體的空間群為P6522,晶格常數(shù)為a=129.0A、b=129.·0A、c=342.0A、α = 90°、β = 90°、Y = 120。，分辨率為 2.85 A 的晶體；〔成花素激活復(fù)合物5〕晶體的空間群為P4,晶格常數(shù)為a=l55.9A、b=l55.9A、c=496.4A、α = 90°、β = 90°、Y = 90。，分辨率為 2.96 A的晶體。(實施例3)關(guān)于成花素激活復(fù)合物的晶體的X射線結(jié)構(gòu)分析對于得到的晶體，在放射光科學(xué)研究設(shè)施Photon Factor的BL5A光束線中使用CCD檢測器對其X射線衍射像進(jìn)行了測量。根據(jù)得到的衍射像而得到了成花素激活復(fù)合物的原子坐標(biāo)。收集X射線衍射數(shù)據(jù)，并進(jìn)行了各個衍射斑點(diǎn)的指數(shù)標(biāo)定(indexing)和衍射強(qiáng)度的計算。利用分子置換法從得到的衍射強(qiáng)度和搜索模型(search model)確定了相位角。使用這些衍射斑點(diǎn)的衍射強(qiáng)度和相位角，并通過傅里葉逆變換而導(dǎo)出了電子密度圖。根據(jù)得到的電子密度圖而構(gòu)建了原子坐標(biāo)。具體而言，使用HKL2000對得到數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并通過SCALEPACK進(jìn)行了縮放。作為搜索模型，利用分子置換法而確定了成花素的晶體結(jié)構(gòu)。使用CNS和REFMAC以2.4 A對得到的模型進(jìn)行了精密化。在各精密化之后，使用COOT并根據(jù)作為電子密度圖的2Fo-Fcmap對得到的模型進(jìn)行了補(bǔ)正。將由上述成花素激活復(fù)合物I的晶體得到的原子坐標(biāo)表示在表I中。另外，將根據(jù)原子坐標(biāo)構(gòu)建的立體結(jié)構(gòu)模型示于圖I和圖4中?？芍狦F14c特異性地識別OsFDl的被磷酸化后的S192(pS192)。(表I)成花素激活復(fù)合物的原子坐標(biāo)ATOMIN ALAA2 31.1421.296 -20.9841.00 51.41N
ATOM2CA ALAA 2 32.2681.774-21.8091.00 52.40C
ATOM3CB ALAA 2 33.5132.058 -20.9371.00 52.30C
ATOM4C ALAA2 32.5930.828 -22.9751.00 52.86C
ATOM5O ALAA2 33.229-0.202 -22.7721.00 53.40O
ATOM6N ARGA 3 32.0841.185-24.1691.00 53.41N
ATOM7CA ARGA 3 32.440 0.674 -25.5581.00 53.27C
ATOM8CB ARGA 3 33.537-0.414-25.6471.00 53.41C
ATOM9CG ARGA 3 34.919 0.203 -25.8661.00 54.57C
ATOM10CD ARGA 3 34.8061.706-25.5821.00 55.37C
ATOM11NE ARGA 3 35.9002.301 -24.8181.00 55.34N
ATOM12CZ ARGA 3 35.7303.286 -23.9371.00 55.19C
ATOM13NHl ARGA3 34.5113.759 -23.6911.00 56.49N
ATOM14NH2ARGA3 36.7693.802 -23.2971.00 53.48N
ATOM15C ARGA3 31.3000.588-26.6191.00 53.10C
ATOM16O ARGA3 31.3371.366 -27.5651.00 53.15O
ATOM17N ALAA4 30.324-0.339 -26.5241.00 52.96N
ATOM18CA ALAA 4 30.299-1.577 -25.6651.00 52.78C
ATOM19CB ALAA4 31.747-2.092 -25.3331.00 53.18C
ATOM20C ALAA4 29.374-1.880 -24.4291.00 52.15C
ATOM21O ALAA4 29.576-2.972 -23.8611.00 52.35O
ATOM22N GLUA5 28.389-1.057 -23.9921.00 50.91N
ATOM23CA GLUA 5 27.7980.159 -24.6171.0049.94C
ATOM24CB GLUA 5 26.390-0.151 -25.1491.00 50.00C
ATOM25CG GLUA 5 25.7231.029-25.8471.00 50.89C
ATOM26CD GLUA 5 26.0691.106 -27.3221.0051.65C
ATOM27OEl GLUA5 26.8871.977 -27.7041.0051.42O
ATOM28OE2GLUA5 25.5300.274-28.0891.00 50.98O
ATOM29C GLUA5 27.6331.316-23.6161.0048.74C
ATOM30O GLUA5 27.2611.100-22.4461.0049.06O
ATOM31N ASNA6 27.8442.541 -24.0971.0046.60N
ATOM32CA ASNA 6 27.7503.746 -23.2741.00 44.70C
ATOM33CB ASNA6 28.6164.837 -23.8891.0045.55C
ATOM34CG ASNA 6 30.0494.466 -23.8771.00 45.64C
ATOM35ODl ASNA6 30.4013.481 -23.2741.00 46.78O
ATOM36ND2ASNA6 30.8885.234 -24.5441.0049.27N
ATOM37C ASNA6 26.3514.279 -22.9411.0042.93C
ATOM38O ASNA6 26.1704.970-21.9321.00 42.13O
ATOM39N VALA7 25.3843.957 -23.8011.0041.06N
ATOM40CA YALA7 23.9774.191 -23.5491.00 38.54C
