專利名稱：襯底介導的膜蛋白在脂雙層中的重組方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種膜蛋白的重組方法，特別涉及膜蛋白在脂雙層中的重組方法。
通常膜蛋白的重組方法是在脂質體形成過程中直接將蛋白插入形成蛋白脂質體，如文獻Banerjee RK，Datta AG.Mol Cell Biochem.1983；50(1)3-15、Levy D，Bluzat A，Seigneuret M，Rigard JL.Biochim Biophys Acta.1990 Jun27；1025(2)179-90、Parmar MM，Blake MS，Madden TD.Vaccine.1997Sep；68(9)1128-34和Racher KI，Voegele RT et al.Biochemistry.1999；38(6)1676-84所報道的技術，其基本過程是用去垢劑將膜蛋白提取出來，與適當比例的脂類混合，形成混合微團液，然后降低去垢劑的濃度以形成蛋白脂質體(降低去垢劑的濃度通常有三種方法(1)稀釋。將膜蛋白、脂類和去垢劑的混合溶液進行稀釋，當去垢劑的濃度足夠低的時候，膜蛋白和脂類會自發(fā)形成蛋白脂質體。這個方法的一大缺點是要求膜蛋白的起始濃度必須足夠高。(2)透析。這是一個比較常用的方法。在該方法中，一個關鍵因素是去垢劑的膠團臨界濃度，當去垢劑的濃度高于其膠團臨界濃度時，去垢劑本身形成膠團，無法被透析。由于低膠團臨界濃度的去垢劑所用的透析時間非常長，所以通常只適用于膠團臨界濃度＞1mM的去垢劑。但是即使是高膠團臨界濃度的去垢劑，透析往往也需要幾十小時，因此不適用于結構復雜、易于水解的膜蛋白的重組。(3)層析。選擇性地吸附去垢劑以促進蛋白脂質體的形成。這一方法雖然比較迅速，但是在短時間內重組上去的蛋白不多，而且形成的脂質體大小不均一。
用上述方法制備的蛋白脂質體是直徑為幾十nm級的小脂質體，在實際工作中通常需要將小脂質體融合形成直徑約為μm級的巨脂質體(Rogen A.H.A.ET al.J.Immmu.Methods.1997；204105-133)。制備巨脂質體的方法有以下兩種(1)脫水-復水法(dehydration-rehydration，DR)。這種方法的缺點是過程煩瑣，所需時間長，對于結構容易破壞的蛋白不適用。(2)冰凍-熔融法(freeze-thaw，F(xiàn)T)。該方法雖然過程簡單，所需時間短，但是制備時需要特殊的蛋白-磷脂比例，形成的巨脂質體數(shù)目較少，且常為多層磷脂膜。
目前，盡管人們已經發(fā)展了許多膜蛋白的重組方法，但是這些方法都是把膜蛋白重組到未受支撐的膜上。近幾年，人們已經發(fā)展出幾種制備受支撐磷脂膜的方法(1)制備LB膜。這一方法需要有專門的LB膜制備儀，且技術要求高，較難掌握，在制備LB膜的過程中不能將膜蛋白重組進去(Hasker L，HeymannJB，Engel A，Kistler J，Walz T.J Struct Biol.1998；121(2)162-171、Michael L，Wagner ML，Tamm LK.Biophys J.2000；79(3)1400-1414；)。
(2)單層脂質體融合。制備好的單層脂質體鋪在襯底上孵育，使之相互融合形成脂雙層。但是單層脂質體的制備比較復雜，而且難以控制。而且脂質體的融合需要干燥等極端環(huán)境，對膜蛋白的結構功能會有嚴重損傷(Kuehlbrandt，W.Quart.Rev.Biophy 1992；25，1-49)。
總的來說，現(xiàn)有的蛋白重組方法或操作復雜、過程煩瑣，或不利于保持蛋白的生物活性，無法滿足一些結構或功能研究技術的需要。
本發(fā)明的技術方案本發(fā)明所說的方法包括如下步驟(1)膜蛋白經純化后與適量的磷脂混合，蛋白和磷脂的摩爾比是1∶102～1∶107，優(yōu)選的為1∶105～1∶106；(2)取少量該溶液滴于襯底表面，于溫度15～40℃的條件下，在孵育槽中孵育，液滴中的蛋白和磷脂同時吸附在襯底表面，磷脂在襯底表面自發(fā)形成脂雙層并迅速鋪展，將蛋白鑲嵌其中。液滴吸附20-45分鐘后，用1～2ml緩沖液緩慢沖洗表面，洗去吸附不牢固的蛋白和磷脂，在襯底表面即為重組了蛋白的脂雙層.優(yōu)選的溫度為20～25℃。
也可將步驟(1)的溶液先用pH為6.5～7.5的緩沖液稀釋，然后在襯底表面進行吸附。
