專利名稱：用于使用圖表檢測(cè)生物狀態(tài)的存在的系統(tǒng)和方法
用于使用圖表檢測(cè)生物狀態(tài)的存在的系統(tǒng)和方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用這個(gè)申請(qǐng)是非臨時(shí)的，而且要求在2009年11月13日美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)第 61/261，109號(hào)，名稱為“用于使用圖表檢測(cè)生物狀態(tài)的存在的系統(tǒng)和方法”(代理機(jī)構(gòu)標(biāo)簽號(hào)021594-010300US)，為了所有的目的，通過(guò)引用在此被全部結(jié)合。
背景技術(shù)：
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)涉及伴有包含醫(yī)院暴發(fā)的嚴(yán)重后果的感染，而且對(duì)各種各樣的抗生素顯現(xiàn)抵抗力，因此限制了治療選擇。與MRSA關(guān)聯(lián)的保健有特殊的臨床重要性，因?yàn)樗坏珜?duì)所有的青霉素和頭孢菌素有顯著的交叉抗性，而且還對(duì)多個(gè)其它通常使用的抗生素有典型的抗藥性。MRSA感染的治療通常需要更加昂貴的以及常常更加有毒性的抗生素，這通常被用作最后的防線。因此，MRSA的迅速檢測(cè)對(duì)于治療以及感染控制措施兩者來(lái)說(shuō)在臨床上是至關(guān)緊要的。由于MRSA可能常常與多個(gè)其它相關(guān)的細(xì)菌相互移植的事實(shí)，MRSA的檢測(cè)進(jìn)一步是復(fù)雜的，多個(gè)其它相關(guān)的細(xì)菌包含甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林血漿凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CoNQ和/或甲氧西林敏感血漿凝固酶陰性葡萄球菌 (MS-CoNS)0在臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中用于MRSA的檢測(cè)的傳統(tǒng)方法涉及將來(lái)自樣品的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng)作為第一步驟，用于MRSA與MSSA以及MR-CoNS的隔離和區(qū)分。這個(gè)方法是消耗時(shí)間的，而且需要最少20到M小時(shí)，直至知道結(jié)果為止。對(duì)于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的檢測(cè)以及將它與甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)區(qū)分，許多基于分子的方法已經(jīng)被出版。一個(gè)這樣的方法靶向MRSA、葡萄球菌盒(Staphylococcus cassette)染色體的mecA基因(SCCmec，擔(dān)負(fù)甲氧西林耐藥性)以及金黃色葡萄球菌的礦泉基因的兩個(gè)分離區(qū)域(美國(guó)專利5，702，895，Sinsimer等人，臨床微生物學(xué)的期刊(Journal of Clinical Microbiology)，2005 年 9 月，45854591 )。 使用這個(gè)方法的MRSA的清楚的檢測(cè)被非金黃色葡萄球菌菌株的相互存在所阻礙，非金黃色葡萄球菌菌株諸如是還持有用于甲氧西林耐藥性的mecA基因的耐甲氧西林血漿凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CoNS) (Becker等人，臨床微生物學(xué)的期刊(Journal of Clinical Microbiology), 2006 年 1 月，p229_231)。更近來(lái)的分子的方法對(duì)于SCCmec以及金黃色葡萄球菌基因組的側(cè)翼區(qū)域 (flanking region)利用引物以及探針(美國(guó)專利6，156, 507, Huletsky等人，臨床微生物學(xué)的期刊(Journal of Clinical Microbiology )，2004 年 5 月，pl875_1884)。SCCmec 是可動(dòng)遺傳因子，可動(dòng)遺傳因子攜帶mecA基因，并且在orfX基因的3’端插入在特異性位點(diǎn)attBscc。SCCmec的左末端鄰接有attBscc的無(wú)orfX側(cè)，同時(shí)SCCmec的右末端鄰接有 attBscc 的 orfX 側(cè)(Ito 等人，Antimicrob. Agent Chemother. 2001，45，pl323_1336 ；Ito 等人，Antimicrob. Agent Chemother. 2004,48, p2637-2651, Noto ^A, J. Bacteriol. 2008, 190:1276-1^3)。這個(gè)方法從SCCmec/orfX接點(diǎn)的檢測(cè)來(lái)推斷mecA基因的存在。當(dāng)已經(jīng)有描述的許多不同類型的SCCmec時(shí)，這個(gè)方法需要多個(gè)引物的使用。這個(gè)方法還受到由沒(méi)有包含mecA基因的SCCmec盒的存在所引起的假陽(yáng)性結(jié)果(Farley等人，臨床微生物學(xué)的期刊(Journal of Clinical Microbiology)，2008 年 2 月，p743_746)以及由新出現(xiàn)的SCCmec類型沒(méi)有被化驗(yàn)覆蓋所引起的假陰性結(jié)果(Heusser等人，Antimicrob. Agent s Chemother. 2007 年 1 月，p390_393)。另一個(gè)方法利用跨越不同的SCCmec類型的高同源性的區(qū)域中的一個(gè)引物以及側(cè)翼金黃色葡萄球菌DNA中的一個(gè)引物(Cuny等人，Clin. Microbiol Infect 2005 ；11 834-837，歐洲專利15^847B1)。這個(gè)方法也經(jīng)受假陽(yáng)性，因?yàn)殡S著引物包圍這個(gè)區(qū)域，同樣引發(fā)MSSA的概率是高的。最后，已經(jīng)描述一種方法，使用特異性抗體以及磁性顆粒對(duì)于金黃色葡萄球菌進(jìn)行積極地選擇(Francois等人，臨床微生物學(xué)的期刊(Journal of Clinical Microbiology), 2003年1月，p2M_260 ；歐洲專利1，370，694B1)。這個(gè)方法使金黃色葡萄球菌富足，但是需要三個(gè)引物/探針組的使用以便積極地識(shí)別MRSA并且降低檢測(cè)CoNS的可能性。該方法需要離心步驟以及分離溶菌步驟以便恢復(fù)核酸。市場(chǎng)上可買到的MRSA化驗(yàn)靶向SCCmec右末端接點(diǎn)以及orfX。五個(gè)不同類型以及很多亞型的SCCmec已經(jīng)被識(shí)別，并且新的SCCmec亞型的出現(xiàn)的潛力是高的。此外，來(lái)源于MRSA的MSSA可能保留一部分SCCmec序列，而沒(méi)有mecA基因是可能的。因此，靶向具有 orfX的SCCmec右末端接點(diǎn)的化驗(yàn)可能給出伴隨MRSA衍生出的MSSA的假陽(yáng)性結(jié)果，以及伴隨MRSA攜帶新的緊急的SCCmec型/亞型的假陰性結(jié)果。如此，當(dāng)前用于MRSA的檢測(cè)的方法是麻煩的、消耗時(shí)間的，而且對(duì)于常規(guī)的臨床和監(jiān)督目的是不可靠的。因此，存在有開發(fā)化驗(yàn)的需要，該化驗(yàn)快速、簡(jiǎn)單、可靠而且能夠從包含MSSA和/或MR-CoNS的其它相關(guān)的細(xì)菌檢測(cè)和同時(shí)區(qū)分MRSA。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實(shí)施例涉及用于檢測(cè)樣品中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的系統(tǒng)和方法，樣品可能另外包含甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)、耐甲氧西林血漿凝固酶陰性葡萄球菌(MR-CoNS)，和/或細(xì)菌的其它菌株。本發(fā)明的其它實(shí)施例可能更一般地涉及用于使用圖表和邊界函數(shù)來(lái)分析生物學(xué)實(shí)體的系統(tǒng)和方法。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例指向用于判定樣品中的生物學(xué)實(shí)體的存在的方法。該方法包括檢測(cè)樣品中的至少三個(gè)遺傳因子的量。通過(guò)在數(shù)字計(jì)算機(jī)上執(zhí)行調(diào)用算法來(lái)判定樣品中的生物學(xué)實(shí)體的存在。該調(diào)用算法使用與至少三個(gè)遺傳因子關(guān)聯(lián)的測(cè)量值(例如，量)作為輸入，并且將它們組合以形成矢量，將該矢量與2維圖表上的邊界函數(shù)相比。如果該矢量在邊界函數(shù)之內(nèi)，那么生物學(xué)實(shí)體存在，而且如果該矢量不在邊界函數(shù)之內(nèi)，那么生物學(xué)實(shí)體不存在。