ATOM41CB VALA7 23.0893.803 -24.8101.00 39.03C
ATOM42CGl VALA7 21.6163.714-24.4581.00 35.44C
ATOM43CG2VALA7 23.2974.811 -25.9481.00 37.57CATOM44C VALA7 23.5573.384 -22.3261.00 37.95C
ATOM45O VALA7 22.7843.858-21.4871.00 37.36O
ATOM46N TYRA8 24.0572.156 -22.2441.00 37.25N
ATOM47CA TYRA8 23.6711.234-21.178 1.00 37.26C
ATOM48CB TYRA8 24.172-0.198 -21.4751.00 37.87C
ATOM49CG TYRA8 23.687-1.173 -20.4311.00 39.00C
ATOM50CDl TYRA8 24.479-1.480-19.3041.00 39.44C
ATOM51CEl TYRA8 24.011-2.338-18.3031.0039.53C
ATOM52CZ TYRA8 22.747-2.885-18.4161.00 39.69C
ATOM53OH TYRA8 22.270-3.732-17.434 1.00 39.52O
ATOM54CE2 TYRA8 21.943-2.595-19.5311.0040.46C
ATOM55CD2TYRA8 22.414-1.744 -20.5301.00 37.47C
ATOM56C TYRA8 24.2191.756-19.8341.00 36.60C
ATOM57O TYRA8 23.4931.838-18.8371.00 36.56O
ATOM58N META9 25.4982.123-19.8351.00 35.58N
ATOM59CA META9 26.1492.696-18.657 1.00 35.28C
ATOM60CB META9 27.6562.799-18.867 1.00 35.75C
ATOM61CG META9 28.3101.415-18.894 1.00 37.42C
ATOM62SD META9 27.8040.449-17.4351.0040.70S
ATOM63CE META9 28.8291.257-16.1811.00 38.72C
ATOM64C META9 25.5394.018-18.2531.00 34.23C
ATOM65O META9 25.3944.300-17.0661.00 34.05O
ATOM66N ALAA10 25.1234.795-19.2511.00 33.43N
ATOM67CA ALAA10 24.3486.007-19.023 1.00 32.18C
ATOM68CB ALAA10 24.1286.764 -20.3191.0031.28C
ATOM69C ALAA10 23.0205.721-18.3191.0031.48C
ATOM70O ALAA10 22.6746.406-17.3801.0031.40O
ATOM71N LYSA11 22.2854.716-18.7651.00 30.72N
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ATOM76CE LYSA11 18.0302.818-21.7901.0038.03C
ATOM77NZ LYSA11 18.1081.757 -22.8591.0040.35N
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ATOM79O LYSA11 20.4424.182-15.7831.0028.77O
ATOM80N LEUA12 22.2923.049-16.4901.0029.31N
ATOM81CA LEUA12 22.6732.490-15.1841.00 29.37C
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ATOM83CG LEUA12 24.2400.361 -14.4651.0028.96C
ATOM84CDl LEU A12 25.7370.233-14.1391.0027.79C
ATOM85CD2LEUA12 23.4370.206-13.1961.0027.82C
ATOM86C LEUA12 22.9183.650-14.2561.00 28.79C
ATOM87O LEUA12 22.4003.646-13.1681.00 28.52OATOM88N ALAA1323.6994.633 -14.7231.00 29.20N
ATOM89CA ALAA1324.1125.813-13.9361.0028.98C
ATOM90CB ALAA1325.1776.594-14.6941.0028.06C
ATOM91C ALAA1322.9136.707-13.6031.0029.17C
ATOM92O ALAA1322.8187.290-12.5151.00 29.82O
ATOM93N GLUA1421.9766.792-14.5381.0028.60N
ATOM94CA GLUA 1420.7057.464-14.2811.0028.31C
ATOM95CB GLUA1419.8077.409-15.5231.0027.41C ATOM96CG GLUA 1418.5278.220-15.3351.0026.34C
ATOM97CD GLUA 1417.6408.210-16.5871.00 27.63C
ATOM98OEl GLUA1417.6747.209-17.3341.00 26.33O
ATOM99OE2GLUA1416.9609.231 -16.8341.0025.29O
ATOM100C GLUA1419.9226.888-13.0911.00 28.14C
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ATOM108NE2GLNA1517.8271.341 -14.4051.00 43.02N
ATOM109C GLNA1519.8835.051 -10.5851.00 28.96C
ATOMHOO GLNA1519.2245.155 -9.5551.0029.05O
