專利名稱：：一種生物分子高通量定量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種生物分子高通量定量檢測方法。
背景技術(shù)：
：在生物學研究和臨床診斷中，經(jīng)常需要了解研究標本或臨床標本中含有多少種生物分子及其含量的信息。在高通量定量檢測方法(highthroughputdetectionmethods)問世以前，需要了解一個標本中存在多少種生物分子，就需要對該標本實施多少次檢測，不僅費時費力，而且在實際工作中，研究標本和臨床標本的數(shù)量往往是有限的，難以對其實施太多次數(shù)的檢測，極難獲得大量的檢測信息。因此，高通量定量檢測技術(shù)不僅可以大幅度提高生物學研究和實驗診斷的檢測效率，還可以大幅度提高從一個有限量標本中可以獲得的信息豐度。需要從標本中檢測的生物分子稱為檢測目的分子或檢測靶分子(targetmolecules,TMs)。現(xiàn)有生物學研究已經(jīng)證實每種TM都存在至少一種能與之發(fā)生特異性結(jié)合的生物分子，稱為這種TM的生物分子識別元件(biomolecularrecognizationelements,BREs)。與BRE的特異性結(jié)合常被用作TM分離和檢測方法的技術(shù)基礎(chǔ)。生物芯片(Biochips)技術(shù)作為第一個高通量生物分子檢測技術(shù)，很好地詮釋了高通量定量檢測方法對生物學研究的巨大促進作用。生物芯片采用微型電子與微機械系統(tǒng)(MicroElectronicMechanicalSystem,MEMS)，將不同TMs的BREs分別固定在某個固相支持物上，并排列成有序的點陣，稱為生物芯片。其中，固相支持物稱為生物芯片的片基(filmbase),每個BRE在基片上的占位稱為芯片的1個位點，所有位點組成的點陣稱為生物芯片的探針微陣列。生物芯片與待測標本反應之后，不同的TM被位于某一位點的特異性BRE所結(jié)合，再用一種報告分子，如熒光分子，來指示這種TM與BRE的特異性結(jié)合，使得結(jié)合了TM的位點發(fā)生可以被機電技術(shù)或人工識別的變化。反過來，通過判讀生物芯片與待測標本反應之后不同位點的變化，根據(jù)預先確定的位點與BRE的對應關(guān)系，一次檢測反應就可以檢出待測標本中成千上萬的生物分子。生物芯片實現(xiàn)高通量定量檢測的技術(shù)引起了相關(guān)領(lǐng)域?qū)W者的極大興趣和高度重視，被不斷派生、發(fā)展和應用，對比較基因組學、蛋白質(zhì)組學、藥物篩選和臨床檢測等學科的發(fā)展起到了積極的推動作用，被譽為21世紀生命支撐平臺。但是，生物芯片也存在由其方法學原理所決定的固有不足，主要是(1)反應效率不高，所有TMs的BREs都被固定在一個固相基片上，使得芯片與待測標本的雜交成為一種固-液相模式的雜交，固液相雜交反應存在空間位阻作用，降低了TM與BRE結(jié)合的效率，使得芯片雜交往往需要過夜；(2)重復性不佳，生物芯片不同片基對BRE的吸附能力不同，片基不同位點吸附BRE的效率不同，報告分子對不同標本的標記效率也存在差異，這使得生物芯片難以取得較好的重復性，有報道指出生物芯片的重復性一般在85%以內(nèi)；(3)不能用于定量分析，為了提高生物芯片的重復性，研究者在生物芯片中引入了內(nèi)源標準化信噪比(InternallyNormalizedRatio,INR),可以作為消除TMs—BREs結(jié)合效率差異的對照，也可以消除潛在的不同熒光分子的標記效率差異,但由于抗體抗原結(jié)合的差異、標記差異等原因，根據(jù)芯片結(jié)果信號的強弱判斷同一樣品中兩種不同蛋白的含量是不恰當?shù)?。針對生物芯片的固有不足，美國Luminex公司開發(fā)了另一種高通量定量檢測技術(shù)，英文名稱為flexibleMulti-AnalyteProfiling,簡稱xMAP。xMAP的檢測過程全部在液相完成，因此又稱為液相芯片(liquidchips)。在xMAP技術(shù)中，首先對一些塑料微球進行顏色編碼，即使用兩種不同的熒光染料將直徑約5.6^im的聚苯乙烯微球染成不同的熒光色，受分辨技術(shù)的限制，最多可以獲得100種經(jīng)熒光編碼的微球。然后將不同BREs通過化學方法共價交聯(lián)在不同顏色的微球上，根據(jù)檢測的需要將結(jié)合有不同BRE的微球以及TMs的另一種結(jié)合有熒光分子的BREs共同組成檢測試劑，與待測標本進行反應之后，將形成編碼微球-TM-熒光報告分子復合物。