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例指向用于判定樣品中的生物學(xué)實(shí)體的存在的系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括能夠檢測(cè)樣品中的至少三個(gè)遺傳因子的值(例如，量)的測(cè)量模塊、以及存儲(chǔ)來(lái)自測(cè)量模塊的檢測(cè)值(例如，量)的存儲(chǔ)器。該系統(tǒng)還包括計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，該計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包含具有用于執(zhí)行調(diào)用算法的計(jì)算機(jī)可讀代碼，其中，調(diào)用算法使用至少三個(gè)遺傳因子的檢測(cè)和測(cè)量值(例如，量)作為輸入，并且將它們組合以形成矢量。將該矢量與2維圖表上的邊界函數(shù)相比。如果該矢量在邊界函數(shù)之內(nèi)，那么生物學(xué)實(shí)體存在，而且如果該矢量不在邊界函數(shù)之內(nèi)，那么生物學(xué)實(shí)體不存在。該系統(tǒng)還包括處理器，該處理器在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上執(zhí)行計(jì)算機(jī)可讀代碼，以便判定樣品中的生物學(xué)實(shí)體的存在。所述發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例指向包含用于調(diào)用算法的代碼的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。該調(diào)用算法使用與至少三個(gè)遺傳因子關(guān)聯(lián)的檢測(cè)和測(cè)量值(例如，量)作為輸入，并且將它們組合以形成矢量。將該矢量與2維圖表上的邊界函數(shù)相比。如果該矢量在邊界函數(shù)之內(nèi)，那么生物學(xué)實(shí)體存在，而且如果該矢量不在邊界函數(shù)之內(nèi)，那么生物學(xué)實(shí)體不存在。發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例指向用于產(chǎn)生模型的方法，該模型可用于判定未知樣品中的生物學(xué)實(shí)體的存在。該方法包括檢測(cè)在已知樣品中的至少三個(gè)遺傳因子的存在和值(例如， 量)，以及對(duì)于已知樣品中的每個(gè)樣品在數(shù)字計(jì)算機(jī)上執(zhí)行調(diào)用算法，其中調(diào)用算法產(chǎn)生矢量，而且使用至少三個(gè)遺傳因子的檢測(cè)值(例如，量)作為每個(gè)矢量的輸入。一些矢量與生物學(xué)實(shí)體關(guān)聯(lián)，以及一些矢量與生物學(xué)實(shí)體不關(guān)聯(lián)。該方法進(jìn)一步包括在2維圖表上標(biāo)繪矢量，以及產(chǎn)生將與生物學(xué)實(shí)體關(guān)聯(lián)的矢量和與生物學(xué)實(shí)體不關(guān)聯(lián)的矢量分離的邊界函數(shù)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，公開一種對(duì)于判定樣品中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA) 的存在的方法。該方法使樣品經(jīng)受將暴露存在于樣品中的任何細(xì)菌的核酸的條件。接下來(lái)， 樣品可以被擴(kuò)增，而且可以檢測(cè)樣品中的至少mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌(SA)特異性靶基因序列的存在和量。然后通過(guò)在數(shù)字計(jì)算機(jī)上執(zhí)行調(diào)用算法來(lái)判定樣品中的MRSA的存在。該調(diào)用算法可以使用mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的檢測(cè)和測(cè)量量作為輸入，以判定MRSA是否存在于樣品中。當(dāng)樣品中的mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的檢測(cè)量與通過(guò)選擇的邊界函數(shù)限定的近似相等時(shí)，調(diào)用算法可用于判定MRSA存在于樣品中。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，公開一種對(duì)于判定樣品中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA) 的存在的系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以包含許多部件。比如，該系統(tǒng)可以包含測(cè)量模塊，在樣品已經(jīng)經(jīng)受將暴露存在于樣品中的任何細(xì)菌的核酸的條件之后，該測(cè)量模塊能夠擴(kuò)增和檢測(cè)樣品中的至少mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的存在和量。該系統(tǒng)可以進(jìn)一步包含存儲(chǔ)器，該存儲(chǔ)器可以存儲(chǔ)來(lái)自測(cè)量模塊的檢測(cè)量。該系統(tǒng)還可以包含計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，該計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)包含具有對(duì)于執(zhí)行調(diào)用算法的指令的計(jì)算機(jī)可讀代碼。該調(diào)用算法可以使用mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的檢測(cè)和測(cè)量量作為輸入，以判定MRSA是否存在于樣品中。當(dāng)樣品中的mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的檢測(cè)量與通過(guò)選擇的邊界函數(shù)限定的近似相等時(shí)，調(diào)用算法可用于判定MRSA存在于樣品中。該系統(tǒng)還可以包含處理器，該處理器可以在計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上執(zhí)行計(jì)算機(jī)可讀代碼，以便判定樣品中的MRSA的存在。根據(jù)另一個(gè)實(shí)施例，公開一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)。計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)可以包含用于調(diào)用算法的代碼，該調(diào)用算法可以判定樣品中的MRSA的存在。該調(diào)用算法可以使用mecA、 SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的檢測(cè)和測(cè)量量作為輸入，以判定MRSA是否存在于樣品中。當(dāng)樣品中的mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的檢測(cè)量與通過(guò)選擇的邊界函數(shù)限定的近似相等時(shí)，調(diào)用算法可用于判定MRSA存在于樣品中。通過(guò)使樣品經(jīng)受將暴露存在于樣品中的任何細(xì)菌的核酸的條件、以及擴(kuò)增和檢測(cè)樣品中的至少 mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的存在和量，獲得mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的檢測(cè)和測(cè)量量。根據(jù)又一個(gè)實(shí)施例，公開一種用于產(chǎn)生模型的方法，該模型可用于判定未知樣品中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的存在。該方法可以包含使一組已知樣品經(jīng)受將暴露存在于已知樣品中的任何細(xì)菌的核酸的條件。對(duì)于該組已知樣品中的每個(gè)樣品，MRSA的存在或不存在是已知的。然后該方法可以擴(kuò)增和檢測(cè)所述已知樣品中的至少mecA、SCCmec 和金黃色葡萄球菌(SA)特異性靶基因序列的存在和量。然后該方法可以在數(shù)字計(jì)算機(jī)上對(duì)于已知樣品中的每個(gè)樣品執(zhí)行調(diào)用算法。該調(diào)用算法可以使用mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的檢測(cè)和測(cè)量量作為輸入。最后，該方法可以產(chǎn)生模型，該模型可用于判定MRSA是否存在于未知樣品中?？梢詮尼槍?duì)已知樣品執(zhí)行的調(diào)用算法的輸出產(chǎn)生該模型，而且可以通過(guò)選擇的邊界函數(shù)來(lái)限定該模型，該選擇的邊界函數(shù)限定MRSA陽(yáng)性和 MRSA陰性樣品之間的邊界。在這個(gè)公開中，這些實(shí)施例以及其它實(shí)施例稍后將被更詳細(xì)地描述。


圖1顯示說(shuō)明在根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的方法中采取的步驟的流程圖。圖2顯示說(shuō)明在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的方法中采取的步驟的流程圖。圖3-5顯示說(shuō)明根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的來(lái)自各種陽(yáng)性和陰性樣品的調(diào)用算法的輸出的圖。圖6是可用于執(zhí)行本發(fā)明的各種實(shí)施例的系統(tǒng)的方框圖。