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ΑΓΟΜ112CA ALAA1622.0535.274 -9.4551.00 28.31C
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ATOM115O ALAA1622.6307.143 -8.0671.0029.06O
ATOM116N GLUA1721.3967.579 -9.9061.0027.98N
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ATOM119CG GLUA1719.0838.755 -8.5911.0029.51C
ATOM120CD GLUA 1718.1549.239 -7.477 1.0031.66C
ATOM121OEl GLUA1718.6099.968 -6.5491.00 35.44O
ATOM122OE2GLUA1716.9588.875 -7.5441.0037.86O
ATOM123C GLUA1722.7939.542 -9.5491.00 26.63C
ATOM124O GLUA1723.08110.355 -8.6611.0025.95O
ATOM125N ARGA1823.6859.050-10.4111.00 25.69N
ATOM126CA ARGA 1825.0519.549-10.4671.0024.20C
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ATOM128CG ARGA 1826.2017.717 -8.956 1.00 23.12C
ATOM129CD ARGA 1827.3746.698 -8.976 1.00 24.79C
ATOM130NE ARGA1828.0506.725 -7.694 1.00 30.66N
ATOM131CZ ARGA1829.3157.080 -7.4551.00 30.81C

ATOM132NHl ARGA18 29.7287.082 -6.202 1.00 30.96N
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〔02 s
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ATOM509C VAT.A 64 23.449 32.045 -1.508 1.00 36.91C
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ATOM514OG SERA 65 22.563 34.817 -5.247 1.0040.44 O
ATOM515C SERA 65 21.754 34.411 -2.225 1.00 39.20C
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ATOM518CA SERA 66 19.651 34.278 -1.018 1.0040.56 C
ATOM519CB SERA 66 18.442 33.374 -0.995 1.0040.06 C
ATOM520OG SERA 66 17.637 33.748 0.108 1.00 43.13 O
ATOM521C SERA 66 20.145 34.508 0.418 1.0040.56C
ATOM522O SERA 66 19.760 35.476 1.052 1.0040.06O
ATOM523N ILEA 67 20.955 33.588 0.928 1.00 41.61N
ATOM524CA ILEA 67 21.656 33.784 2.189 1.0042.72C
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ATOM724CA GLUA 91 29.619 29.450-10.1271.00 30.70C
ATOM725CB GLUA 9129.763 30.964 -9.9961.0031.06C
ATOM726CG GLUA 91 28.561 31.664 -9.3811.0029.69C
ATOM727CD GLUA 9128.765 33.151 -9.2591.00 29.43C
ATOM728OEl GLUA 9129.726 33.689 -9.8431.00 34.98O
ATOM729OE2GLUA 9127.951 33.822 -8.6171.00 27.73O
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ATOM741CD GLUA 93 30.798 22.198 -8.3931.0037.60C
ATOM742OEl GLUA 9331.525 21.740 -7.4811.00 39.18O
ATOM743OE2GLUA 9329.551 22.074 -8.4041.00 37.67O
ATOM744C GLUA 9330.029 24.803 -12.4631.0029.12C
ATOM745O GLUA 9330.045 24.048-13.4071.0028.16O
ATOM746N LEUA 9429.152 25.776-12.2871.0028.54N
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ATOM749CG LEUA 94 26.090 27.491 -11.935 1.00 29.94 C
ATOM750CDl LEUA 94 26.239 28.451 -10.703 1.00 29.49C
ATOM751CD2LEUA 94 25.613 26.178-11.502 1.00 26.53C
ATOM752C LEUA 94 28.752 26.498-14.622 1.00 29.05C
ATOM753O LEUA 94 28.275 26.013-15.656 1.00 27.18O
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ATOM762CB LYSA 96 33.133 23.723-15.312 1.00 32.09C
ATOM763CG LYSA 96 34.639 24.104-15.365 1.00 36.48C