最后利用一種專用的分析儀對這種微球-TM-熒光報告分子復合物進行檢測，分析儀可發(fā)出兩束不同的激光，一束用于激發(fā)熒光報告分子，根據(jù)熒光強度可以判定微球上結(jié)合的TM的量，另一束激光用于激發(fā)微球上的熒光素，判定是那種微球，根據(jù)預先確定的微球與BRE的對應關(guān)系，確定是那一種TM。盡管xMAP技術(shù)相比Biochips技術(shù)有一些顯著的優(yōu)勢，例如幾乎沒有空間位阻效應，雜交反應快、效率高；重復性得到極大提高，xMAP通過對多個同色微球進行重復檢測，極大地提高了檢測的重復性；實現(xiàn)了一定的定量功能等，但xMAP技術(shù)也存在一些顯著的不足(l)檢測通量有限，由于熒光編碼最多可以獲得100種不同顏色的聚丙乙烯微球，xMAP的檢測通量就不可能超過100種TM/測試；(2)應用開發(fā)難度大、成本高，xMAP每檢測一種TM，都需要開發(fā)兩種不同的BRE，加大了應用開發(fā)的難度、周期和成本，這使得xMAP技術(shù)的應用價格居高不下；(3)沒有定量分析的準確依據(jù)，xMAP技術(shù)中可以測定每個微球-TM-熒光報告分子復合物的熒光強度，也可以測定多個同色微球中被結(jié)合了熒光報告分子的微球所占的比例，這些信息可以用于分析相應TM的含量，但由于每個微球交聯(lián)BRE的量不可能完全相同，根據(jù)微球-TM-熒光報告分子復合物的熒光強度進行定量將存在很大的誤差，由于采樣的隨機性，每次分析采集的微球都各不相同，因此每次測試的發(fā)光微球比例也不可能完全相同，所以xMAP只能根據(jù)以上兩個指標，從統(tǒng)計學意義上進行定量分析，而不能給出有直接關(guān)系的定量公式。綜上所述，高通量定量檢測方法是生物學研究和臨床診斷的一種重要技術(shù)手段，但現(xiàn)有的高通量定量檢測技術(shù)都還存在一定的不足，開發(fā)一種更優(yōu)秀的高通量定量檢測技術(shù)彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，進一步促進生物學研究的發(fā)展和臨床檢測的進步，是迫切需要解決的問題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種生物分子通用高通量定量檢測方法。其能夠顯著提高生物學研究、臨床檢驗、食品衛(wèi)生檢驗、環(huán)境檢測和法醫(yī)學檢驗等領(lǐng)域相關(guān)應用的效率。為實現(xiàn)本發(fā)明目的而提供的一種生物分子高通量定量檢測方法，使用分子編碼的方法實現(xiàn)了生物分子的高通量定量檢測。所述的生物分子高通量定量檢測方法，把不同的編碼分子(CodingMolecules,CMs)標記在不同生物分子識別元件(BREs)上，形成分子性質(zhì)各不相同的生物識別元件-編碼分子(BRE-CM)，將所有能與檢測靶分子特異性結(jié)合的生物識別元件-編碼分子(tBRE-CM)和至少1種參考生物識別元件-編碼分子(rBRE-CM)以及合適的緩沖液組成檢測試劑，將檢測試劑和檢測標本在合適的溫度和緩沖液中保溫一定時間，然后用能夠鑒別生物識別元件-編碼分子(BRE-CM)性質(zhì)差異的分離檢測方法，測定出標本/檢測試劑混合物中中各種生物識別元件-編碼分子(BRE-CM)的濃度，進而計算出標本中靶分子的濃度。所述的生物分子高通量定量檢測方法，包括下列步驟步驟A，制備生物分子編碼分析檢測試劑；步驟B，將所述檢測試劑與檢測標本混合，檢測試劑中的BRE-CM與檢測標本中的TMs進行結(jié)合反應；步驟C，用分離檢測方法對標本-檢測試劑混合物進行分析，使各種BRE-CMs和TM-BRE-CMs組分被分離并測定每種組分含量；步驟D,根據(jù)消耗BRE-CMs的量或生成的TM-BRE-CMs的量，計算出標本中各種靶分子的濃度。所述步驟A包括下列步驟步驟A1，給不同TM的BRE標記上不同的CM，進行分子編碼，形成分子性質(zhì)不同的BRE-CM復合分子；步驟A2，將所有能與TM發(fā)生特異性結(jié)合的BRE-CM(tBRE-CM)和至少一種用作參考的BRE-CM(rBRE-CM)按一定濃度，與根據(jù)檢測對象所需的適量緩沖液混合，作為BMCA的檢測試劑。所述分子性質(zhì)不同為分子量的差異，或者所帶電荷的差異，或者光學性質(zhì)的差異或者分子物理尺寸的差異。