可用于檢測喉癌的標志物及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于確定受試者是否具有或?qū)l(fā)展喉癌的標志物，其包括：肌酸、1,3?二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3?氨基異丁酸、胞苷酸和腐胺中的一種或多種，診斷靈敏度可達93.33％，特異度為0％。
【專利說明】
可用于檢測喉癌的標志物及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種喉癌標志物，特別地，進一步具體涉及G01N33/68。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，由于環(huán)境等多種不同致癌因素的共同作用，喉癌的發(fā)病率呈逐漸上升的 趨勢。盡管以外科手術(shù)為主的綜合治療措施取得較大進展，但是喉癌患者綜合治療后的5年 生存率仍無明顯的提高。盡管如此，臨床大量數(shù)據(jù)表明，治療的早晚對患者預后產(chǎn)生重要的 影響。然而，喉癌因其發(fā)生部位比較隱蔽，早期往往無明顯癥狀，早期診斷困難，目前尚沒有 可靠的用于早期診斷的特異性指標，因此，臨床上亟待尋找喉癌及下咽癌相關(guān)的特異性腫 瘤標志物以輔助早期診斷。
[0003] 既往國外研究是將頭頸癌（除眼、腦、耳、甲狀腺和食道外頭頸部任何組織或器官 的腫瘤)作為一個整體進行研究，未對每種頭頸癌進行分類研究，研究指標缺乏特異性。國、 內(nèi)外大多研究未進行腫瘤病理分型，也未進行分級和分期，未對治療前后療效判斷的對比 研究，尚缺乏對預后判斷的指標。目前為止，國內(nèi)外對喉癌及下咽癌的代謝組學研究報道較 少，尚沒有可供用喉癌早期診斷、治療及預后監(jiān)測的特異性標志物應用于臨床。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述問題，本發(fā)明提供用于確定受試者是否具有或?qū)l(fā)展喉癌的標志物，其 包括:肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3-氨基異丁酸、胞苷酸和腐胺中的一種或多種。
[0005] 本發(fā)明的一方面提供用于確定受試者是否具有或?qū)l(fā)展喉癌的方法，所述方法包 括：
[0006] 在受試者的樣品中測定上述一種或多種標志物的水平；
[0007] 將受試者樣品中的一種或多種標志物的水平與對照樣品中的一種或多種標志物 的水平相比較，其中與對照樣品中的一種或多種標志物的水平相比，受試者樣品中的一種 或多種標志物的水平的差異指示所述受試者具有或?qū)l(fā)展喉癌。
[0008] 本發(fā)明的另一方面提供用于確定具有喉癌的受試者是否將對療法有反應的方法， 所述方法包括
[0009] 在受試者的樣品中測定上述一種或多種標志物的水平；
[0010] 將受試者樣品中的一種或多種標志物的水平與對照樣品中的一種或多種標志物 的水平相比較，其中與對照樣品中的一種或多種標志物的水平相比，受試者樣品中的一種 或多種標志物的水平的差異指示所述受試者將對所述療法有反應。
[0011] 本發(fā)明的另一方面提供用于確定受試者是否具有或?qū)⒑戆┑脑噭┖校鲈噭┖?包括用于在受試者樣品中上述一種或多種標志物的水平的試劑和確定受試者是否具有或 將發(fā)展喉癌的試劑盒使用說明書。
[0012] 本發(fā)明的另一方面提供用于確定具有喉癌的受試者是否將對治療有反應的試劑 盒，所述試劑盒包括用于在受試者樣品中上述一種或多種標志物的水平的試劑和確定受試 者是否將對所述治療有反應的試劑盒使用說明書。
[0013] 本發(fā)明的另一方面提供用于確定受試者是否具有或?qū)l(fā)展喉癌的方法，所述方法 包括：
[0014] 測定在受試者樣品中的所述肌酸的水平；
[0015] 將受試者樣品中的肌酸的水平與對照樣品中的肌酸的水平相比較，其中受試者樣 品中的肌酸的水平高于對照樣品中的肌酸的水平，指示所述受試者具有或?qū)l(fā)展喉癌。
[0016] 本發(fā)明的另一方面提供用于確定具有喉癌的受試者是否將對治療有反應的方法， 所述方法包括：
[0017] 測定在受試者樣品中的肌酸的水平；
[0018] 將受試者樣品中的肌酸的水平與對照樣品中肌酸的水平相比較，其中受試者樣品 中的肌酸的水平高于對照樣品中的肌酸的水平，指示所述受試者將對所述治療有反應。
[0019] 本發(fā)明的另一方面提供在具有喉癌的受試者中監(jiān)測治療的功效的方法，所述方法 包括：
[0020] 在給予受試者所述治療的至少一部分之前和之后，測定在受試者樣品中的肌酸的 水平;和
[0021] 將在給予所述治療之前來自受試者樣品中的肌酸的水平與在給予所述治療的至 少一部分之后來自受試者樣品中的肌酸的水平相比較，其中與在給予所述治療之前的樣品 中的肌酸的水平相比，在給予所述治療的至少一部分之后的樣品中的肌酸的水平降低表明 所述受試者對所述治療有反應，從而監(jiān)測所述治療的功效。
[0022] 作為一種實施方式，進一步包括測定在受試者樣品中上述的一種或多種另外的標 志物的水平。
[0023] 本發(fā)明的另一方面提供用于鑒定喉癌標志物的方法，所述方法包括：