ATOM764CD LYSA 96 34.900 25.643-15.399 1.0038.14C
ATOM765CE LYSA 96 35.058 26.245-14.015 1.00 38.67C
ATOM766NZ LYSA 96 34.849 27.712-14.076 1.00 39.45N
ATOM767C LYSA 96 31.245 23.459-16.912 1.0031.01C
ATOM768O LYSA 96 31.518 22.825-17.919 1.00 30.46O
ATOM769N ILEA 97 30.103 23.300-16.245 1.00 30.35N
ATOM770CA ILEA 97 29.051 22.383-16.727 1.00 30.28C
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ATOM773CDl ILEA 97 27.798 22.031 -13.107 1.0028.59C
ATOM774CG2ILEA 97 26.857 21.121 -16.152 1.0029.49C
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ATOM777N CYSA 98 28.058 24.178-18.075 1.00 29.43N
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ATOM780SG CYSA 98 25.853 26.765 -17.881 1.0025.39S
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ATOM785CB ASPA 99 32.271 25.549-20.560 1.00 33.03C
ATOM786CG ASPA 99 33.447 25.406-21.523 1.00 35.55C
ATOM787ODl ASPA 99 33.787 26.402-22.181 1.0043.23O
ATOM788OD2ASPA 99 34.025 24.309-21.652 1.00 37.25O
ATOM789C ASPA 99 31.077 23.712-21.815 1.0031.89C
ATOM790O ASPA 99 31.269 23.595 -23.027 1.0032.70O
ATOM791N GLYA100 31.025 22.673 -20.983 1.0031.59N

ATOM792CA GLYA100 31.018 21.294-21.464 1.0031.05C
ATOM793C GLYA10029.98921.056-22.5821.00 30.47C
ATOM794O GLYA10030.34620.611 -23.6651.00 30.74O
ATOM795N ILEA 10128.71821.361 -22.3161.00 30.07N
ATOM796CA ILEA 10127.60621.052 -23.2561.0028.15C
ATOM797CB ILEA 10126.23820.900-22.5121.0027.85C
ATOM798CGl ILEA 10125.05020.599 -23.4711.0026.33C
ATOM799CDl ILEA 10125.25019.370 -24.3211.00 20.64C·
ATOM800CG2 ILEA 10125.92322.107-21.6691.00 26.52C
ATOM801C ILEA 10127.58022.096 -24.3801.0028.52C
ATOM802O ILEA 10127.34821.758-25.5341.00 27.98O
ATOM803N LEU A10227.86023.356 -24.0461.0029.39N
ATOM804CA LEUA102 27.955 24.410-25.0741.0029.94C
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ATOM807CDl LEU A10225.61526.371 -24.6411.0022.08C
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ATOM836N ASPA106 28.12023.112-30.1661.00 32.69N
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ATOM840ODl ASPA106 27.78926.286 -30.6141.0041.30O
ATOM841OD2ASPA106 29.55026.946 -29.4221.0044.10O
ATOM842C ASPA106 29.66922.990 -32.1821.00 34.19C
ATOM843O ASPA106 29.79223.339-33.3541.00 34.33O
ATOM844N SERA 107 30.25521.901 -31.6811.00 34.32N
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ATOM848C SERA 107 30.45719.875 -33.1651.00 33.10C
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ATOM850N HISA108 29.46419.301 -32.5101.00 32.75N
ATOM851CA HISA108 28.85018.074-32.9911.00 31.83C
ATOM852CB HISA108 29.08216.922 -31.9881.0031.81C·
ATOM853CG HISA108 30.48816.402-31.9841.00 33.66C
ATOM854NDl HISA108 31.53017.079-31.3811.00 33.18N
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ATOM857CD2HISA108 31.03315.294-32.5431.00 32.74C
ATOM858C HlSA 108 27.37418.247 -33.1871.0032.02C
