心外膜脂肪組織的生物標(biāo)志物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于預(yù)測(cè)受試對(duì)象心外膜脂肪組織(EAT)水平的方法，包括：(a)測(cè)定取自所述受試對(duì)象的樣品中的一種或多種脂質(zhì)生物標(biāo)志物的水平，其中所述生物標(biāo)志物選自以下物質(zhì)：(i)磷脂酰膽堿(PC)[16:1/16:1]，(ii)甘油二酯(DAG)[42:8]，(iii)磷脂酰乙醇胺?醚(PE?O)[32:5]，(iv)磷脂酰膽堿(PC)[18:0/22:5]，(v)磷脂酰肌醇(PI)[18:0/16:1]，(vi)磷脂酰甘油(PG)[20:3/20:3]，(vii)磷脂酰甘油(PG)[22:5/18:1]；(b)將所述樣品中的所述生物標(biāo)志物的水平與參考值比較；其中所述樣品中的所述生物標(biāo)志物的水平與所述參考值相比，指示了所述受試對(duì)象中EAT脂肪的水平。
【專利說(shuō)明】
心外膜脂肪組織的生物標(biāo)志物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明提供了可用于預(yù)測(cè)受試對(duì)象心外膜脂肪組織水平的多種脂質(zhì)生物標(biāo)志物 和生物標(biāo)志物的組合。
【背景技術(shù)】
[0002] 內(nèi)臟脂肪組織是預(yù)示心臟代謝性疾病的重要結(jié)構(gòu)，相比一般脂肪堆積，引起的風(fēng) 險(xiǎn)更尚。
[0003] 有損代謝和危及生命程度的肥胖與脂肪堆積于內(nèi)臟脂肪組織和器官的異位脂肪 沉積相關(guān)聯(lián)(Graner et al · (2013)，98:1189-1197(Graner等人，2013年，第98卷，第1189-1197頁(yè)）；Donahue and Abbott，（1987)，Lancet 2:1215(Donahue和Abbott，1987年，《柳葉 刀》第2卷，第 1215頁(yè)）；Kalkhoff et al.(1983)，J Lab Clin Med 102:621-627(Kalkhoff 等人，1983年，《實(shí)驗(yàn)室與臨床醫(yī)學(xué)雜志》第102卷，第621-627頁(yè)））。具體地講，內(nèi)臟脂肪含量 (VA)越高，發(fā)展動(dòng)脈粥樣硬化心血管疾病的可能性越高，這類疾病是由與內(nèi)分泌和免疫系 統(tǒng)相互影響的復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)代謝功能介導(dǎo)的（Batra and Siegmund，（2012)，Dig Dis 30: 70-74(Batra和Siegmund，2012年，《消化性疾病》第30卷，第70-74頁(yè)）；Fox et al. (2007)， Circulation 116:39-48(Fox等人，2007年，《循環(huán)》第 116卷，第39-48頁(yè)））。
[0004] 內(nèi)臟脂肪包括外形復(fù)雜的脂肪沉積，即腸系膜和心外膜脂肪組織，以及圍繞其他 器官的外圍脂肪庫(kù)（Dulloo et al.(2010)，Int J 0bes(Lond)34 Suppl 2:Sl_S3(Dulloo 等人，2010年，倫敦《國(guó)際肥胖期刊》第34卷，增刊第2期，第S1-S3頁(yè)））。這些內(nèi)臟組織明顯不 同的代謝差異以特殊的方式造就疾病病因。
[0005] 心外膜脂肪組織(EAT)是沉積在心臟周圍的特殊形式的內(nèi)臟脂肪。EAT出現(xiàn)在心臟 的表面，位于心肌和心外膜之間，并覆蓋了心臟表面的一大部分。
[0006] EAT數(shù)量增加與冠狀動(dòng)脈疾病事件和主要的心臟不良事件相關(guān)聯(lián)(Mahabadi et al.，2013，J Am Coll Cardiol.2013Apr 2;61(13):1388-95(Mahabadi等人，《美國(guó)心臟病 學(xué)會(huì)雜志》，2013年4月2日，第61卷第13期，第1388-1395頁(yè)））。具體地講，心外膜脂肪組織與 動(dòng)脈粥樣硬化、代謝綜合征、空腹血糖受損、胰島素抵抗、高血壓和糖尿病密切相關(guān)。
[0007] 事實(shí)上，在健康方面，公眾越來(lái)越關(guān)注兒童成長(zhǎng)和兒童肥胖，其中EAT被認(rèn)為是預(yù) 測(cè)代謝是否健康的重要指標(biāo)。
[0008] 也有研究證實(shí)，銀肩病患者與對(duì)照組相比，心外膜脂肪水平更高（Balci et al. (2013)，0ct 25，CED,12216)。
[0009] 心外膜脂肪組織可由多種成像技術(shù)測(cè)量，包括超聲波心動(dòng)描記術(shù)、計(jì)算機(jī)斷層掃 描術(shù)(CT)和磁共振成像術(shù)(MRI)。然而，這些方法可能耗時(shí)較長(zhǎng)、價(jià)格昂貴，因而不適宜常規(guī) 使用。
[0010]最近的應(yīng)用已證明，將特定代謝物譜與體脂分布建立關(guān)聯(lián)是可行的（Szymanska et al· (2012)0MICS 16:652-667(Szymanska等人，2012年，0MICS第 16卷，第652-667頁(yè)）； Yamakado et al.(2012),Clinical Obesity 2:29_40(Yamakado等人，2012年，《臨床肥胖 癥》第2卷，第29-40頁(yè)）），其中代謝物包括氨基酸和各種脂質(zhì)種類(甘油三酯、甘油二酯、溶 血磷脂、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺）。但與心外膜脂肪相關(guān)的標(biāo)志物尚未鑒別出來(lái)。