[0024] 在穩(wěn)定狀態(tài)條件下，鑒定來自兩個或更多個物種的兩種或更多種的血液，從而產(chǎn) 生標志物的臨時列表；
[0025]在功能障礙條件下鑒定臨時列表中標志物，在正常條件下鑒定臨時列表中標志 物，
[0026] 測定試驗樣品和對照樣品的樣品中的標志物的水平，其中與試驗樣品中的水平相 比，對照樣品中標志物的水平的差異鑒定所述標志物為喉癌標志物；
[0027] 其中試驗樣品來自具有喉癌的受試者；
[0028]其中對照樣品來自具有正常的受試者。
[0029] 附圖簡述
[0030]圖1:實施例1，以肌酸為標志物時的R0C圖；
[0031]圖2:實施例10,以肌酸和腐胺為標志物時的R0C圖；
[0032]圖3:實施例20,以胸腺嘧啶和胞苷酸為標志物時的R0C圖；
[0033]圖4:實施例30,以肌酸、胸腺嘧啶和胞苷酸為標志物時的R0C圖；
[0034]圖5:實施例40,以3-氨基異丁酸、腐胺和胞苷酸為標志物時的R0C圖；
[0035]圖6:實施例53，以1，3-二氨基丙烷、3-氨基異丁酸、胸腺嘧啶和胞苷酸為標志物時 的R0C圖；
[0036]圖7:實施例62,以1，3_二氨基丙烷、3-氨基異丁酸、胸腺嘧啶、腐胺和胞苷酸為標 志物時的ROC圖；
【具體實施方式】
[0037] 本發(fā)明至少部分地基于與喉癌的發(fā)展相關(guān)的和具有喉癌的受試者對治療的反應 相關(guān)的標志物的發(fā)現(xiàn)。因此，本發(fā)明通過測量和鑒定特定的標志物或特定的標志物組合，提 供用于預測受試者是否具有或?qū)l(fā)展喉癌的方法和試劑盒，以及用于鑒定可減緩喉癌的進 展的化合物的方法，監(jiān)測某一療法在減低受試者的喉癌的進展中的功效的方法。
[0038] 因此，在一個方面，本發(fā)明提供用于確定受試者是否具有或?qū)l(fā)展喉癌的標志物： 肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3-氨基異丁酸、胞苷酸、腐胺。
[0039] 在另一方面，本發(fā)明提供用于抑制受試者的喉癌的發(fā)展的方法。所述方法包括給 予所述受試者有效量的試劑，所述試劑調(diào)節(jié)本發(fā)明的任何一種或多種標志物的表達和/或 活性，從而抑制受試者的喉癌的發(fā)展。
[0040] 在一個實施方案中，受試者樣品中的水平通過質(zhì)譜法測定。在一個實施方案中，所 述質(zhì)譜法是基質(zhì)輔助的激光解吸/飛行時間(MALDI/T0F)質(zhì)譜法、液相色譜四重離子捕獲電 噴射(LCQ-MS)或表面增強激光解吸電離/飛行時間（SELDI/T0F)質(zhì)譜法。
[0041] 在另一個實施方案中，受試者樣品中的水平通過免疫測定法測定。
[0042] 受試者的樣品可以是流體樣品或組織樣品。
[0043] 在一個實施方案中，所述標志物的水平是標志物的表達水平和/或活性。
[0044] 在一個實施方案中，所述受試者具有發(fā)展喉癌的風險。
[0045] 在一個方面，本發(fā)明提供用于確定受試者是否具有或?qū)l(fā)展喉癌的試劑盒，所述 試劑盒包括用于在受試者樣品中上述的一種或多種標志物的水平的試劑和確定受試者是 否具有或?qū)l(fā)展喉癌的試劑盒使用說明書。
[0046] 在另一方面，本發(fā)明提供用于確定具有喉癌的受試者是否將對治療有反應的試劑 盒，所述試劑盒包括用于在受試者樣品中測定上述中的一種或多種標志物的水平的試劑和 確定受試者是否將對所述治療有反應的試劑盒使用說明書。
[0047] 在又一方面，本發(fā)明提供在具有喉癌的受試者中監(jiān)測治療的功效的試劑盒。所述 試劑盒包括用于測定受試者樣品中的一種或多種標志物的水平的試劑，和監(jiān)測所述治療的 功效的試劑盒使用說明書。
[0048] 在一個實施方案中，所述試劑盒進一步包括用于從受試者獲得樣品的試劑。
[0049] 在一個實施方案中，所述試劑盒進一步包括對照樣品。
[0050] 在一個方面，本發(fā)明提供用于鑒定喉癌標志物的方法，所述方法包括：
[00511在穩(wěn)定狀態(tài)條件下，鑒定來自兩個或更多物種的兩種或更多種的血液，從而產(chǎn)生 標志物的臨時列表；
[0052]在功能障礙條件下鑒定臨時列表中標志物；
[0053]在正常條件下鑒定臨時列表中標志物；
[0054] 測定試驗樣品和對照樣品的樣品中的標志物的水平，其中與試驗樣品中的水平相 比，對照樣品中標志物的水平的差異鑒定所述標志物為喉癌標志物；
[0055] 其中試驗樣品來自具有喉癌的受試者；
[0056] 其中對照樣品來自健康人的受試者。
[0057] 本發(fā)明的各個方面更詳細地描述于以下節(jié)段中：
[0058] 定義
[0059] 如本文所用，以下術(shù)語的每一個具有與其在本部分中相關(guān)的含義。
[0060] 冠詞〃一個〃和〃一種〃在本文用于指該冠詞的一個或超過一個（即至少一個）的語 法對象。例如，"要素"意指一個要素或超過一個要素。