所述步驟C中的分離檢測方法是能夠利用所述分子性質(zhì)差異對BRE-CM和TM-BRE-CM進行組分分離和定量測定的方法。所述步驟D具體包括下列步驟根據(jù)靶分子與其生物識別元件的結(jié)合比t所述檢測試劑中rBRE-CM的濃度，步驟B中加入所述檢測試劑的體積^和所述檢測標本的體積^，以及步驟C中測得的tBRE-CM的濃度與rBRE-CM濃度之比相對檢測試劑中tBRE-CM與rBRE-CM的濃度之比的降低值M，計算出每種靶分子的濃度，或者是TM-BRE-CM的量來計算標本中相應TM的濃度。但是，下述情況除外當不等式I成立時，對應靶分子的濃度低于生物分子編碼分析的最低檢出限Cm,"，不進行靶分子的濃度計算；所述不等式I為其中Si^是M的變異系數(shù)。&Fs當步驟C中某tBRE-CM的濃度為零時，相應靶分子的含量超過生物分子編碼分析的檢測上限，認為靶分子的濃度滿足等式II，不進行靶分子的濃度計算；所述等式II為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>其中，C,皿—ew是檢測試劑中相應tBRE-CM的濃度。所述分離檢測方法為電泳分析方法或者色譜分析方法。所述生物分子為核酸或者蛋白質(zhì)或者細胞表面標志物。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供的一種生物分子高通量定量檢測方法，可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)/細胞、核酸片段等所有生物大分子的高通量定量檢測，顯著提高生物學研究、臨床檢驗、食品衛(wèi)生檢驗、環(huán)境檢測和法醫(yī)學檢驗等領(lǐng)域相關(guān)應用的效率。圖1為本發(fā)明的利用生物分子編碼分析(BMCA)進行生物分子高通量定量檢測的方法實施過程示意圖2為生物分子編碼分析方法(BMCA)分析蛋白質(zhì)的虛擬電泳圖。具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明的一種生物分子通用高通量定量檢測方法進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。在從事免疫PCR(immunopolymerasechainreaction,immuno-PCR)檢觀!jHIV(Humanimmunodeficiencyvirus,人類免疫缺陷病毒)早期蛋白的研究過程中，發(fā)現(xiàn)給抗體分子標記不同長度的雙鏈DNA(doublestraindDNA，dsDNA)之后，抗體-dsDNA復合物在電泳中形成的條帶位置不同。據(jù)此，得到了一種與生物芯片和xMAP技術(shù)完全不同的生物分子通用的高通量定量檢測方法，即生物分子編碼分析(BiomoleculesCodingAssay,BMCA)。本發(fā)明利用生物分子編碼分析(BMCA)進行生物分子高通量定量檢測的方法仍然利用TM與其BRE結(jié)合的特異性作為本方法特異性的保證。但與現(xiàn)有生物分子檢測技術(shù)不同的是，本發(fā)明使用分子編碼的方法實現(xiàn)了生物分子的高通量定量檢測。即把不同的編碼分子(CodingMolecules,CMs)標記在不同生物分子識別元件(BREs)上，形成分子性質(zhì)各不相同的生物識別元件-編碼分子(BRE-CM)，將所有能與檢測靶分子特異性結(jié)合的生物識別元件-編碼分子(tBRE-CM)和至少1種參考生物識別元件-編碼分子(rBRE-CM)以及合適的緩沖液組成檢測試劑，將檢測試劑和檢測標本在合適的溫度和緩沖液中保溫一定時間，然后用能夠鑒別生物識別元件-編碼分子(BRE-CM)性質(zhì)差異的分離檢測方法，如電泳分析方法或者色譜分析方法，測定出標本/檢測試劑混合物中中各種生物識別元件-編碼分子(BRE-CM)的濃度，進而計算出標本中靶分子的濃度。本發(fā)明的生物分子通用高通量定量檢測方法，包括如下基本步驟步驟1，制備包含至少1種rBRE-CM和若干種tBRE-CM的生物分子編碼分析(BMCA)檢測試劑；如圖1中A部分所示，首先，給不同TM的BRE標記上不同的CM,進行分子編碼，形成分子性質(zhì)不同的BRE-CM復合分子BRE1-CM1BRE2-CM2BRE3-CM3所述分子性質(zhì)不同可以是分子量的差異、所帶電荷的差異、光學性質(zhì)的差異或分子物理尺寸的差異，但并不限于這些差異。