ATOM859O HIS A108 26.83017.940 -34.2741.00 30.92O
ATOM860N LEU A109 26.71418.697 -32.1121.0031.75N
ATOM861CA LEUA109 25.262 18.559-32.0151.0031.65C
ATOM862CB LEUA109 24.80218.656 -30.5481.00 30.95C
ATOM863CG LEU A109 25.414 17.574 -29.6311.0030.12C
ATOM864CDl LEUA109 24.86117.642-28.2371.00 25.70C
ATOM865CD2LEUA109 25.28716.133-30.2151.0026.65C
ATOM866C LEUA109 24.45319.461 -32.9531.00 31.93C
ATOM867O LEUA109 23.60818.963 -33.7681.00 32.07O
ATOM868N VALA HO 24.67020.767 -32.8391.0031.47N
ATOM869CA VALA HO 23.97321.712-33.7291.00 32.21C
ATOM870CB VALA110 24.09623.200 -33.2911.00 32.24C
ATOM871CGl VALA110 23.43524.130 -34.3111.0031.63C
ATOM872CG2VALA110 23.49723.422 -31.8891.0029.82C
ATOM873C VALAHO 24.42721.491 -35.1891.0032.97C
ATOM874O VALA110 23.58221.282 -36.0451.0033.49O
ATOM875N PROA 111 25.75821.504-35.4581.00 33.65N
ATOM876CA PROA 111 26.22721.303 -36.8251.00 34.21C
ATOM877CB PROA 111 27.75421.307-36.6651.00 34.18C
ATOM878CG PROA 111 27.95322.236-35.4791.00 33.71C
ATOM879CD PROA 111 26.90021.797-34.5531.00^14C

ATOM880C PROA 11125.76320.028 -37.4881.00 34.75C
ATOM881O PROA 11125.60820.035 -38.7031.00 35.69O
ATOM882N SERA 11225.53818.968 -36.7021.00 34.66N
ATOM883CA SERA 11225.14517.644-37.1881.00 33.96C
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ATOM885OG SERA 11224.46716.210-35.2511.0034.24O
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ATOM887O SERA 11223.30616.482 -38.1761.00 34.25O
ATOM888N SERA 11322.81918.386-37.0851.00 33.30N
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ATOM891OG SERA 11320.87218.739-34.9121.0031.71O
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ATOM893O SERA 11321.09119.524-39.1821.0031.69O
ATOM894N THRA11420.19817.479 -39.1501.0031.93N
ATOM895CA THRA11419.70917.600-40.5381.0031.87 C
ATOM896CB THR A11419.90716.294-41.3801.0031.88C
ATOM897OGl THRA11419.33215.169 -40.7011.00 32.60O
ATOM898CG2THRA11421.39016.009 -41.6601.00 32.46C
ATOM899C THRA11418.25218.031-40.5561.0031.50C
ATOM900O THRA11417.82018.752 -41.4441.00 30.80O
ATOM901N ALAA11517.52217.596 -39.5341.0031.86N
ATOM902CA ALAA11516.07817.721 -39.4741.00 32.13C
ATOM903CB ALAA11515.46816.413 -38.9641.00 32.63C
ATOM904C ALAA11515.66718.868 -38.5821.00 32.38C
ATOM905O ALAA11516.45619.320 -37.7131.00 32.37O
ATOM906N ALAA11614.43019.332 -38.7881.0031.56N
ATOM907CA ALAA11613.88620.460 -38.0261.0031.20C
ATOM908CB ALAA11612.60920.953 -38.6241.00 30.42C
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ATOM1272O LEUA161 6.298 27.389 -38.792 1.0028.60O
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權(quán)利要求