[0061] "標志物"或"生物標志物"是與另一種表型狀態(tài)(例如未患有疾病)相比，在取自一 種表型狀態(tài)(例如患有疾?。┑氖茉囌叩臉悠分胁顒e存在的有機生物分子。如果在不同組中 生物標志物的平均或中位水平、例如表達水平經(jīng)計算為統(tǒng)計學顯著的，則生物標志物在不 同的表型狀態(tài)中差別存在。統(tǒng)計學顯著性的常見檢驗特別包括t-檢驗）漏￥六、&1^1?11-Wallis、Wilcoxon、Mann_Whitney和優(yōu)勢比。單獨或組合的生物標志物提供受試者屬于一種 表型狀態(tài)或另一種表型狀態(tài)的相對風險的度量。因此，它們用作標志物，例如，用于疾病(預 后和診斷）、藥物的治療功效(治療診斷學)和藥物毒性的標志物。
[0062] 在一些實施方案中，用于本發(fā)明的組合物和方法的標志物的準確性可通過接收器 工作特征曲線（"R0C曲線"）來表征。R0C是對于診斷標志物的不同可能的割點的真陽性率相 對假陽性率的曲線。R0C曲線顯示靈敏性和特異性之間的關(guān)系。即是說，靈敏性的增加將伴 隨特異性的降低。曲線越靠近R0C空間的左軸，然后頂緣，標志物越準確。相反地，曲線越靠 近R0C圖的45度對角線，標志物越不準確。R0C下的面積是標志物準確性的度量。標志物的準 確性取決于標志物如何適當?shù)貙⒋郎y試的組分成具有所述疾病的組和不具有所述疾病的 組。曲線下面積(稱為"AUC"）為1表示完美的標志物，而面積為0.5表示有用性較差的標志 物。因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的生物標志物和方法的AUC大于約0.50、大于約0.60或 大于約0.70。
[0063] "喉癌"：主要分為原位癌、鱗狀細胞癌、疣狀癌、腺癌。
[0064] 原位癌的病變多發(fā)生在聲帶和室?guī)?，局部變化較輕，可見黏膜充血、水腫、增厚，有 時可出現(xiàn)角化、白斑。鏡下可見非典型細胞浸潤、分化不良的鱗狀細胞。
[0065] 鱗狀細胞癌:此類型喉癌表現(xiàn)為菜花型、浸潤型和潰瘍型。聲門下區(qū)癌多屬于浸潤 型，聲門區(qū)癌分化程度較高，聲門上區(qū)癌分化程度較低者多見。
[0066] 疣狀癌:疣狀癌是高分化鱗狀細胞癌的一種特殊類型，占喉惡性腫瘤的1 %~4%， 臨床表現(xiàn)呈局部侵襲性、真菌樣塊，不發(fā)生頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。組織學特點為高分化鱗癌，像粗 針狀、以推進方式侵襲到喉基質(zhì)內(nèi)。
[0067] 腺癌：腺癌包括腺樣囊性癌、黏液表皮樣癌等，多發(fā)生在聲門下或聲門上區(qū)。其中 囊腺癌多趨向于神經(jīng)周圍浸潤。
[0068]喉癌癥狀主要為聲嘶、呼吸困難、咳嗽、吞咽困難、頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。
[0069] 喉癌的分類分期:按照解剖位置分為3區(qū)：
[0070] 1.聲門上區(qū)：會厭喉面、會厭杓狀皺襞、杓狀軟骨、假聲帶及喉室，不包括會厭舌 面、會厭溪、梨狀窩等。
[0071] 2.聲帶區(qū)兩側(cè)聲帶及前聯(lián)合。
[0072] 3.聲門下區(qū)兩側(cè)聲門下，不包括聲帶下面，其下緣以環(huán)狀軟骨下緣為界。
[0073] "標志物的水平"或"生物標志物的水平"是指在待測試的樣品中存在的標志物的 量。標志物的水平可以是絕對水平或量(例如μg/ml)或相對水平或量(例如相對信號強度）。
[0074] 標志物的"更高水平"或"水平增加"是指大于用于評估標志物水平的測定法的標 準誤差的試驗樣品中的標志物水平，和優(yōu)選為對照樣品中標志物水平(例如來自具有健康 人的受試者、具有喉癌的受試者、在過去18個月內(nèi)已經(jīng)診斷為喉癌的受試者的樣品和/或幾 種對照樣品中標志物的平均水平)的至少1.5倍、和更優(yōu)選3、4、5、6、7、8、9或10或更多倍。
[0075] 標志物的"更低水平"或"水平降低"是指小于用于評估標志物水平的測定法的標 準誤差的試驗樣品中的標志物的水平，和優(yōu)選為對照樣品中標志物水平(例如來自具有健 康人的受試者、具有喉癌的受試者、在過去18個月內(nèi)已經(jīng)診斷為喉癌的受試者的樣品和/或 幾種對照樣品中標志物的平均水平）的至多1/2、和更優(yōu)選1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9 或1/10或更低。
[0076] 術(shù)語"已知的標準水平"或"對照水平"是指標志物的公認的或預定的水平，其用于 比較來自受試者的樣品中的標志物的水平。
[0077] 在一個實施方案中，標志物的對照水平基于來自健康人的受試者的樣品中的標志 物的水平。
[0078] 在另一個實施方案中，標志物的對照水平基于來自具有喉癌的一個或多個受試者 的樣品中的標志物的水平。
[0079]在另一個實施方案中，標志物的對照水平基于來自在過去18個月內(nèi)已經(jīng)診斷為喉 癌的受試者的樣品中的標志物的水平。
[0080] 在另一個實施方案中，來自受試者的樣品中的標志物的對照水平是之前在受試者 的樣品中已確定的標志物的水平。
[0081] 在又一個實施方案中，標志物的對照水平基于在給予對喉癌的療法之前來自受試 者的樣品中的標志物的水平。
[0082] 在另一個實施方案中，標志物的對照水平基于來自未與試驗化合物接觸的具有喉 癌的受試者的樣品中的標志物的水平。