具體實(shí)施例方式各種實(shí)施例公開了用于基于MRSA陽(yáng)性樣品可以大致具有相同復(fù)制數(shù)的mecA、 SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的事實(shí)，來(lái)識(shí)別樣品中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的系統(tǒng)和方法。這些系統(tǒng)和方法可以進(jìn)一步在2維圖表上同時(shí)呈現(xiàn)三個(gè)化驗(yàn)，圖表的每一個(gè)軸相隔120°的角度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，Y圖表被用于2維顯示。如果給定的樣品具有mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的類似值，那么樣品的 mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的測(cè)量的復(fù)制數(shù)可以標(biāo)繪為非?？拷瘘c(diǎn)，而不管樣品的絕對(duì)的化驗(yàn)讀數(shù)。借助于這個(gè)轉(zhuǎn)換，邊界函數(shù)可以被限定，該邊界函數(shù)可用于區(qū)分MRSA陽(yáng)性樣品與MRSA陰性樣品。在這個(gè)公開中使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)具有本領(lǐng)域中通常使用的含義，除非另有說(shuō)明。如在這個(gè)公開中使用的，以下的詞或短語(yǔ)具有指定的含義。如在此使用的，“邊界函數(shù)”可以是被用于判定數(shù)據(jù)是與生物學(xué)狀態(tài)關(guān)聯(lián)還是與生物學(xué)狀態(tài)不關(guān)聯(lián)的數(shù)學(xué)函數(shù)。通過(guò)使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、代價(jià)函數(shù)等等，可以以包含手工的任何適當(dāng)?shù)姆绞疆a(chǎn)生邊界函數(shù)。邊界函數(shù)還可以由包含橢圓形、矩形、圓形等等的任何適當(dāng)?shù)男螤罨蚓€條來(lái)表示。邊界函數(shù)還可以是在形狀上有規(guī)律的或無(wú)規(guī)律的。如在此使用的，“矢量”可以涉及來(lái)源于一個(gè)以上的分量的值，每個(gè)分量具有至少方向和典型的標(biāo)量。如在此使用的術(shù)語(yǔ)“遺傳因子”可以涉及在本發(fā)明的方法中作為標(biāo)靶是有用的所關(guān)心的基因組中的子序列。在一些實(shí)施例中，遺傳因子是開放解讀框或基因，諸如例如葡萄球菌中的orfX、femA或mecA。遺傳因子還可以是可能或不可能包含mecA基因的可動(dòng)遺傳因子，諸如葡萄球菌盒染色體、SCCmec。在此，術(shù)語(yǔ)“SCCmec”、“SCCmec序列”和“SCCmec盒”被可替交地使用，以涉及被稱為葡萄球菌盒染色體的遺傳因子，該遺傳因子攜帶mecA基因并且被插入如Ito等人Q001， Antimicrob. Agents Chemother.，45 1323-1336)中描述的葡萄球菌基因組中。在這個(gè)申請(qǐng)中，SCCmec插入位點(diǎn)被稱為“orfX-ISS/attBscc”。插入位點(diǎn)基因的3’ 端，在此指的是“orfX”。發(fā)生SCCmec插入的染色體位點(diǎn)指的是“attBscc”。在插入位點(diǎn)的特異性序列在這里指的是“orfX-插入位點(diǎn)序列(orfX-ISS)”或“attBscc核心區(qū)域”。已知這個(gè)序列在金黃色葡萄球菌中是高保存的序列(Ito等人，Antomicrob. Agent Chemother.， 2001,45, p323-1336, Noto 等人，J. Bacteriol.，2008，190 :1276_1283)。在插入金黃色葡萄球菌的orfX-ISS/attBscc區(qū)域之后，SCCmec左末端接點(diǎn)區(qū)域被稱為MRSA-LE并且右末端接點(diǎn)區(qū)域被稱為MRSA-RE。在左末端接點(diǎn)中，SCCmec序列與attBscc的無(wú)orfX側(cè)鄰接。在右末端接點(diǎn)中，SCCmec序列與attBscc的orfX側(cè)鄰接。OrfX-ISS/attBscc 區(qū)域被詳細(xì)地描述在 Ito 等人中(2001，Antimicrob, Agents Chemother. 45 1323-1336 ；Ito ^A, Antimicrob, Agent Chemother, 2004, 48, p2637-2651, Noto 等人，J. Bacteriol,2008,190 :1276-1283)以及美國(guó)專利第 6，156，507 號(hào)中，所有都通過(guò)引用被結(jié)合在此。如果SCCmec插入不存在，那么orfX-ISS/attBscc區(qū)域是不間斷的。如果orfX-ISS/attBscc區(qū)域被識(shí)別作為完整的通過(guò)擴(kuò)增方法論，那么這表示SCCmec 盒沒(méi)有被插入。然而，沒(méi)有orfX-ISS/attBscc區(qū)域的擴(kuò)增不表示mecA基因存在。已知在 SCCmec盒變得被插入之后，可能失去mecA基因。因此即使沒(méi)有mecA，SCCmec盒仍然可以防止orfX-ISS/attBscs區(qū)域的擴(kuò)增?！暗途酆塑账帷笔蔷哂袃蓚€(gè)以上的核苷酸亞基共價(jià)連接在一起的核苷聚合體。低聚核苷酸通常是大約10到大約100核苷酸。核苷酸亞基的糖類基團(tuán)可以是核糖、脫氧核糖或它們的改性派生物，諸如OMe。核苷酸亞基可以通過(guò)諸如磷酸二酯鍵合、改性鍵合的鍵合或通過(guò)不防止低聚核苷酸與它的互補(bǔ)標(biāo)靶核苷酸序列雜交的非核苷酸部分被結(jié)合。改性鍵合包含其中標(biāo)準(zhǔn)磷酸二酯鍵合被諸如硫代磷酯鍵合、膦酸甲酯聯(lián)接或中性的肽鍵代替的那些鍵合。含氮堿基類似物還可以是對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的低聚核苷酸的成分?！皹?biāo)靶核酸”是包含標(biāo)靶核酸序列的核酸。“標(biāo)靶核酸序列”、“標(biāo)靶核苷酸序列，，或“標(biāo)靶序列，，是可以被雜交到互補(bǔ)低聚核苷酸的特異性脫氧核糖核苷酸或核苷酸序列。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“探針”指的是能夠雜交到所關(guān)心的標(biāo)靶核酸的低聚核苷酸。 作為探針通過(guò)互補(bǔ)堿基對(duì)結(jié)合到所關(guān)心的標(biāo)靶核酸的結(jié)果，雜交出現(xiàn)。一個(gè)本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，依據(jù)雜交條件的嚴(yán)格性，探針將典型地基本上使缺乏完全互補(bǔ)的標(biāo)靶序列與探針序列形成化學(xué)鍵。探針可以與適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽或報(bào)道基因部分(importer moiety)關(guān)聯(lián)， 以使探針(以及因此它的標(biāo)靶)可以被檢測(cè)、目測(cè)、測(cè)量和/或測(cè)定。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“引物”指的是用于引發(fā)核酸綜合物的低聚核苷酸。引物通過(guò)互補(bǔ)堿基對(duì)與模板雜交，并且因此用于發(fā)起復(fù)制。以與以上對(duì)于探針的描述的同樣方式出現(xiàn)雜交。在PCR中，使用兩個(gè)引物典型地與雙鏈核酸分子的有義鏈雜交的“正向引物”以及典型地與分子的反義鏈雜交的“反向引物”。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“PCR”指的是用于通過(guò)在沒(méi)有使用活體的情況下的DNA的酶的復(fù)制，在較長(zhǎng)的雙鏈DNA分子之內(nèi)的短的DNA序列(通常50到600個(gè)堿基)的指數(shù)式擴(kuò)增的技術(shù)(Mullis等人，MethodsEnzymol. 1987 ；155 :335_50)。其它體外擴(kuò)增技術(shù)可被用于本發(fā)明，而且對(duì)于那些技術(shù)人員是眾所周知的。這些方法例如包括連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、核酸序列擴(kuò)增法(NASBA)、鏈置換擴(kuò)增法(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增法(TMA)、分支DNA (bDNA)以及滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCAT)。在此使用的術(shù)語(yǔ)“實(shí)時(shí)PCR”指的是PCR的類型，在每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)之后，當(dāng)實(shí)時(shí)積聚在反應(yīng)中時(shí)，擴(kuò)增的 DNA 被量化(Heid 等人，Genome Research, 19966 (10) :986_994)。 