對生物識別元件(BRE)的分子編碼并不影響它與靶分子(TM)結(jié)合的特異性，而因為編碼分子(CM)具有不同的分子性質(zhì)，使得分子性質(zhì)相同或不同的生物識別元件(BRE)被轉(zhuǎn)變成分子性質(zhì)不同生物識別元件-編碼分子(BRE腸CM)。然后將所有tBRE-CM和rBRE-CM按一定濃度組成檢測試劑。因此，本發(fā)明的分子編碼分析檢測試劑(BMCA檢測試劑)中包含至少1種rBRE-CM和若干種tBRE-CM:rBRE-CMtBREl-CMltBRE2-CM2tBRE3畫CM3步驟2，將所述檢測試劑和檢測標本混合，檢測試劑中的tBRE-CM與混合液中的靶分子(TM)的進行結(jié)合反應。如圖1中C部分所示，將檢測試劑、檢測標本和緩沖液混合后，在合適溫度下反應一定時間。如果標本中含有被檢測的靶分子(TM)，如圖1中B部分所示，TM將與相應的tBRE-CM形成TM-BRE-CM復合分子，同時其相應的tBRE-CM被消耗。步驟3，將各種BRE-CM或TM-BRE-CM進行定量檢測。使用色譜或電泳等組分分離檢測方法對標本與檢測試劑混合物進行組分分析。由于各種BRE-CM和TM-BRE-CM具有各不相同的分子性質(zhì)，因此能夠在色譜或電泳中彼此分離并被定量測定，如圖1中Dl部分和圖1中D2部分所示。步驟4，計算標本中各靶分子(TM)的濃度。根據(jù)靶分子(TM)與其生物識別元件(BRE)的結(jié)合比"以及BMCA檢測試劑中rBRE-CM的濃度CrBRE.CM，步驟S200中加入檢測試劑的體積(&)和標本的體積(^)，以及步驟S300中測得的tBRE-CM的濃度與rBRE-CM濃度之比相對檢測試劑中tBRE-CM與rBRE-CM的濃度之比的降低值M，利用公式(l),可以計算出每種靶分子(TM)的濃度C^。公式(l):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>(1)但是，公式(l)有兩個例外一是當不等式(I)成立時，對應靶分子(TM)的濃度低于生物分子編碼分析(BMCA)的最低檢出險，而不使用公式(l)進行計算。二是當剩余tBRE-CM的濃度為零時，相應靶分子(TM)的含量超過生物分子編碼分析(BMCA)的檢測上限，應認為靶分子(TM)的濃度滿足等式(II)，而不應該使用公式(l)進行計算。不等式(I):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>(I)其中SD^是M的變異系數(shù)。不等式(II):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>(II)其中，CtBRE-CM是檢測試劑中tBRE-CM的濃度。下面進一步詳細說明本發(fā)明利用生物分子編碼分析(BMCA)進行生物分子通用高通量定量檢測。利用本發(fā)明的生物分子編碼分析(BMCA)進行生物分子通用高通量定量檢測方法，即利用物分子編碼分析方法(BMCA)分析蛋白質(zhì)、核酸片段或細胞表面標志物等所有生物大分子，實現(xiàn)對蛋白質(zhì)、細胞表面標志物、核酸片段等所有生物大分子的高通量定量檢測。為了詳細說明本發(fā)明利用生物分子編碼分析(BMCA)進行生物分子通用高通量定量檢測，即利用生物分子編碼分析方法(BMCA)在實現(xiàn)生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸以及細胞目標面標志物的分析應用，現(xiàn)以生物分子編碼分析方法(BMCA)分析核酸片斷和蛋白質(zhì)的方法為例，說明本發(fā)明的利用生物分子編碼分析(BMCA)進行生物分子通用高通量定量檢測，但應當說明的是，本發(fā)明利用生物分子編碼分析(BMCA)進行生物分子通用高通量定量檢測并不只限于本實例所述的方式。實施例一生物分子編碼分析方法(BMCA)分析核酸片段的方法以124bpdsDNA作為rBRE-CM，以大腸桿菌16SRNA基因組探針作為tBREt，以175bpdsDNA作為CMP以金黃色葡萄球菌16SRNA基因組探針作為tBRE2，以322bpdsDNA標記的CM2，配制由rBRE-CM3.3ng/pl、tBRE-CM!3.9ng^1、tBRE-CM215ng/nl組成的檢測試劑。以銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌16SRNA基因組DNA的PCR產(chǎn)物作為檢測標本。以安捷倫2100生物芯片分析儀和DNA2100型電泳芯片作為分離檢測方法，建立BMCA檢測系統(tǒng)，對金黃色葡萄球菌16SRNA基因的PCR產(chǎn)物進行檢測。