[0083] 在另一個實施方案中，標志物的對照水平基于來自與試驗化合物接觸的健康人的 受試者的樣品中的標志物的水平。
[0084] 在其它實施方案中，標志物的"對照"水平可通過測定獲自在受試者中懷疑喉癌發(fā) 作之前的受試者樣品、獲自存檔的受試者樣品等的標志物的水平來確定。
[0085] 如本文所用的，術(shù)語〃患者〃或"受試者"是指人和非人動物，例如獸醫(yī)學患者。術(shù)語 "非人動物"包括所有脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，例如非人靈長類動物、小鼠、 兔、綿羊、狗、貓、馬、奶牛、雞、兩棲動物和爬行動物。在一個實施方案中，所述受試者是人。 [0086] 在一些實施方案中，受試者的體重指數(shù)(BMI)為小于約40kg/m2(例如約40、39、38、 37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或約181^/111 2)。在其它實 施方案中，受試者的體重指數(shù)(BMI)為大于約40kg/m2(例如約41、42、43、44、45、46、47、48、 49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79或約801^/111 2)。
[0087]本文所用的術(shù)語"樣品"是指自受試者分離的類似細胞或組織的收集物，以及在受 試者內(nèi)存在的組織、細胞和流體。術(shù)語"樣品"包括來自受試者的任何體液(例如血液、淋巴、 婦科流體、囊液、尿液、眼淚和通過支氣管灌洗和/或腹膜沖洗收集的流體)或細胞。在一個 實施方案中，從受試者取出所述組織或細胞。在另一實施方案中，所述或細胞存在于所述受 試者內(nèi)。其它受試者樣品包括淚滴、血清、腦脊液、糞便、痰和細胞提取物。在一個實施方案 中，生物學樣品包含來自測試受試者的蛋白分子。在另一實施方案中，生物學樣品可包含來 自測試受試者的mRNA分子或來自測試受試者的基因組DNA分子。
[0088]術(shù)語〃測定〃意指包括檢測樣品中標志物的存在或不存在、定量測定樣品中標志物 的量、和/或確定生物標志物的類型的方法。測量可通過本領(lǐng)域已知的方法和本文進一步描 述的那些方法實現(xiàn)。
[0089]試劑盒是包含特異性檢測本發(fā)明的標志物的至少一種試劑例如探針、引物或抗體 的任何制品（例如包裝或容器），所述制品作為用于進行本發(fā)明的方法的一個單位來推銷、 分配或銷售。在某些實施方案中，試劑盒可包括基質(zhì)，例如包含本發(fā)明的一種或多種標志物 的捕獲試劑和/或與本發(fā)明的一種或多種標志物結(jié)合的捕獲試劑的基質(zhì)。在一些實施方案 中，這樣的試劑盒包含用于使用質(zhì)譜測定標志物的水平的使用說明書。
[0090] 本發(fā)明的標志物
[0091] 本發(fā)明的一個方面，提供一種用于確定受試者是否具有或?qū)l(fā)展喉癌的標志物， 其包括:肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3-氨基異丁酸、胞苷酸和腐胺中的一種或多種。
[0092] 肌酸:是一種自然存在于脊椎動物體內(nèi)的一種含氮的有機酸，能夠輔助為肌肉和 神經(jīng)細胞提供能量。
[0093] 1，3-二氛基丙烷:C3H10N2。
[0094]胸腺嘧啶：C5H6N202。
[0095] 3-氨基異丁酸:C4H9N02，
[0096] 胞苷酸：
[0097]腐胺:C4H12N2，腐胺在上皮細胞迀移、增殖和分化過程中發(fā)揮著重要的作用。
[0098]在本發(fā)明的某些方面，單個標志物可用于本發(fā)明的方法和組合物。例如，在一個實 施方案中，用于本發(fā)明的方法和組合物的標志物是肌酸。在一個實施方案中，標志物是1，3_ 二氨基丙烷。在一個實施方案中，標志物是胸腺嘧啶。在一個實施方案中，標志物是3-氨基 異丁酸。在一個實施方案中，標志物是胞苷酸。在一個實施方案中，標志物是腐胺。
[0099] 在本發(fā)明的其它方面，超過一種標志物，例如多種標志物，例如2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11或更多種標志物，可用于本發(fā)明的方法和組合物。例如，在一個實施方案中，用于本發(fā) 明的方法和組合物的標志物包括肌酸和1，3_二氨基丙烷。在一個實施方案中，標志物包括 肌酸和胸腺啼啶。在一個實施方案中，標志物包括肌酸和3-氨基異丁酸。在一個實施方案 中，標志物包括肌酸和胞苷酸。在一個實施方案中，標志物包括肌酸和腐胺。在一個實施方 案中，標志物包括1，3_二氨基丙烷和胸腺嘧啶。在一個實施方案中，標志物包括1，3_二氨基 丙烷和3-氨基異丁酸。在一個實施方案中，標志物包括1，3_二氨基丙烷和胞苷酸。在一個實 施方案中，標志物包括1，3_二氨基丙烷和腐胺。在一個實施方案中，標志物包括胸腺嘧啶和 3_氨基異丁酸。在一個實施方案中，標志物包括胸腺嘧啶和胞苷酸。在一個實施方案中，標 志物包括胸腺嘧啶和腐胺。在一個實施方案中，標志物包括3-氨基異丁酸和胞苷酸。在一個 實施方案中，標志物包括3-氨基異丁酸和腐胺。在一個實施方案中，標志物包括胞苷酸和腐 胺。