用于實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)PCR的許多探針化學(xué)處理對(duì)于那些技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是眾所周知的。一個(gè)通常使用的方法是TaqMan 化驗(yàn)(參見，例如，美國(guó)專利第5，210，015號(hào)；第5，487，972號(hào)；以及第5，804，375號(hào))?？梢允褂貌⑶铱梢员簧虡I(yè)上采購(gòu)的其它實(shí)時(shí)PCR探針包含F(xiàn)RET引物、Molecular Beacons、Scorpion 弓| 物 、Amplifluor 弓|物 、·弓| 物 、Eclipse 以及 Ultimate 探針 。對(duì)于實(shí)時(shí)PCR技術(shù)的綜述，參見 Bustin 等人，J. Mol. Endocrin, 34 :597-601 (2005)。如在此使用的，術(shù)語(yǔ)“多重PCR”指的是PCR的類型，其中，超過(guò)一個(gè)組的引物被包含在反應(yīng)中，該反應(yīng)允許兩個(gè)以上的不同的標(biāo)靶在單個(gè)反應(yīng)試管中被擴(kuò)增。術(shù)語(yǔ)“多重PCR” 還指的是多個(gè)引物以及探針被使用，但只有一個(gè)標(biāo)靶被擴(kuò)增的PCR。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的多重PCR是實(shí)時(shí)PCR。如在此使用的，“生物學(xué)狀態(tài)”可以涉及來(lái)源于病人的樣品的特殊的生物學(xué)狀態(tài)。 在大多數(shù)情況下，生物學(xué)狀態(tài)涉及樣品是否包含特殊的生物學(xué)實(shí)體，例如，標(biāo)靶疾病生物體或與疾病關(guān)聯(lián)的患者細(xì)胞。例如，一個(gè)生物學(xué)狀態(tài)可以是包含MRSA細(xì)菌的樣品，同時(shí)另一個(gè)生物學(xué)狀態(tài)可以是不包含MRSA細(xì)菌的樣品。在其它實(shí)例中，生物學(xué)狀態(tài)可以涉及樣品是否包含癌細(xì)胞。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例涉及用于檢測(cè)樣品中的MRSA的化驗(yàn)，該樣品可以包含MRSA、 MSSA、MR-CoNS或其它細(xì)菌。本發(fā)明的實(shí)施例利用用于同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)多個(gè)遺傳因子(例如， 標(biāo)靶)的組合的多重PCR。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，標(biāo)靶DNA的初始量通過(guò)PCR閾值循環(huán)(Ct)被測(cè)量。例如，對(duì)于要被分析的反應(yīng)，確定限定的信號(hào)閾值。達(dá)到這個(gè)信號(hào)閾值所需的循環(huán)數(shù)(Ct)被確定，用于標(biāo)靶核酸以及用于參考或標(biāo)準(zhǔn)核酸。靶分子的絕對(duì)的或相對(duì)的復(fù)制數(shù)可以根據(jù)對(duì)于標(biāo)靶核酸獲得的Ct值與參考核酸相比來(lái)確定。因此Ct值與初始標(biāo)靶DNA的量成反比，參見Heid 等人，1996，Genome Research 6 (10):986,用于通過(guò)引用在此結(jié)合的Ct值的全部討論。可以采用其它數(shù)學(xué)方法，其考慮基于在一個(gè)識(shí)別方法期間擴(kuò)增的基因的預(yù)定設(shè)置量或數(shù)量的指征的特殊的靶基因的初始量的外推法。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明指向判定樣品中的MRSA的存在的方法，所述方法包括使樣品暫時(shí)并且在條件下經(jīng)受實(shí)時(shí)PCR，以便產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物的水平，該擴(kuò)增產(chǎn)物的水平足以通過(guò)熒光被檢測(cè)，而且指示樣品中的一個(gè)以上的MRSA特異性標(biāo)靶序列的初始水平。在另一個(gè)實(shí)施例中，利用一組引物(正向和反向)以及探針進(jìn)行擴(kuò)增。可以利用在它的5’端的熒光報(bào)道基因分子以及在它的3’端的猝滅分子標(biāo)明該探針。該猝滅分子防止信號(hào)從熒光報(bào)道基因分子的發(fā)射。探針雜交到正向和反向引物雜交的區(qū)域之間的標(biāo)靶序列的區(qū)域。隨著聚合酶沿著探針已經(jīng)雜交的鏈移動(dòng)，探針的5’端通過(guò)聚合酶的外切核酸酶活度被劈開，因此允許由于猝滅部分的分離引起的熒光信號(hào)的發(fā)射。在具體的實(shí)施例中，本發(fā)明的探針可以包含雙標(biāo)簽的熒光探針，雙標(biāo)簽的熒光探針包括熒光的報(bào)道基因(熒光基團(tuán))和熒光的或非熒光的猝滅劑分子。本發(fā)明的實(shí)施例的熒光團(tuán)可以在任何位置被附接到探針，包含在5’末端、3’末端或任何末端的內(nèi)部。在本發(fā)明的實(shí)施例中，熒光團(tuán)和猝滅劑分別被附接到探針的5’和3’末端。熒光團(tuán)的實(shí)例包括但不局限于 FAM、R0X、HEX、NED、Cy5、Texas RecUCalfluor RecUCalFluor Orange、Quasar 670、 Quasar 705。猝滅劑的實(shí)例包括但不局限于TAMARA、Blackhole猝滅劑BHQ-1, BHQ-2。在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種利用三個(gè)標(biāo)靶化驗(yàn)來(lái)檢測(cè)和區(qū)分MRSA與 MSSA、MR-CoNS或其它細(xì)菌的方法，其中，化驗(yàn)中使用的標(biāo)靶包含mecA基因序列、金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列和SCCmec基因序列。在具體的實(shí)施例中，金黃色葡萄球菌特異性靶基因是femA。在以下的描述中，femA常常被明確地提及作為金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列；然而，根據(jù)各種實(shí)施例，其它金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列同樣可以被使用。 然而，可用于判定MRSA的存在的其它標(biāo)靶可以包含orfX。各種實(shí)施例無(wú)須使用傳統(tǒng)的陽(yáng)性-陰性或德耳塔方法，以便判定MRSA的存在。代替地，基于MRSA陽(yáng)性樣品大致具有相同的mecA、femA和SCCmec的復(fù)制數(shù)的事實(shí)，使用一個(gè)方法。當(dāng)mecA、femA和SCCmec的復(fù)制數(shù)以大致等份存在時(shí)，可以表現(xiàn)出樣品中的MRSA的存在。在本發(fā)明的實(shí)施例中，可以使用化驗(yàn)調(diào)用算法來(lái)分析mecA、SCCmec和femA的Ct值。 這個(gè)調(diào)用算法可以進(jìn)一步在2維圖表上同時(shí)呈現(xiàn)三個(gè)化驗(yàn)，2維圖表中的線相隔120度。這個(gè)圖表可以指的是Y圖表，因?yàn)楸硎緈ecA、SCCmec和femA的測(cè)量量的圖表的三個(gè)軸中的每個(gè)軸看起來(lái)像2維圖表上的“Y”。如果樣品具有類似的mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的讀數(shù)，那么樣品的mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的測(cè)量復(fù)制數(shù)將靠近圖表的起點(diǎn)標(biāo)繪，而不管樣品的絕對(duì)的化驗(yàn)讀數(shù)。借助于這個(gè)轉(zhuǎn)換，矩形門方法可以足以區(qū)分MRSA陽(yáng)性和陰性樣品。其它適當(dāng)?shù)姆椒梢允褂脠A形門函數(shù)、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或高斯分布函數(shù)。以下提供其他的細(xì)節(jié)。圖1圖解根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的可用于構(gòu)造模型的步驟，該模型可用于判定MRSA是否存在于樣品中。該模型中的邊界函數(shù)可以基于mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的測(cè)量量，使MRSA陽(yáng)性樣品與MRSA陰性樣品分離。在更多的通稱中，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例指向用于產(chǎn)生模型的方法，該模型可用于判定未知樣品中的生物學(xué)實(shí)體的存在。