TM:金黃色葡萄球菌16SRNA基因片段tBRE1:5'CGAACGGTAACAGGAAGAAGC3'tBRE2:5'CTTCTCTGATGTTAGCGGCG3'CM5'CGTGGTCATCACCTCGTCAATTGGTGCGGTCTACATGGACCCGAACCGTGACCCTGAAGCCGTCGTTGACGAAAGTTGCTGGAGTGATCTTGAGTTCTGCAAAAACACCAAGAATTGGTATTGTTACGGCAAGATGGTGGCGGAGCAAGCCGCGTGGGAGACGGCAGAGGAGAAA3'CM2:5'GGCTACACGGTCAAAGGAACCGTACGGAATCCAGATGATCCGAAGAATACACATTTGAGAGAGATCGAAGGAGCCAAGGAGAGACTGATTCTGTGCAAAGCAGATCTTCAGGACTACGATGCTCTTAAGGCGGCTATCGATGGTTGTGACGGCGTCTTTCACACGGCTTCTCCGGTCACTGACGATCCCGAGCAAATGGTGGAGCCGGCCGTGAACGGAGCCAAGTTTGTAGTTAATGCTGCAGCTGAAGCCAAGGTGAAGCGCGTGGTCATCACCTCGTCAATTGGTGCGGTCTACATGGACCCGAACCGTGACCCTGAAG3'rBRE-CM:5'TGACGATCCCGAGCAAATGGTGGAGCCGGCCGTGAACGGAGCCAAGTTTGTAGTTAATGCTGCAGCTGAAGCCAAGGTGAAGCGCGTGGTCATCACCTCGTCAATTGGTGCGGTCTACATGGAC3'檢測標本金黃色葡萄球菌16SRNA基因的PCR產(chǎn)物作為標本l，稀釋為50%后作檢測標本2，稀釋為25%后作檢測標本3。檢測過程如下1.進行生物識別元件(BRE)的分子編碼與制備檢測試劑。(1)CMj示記tBRE^將tBRE!的序列加掛在CM!正義鏈引物的5'端，合成引物Pl:5'CGAACGGTAACAGGAAGAAAACAAGCCGTGGTCATCACCTCGTC3'，將Pl與CMi按一定的比例混合，其物質(zhì)的量之比為1:110:1，體系中含Taq酶0.1lU/pl和1.53.0mmol/LMgCl2。94。C變性520分鐘(min)，迅速降溫到506(TC，保溫30秒(s)10分鐘(min),升溫到72'C，保溫530分鐘(min)。之后用高效液相色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳或PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化tBRErCMj。(2)CM2標記tBRE2:將tBRE2的序列加掛在CM2正義鏈引物的5'端，合成弓|物P2:5'CTTCTCTGATGTTAGGCTCTAGGGCGGGCTACACGGTCAAAGGA3'，將P2與CM2按一定的比例混合，其物質(zhì)的量之比為1:110:1，體系中含Taq酶0.1lU/nl和1.53.0mmol/LMgCl2。94""C變性520分鐘(min)，迅速降溫到5060。C，保溫30秒(s)10分鐘(min)，升溫到72'C，保溫530分鐘(min)。之后用高效液相色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳或PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化tBRE2-CM2。。(3)按rBRE-CM3.3nmol4il、tBRE廣CM丄3.9nmol/ixl、tBRE2-CM215nmol/|il組成檢測試劑，其中含2XPCR緩沖液和2.0-5.0mmol/LMgCl2。2.檢測試劑與標本反應。取200^1Eppendof管6支，編16號按表1操作，檢測標本1、標本2和標本3首先在99。C變性51(TC后立即置冰浴備檢，首先按表l.加樣表l.加樣表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>加樣完畢后，用渦旋混合器混勻，3000rpm離心30s,置5060°C，保溫3060分鐘(min)以完成BRE-CM與核酸片斷的雜交。3.進行電泳檢測使用Agilent2100Analyzer和DNA1000型電泳芯片進行電泳檢測，按儀器和DNA1000電泳芯片的操作常規(guī)進行電泳檢測。