[0100]在一個實施方案中，標志物包括肌酸、1，3-二氨基丙烷和胸腺嘧啶。在一個實施方 案中，標志物包括肌酸、1，3-二氨基丙烷和3-氨基異丁酸。在一個實施方案中，標志物包括 肌酸、1，3-二氨基丙烷和胞苷酸。在一個實施方案中，標志物包括肌酸、1，3-二氨基丙烷和 腐胺。在一個實施方案中，標志物包括肌酸、胸腺嘧啶和3-氨基異丁酸。在一個實施方案中， 標志物包括肌酸、胸腺嘧啶和胞苷酸。在一個實施方案中，標志物包括肌酸、胸腺嘧啶和腐 胺。在一個實施方案中，標志物包括肌酸、3-氨基異丁酸和胞苷酸。在一個實施方案中，標志 物包括肌酸、3-氨基異丁酸和腐胺。在一個實施方案中，標志物包括肌酸、胞苷酸和腐胺。在 一個實施方案中，標志物包括1,3-二氨基丙烷、胸腺啼啶和3-氨基異丁酸。在一個實施方案 中，標志物包括1，3-二氨基丙烷、胸腺嘧啶和胞苷酸。在一個實施方案中，標志物包括1，3-二氨基丙烷、胸腺嘧啶和腐胺。
[0101] 在一個實施方案中，標志物包括肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶和3-氨基異丁 酸。在一個實施方案中，標志物包括肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶和胞苷酸。在一個實施 方案中，標志物包括肌酸、1，3-二氨基丙烷、胸腺嘧啶和腐胺。在一個實施方案中，標志物包 括肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3-氨基異丁酸和腐胺。在一個實施方案中，標志物包括 肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3-氨基異丁酸、胞苷酸和腐胺。
[0102] 本發(fā)明的一個方面提供獲取所述標志物的方法，其具體步驟在于：
[0103] 1、獲取受試者樣品，并進行前處理；
[0104] 2、將前處理過的受試者樣品進行GC-MS或者LC-MS進行檢測，收集數(shù)據(jù)；
[0105] 3、進行數(shù)據(jù)分析，獲取可行的標志物。
[0106] 上述步驟中，所述受試者樣品可以是固體、液體，也可以是細胞、微生物等。
[0107] 作為一種實施方式，當所述受試者樣品為固體時，所述具體前處理的方法為：將 100mg固體溶于400yL提取試劑，加入鋼珠進行研磨，所述研磨的條件為30Hz，5分鐘;然后進 行離心，取上清。
[0108] 若要進行GC-MS測試，可進行濃縮干燥。所述濃縮干燥的步驟為將上清中加入 20mg/ml的甲氧胺，在80 °C下干燥20min，然后加入試劑BSTFA下進行衍生化處理1小時后，進 行測試。
[0109] 若要進行LC-MS測試，則只需將上清液進行濃縮干燥，加入100yL乙腈進行復溶，經(jīng) 過濾塞，可直接進行LC-MS測試。
[0110] 作為一種實施方式，所述受試者樣品為液體時，例如血清、尿液等。所述具體前處 理的方法為：100yL液體加入350yL甲醇中，進行斡旋混勻，高速離心，取上清液，進行測試。
[0111] 若要進行GC-MS測試，可進行濃縮干燥。所述濃縮干燥的步驟為將上清中加入 20mg/ml的甲氧胺，在80 °C下干燥20min，然后加入試劑BSTFA下進行衍生化處理1小時后，進 行測試。
[0112] 若要進行LC-MS測試，則只需將上清液進行濃縮干燥，加入100yL乙腈進行復溶，經(jīng) 過濾塞，可直接進行LC-MS測試。
[0113]作為一種實施方式，所述受試者樣品為微生物時，所述處理方式與細胞的處理方 式一樣。
[0114] 本發(fā)明的方法
[0115] 在某些方面，本發(fā)明提供診斷方法。例如，在一個方面，本發(fā)明提供用于確定受試 者是否具有喉癌的方法。所述方法包括測定在受試者樣品中的本發(fā)明的一種或多種標志物 的水平與在對照樣品中的所述一種或多種標志物的水平。與對照樣品中一種或多種標志物 的水平相比，受試者樣品中的一種或多種標志物的水平差異(例如更高或更低)指示所述受 試者具有喉癌。
[0116] 在另一方面，本發(fā)明提供用于確定受試者是否具有喉癌的方法。所述方法包括測 定在受試者樣品中的本發(fā)明的一種或多種標志物的水平與在對照樣品中的所述一種或多 種標志物的水平。與對照樣品中的一種或多種標志物的水平相比，受試者樣品中的一種或 多種標志物的水平差異(例如更高或更低)指示所述受試者具有喉癌。
[0117] 本發(fā)明還提供預后方法。例如，在一個方面，本發(fā)明提供用于確定受試者是否將發(fā) 展喉癌的方法。所述方法包括測定在受試者樣品中的本發(fā)明的一種或多種標志物的水平與 在對照樣品中的所述一種或多種標志物的水平。與對照樣品中的一種或多種標志物的水平 相比，受試者樣品中的一種或多種標志物的水平差異(例如更高或更低)指示所述受試者將 發(fā)展喉癌。
[0118] 在另一方面，本發(fā)明提供用于確定受試者是否將發(fā)展喉癌的方法。所述方法包括 測定在受試者樣品中的本發(fā)明的一種或多種標志物的水平與在對照樣品中的所述一種或 多種標志物的水平。與對照樣品中一種或多種標志物的水平相比，受試者樣品中的一種或 多種標志物的水平差異(例如更高或更低)指示所述受試者將發(fā)展喉癌。