所說的純化為一現(xiàn)有技術，該領域一般的技術人員均能夠實施這一方法。本發(fā)明的方法優(yōu)點是十分顯著的1.步驟簡單，方便快速；2.形成有支撐的脂雙層；3.適用于各種膜蛋白，特別適用于結構復雜、易于水解的膜蛋白。
圖2為樣品注入孵育槽后孵育20分鐘的AFM圖象。
圖3為樣品注入孵育槽后孵育45分鐘的AFM圖象。
實施例1取10μl純化的兔骨骼肌鈣釋放通道溶液(蛋白濃度為0.03-0.04mg/ml，L-α-卵磷脂的濃度是3mg/ml)用1M NaCl，20mM Na-Pipes，500μM EGTA，pH7.1的緩沖液稀釋10倍，注入孵育槽中，使樣品吸附在新剖裂的云母上。當樣品吸附一定時間后，用2ml該緩沖液沖洗，并在該溶液中用接觸型AFM觀察。觀察結果如

圖1、圖2和圖3所示，結果表明，樣品中的磷脂在云母表面迅速形成不完整的雙層膜，同時也有蛋白顆粒吸附到云母上。隨著吸附時間增加，磷脂膜逐漸鋪滿云母表面，且蛋白重組到磷脂膜中。
上述Na-Pipes的化學式為C8H16N2O6S2Na2，購自美國Sigma公司，產品號為P3768；上述EGTA的化學式為C14H24N2O10，購自美國Sigma公司，產品號為E9129。
由圖1可見磷脂和蛋白同時吸附到云母表面，磷脂形成互不相連的小片磷脂膜，膜的高度約5nm，說明形成的是雙層膜。此時，吸附到云母表面的蛋白并沒有重組到脂雙層中，蛋白和磷脂層之間有較大的空隙。
由圖2可見隨著吸附時間增長，吸附到云母表面的磷脂逐漸增多，小片的磷脂膜逐漸鋪展、相互融合。在圖2上已無小片磷脂膜，但在蛋白顆粒的周圍，仍然可以看到一些空隙，與圖1相比空隙明顯減小。
由圖3可見蛋白顆粒的周圍已經看不到空隙，加大掃描力不能使蛋白顆粒移位，說明此時蛋白已經重組到脂雙層中。
實施例2短桿菌肽A(從Calbiochen Biochemicals(La Jolla，CA)處購得)，與適量的磷脂混合，短桿菌肽A與磷脂的摩爾比在1％-5％的范圍內均能得到在云母表面形成的脂雙層中的重組蛋白。
權利要求
1.一種襯底介導的膜蛋白在脂雙層中的重組方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)將純化后的膜蛋白與磷脂混合，蛋白和磷脂的摩爾比為1∶102～1∶107；(2)將該溶液滴于襯底表面，于溫度15～40℃的條件下，在孵育槽中孵育，液滴中的蛋白和磷脂同時吸附在襯底表面，然后用緩沖液沖洗表面，洗去吸附不牢固的蛋白和磷脂，在襯底表面即為重組了蛋白的脂雙層。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白和磷脂的摩爾比為1∶105～1∶106。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(2)的溫度為20～25℃。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，將步驟(1)的溶液先用pH為6.5～7.5的緩沖液稀釋，然后滴于襯底表面。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，液滴吸附20-45分鐘后用緩沖液沖洗表面。
6.如權利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所說的純化后的膜蛋白為純化后的兔骨骼肌鈣釋放通道。
7.如權利要求1～5任一所述的方法，其特征在于，所說的純化后的膜蛋白為短桿菌肽A。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種襯底介導的膜蛋白在脂雙層中的重組方法，該方法將膜蛋白經純化后與磷脂混合，然后將該溶液滴于襯底表面，液滴中的蛋白和磷脂同時吸附在襯底表面，磷脂在襯底表面自發(fā)形成脂雙層并迅速鋪展，將蛋白鑲嵌其中，用緩沖液沖洗表面，洗去吸附不牢固的蛋白和磷脂，在襯底表面即為重組了蛋白的脂雙層。本發(fā)明的方法步驟簡單，方便快速，能夠形成有支撐的脂雙層，適用于各種膜蛋白，特別適用于結構復雜、易于水解的膜蛋白。
文檔編號C07K1/00GK1400221SQ0112636
公開日2003年3月5日 申請日期2001年7月27日 優(yōu)先權日2001年7月27日
發(fā)明者魏青青, 胡曉芳, 孫潔林, 朱培閎, 胡鈞, 李民乾 申請人:中國科學院上海原子核研究所, 中國科學院上海生理研究所, 上海交通大學