各檢測標本和標本空白中rBRE-CM和tBRErCN^、tBRErCM2的濃度見表2。表2.檢測結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>4.計算耙分子(TM)的濃度。(1)由于BRE-CM與耙分子(TM)的結(jié)合比為1:1，所以/t-l^=5^il(2)計算比率下降值M,見表3:表3.各組分的M值<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>標本l1.16000.0005272.831.6906標本21.15990.0006273.7310.7896標本31.1607-0.000174.03010.4905(3)計算各靶分子(TM)濃度由于標本1、2、3中M,均滿足不等式(I)，故TMi的含量均為0nmol4il;由于M,不滿足不等式(I)，且標本l、2、3中剩余tBRE2-CM2的濃度均大于零，固可以用公式1對TM2的濃度進行計算。結(jié)果見表4:表4.檢測標本中靶分子(TM)含量<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(4)結(jié)果分析:理論上，標本2中TM2的濃度應當為標本1的50%，標本2中的濃度應當為標本2的50%，而實際測得的濃度與此有一些小的誤差，其是稀釋時的加樣誤差所致。實施例二生物分子編碼分析方法(BMCA)分析蛋白質(zhì)的方法以124bpdsDNA作為rBRE-CM，以地高辛(Dig)作為tBREp以367bpdsDNA作為CMP以生物素(Bio)作為tBRE2，以394bpdsDNA作為CM2，按照2.0ng/|xlrBRE畫CM、1.6ng/plDig誦367bpdsDNA(tBRE廣CM)和2.0ng/plBio-394bpdsDNA(tBRE2-CM2)組成BMCA檢測試劑Rl，以安捷倫2100生物分析儀和DNA1000型電泳芯片作為分離檢測方法，構(gòu)建BMCA檢測系統(tǒng)。TM:鏈親和素下面詳細說明本實施例利用生物分子編碼分析方法(BMCA)進行蛋白質(zhì)檢測過程的過程1.制備檢測試劑(1)PCR制備124bpdsDNA:PCR弓I物S:5'GACGATCCCGAGCAAAT3'PCR引物A:5'GTCCATGTAGACCGCACC3'PCR模版為甘藍型油菜(Brassicanapus丄.)中一條肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)基因的一個片斷，克隆載體為pMD18-T(TaKaRa)，含Amp抗性基因，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，用熱裂解法提取核酸作為PCR模版。PCR條件為94。C5min——>94。C30s——^55。C30s——>72。C30s——>72。C5min35x(2)PCR制備Dig國367bpdsDNA:PCR引物S:5'Dig-GGTGGATACATCGCTTCTT3'PCR引物A:5'CTTCAGGGTCACGGTTCG3'其余過程與制備124bpdsDNA的方法過程相同，請參照制備124bpdsDNA過程，本實施例中不再一一詳細描述。(3)PCR制備Bio國394bpdsDNA:PCR引物S:5'Bio-GGTGGATACATCGCTTCTT3'PCR弓I物A:5'CACTCCAGCAACTTTCGT3'其余過程與制備124bpdsDNA的方法過程相同，請參照制備124bpdsDNA過程，本實施例中不再一一詳細描述。(4)測定PCR產(chǎn)物中dsDNA濃度使用Bio-RADSmartSpect3000型紫外分光光度計，按操作規(guī)程進行。(5)配制檢測試劑R1:按20ng/pl124bpdsDNA、16ng/plDig國(367bp)dsDNA和20ng/jxlBio-(394bp)dsDNA配制成R;將R用去離子水稀釋10倍，配成Rl。2.準備檢測標本取lmgStreptAvidin1支，14，000rpm離心10min;加入lxPBS(pH7.4)lml，顛倒混勻溶解3min;取500^1EP管3支，標S10ng、Sing和S500pg，向SlOng管中加入lxPBS(pH7.4)99|il、lmg/mlStreptAvidin1^1，向Sing管中加入lxPBS(pH7.4)90nl、S10ng10^1，向S500pg管中加入lxPBS(pH7.4)50pl、S10ng50W，反復顛倒混勻，置4-C冰箱備用。