該方法包括檢測(cè)在已知樣品中的至少三個(gè)標(biāo)靶的存在和量以及對(duì)于已知樣品中的每個(gè)樣品在數(shù)字計(jì)算機(jī)上執(zhí)行調(diào)用算法，其中調(diào)用算法產(chǎn)生矢量，以及將至少三個(gè)標(biāo)靶的檢測(cè)量使用作為每個(gè)矢量的輸入。一些矢量與生物學(xué)實(shí)體關(guān)聯(lián)，以及一些矢量不與生物學(xué)實(shí)體關(guān)聯(lián)。該方法進(jìn)一步包括在2維圖表上標(biāo)繪矢量，以及產(chǎn)生使與生物學(xué)實(shí)體關(guān)聯(lián)的矢量和與生物學(xué)實(shí)體不關(guān)聯(lián)的矢量分離的邊界函數(shù)。在步驟1000，選擇數(shù)量的已知樣品經(jīng)受暴露樣品中的細(xì)菌的核酸的條件。關(guān)于這點(diǎn)，已知樣品是其中已經(jīng)知道樣品是否應(yīng)當(dāng)對(duì)于MRSA測(cè)試陽(yáng)性或陰性的樣品。如此，已知樣品可以被用于構(gòu)造可以判定以后的未知樣品是否也包含MRSA的模型。雖然詳細(xì)地描述 MRSA，但是當(dāng)然，其它適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)實(shí)體的存在可以在本發(fā)明的其它實(shí)施例中被檢測(cè)。對(duì)于使樣品經(jīng)受暴露樣品中的核酸的條件，有許多不同的方式。例如，如本領(lǐng)域中眾所周知的，樣品可以使它的溫度上升，從而使DNA的鏈分離。同樣可以使用用于暴露樣品中的核酸的其它眾所周知的手段。在步驟1010，對(duì)于每個(gè)已知樣品，檢測(cè)諸如mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的至少三個(gè)標(biāo)靶的存在和量。在一些實(shí)施例中，可以為每個(gè)所關(guān)心的標(biāo)靶測(cè)量Ct值。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列是femA。有許多不同的方式來(lái)從樣品測(cè)量基因。例如，多重PCR可用于為每個(gè)測(cè)量標(biāo)靶測(cè)量PCR閾值循環(huán)(Ct)。其它測(cè)量技術(shù)同樣可以被使用。確定的Ct值可用于產(chǎn)生Y圖表。然而，在Y圖表的產(chǎn)生之前，可以進(jìn)行預(yù)篩選處理。在預(yù)篩選處理中，如果系統(tǒng)沒(méi)有檢測(cè)到三個(gè)標(biāo)靶基因序列中的任何一個(gè)，那么該樣品被認(rèn)為是MRSA陰性的，而且將不被顯示在Y圖表中。在一個(gè)實(shí)施例中，如果mecA>35、femA>32、 或SCCmec>32，那么樣品被認(rèn)為是陰性的。在另一個(gè)實(shí)施例中，如果mecA>30、femA>30或 SCCmec>30，那么樣品被認(rèn)為是陰性的。在一些實(shí)施例中，在樣品經(jīng)受得住這個(gè)預(yù)篩選處理之后，該樣品將被標(biāo)繪在Y圖表上，并且利用該Y圖表被分析。預(yù)篩選處理中使用的閾值可以取決于儀器和樣品制備。在步驟1020，調(diào)用算法可以被應(yīng)用于來(lái)自每個(gè)已知樣品的每個(gè)測(cè)量標(biāo)靶。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，調(diào)用算法可以使用Y圖表。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，對(duì)于每個(gè)已知樣品，該調(diào)用算法產(chǎn)生中間矢量，該中間矢量可以被投射在2維圖表上，該2維圖表可以是Y圖表。該中間矢量可以是三個(gè)單位矢量的總和， 該三個(gè)單位矢量彼此相隔120度，而且通過(guò)從步驟1020獲得的mecA、femA和SCCmec被加權(quán)。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，矢量的總和可以由公式表示聲=艦Μ*,+/捕+艦其中j5是中間矢量。femA可以由通用變
量“SA”(表示與金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列關(guān)聯(lián)的值)代替。根據(jù)其它實(shí)施例，同樣可以使用用于表示測(cè)量標(biāo)靶的多少相對(duì)量的其它類似的手段。在步驟1030，在步驟1020期間對(duì)于每個(gè)已知樣品產(chǎn)生的中間矢量可以被分析，以便產(chǎn)生可用于判定未知樣品是否包含MRSA的模型。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，使用已知樣品的中間矢量，選擇邊界函數(shù)，而且限定該邊界函數(shù)的參數(shù)。該邊界函數(shù)可用于判定MRSA是在未知樣品中還是不在未知樣品中。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，可以在所有測(cè)量的已知樣品的Y圖表上施行聚類分析，從而將MRSA陽(yáng)性和陰性樣品分離。聚類分析可以將陽(yáng)性樣品聚合在一起，因?yàn)閒emA、mecA和 SCCmec是單個(gè)復(fù)制標(biāo)靶，而且在MRSA陽(yáng)性樣品中這些標(biāo)靶應(yīng)當(dāng)是相等的份數(shù)。數(shù)學(xué)上，這意指如果樣品是MRSA陽(yáng)性，那么它在Y圖表上的中間矢量應(yīng)當(dāng)靠近起點(diǎn)。如此，諸如包圍陽(yáng)性樣品的矩形區(qū)域的簡(jiǎn)單的邊界函數(shù)可用于聚集位于Y圖表的起點(diǎn)周圍的陽(yáng)性樣品。陰性樣品可能被分散在這個(gè)邊界之外。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，簡(jiǎn)單的矩形方框可用于分離Y圖表上的陽(yáng)性和陰性樣品?？梢允褂脕?lái)自已知樣品的測(cè)量來(lái)調(diào)節(jié)該矩形方框的邊界。例如，神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法可以被使用以幫助限定該方框的邊界。其它實(shí)施例可以選擇更復(fù)雜的邊界函數(shù)或使用其它手段來(lái)調(diào)節(jié)選擇的邊界函數(shù)的系數(shù)。如上所述，可以使用其它方法(例如，圓形門處理、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或高斯分布函數(shù))來(lái)產(chǎn)生邊界函數(shù)。圖2圖解根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的可用于判定MRSA是否存在于樣品中的步驟。如在此使用的，未知樣品指的是不知道MRSA是否存在于其中的樣品。圖2中的步驟可以使用模型， 諸如使用來(lái)自圖1的步驟產(chǎn)生的模型，來(lái)判定未知樣品是否包含MRSA。未知樣品可以具有各種測(cè)量的標(biāo)靶，而且通過(guò)分析從未知樣品的測(cè)量標(biāo)靶產(chǎn)生的中間矢量相對(duì)于模型的邊界函數(shù)存在于哪里，這些測(cè)量可用于檢測(cè)MRSA的存在。在更多的通稱中，本發(fā)明的實(shí)施例指向用于判定樣品中的生物學(xué)實(shí)體的存在的方法。該方法包括檢測(cè)樣品中的至少三個(gè)標(biāo)靶的值(例如，量)。通過(guò)在數(shù)字計(jì)算機(jī)上執(zhí)行調(diào)用算法來(lái)判定樣品中的生物學(xué)實(shí)體的存在。該調(diào)用算法使用至少三個(gè)標(biāo)靶的測(cè)量值(例如， 量)作為輸入，并且將它們組合以形成矢量，該矢量與2維圖表上的邊界函數(shù)相比較。如果該矢量在邊界函數(shù)之內(nèi)，那么生物學(xué)實(shí)體存在，以及如果該矢量不在邊界函數(shù)之內(nèi)，那么生物學(xué)實(shí)體不存在。在步驟1100，未知樣品經(jīng)受暴露樣品中的細(xì)菌的核酸的條件。同樣可以在步驟 1100使用在構(gòu)造模型的同時(shí)在步驟1000期間使用的相同的技術(shù)。在步驟1110，從未知樣品測(cè)量至少三個(gè)標(biāo)靶，mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的Ct值。在步驟1010期間使用的相同的技術(shù)可用于實(shí)現(xiàn)步驟1110。此時(shí)，如上所述的類似的預(yù)篩選處理可用于去除很可能不與MRSA關(guān)聯(lián)的樣品。在步驟1120，用于構(gòu)造模型的調(diào)用算法可以被應(yīng)用于來(lái)自未知樣品的測(cè)量標(biāo)靶。 例如，可以使用在步驟1020使用的相同的函數(shù)來(lái)從未知樣品產(chǎn)生中間矢量。在步驟1130，判定MRSA是否存在于未知樣品中。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，這可以通過(guò)將對(duì)于未知樣品產(chǎn)生的中間矢量與從已知樣品產(chǎn)生的邊界函數(shù)進(jìn)行比較來(lái)被實(shí)現(xiàn)。如果對(duì)于未知樣品的中間矢量落在標(biāo)明陽(yáng)性MRSA樣品的邊界之內(nèi)，那么可以判定MRSA存在于未知樣品中。如果對(duì)于未知樣品的中間矢量落在標(biāo)明陽(yáng)性MRSA樣品的邊界之外，那么可以判定 MRSA不存在于未知樣品中。