[0119] 在另一方面，本發(fā)明提供用于確定具有喉癌的受試者是否將對治療方案有反應的 方法。所述方法包括測定在受試者樣品中的本發(fā)明的一種或多種標志物的水平與在對照樣 品中的所述一種或多種標志物的水平。與對照樣品中的一種或多種標志物的水平相比，受 試者樣品中的一種或多種標志物的水平差異(例如更高或更低)指示所述受試者將對治療 有反應。
[0120] 本領(lǐng)域已知多種喉癌療法，包括例如:氟尿嘧啶注射液、妥立士寧、迪歐平(鹽酸托 烷司瓊膠囊）、尼泰美(鹽酸托烷司瓊膠囊）、班寧(注射用去甲斑蝥酸鈉）、順鉑注射液、注射 用鹽酸博來霉素、塞替派。
[0121 ]在本發(fā)明的某些實施方案中，所述治療包括氟尿嘧啶注射液。在另一實施方案中， 所述治療包括尼泰美(鹽酸托烷司瓊膠囊）。在又一個實施方案中，所述治療包括注射用鹽 酸博來霉素。
[0122] 在本發(fā)明的任何方法(和試劑盒）中，獲自受試者的樣品中本發(fā)明的標志物的水平 可通過各種眾所周知的技術(shù)和方法中的任一種來測定，其將樣品中的本發(fā)明的標志物轉(zhuǎn)化 成可檢測和定量的部分。這樣的方法的非限制性實例包括使用用于檢測蛋白質(zhì)的免疫學方 法、蛋白質(zhì)純化方法、蛋白質(zhì)功能或活性測定法、核酸雜交方法、核酸逆轉(zhuǎn)錄方法和核酸擴 增方法、免疫印跡法、蛋白質(zhì)印跡法、RNA印跡法、電子顯微術(shù)、質(zhì)譜法（例如MALDI -T0F和 SELDI-T0F)、免疫沉淀、免疫熒光、免疫組織化學、酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)(例如擴增 ELISA)、基于血液的定量測定法（例如血清ELISA)、基于尿液的定量測定法、流式細胞術(shù)、 DNA雜交、陣列分析等和其組合或亞組合分析樣品。
[0123] 普通技術(shù)人員將容易理解的是，本領(lǐng)域已建立用于在核酸或蛋白水平上檢測本發(fā) 明的標志物的水平的任何技術(shù)手段基本上都可用于測定本文所述的本發(fā)明的標志物的水 平。
[0124] 在一個實施方案中，本發(fā)明的標志物的水平使用核酸探針來測定。本文所用的術(shù) 語"探針"是指能夠選擇性結(jié)合本發(fā)明的特定標志物的任何分子。探針可由本領(lǐng)域技術(shù)人員 合成，或來源于合適的生物制備物。探針可經(jīng)特別設計為標記的?？捎米魈结樀姆肿拥膶嵗?包括但不限于RNA、DNA、蛋白質(zhì)、抗體和有機分子。
[0125] 在本發(fā)明的一個實施方案中，使用微陣列來檢測本發(fā)明的標志物的水平。因為不 同實驗之間的可再現(xiàn)性，微陣列特別地非常適合用于此目的。DNA微陣列提供一種用于同時 測量大量基因的水平的方法。各陣列由附著至固體支持物的可重現(xiàn)形式的捕獲探針組成。 標記的RNA或DNA與陣列上的互補探針雜交，然后通過激光掃描檢測。陣列上的各探針的雜 交強度經(jīng)測定并轉(zhuǎn)化成表示相對基因表達水平的定量值。
[0126] 用于在蛋白水平上檢測本發(fā)明的標志物的其它已知方法包括以下方法，例如電 泳、毛細管電泳、高效液相色譜、薄層色譜、超擴散色譜等，或各種免疫學方法例如流體或凝 膠沉淀反應、免疫擴散、免疫電泳、放射免疫測定法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、免疫熒光測定法 和蛋白質(zhì)印跡法。
[0127] 在本發(fā)明的一個實施方案中，使用蛋白質(zhì)組方法，例如質(zhì)譜法。質(zhì)譜法是一種分析 技術(shù)，包括將化合物電離以產(chǎn)生帶電分子(或其片段)和測量其質(zhì)量-電荷比。在典型的質(zhì)譜 程序中，自受試者獲得樣品，加載到質(zhì)譜上，和其組分(例如本發(fā)明的標志物)通過不同的方 法電離(例如通過用電子束轟擊它們），導致形成帶電顆粒(離子）。然后當離子穿越電磁場 時，根據(jù)離子的運動計算顆粒的質(zhì)量-電荷比。
[0128] 例如，基質(zhì)輔助的激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法或表面增強激光解吸/電離飛行 時間質(zhì)譜法，其包括應用生物樣品例如血清至蛋白結(jié)合芯片可用于測定本發(fā)明的標志物的 水平。
[0129] 此外，用于測定本發(fā)明標志物的水平的體內(nèi)技術(shù)包括將針對本發(fā)明標志物的標記 抗體引入到受試者中，所述抗體結(jié)合本發(fā)明的標志物并將其轉(zhuǎn)化成可檢測的分子。如上所 述，在受試者中本發(fā)明的可檢測標志物的存在、水平或甚至位置可通過標準成像技術(shù)檢測 而測定。
[0130]總的來說，優(yōu)選受試者樣品中的本發(fā)明標志物的水平與對照樣品中的本發(fā)明標志 物的量之間的差異盡可能的大。盡管該差異可能與用于測定標志物水平的方法的檢測限度 一樣小，但優(yōu)選所述差異至少大于評估方法的標準誤差，優(yōu)選差異為評估方法的標準誤差 的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、100、500、1000倍或更大。
[0131] 用于監(jiān)測治療功效的方法