3.進行檢測標本與檢測試劑的結(jié)合反應取200plEP管3支，分別標記為Rlb、RlSn、RlSp,按表5加樣:表5BMCA生物結(jié)合反應操作加樣表反應體系組分RlSnRlSpRlbRl1XPBS44Slng100S500pg010加樣完畢后用蝸旋混勻，6，000rpm離心5s,4(TC水浴lh，之后6,000rpm離心10s備檢。4.準備凝膠和染料混合物從4-C冰箱中取出DNA1000試劑盒，室溫平衡30min，從試劑盒中取出凝膠1支、濃縮染料1支，將濃縮染料在蝸旋振蕩器上振蕩混勻10s，在微型離心機上室溫14000rpm離心5s，吸取25^1濃縮染料，加入到凝膠管中，在蝸旋振蕩器上振蕩混勻10s，全部轉(zhuǎn)入1支帶濾芯的Eppendof管的濾芯中，室溫2200G(6000rpm)離心15min，棄慮芯，蓋上Eppendof管的管蓋，標記為Gd。5.準備電泳芯片將DNA1000芯片從4'C冰箱中取出，室溫平衡30min，置于灌膠器上，在黑色圓圈標記的G孔中加入9^1Gd，用定量注射器壓入lml空氣壓膠60s，釋放注射器壓縮定位卡，待注射器自動彈起10s后將注射器拉回lml，卸下注射器，向另外兩個沒有黑色圓圈標記的G孔中加入Gd各9pl。6.芯片上樣在1-12孔和ladder孔中各加5^1DNAMaker,在1-12泳道中分別加入Rlb、Rlb、Rlb、Rlb、Rlb、Rlb、RlSn、RlSn、RlSn、RlSp、RlSp、RlSp各1^1，在ladder孔中加入ladder1^1，將加好樣的DNA1000電泳芯片置于專用振蕩器上振蕩lmin，備檢。7.芯片電泳用清洗芯片(加去離子水)清洗2100分析儀的電極10s，將準備好的DNA1000電泳芯片放入2100分析儀，打開AgilentTechnologies2100Bioanalyzer-2100expertB02.02SI238軟件，選取分析芯片型號為DNA1000，輸入各泳道的樣品名稱，點擊"start"按鈕，開始電泳。8.實驗結(jié)果及分析(1)生物分子編碼分析方法(BMCA)分析蛋白質(zhì)的虛擬電泳圖如圖2所示，行l(wèi)-3為RlSn;行4-6為RlSp;行7-9為R01Sn;行10-12為R01Sp。(2)電泳測得各BMCA測試中BRE-CM的濃度如表6所示表6.BMCA檢測蛋白質(zhì)實驗結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(3)根據(jù)表6結(jié)果，計算tBRE-CM/rBRE-CM，結(jié)果如表7所示。表7.BMCA檢測蛋白實驗中tBRE-CM與rBRE-CM的比值<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>(4)計算標本空白中tBRE-CM2/rBRE-CM的均值(RR)及標準差SARR=(1.01+0.99+1.00+1.00+0.99+1.00)/6=1.00(5)計算BMCA檢測Sing時tBRE-CM2/rBRE-CM的均值(Rn)及測得標本中鏈親和素的濃度(Cim)RT1=(0.59+0.60+0.59)/3=0.59由于RT1的降低值-RirRfl.00-0.59=0.41>3XSZ^，可以使用公式來計算檢測標本中鏈親和素的濃度Cjmi=^x|x2.0x0.41=1.03(ng/nl)。(6)計算BMCA檢測S500pg時tBRE-CM2/rBRE-CM的均值(Ri2)及測得標本中鏈親和素的濃度(CTM2)RT2=(0.82+0.82+0.83)/3=0.82由于Rt2的降低值=RR-RT=1.00-0.82=0.18>3XSi^，可以使用公式來計算檢測標本中鏈親和素的濃度c2=丄x旦x2.0x0.18=0.45(ng/|xl)。41本實施例是為了更好地理解本發(fā)明進行的詳細的描述，并不是對本發(fā)明所保護的范圍的限定，因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不脫離本發(fā)明的主旨未經(jīng)創(chuàng)造性勞動而對本明所做的改變在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。權(quán)利要求1、一種生物分子高通量定量檢測方法，其特征在于，使用分子編碼的方法實現(xiàn)了生物分子的高通量定量檢測。