1.一種植物的成花的調(diào)節(jié)方法，其包括在由成花素、14-3-3蛋白以及bZIP轉(zhuǎn)錄因子的復(fù)合物構(gòu)成的成花素激活復(fù)合物中，對成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位施加影響，由此來促進(jìn)和/或抑制成花素激活復(fù)合物的形成， 成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號I中的D62、M63、R64、P96、T98、F103以及R132的成花素的部位和相當(dāng)于序列編號2中的F200、D201、1204、E212、Y215、R226以及D227的14_3_3蛋白的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位， 14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號2中的K51、R58、F121、R131、L224以及D227的14-3-3蛋白的部位和相當(dāng)于序列編號3中的R189 F195的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的植物的成花的調(diào)節(jié)方法，其中， 促進(jìn)和/或抑制成花素激活復(fù)合物的形成是指制備含有以下的(A) (C)中的任一種以上的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體 (A)成花素與14-3-3蛋白的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的成花素， (B)成花素與14-3-3蛋白的I個以上的結(jié)合部位和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的14-3-3蛋白， (C)14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的bZIP轉(zhuǎn)錄因子。
3.一種轉(zhuǎn)化體，其是含有以下的(A) (C)中的任一種以上的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化體 (A)成花素與14-3-3蛋白的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的成花素， (B)成花素與14-3-3蛋白的I個以上的結(jié)合部位和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的14-3-3蛋白， (C)14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的bZIP轉(zhuǎn)錄因子； 其中，成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號I中的D62、M63、R64、P96、T98、F103以及R132的成花素的部位和相當(dāng)于序列編號2中的F200、D201、I204、E212、Y215、R226以及D227的14_3_3蛋白的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位， 14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號2中的K51、R58、F121、R131、L224以及D227的14-3-3蛋白的部位和相當(dāng)于序列編號3中的R189 F195的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位。
4.一種多核苷酸，其編碼以下的(A) (C)中的任一種以上的蛋白質(zhì) (A)成花素與14-3-3蛋白的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的成花素， (B)成花素與14-3-3蛋白的I個以上的結(jié)合部位和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的14-3-3蛋白， (C)14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的I個以上的結(jié)合部位發(fā)生了變異的bZIP轉(zhuǎn)錄因子； 在此，成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號I中的D62、M63、R64、P96、T98、F103以及R132的成花素的部位和相當(dāng)于序列編號2中的F200、D201、I204、E212、Y215、R226以及D227的14_3_3蛋白的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位， 14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號2中的K51、R58、F121、R131、L224以及D227的14-3-3蛋白的部位和相當(dāng)于序列編號3中的R189 F195的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位。
5.—種重組載體,其含有權(quán)利要求4中所述的任一種以上的多核苷酸。
6.—種控制植物的成花的物質(zhì)的篩選方法，其包括以下的任一工序 (1)使候選物質(zhì)與成花素或14-3-3蛋白中的任一種接觸，然后使候選物質(zhì)與14-3-3蛋白或成花素接觸的工序；或者 (2)使候選物質(zhì)與結(jié)合有或未結(jié)合有成花素的14-3-3蛋白或者bZIP轉(zhuǎn)錄因子中的任一種接觸，然后使候選物質(zhì)與bZIP轉(zhuǎn)錄因子或者結(jié)合有或未結(jié)合有成花素的14-3-3蛋白接觸的工序。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的篩選方法，其還包括以下的工序 選擇成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位上的結(jié)合在候選物質(zhì)的存在下被促進(jìn)和/或阻礙的物質(zhì)的工序， 其中，成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號I中的D62、M63、R64、P96、T98、F103以及R132的成花素的部位和相當(dāng)于序列編號2中的F200、D201、I204、E212、Y215、R226以及D227的14_3_3蛋白的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位， 14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合部位是選自由相當(dāng)于序列編號2中的K51、R58、F121、R131、L224以及D227的14-3-3蛋白的部位和相當(dāng)于序列編號3中的R189 F195的bZIP轉(zhuǎn)錄因子的部位構(gòu)成的群中的I個以上的部位。