[0132] 本發(fā)明還提供用于監(jiān)測可用于在受試者中抑制喉癌的發(fā)展;降低或減慢健康人至 喉癌的進展;和/或降低或抑制與所述疾病相關(guān)的并發(fā)癥的發(fā)展的療法或治療方案或任何 其它治療方法的功效的方法。在這些方法中，評估在一對樣品（不經(jīng)過治療方案的第一樣品 和經(jīng)過治療方案的至少一部分的第二樣品）中的本發(fā)明的一種或多種標志物的水平。相對 于第二樣品，第一樣品中一種或多種標志物的表達水平的調(diào)節(jié)表明所述療法有效在受試者 中抑制喉癌的發(fā)展;降低或減慢健康人至喉癌的進展;和/或降低或抑制與所述疾病相關(guān)的 并發(fā)癥的發(fā)展。
[0133] 鑒定喉癌生物標志物的方法
[0134] 本發(fā)明進一步提供用于鑒定喉癌生物標志物的方法，所述生物標志物用作例如疾 病(預后和診斷）、藥物的治療功效(治療診斷）和藥物毒性的標志物。例如，如上所述，本文 所述的標志物和使用生物標志物發(fā)現(xiàn)的方法鑒定的標志物可用于例如確定受試者是否具 有或?qū)l(fā)展喉癌;確定具有喉癌的受試者是否將對喉癌療法有反應;監(jiān)測用于在受試者中 抑制喉癌的發(fā)展、降低或減慢健康人至喉癌的進展和/或降低或抑制與所述疾病相關(guān)的并 發(fā)癥的發(fā)展的療法的功效;鑒定調(diào)節(jié)(例如降低或增加)用作例如療法的本發(fā)明的標志物的 表達和/或活性的分子的篩選測定法中。
[0135] 喉癌標志物還可通過以下來鑒定:測定提供至少一部分療法給受試者之前獲自具 有喉癌的受試者的第一樣品中的蛋白水平，和測定提供所述療法的至少一部分后獲自所述 受試者的第二樣品中的蛋白水平。相對于第一樣品，第二樣品中蛋白表達水平的差異，例如 統(tǒng)計學顯著水平，鑒定所述蛋白為喉癌標志物。
[0136] 本發(fā)明的試劑盒
[0137] 本發(fā)明還提供用于確定受試者是否具有或?qū)l(fā)展喉癌的試劑盒。還提供確定療法 是否將有效治療具有喉癌的受試者的試劑盒和用于監(jiān)測療法的功效的試劑盒。
[0138] 這些試劑盒包括測定本發(fā)明的一種或多種標志物的水平的工具和試劑盒使用說 明書。
[0139] 本發(fā)明的試劑盒可任選包含用于進行本發(fā)明方法的另外組分。例如，試劑盒可包 含用于從受試者獲得生物樣品的試劑、對照樣品、一個或多個樣品區(qū)室、喉癌治療劑、描述 進行本發(fā)明方法的指導材料和組織特異性對照/標準品。
[0140] 用于測定一種或多種標志物的水平的試劑可包括例如緩沖液或用于評價一種或 多種標志物的水平的測定法的其它試劑。說明書可以是例如用于進行評價本發(fā)明的一種或 多種標志物的水平的測定法的印刷的說明書。
[0141] 用于自受試者分離生物樣品的試劑可包括可用于從受試者獲得流體或組織的一 種或多種試劑，例如用于獲得唾液或血液的工具。
[0142] 本發(fā)明的試劑盒可進一步包括用于培養(yǎng)獲自受試者的樣品的試劑。
[0143]優(yōu)選，試劑盒經(jīng)設計用于人類受試者。
[0144] 本發(fā)明通過以下實施例作進一步說明，實施例不應解釋為進一步限制。本申請全 文所引用的所有參考文獻、專利和公開的專利申請的內(nèi)容，以及附圖，明確地通過引用以其 整體結(jié)合到本文中。
[0145] 等效物
[0146] 在描述實例性實施方案中，為澄清的原因使用特定的術(shù)語。為描述的目的，各特定 的術(shù)語意指至少包括所有技術(shù)和功能等效物，其以類似的方式操作來實現(xiàn)類似的目的。此 外，在其中具體的實例性實施方案包括多個系統(tǒng)要素或方法步驟的一些實例中，那些要素 或步驟可替換為單一要素或步驟。同樣，單一要素或步驟可替換為用于相同目的的多個要 素或步驟。此外，在本文指定實例性實施方案的各種性質(zhì)的參數(shù)的情況下，那些參數(shù)可向上 或向下調(diào)整1/20、1/10、1/5、1/3等，或通過其四舍五入近似值調(diào)整，除非另有說明。此外，盡 管實例性實施方案已經(jīng)參考其具體的實施方案進行顯示和描述，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將 理解，在不背離本發(fā)明的范圍的情況下，可對其進行形式和細節(jié)上的各種替換和改變。還另 外，其它方面、功能和優(yōu)點也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0147]本文提供了實例性的流程圖用于說明的目的，并且是非限制性的方法實例。本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員將認識到，實例性的方法可包括比實例性流程圖中說明的那些更多或更少 的步驟，并且實例性流程圖中的步驟可以與所示不同的順序進行。
[0148] 分組:分為正常組、喉癌組、癌旁組織組。
[0149] 選取950個受試者，其中正常健康人320人;喉癌病300人;癌旁組織330人。
[0150] 一、獲取標志物
[0151] 步驟：1、獲取受試者血清，并進行前處理：100yL液體加入350yL甲醇中，進行斡旋 混勻，高速離心，取上清液，進行濃縮干燥，加入lOOyL乙腈進行復溶，經(jīng)過濾塞，可直接進行 GC-MS測試;收集GC-MS數(shù)據(jù)，進行多元變量統(tǒng)計分析。