本發(fā)明的實(shí)施例是特別有利的。以下注意，本發(fā)明的實(shí)施例在識(shí)別樣品中的MRSA 上是特別有用的，不管MRSA常?？赡芘c多個(gè)其它相關(guān)的細(xì)菌相互移植的事實(shí)。通過(guò)以下說(shuō)明的例子進(jìn)一步論證本發(fā)明的各種實(shí)施例。實(shí)例經(jīng)由說(shuō)明被提供，并且不意欲以任何方式限制所述發(fā)明。說(shuō)明性的實(shí)例1樣品制備659個(gè)樣品被收集和分析，以形成根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的可以使用的模型。樣品是已知樣品，即，已知MRSA是否存在于每個(gè)樣品中。對(duì)于每個(gè)樣品收集兩個(gè)藥簽。然后這兩個(gè)藥簽對(duì)于MRSA被單獨(dú)培養(yǎng)。如果來(lái)自兩個(gè)藥簽的培養(yǎng)結(jié)果一致，那么這個(gè)樣品被認(rèn)為是有效的。然后每個(gè)有效的已知樣品被放置在樣品緩沖劑試管中，樣品緩沖劑試管具有Iml 的Tris、pH8. 0，以及ImM EDTA、pH8. 0。該樣品緩沖管以3000rpm被渦旋40秒，以從藥簽頭逐出細(xì)菌。然后500μ L的細(xì)菌懸浮液(即，包含細(xì)菌懸浮液的樣品緩沖劑)被轉(zhuǎn)移到新的試管中。然后，IOyL的處理控制日常存儲(chǔ)液(Process Control Working Mock)被添加到新的試管中。IOyL的細(xì)胞壁消化酶同樣被添加到新的試管中。在簡(jiǎn)短的渦旋之后，試管在70° C被培育5分鐘。然后使用Agencourt VirNA提取試劑盒(Extraction Kit)提取細(xì)菌性的DNA。然后，通過(guò)將188 μ L 的溶菌緩沖劑、1.0 μ LWpolyA RNA( 10 μ g/μ 1)以及 100 μ 1的蛋白酶K (20mg/ml)混合在一起來(lái)制備預(yù)混合物(在IOmM Tris pH8. 0、50%甘油、5mM氯化鈣中)。該預(yù)混合物然后被添加到試管，以1700RPM渦旋10秒，然后在70° C的水浴槽中
培育5分鐘。在試管被冷卻到室溫之后，575 μ L的100%異丙醇以及10 μ L的凝固緩沖劑(涂有羧基的順磁性的顆粒)被添加到該試管，并且該試管以1700RPM被渦旋10秒。然后該試管在室溫下被培育2分鐘，然后被放置在微量離心管磁體上6分鐘，以捕獲磁性顆粒。上清液被吸出，而沒(méi)有妨礙磁性顆粒。然后試管被去掉磁體，并且500μ L的沖洗緩沖劑(3. 3Μ硫氰酸胍，1. 7%v/v TritonX-100,167. 5mM檸檬酸鈉)被添加。該試管以1700RPM被渦旋10秒，然后被放回在磁體上4分鐘。上清液被吸出并且丟棄。試管被去掉磁體并且900μ L的75%的乙醇被添加。該試管然后以1700RPM被渦旋 10秒，放回在磁體上6分鐘并且上清液被吸出。75%乙醇沖洗重復(fù)總共兩次沖洗。允許磁性顆粒在室溫下在磁體上干燥15分鐘。為了洗提DNA，25 μ L的核酸酶自由水被添加到干燥的顆粒。該試管被短暫地渦旋，然后在70° C被培育5分鐘。然后試管被放回在磁體上1分鐘。洗提的核酸被用于PCR 分析。PCR反應(yīng)混合物設(shè)置PCR試劑首先被解凍然后在以下步驟期間被保持為準(zhǔn)備就緒。在96孔板(行A和 H，列1和12)上不使用邊緣孔。每個(gè)PCR板使用一個(gè)陽(yáng)性和1陰性控制。然后，為了所需量的樣品和控制，制備反應(yīng)混合物。基于12個(gè)反應(yīng)的增量，制備反應(yīng)混合物。以下容量被添加到2. Oml的聚丙烯試管300 μ L的5xPCR反應(yīng)緩沖劑(每個(gè)反應(yīng)所需的容量X 13)，108. 33 μ L的6χ低聚混合物(每個(gè)反應(yīng)所需的容量X 13)，2. 6 μ L的 IM MgC12 (每個(gè)反應(yīng)所需的容量X13)，31.2yL的1單位/μ UDG (每個(gè)反應(yīng)所需的容量X 13)，20. 8μ 1的12. 5mM dNTP(每個(gè)反應(yīng)所需的容量X 13)，1. 82 μ L的40單位/ μ IDNA 聚合酶(每個(gè)反應(yīng)所需的容量X 13)，以及95. 25 μ L Η20 (每個(gè)反應(yīng)所需的容量X 13)。反應(yīng)混合物以每個(gè)孔30 μ L容量被等分到Mratagene的96孔PCR板中。20 μ L 的SPRI-TE提取的DNA樣品被添加到單個(gè)孔中。20 μ L的陰性控制液被添加到具有核酸酶自由水的單個(gè)孔中。20 μ L的陽(yáng)性控制液被添加到單個(gè)孔中。然后，通過(guò)使用設(shè)置為45 μ L 的吸管將混合物向上和向下吸10次，產(chǎn)生樣品和反應(yīng)混合物。然后，制備的PCR板利用光學(xué)粘合蓋(Optical Adhesive Cover)被密封，然后以3000rpm被離心3分鐘。模型產(chǎn)生和分析該板然后被裝載到Mratagene Mx3005P qPCR儀器上。板中使用的孔被選擇，并且為了熒光數(shù)據(jù)收集而選擇以下染料CY5、HEX、ROX、FAM。最后，以下循環(huán)條件被指定 4' §37° C (Ix)5I' §95° C (1χ);5”@91° C—>10"§62° C—>25"§58° C (50χ)。一些監(jiān)視的標(biāo)靶被表示在以下的表1中。
權(quán)利要求
1.一種用于判定樣品中的生物學(xué)實(shí)體的存在的方法，其特征在于，所述方法包括檢測(cè)所述樣品中的至少三個(gè)標(biāo)靶的量；以及通過(guò)在數(shù)字計(jì)算機(jī)上執(zhí)行調(diào)用算法來(lái)判定所述樣品中的所述生物學(xué)實(shí)體的所述存在， 其中，所述調(diào)用算法使用與至少三個(gè)遺傳因子關(guān)聯(lián)的測(cè)量值作為輸入，并且將它們組合以形成矢量，將所述矢量與2維圖表上的邊界函數(shù)相比，并且如果所述矢量在所述邊界函數(shù)之內(nèi)，那么所述生物學(xué)實(shí)體存在，如果所述矢量不在所述邊界函數(shù)之內(nèi)，那么所述生物學(xué)實(shí)體不存在。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述2維圖表是Y圖表，而且其中所述至少三個(gè)遺傳因子包含mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列，而且其中所述調(diào)用算法在所述2維Y圖表上，將mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的檢測(cè)量組合作為矢量多。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，通過(guò)公式限定所述矢量多
4.如權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述至少三個(gè)遺傳因子包含 mecA、SCCmec 禾口 femAo
5.如權(quán)利要求1到4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述生物學(xué)實(shí)體包括MRSA。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含在顯示器上顯示所述Y圖表。
7.如權(quán)利要求1到6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過(guò)矩形門函數(shù)、圓形門處理、 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或高斯分布函數(shù)來(lái)限定所述邊界函數(shù)。
8.如權(quán)利要求1到8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，從一組已知樣品產(chǎn)生所述邊界函數(shù)，其中對(duì)于所述一組已知樣品中的每個(gè)樣品，MRSA的存在是已知的。
9.一種用于判定樣品中的生物學(xué)實(shí)體的存在的系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括測(cè)量模塊，能夠檢測(cè)與所述樣品中的至少三個(gè)遺傳因子關(guān)聯(lián)的值；存儲(chǔ)器，存儲(chǔ)來(lái)自所述測(cè)量模塊的檢測(cè)值；計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，包含具有用于執(zhí)行調(diào)用算法的指令的計(jì)算機(jī)可讀代碼，其中所述調(diào)用算法使用所述至少三個(gè)遺傳因子的所述檢測(cè)和測(cè)量值作為輸入，并且將它們組合以形成矢量，將所述矢量與2維圖表上的邊界函數(shù)相比，并且如果所述矢量在所述邊界函數(shù)之內(nèi)， 那么所述生物學(xué)實(shí)體存在，如果所述矢量不在所述邊界函數(shù)之內(nèi)，那么所述生物學(xué)實(shí)體不存在；和處理器，在所述計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上執(zhí)行所述計(jì)算機(jī)可讀代碼，以便判定所述樣品中的所述生物學(xué)實(shí)體的所述存在。
10.如權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述值是所述至少三個(gè)標(biāo)靶的量。