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物分子高通量定量檢測方法，其特征在于，把不同的編碼分子標記在不同生物分子識別元件上，形成分子性質(zhì)各不相同的生物識別元件-編碼分子，將所有能與檢測靶分子特異性結(jié)合的生物識別元件-編碼分子和至少1種參考生物識別元件-編碼分子以及合適的緩沖液組成檢測試劑，將檢測試劑和檢測標本在合適的溫度和緩沖液中保溫一定時間，然后用能夠鑒別生物識別元件-編碼分子性質(zhì)差異的分離檢測方法，測定出標本/檢測試劑混合物中中各種生物識別元件-編碼分子的濃度，進而計算出標本中靶分子的濃度。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物分子高通量定量檢測方法，其特征在于，包括下列步驟步驟A，制備生物分子編碼分析檢測試劑；步驟B，將所述檢測試劑與檢測標本混合，檢測試劑中的BRE-CM與檢測標本中的TMs進行結(jié)合反應；步驟C，用分離檢測方法對標本-檢測試劑混合物進行分析，使各種BRE-CMs和TM-BRE-CMs組分被分離并測定每種組分含量；步驟D，根據(jù)消耗BRE-CMs的量或生成的TM-BRE-CMs的量，計算出標本中各種靶分子的濃度。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物分子通用高通量定量檢測方法，其特征在于，所述步驟A包括下列步驟步驟A1，給不同TM的BRE標記上不同的CM，進行分子編碼，形成分子性質(zhì)不同的BRE-CM復合分子；步驟A2，將所有能與TM發(fā)生特異性結(jié)合的BRE-CM(tBRE-CM)和至少一種用作參考的BRE-CM(rBRE-CM)按一定濃度，與根據(jù)檢測對象所需的適量緩沖液混合，作為BMCA的檢測試劑。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的生物分子通用高通量定量檢測方法，其特征在于，所述分子性質(zhì)不同為分子量的差異，或者所帶電荷的差異，或者光學性質(zhì)的差異或者分子物理尺寸的差異。6、根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物分子通用高通量定量檢測方法，其特征在于，所述步驟C中的分離檢測方法是能夠利用所述分子性質(zhì)差異對BRE-CM和TM-BRE-CM進行組分分離和定量測定的方法。7、根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物分子通用高通量定量檢測方法，其特征在于，所述步驟D具體包括下列步驟根據(jù)靶分子與其生物識別元件的結(jié)合比t所述檢測試劑中rBRE-CM的濃度C;BRE_CM，步驟B中加入所述檢測試劑的體積Kw和所述檢測標本的體積^，以及步驟C中測得的tBRE-CM的濃度與rBRE-CM濃度之比相對檢測試劑中tBRE-CM與rBRE-CM的濃度之比的降低值M，計算出每種耙分子的濃度:但是，下述情況除外當不等式I成立時，對應靶分子的濃度低于生物分子編碼分析的最低檢出限C^，不進行靶分子的濃度計算；所述不等式I為|M|《3XSI)"其中SZ^是M的變異系數(shù)。當tBRE-CM的濃度為零時，相應靶分子的含量超過生物分子編碼分析的檢測上限，認為靶分子的濃度滿足等式II，不進行靶分子的濃度計算；所述等式II為Qm》先x4xc,-cm其中，C,^^m是檢測試劑中相應tBRE-CM的濃度。8、根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物分子通用高通量定量檢測方法，其特征在于，所述分離檢測方法為電泳分析方法或者色譜分析方法。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物分子通用高通量定量檢測方法，其特征在于，所述生物分子為核酸或者蛋白質(zhì)或者細胞表面標志物。全文摘要本發(fā)明公開了一種生物分子高通量定量檢測方法，其使用分子編碼的方法實現(xiàn)了生物分子的高通量定量檢測，其能夠顯著提高生物學研究、臨床檢驗、食品衛(wèi)生檢驗、環(huán)境檢測和法醫(yī)學檢驗等領(lǐng)域相關(guān)應用的效率。文檔編號G06F19/00GK101101292SQ200710078469公開日2008年1月9日申請日期2007年5月11日優(yōu)先權(quán)日2007年5月11日發(fā)明者府偉靈,蔣天倫,鳴陳申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院