[0152] 采用GC-MS定量驗證后發(fā)現(xiàn)正常組、喉癌組、癌旁組織組，與正常人組相比，特異有 差異的表達物質(zhì)有:肌酸、1，3_二氨基丙烷、胸腺嘧啶、3-氨基異丁酸、胞苷酸和腐胺。
[0153] 標注物編號:編號1是肌酸;編號2是1，3-二氨基丙烷;編號3是3-氨基異丁酸;編號 4是胸腺啼啶;編號5是腐胺;編號6是胞苷酸。
[0154] 實施例如表1所示：
[0155] 表1【具體實施方式】


[0159] 其中，編號"2-3"代表以編號為2的標志物和編號為3的標志物組合聯(lián)合診斷喉癌 組、癌旁組織組和正常人組，也就是以1，3-二氨基丙烷和3-氨基異丁酸為標志物組合聯(lián)合 診斷。其余編號以此類推。
[0160] 以上數(shù)據(jù)可以看出，標志物組合使用時，診斷靈敏度為93.33%，特異度為0%。本 發(fā)明所選擇的標志物具有很強的使用前景，因此提供了本發(fā)明的有益技術(shù)效果。
[0161] 前述的實例僅是說明性的，用于解釋本公開的特征的一些特征。所附的權(quán)利要求 旨在要求可以設想的盡可能廣的范圍，且本文所呈現(xiàn)的實施例僅是根據(jù)所有可能的實施例 的組合的選擇的實施方式的說明。因此，
【申請人】的用意是所附的權(quán)利要求不被說明本發(fā)明 的特征的示例的選擇限制。而且在科技上的進步將形成由于語言表達的不準確的原因而未 被目前考慮的可能的等同物或子替換，且這些變化也應在可能的情況下被解釋為被所附的 權(quán)利要求覆蓋。
【主權(quán)項】
1. 用于確定受試者是否具有或?qū)l(fā)展喉癌的標志物，其包括:肌酸、1，3-二氨基丙烷、 胸腺嘧啶、3-氨基異丁酸、胞苷酸和腐胺中的一種或多種。2. 用于確定受試者是否具有或?qū)l(fā)展喉癌的方法，所述方法包括： 在受試者的樣品中測定權(quán)利要求1中一種或多種標志物的水平； 將受試者樣品中的一種或多種標志物的水平與對照樣品中的一種或多種標志物的水 平相比較，其中與對照樣品中的一種或多種標志物的水平相比，受試者樣品中的一種或多 種標志物的水平的差異指示所述受試者具有或?qū)l(fā)展喉癌。3. 用于確定具有喉癌的受試者是否將對療法有反應的方法，所述方法包括 在受試者的樣品中測定權(quán)利要求1中一種或多種標志物的水平； 將受試者樣品中的一種或多種標志物的水平與對照樣品中的一種或多種標志物的水 平相比較，其中與對照樣品中的一種或多種標志物的水平相比，受試者樣品中的一種或多 種標志物的水平的差異指示所述受試者將對所述療法有反應。4. 用于確定受試者是否具有或?qū)⒑戆┑脑噭┖?，所述試劑盒包括用于在受試者樣品?權(quán)利要求1中的一種或多種標志物的水平的試劑和確定受試者是否具有或?qū)l(fā)展喉癌的試 劑盒使用說明書。5. 用于確定具有喉癌的受試者是否將對治療有反應的試劑盒，所述試劑盒包括用于在 受試者樣品中測定權(quán)利要求1中的一種或多種標志物的水平的試劑和確定受試者是否將對 所述治療有反應的試劑盒使用說明書。6. 用于確定受試者是否具有或?qū)l(fā)展喉癌的方法，所述方法包括 測定在受試者樣品中的所述肌酸的水平； 將受試者樣品中的肌酸的水平與對照樣品中的肌酸的水平相比較，其中受試者樣品中 的肌酸的水平高于對照樣品中的肌酸的水平，指示所述受試者具有或?qū)l(fā)展喉癌。7. 用于確定具有喉癌的受試者是否將對治療有反應的方法，所述方法包括 測定在受試者樣品中的肌酸的水平； 將受試者樣品中的肌酸的水平與對照樣品中肌酸的水平相比較，其中受試者樣品中的 肌酸的水平高于對照樣品中的肌酸的水平，指示所述受試者將對所述治療有反應。8. 在具有喉癌的受試者中監(jiān)測治療的功效的方法，所述方法包括： 在給予受試者所述治療的至少一部分之前和之后，測定在受試者樣品中的肌酸的水 平;和 將在給予所述治療之前來自受試者樣品中的肌酸的水平與在給予所述治療的至少一 部分之后來自受試者樣品中的肌酸的水平相比較，其中與在給予所述治療之前的樣品中的 肌酸的水平相比，在給予所述治療的至少一部分之后的樣品中的肌酸的水平降低表明所述 受試者對所述治療有反應，從而監(jiān)測所述治療的功效。9. 權(quán)利要求6-8中任一項的方法，進一步包括測定在受試者樣品中的權(quán)利要求1中的一 種或多種另外的標志物的水平。10. 用于鑒定喉癌標志物的方法，所述方法包括 在穩(wěn)定狀態(tài)條件下，鑒定來自兩個或更多個物種的兩種或更多種的血液，從而產(chǎn)生標 志物的臨時列表； 在功能障礙條件下鑒定臨時列表中標志物，在正常條件下鑒定臨時列表中標志物， 測定試驗樣品和對照樣品的樣品中的標志物的水平，其中與試驗樣品中的水平相比， 對照樣品中標志物的水平的差異鑒定所述標志物為喉癌標志物； 其中試驗樣品來自具有喉癌的受試者； 其中對照樣品來自具有正常的受試者。
【文檔編號】G01N33/574GK106093241SQ201610403136
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月8日
【發(fā)明人】樓格爾, 鄧軍亮, 吳洪強
【申請人】上海阿趣生物科技有限公司