11.如權(quán)利要求9或10所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述2維圖表是2維Y圖表，而且其中所述至少三個(gè)遺傳因子包含mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列，而且其中所述調(diào)用算法在所述2維Y圖表上，將mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)量組合作為矢量J5。
12.如權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其特征在于，通過(guò)公式限定所述矢量聲
13.如權(quán)利要求9到12中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述測(cè)量模塊包括實(shí)時(shí)PCR設(shè)備。
14.如權(quán)利要求11所述的系統(tǒng)，其特征在于，進(jìn)一步包含用于顯示所述2維圖表的顯示器。
15.如權(quán)利要求9到14中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其特征在于，通過(guò)矩形門函數(shù)、圓形門處理、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或高斯分布函數(shù)來(lái)限定所述邊界函數(shù)。
16.一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，包括用于調(diào)用算法的代碼，其中所述調(diào)用算法使用所述至少三個(gè)遺傳因子的檢測(cè)和測(cè)量值作為輸入，并且將它們組合以形成矢量，將所述矢量與2維圖表上的邊界函數(shù)相比，而且如果所述矢量在所述邊界函數(shù)之內(nèi)，那么生物學(xué)實(shí)體存在，并且如果所述矢量不在所述邊界函數(shù)之內(nèi)，那么所述生物學(xué)實(shí)體不存在。
17.如權(quán)利要求16或17所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，通過(guò)矩形門函數(shù)、圓形門處理、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或高斯分布函數(shù)來(lái)限定所述邊界函數(shù)。
18.如權(quán)利要求16所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，所述2維圖表是2維Y圖表， 而且其中至少三個(gè)遺傳因子包含mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列，而且其中所述調(diào)用算法在所述2維Y圖表上，將mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)量組合作為矢量J5 ο
19.如權(quán)利要求18所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，通過(guò)公式限定所述矢量F
20.如權(quán)利要求18所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，進(jìn)一步包含用于顯示所述2維圖表的代碼。
21.一種用于產(chǎn)生模型的方法，所述模型能夠用于判定未知樣品中的生物學(xué)實(shí)體的存在，其特征在于，所述方法包括檢測(cè)已知樣品中的至少三個(gè)遺傳因子的所述存在和值；在數(shù)字計(jì)算機(jī)上對(duì)所述已知樣品中的每個(gè)樣品執(zhí)行調(diào)用算法，其中，所述調(diào)用算法產(chǎn)生矢量，而且對(duì)于每個(gè)矢量，使用所述至少三個(gè)遺傳因子的所述檢測(cè)值作為輸入，其中一些矢量與所述生物學(xué)實(shí)體關(guān)聯(lián)，并且一些矢量不與所述生物學(xué)實(shí)體關(guān)聯(lián)；在2維圖表上標(biāo)繪所述矢量；以及產(chǎn)生邊界函數(shù)，所述邊界函數(shù)將與所述生物學(xué)實(shí)體關(guān)聯(lián)的所述矢量和與所述生物學(xué)實(shí)體不關(guān)聯(lián)的所述矢量分離。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，通過(guò)使用矩形門函數(shù)、圓形門處理、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或高斯分布函數(shù)來(lái)限定所述邊界函數(shù)。
23.如權(quán)利要求21或22所述的方法，其特征在于，進(jìn)一步包含顯示所述2維圖表。
24.如權(quán)利要求21到23中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述2維圖表是Y圖表，而且其中所述至少三個(gè)遺傳因子包含mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列，而且其中所述調(diào)用算法在所述2維Y圖表上，將mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的檢測(cè)量組合作為矢量多。
25.如權(quán)利要求M所述的方法，其特征在于，通過(guò)公式限定所述矢量聲
26.一種用于判定樣品中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的存在的方法，其特征在于，所述方法包括使所述樣品經(jīng)受將暴露存在于所述樣品中的任何細(xì)菌的核酸的條件；擴(kuò)增和檢測(cè)所述樣品中的至少mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌(SA)特異性靶基因序列的存在和量；和通過(guò)在數(shù)字計(jì)算機(jī)上執(zhí)行調(diào)用算法來(lái)判定所述樣品中的MRSA的所述存在，其中所述調(diào)用算法使用mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)和測(cè)量量作為輸入，其中，當(dāng)所述樣品中的mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)量與通過(guò)選擇的邊界函數(shù)限定的近似相等時(shí)，所述調(diào)用算法能夠用于判定 MRSA存在于所述樣品中。
27.如權(quán)利要求沈所述的方法，其特征在于，所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列是 femAo
28.如權(quán)利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述調(diào)用算法在2維Y圖表上將 mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)量組合作為矢量多，其中所述矢量多能夠用于判定mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)量是否與通過(guò)所述選擇的邊界函數(shù)限定的近似相等。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，通過(guò)公式限定所述矢量P
30.如權(quán)利要求28或四所述的方法，其特征在于，所述2維Y圖表被顯示在顯示器上。
31.如權(quán)利要求沈到30中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過(guò)使用矩形門方法、圓形門處理、或高斯分布函數(shù)來(lái)限定所述選擇的邊界函數(shù)。
32.如權(quán)利要求沈到31中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來(lái)計(jì)算所述選擇的邊界函數(shù)。
33.如權(quán)利要求沈到32中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，從一組已知樣品中產(chǎn)生所述選擇的邊界函數(shù)，其中對(duì)于所述一組已知樣品中的每個(gè)樣品，MRSA的存在是已知的。
34.如權(quán)利要求沈到33中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR來(lái)檢測(cè)所述樣品中的至少mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述存在和量。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，至少mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述量被循環(huán)測(cè)量。