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的篩選方法，其中， 成花素是至少含有序列編號I中所示的氨基酸序列中的第62 132位的氨基酸序列，并且含有以第I 6位中的I個氨基酸開始且以第165 177位中的I個氨基酸結(jié)束的氨基酸序列的成花素多肽片段， 14-3-3蛋白是至少含有序列編號2中所示的氨基酸序列中的第51 227位的氨基酸序列，并且含有以第I 5位中的I個氨基酸開始且以第230 256位中的I個氨基酸結(jié)束的氨基酸序列的14-3-3蛋白的多肽片段， bZIP轉(zhuǎn)錄因子是至少含有序列編號3中所示的氨基酸序列中的第189 195位的氨基酸序列，并且含有以第182 188位中的I個氨基酸開始且以第195位氨基酸結(jié)束的氨基酸序列的bZIP轉(zhuǎn)錄因子多肽片段。
9.一種多肽片段，其是選自以下的多肽片段 (i)至少含有序列編號I中所示的氨基酸序列中的第62 132位的氨基酸序列，并且含有以第I 6位中的I個氨基酸開始且以第165 177位中的I個氨基酸結(jié)束的氨基酸序列的新型成花素多肽片段； ( )至少含有序列編號2中所示的氨基酸序列中的第51 227位的氨基酸序列，并且含有以第I 5位中的I個氨基酸開始且以第230 256位中的I個氨基酸結(jié)束的氨基酸序列的新型14-3-3蛋白多肽片段； (iii)至少含有序列編號3中所示的OsFDl的第189 195位的氨基酸序列，并且以第182 188位中的I個氨基酸開始且以第195位的氨基酸結(jié)束的新型bZIP轉(zhuǎn)錄因子多肽片段。
10.一種多核苷酸，其編碼權(quán)利要求9的⑴ (iii)中所述的多肽片段。
11.一種成花素激活復(fù)合物，其是成花素多肽片段通過14-3-3蛋白多肽片段與bZIP轉(zhuǎn)錄因子多肽片段結(jié)合而形成的成花素激活復(fù)合物，其中，成花素多肽片段、14-3-3蛋白多肽片段以及bZIP轉(zhuǎn)錄因子多肽片段分別為權(quán)利要求9的⑴ (iii)中所述的多肽片段。
12.一種成花素激活復(fù)合物的晶體，其是成花素通過14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而形成的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的成花素激活復(fù)合物的晶體，其中， 晶體的空間群為P1、P6522或者P4，晶格常數(shù)為a=74 A 158 A、b=64 A 158 A、ο=96Λ 500Λ、α = 66° 90°、β = 85° 90°、γ = 75° 120°。
14.一種權(quán)利要求12或13所述的成花素激活復(fù)合物的晶體的制備方法，其包括 使用作為沉淀劑而至少含有容量百分比為5 35的聚乙二醇的沉淀劑溶液，并通過蒸汽擴(kuò)散法而將含有成花素與14-3-3蛋白的復(fù)合物的溶液晶化的工序； 回收得到的晶體的工序；以及 使用沉淀劑溶液對得到的晶體進(jìn)行培養(yǎng)，從而得到成花素激活復(fù)合物的晶體的工序，其中，所述沉淀劑溶液作為沉淀劑而至少含有容量百分比為5 35的聚乙二醇且含有bZIP轉(zhuǎn)錄因子。
15.一種調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的篩選方法，其是使用計算機(jī)而設(shè)計和/或選擇具有調(diào)節(jié)成花素激活復(fù)合物的活性的功能的候選物質(zhì)，由此來篩選調(diào)節(jié)植物的成花的物質(zhì)的方法， 其中，所述篩選方法包括 (a)將從權(quán)利要求12或13所述的成花素激活復(fù)合物的晶體中得到的立體結(jié)構(gòu)信息存儲在存儲手段中的工序， (b)根據(jù)立體結(jié)構(gòu)信息并利用導(dǎo)出手段而導(dǎo)出三維立體結(jié)構(gòu)模型的工序， (C)在導(dǎo)出的三維立體結(jié)構(gòu)模型中，利用計算手段計算出原子間距離的工序，以及(d)根據(jù)計算出的原子間距離并利用計算手段而計算出候選物質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)信息，從而設(shè)計和/或選擇候選物質(zhì)的工序，其中，所述候選物質(zhì)能夠增強(qiáng)和/或阻礙成花素與14-3-3蛋白的結(jié)合和/或14-3-3蛋白與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明的課題在于提供由成花素、14-3-3蛋白以及bZIP轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而成的成花素激活復(fù)合物的晶體，進(jìn)而利用該晶體并對它們的相互作用機(jī)制加以控制從而調(diào)節(jié)植物的成花；本發(fā)明的課題通過如下方案來解決，即，著眼于Hd3a通過GF14c與FD1結(jié)合而形成成花素激活復(fù)合物，并且，通過制備該成花素激活復(fù)合物的晶體、和使用成花素激活復(fù)合物的晶體得到立體結(jié)構(gòu)信息，并利用該立體結(jié)構(gòu)信息對成花素等的相互作用機(jī)制加以控制，由此來調(diào)節(jié)植物的成花。
文檔編號G06F19/16GK102947445SQ20118001393
公開日2013年2月27日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月17日
發(fā)明者大木出, 田岡健一郎, 辻寬之, 兒島長次郎, 島本功 申請人:國立大學(xué)法人奈良先端科學(xué)技術(shù)大學(xué)院大學(xué)