36.一種用于判定樣品中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的存在的系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括測(cè)量模塊，能夠擴(kuò)增和檢測(cè)所述樣品中的至少mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌(SA)特異性靶基因序列的所述存在和量，其中所述樣品已經(jīng)經(jīng)受將暴露存在于所述樣品中的任何細(xì)菌的核酸的條件；存儲(chǔ)器，存儲(chǔ)來(lái)自所述測(cè)量模塊的檢測(cè)量；計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，包含具有用于執(zhí)行調(diào)用算法的指令的計(jì)算機(jī)可讀代碼，其中所述調(diào)用算法使用mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)和測(cè)量量作為輸入；和處理器，在所述計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)上執(zhí)行所述計(jì)算機(jī)可讀代碼，以便判定所述樣品中的 MRSA的所述存在；其中，當(dāng)所述樣品中的mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)量與通過(guò)選擇的邊界函數(shù)限定的近似相等時(shí)，所述調(diào)用算法判定MRSA存在于所述樣品中。
37.如權(quán)利要求36所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列是 femAo
38.如權(quán)利要求36或37所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述調(diào)用算法在2維Y圖表上將 mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)量組合作為矢量多，其中所述矢量聲能夠用于判定mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)是否與通過(guò)所述選擇的邊界函數(shù)限定的近似相等。
39.如權(quán)利要求38所述的系統(tǒng)，其特征在于，通過(guò)公式限定所述矢量聲
40.如權(quán)利要求38或39所述的系統(tǒng)，其特征在于，進(jìn)一步包括能夠?qū)⑿畔@示給用戶的顯示器，其中所述2維Y圖表被顯示在所述顯示器上。
41.如權(quán)利要求36到40中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其特征在于，使用矩形門方法來(lái)限定所述選擇的邊界函數(shù)。
42.如權(quán)利要求36到41中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其特征在于，使用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來(lái)計(jì)算所述選擇的邊界函數(shù)。
43.如權(quán)利要求36到42中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其特征在于，從一組已知樣品中產(chǎn)生所述選擇的邊界函數(shù)，其中對(duì)于所述一組已知樣品中的每個(gè)樣品，MRSA的存在是已知的。
44.如權(quán)利要求39到43中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)，其特征在于，所述測(cè)量模塊使用實(shí)時(shí) PCR來(lái)檢測(cè)至少mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述存在和量。
45.如權(quán)利要求44所述的系統(tǒng)，其特征在于，至少mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述量被循環(huán)測(cè)量。
46.一種計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，包括用于能夠判定樣品中的MRSA的存在的調(diào)用算法的代碼，其中，所述調(diào)用算法使用 mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌(SA)特異性靶基因序列的檢測(cè)和測(cè)量量作為輸入，其中， 當(dāng)所述樣品中的mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)量與通過(guò)選擇的邊界函數(shù)限定的近似相等時(shí)，所述調(diào)用算法判定MRSA存在于所述樣品中；其中，通過(guò)使所述樣品經(jīng)受將暴露存在于所述樣品中的任何細(xì)菌的核酸的條件，以及擴(kuò)增和檢測(cè)所述樣品中的至少mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述存在和量，獲得mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)和測(cè)量量。
47.如權(quán)利要求46所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列是femA。
48.如權(quán)利要求46或47所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，所述調(diào)用算法在2維Y 圖表上將mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)量組合作為矢量P，以便判定mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)是否與通過(guò)所述選擇的邊界函數(shù)限定的近似相等。
49.如權(quán)利要求48所述的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，其特征在于，通過(guò)公式限定所述矢量尹
50.一種用于產(chǎn)生模型的方法，所述模型能夠用于判定未知樣品中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的存在，其特征在于，所述方法包括使一組已知樣品經(jīng)受將暴露存在于所述已知樣品中的任何細(xì)菌的核酸的條件，其中， 對(duì)于所述一組已知樣品中的每個(gè)樣品，MRSA的所述存在是已知的；擴(kuò)增和檢測(cè)所述已知樣品中的至少mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌(SA)特異性靶基因序列的所述存在和量；和在數(shù)字計(jì)算機(jī)上對(duì)所述已知樣品中的每個(gè)樣品執(zhí)行調(diào)用算法，其中，所述調(diào)用算法使用mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)和測(cè)量量作為輸入； 和產(chǎn)生能夠被用于判定MRSA是否存在于所述未知樣品中的模型，其中，從相對(duì)所述已知樣品執(zhí)行的所述調(diào)用算法的所述輸出產(chǎn)生所述模型，其中，通過(guò)選擇的邊界函數(shù)來(lái)限定所述模型，所述選擇的邊界函數(shù)限定MRSA陽(yáng)性和MRSA陰性樣品之間的邊界。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列是 femAo
52.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，所述調(diào)用算法在2維Y圖表上將對(duì)于所述已知樣品中的每個(gè)樣品的mecA、SCCmec和所述金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的所述檢測(cè)量組合作為矢量月，以便校準(zhǔn)所述選擇的邊界函數(shù)。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其特征在于，通過(guò)公式限定所述矢量尹
全文摘要
基于MRSA陽(yáng)性樣品應(yīng)當(dāng)大致具有相同復(fù)制數(shù)的mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的事實(shí)，使用用于識(shí)別樣品中的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的系統(tǒng)和方法。這些系統(tǒng)和方法可以進(jìn)一步在2維圖表上同時(shí)呈現(xiàn)三個(gè)化驗(yàn)，圖表的每個(gè)軸相隔120度。根據(jù)一個(gè)實(shí)施例，Y圖表被用于2維顯示。如果給定的樣品具有mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的類似讀數(shù)，那么樣品的mecA、SCCmec和金黃色葡萄球菌特異性靶基因序列的測(cè)量復(fù)制數(shù)可以靠近起點(diǎn)標(biāo)繪，而不管樣品的絕對(duì)的化驗(yàn)讀數(shù)。借助于這個(gè)轉(zhuǎn)換，邊界函數(shù)可以被限定，該邊界函數(shù)可用于區(qū)分MRSA陽(yáng)性樣品與MRSA陰性樣品。
文檔編號(hào)G06F19/26GK102598006SQ201080051501
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日
發(fā)明者埃里克·艾倫·古斯塔夫森, 子華·王, 安東尼奧·阿雷瓦洛·雷耶斯, 約翰·史蒂文·賴?yán)? 陸久留 申請(qǐng)人:貝克曼考爾特公司