[0011] 因此，本發(fā)明的目的是提供既容易檢測(cè)、又便于預(yù)測(cè)EAT的脂質(zhì)生物標(biāo)志物。利用 此類脂質(zhì)生物標(biāo)志物可識(shí)別需要降低EAT水平的受試對(duì)象，據(jù)此改變這類受試對(duì)象的生活 方式，從而促進(jìn)其以健康的方式生活。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明研究了特定內(nèi)臟脂肪庫(kù)中的血漿脂質(zhì)組，及其內(nèi)部容納的信息。鳥槍脂質(zhì) 組學(xué)方法已被用于量化血漿脂質(zhì)的分布，并評(píng)估與特定體脂沉積相關(guān)的復(fù)合代謝特征，尤 其注重心外膜脂肪組織(EAT)。
[0013] 因此，本發(fā)明一方面提供了一種用于預(yù)測(cè)受試對(duì)象中EAT水平的方法，包括：
[0014] (a)測(cè)定取自受試對(duì)象的樣品中的一種或多種脂質(zhì)生物標(biāo)志物的水平，其中所述 生物標(biāo)志物選自以下物質(zhì)：
[0015] ⑴磷脂酰膽堿(PC)[16:1/16:1]
[0016] (ii)甘油二酯(DAG)[42:8]
[0017] (iii)磷脂酰乙醇胺-醚(PE-0)[32:5]
[0018] (iv)磷脂酰膽堿(PC) [ 18:0/22:5]
[0019] (v)磷脂酰肌醇(PI)[18:0/16:1]
[0020] (vi)磷脂酰甘油(PG) [20:3/20:3]
[0021] (vii)磷脂酰甘油(PG) [22:5/18:1]
[0022] (b)將樣品中的生物標(biāo)志物水平與參考值比較；
[0023] 其中樣品中的生物標(biāo)志物水平與參考值相比，指示了受試對(duì)象中EAT的水平。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種用于預(yù)測(cè)受試對(duì)象心外膜脂肪組織(EAT)水平的方法， 包括：
[0025] (a)使用檢測(cè)裝置測(cè)定取自受試對(duì)象的樣品中的一種或多種脂質(zhì)生物標(biāo)志物的水 平，其中所述生物標(biāo)志物選自以下物質(zhì)：
[0026] (i)磷脂酰膽堿(PC) [ 16:1/16:1 ]
[0027] (ii)甘油二酯（DAG)[42:8]
[0028] (iii)磷脂酰乙醇胺-醚(PE-0)[32:5]
[0029] (iv)磷脂酰膽堿(PC) [ 18:0/22:5]
[0030] (v)磷脂酰肌醇(PI)[18:0/16:1]
[0031 ] (vi)磷脂酰甘油（PG) [20:3/20:3]
[0032] (vii)磷脂酰甘油(PG)[22:5/18:1]
[0033] 然后根據(jù)樣品中的生物標(biāo)志物相對(duì)參考值的水平，預(yù)測(cè)受試對(duì)象中EAT的水平。 [0034]檢測(cè)裝置優(yōu)選為質(zhì)譜儀。
[0035] 優(yōu)選的是，該方法包括測(cè)定取自所述受試對(duì)象的樣品中的一種或多種脂質(zhì)生物標(biāo) 志物的水平，所述脂質(zhì)生物標(biāo)志物選自PC[ 16:1 /16:1 ]、DAG[42:8]和ΡΕ-0[ 32:5]。
[0036] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括測(cè)定取自所述受試對(duì)象的樣品中的兩種或更多種 脂質(zhì)生物標(biāo)志物的水平，所述脂質(zhì)生物標(biāo)志物選自PC[ 16:1/16:1 ]、DAG[42:8]和PE-0[32: 5]〇
[0037] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括測(cè)定取自所述受試對(duì)象的樣品中的PC[ 16 :1/ 16:1]、DAG[42:8]和 PE-0[32:5]每一種的水平。
[0038] 在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定了PC[ 16 :1/16 :1 ]的水平，取自受試對(duì)象的樣品中的PC [16:1/16:1 ]水平相比參考樣品降低，指示EAT水平較高。
[0039] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定了DAG[42 : 8]的水平，取自受試對(duì)象的樣品中的DAG [42:8 ]水平相比參考樣品升高，指示EAT水平較高。
[0040] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定了PE-0[32 :5]的水平，取自受試對(duì)象的樣品中的ΡΕ-0 [32:5]水平相比參考樣品升高，指示EAT水平較高。
[0041 ]在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定了PC[ 18:0/22:5]的水平，取自受試對(duì)象的樣品中的PC [18:0/22:5]水平相比參考樣品升高，指示EAT水平較高。
[0042]在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定了PI[18:0/16:1]的水平，取自受試對(duì)象的樣品中的PI [18:0/16:1 ]水平相比參考樣品升高，指示EAT水平較高。
[0043]在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定了PG[20:3/20:3]的水平，取自受試對(duì)象的樣品中的PG [20:3/20:3 ]水平相比參考樣品升高，指示EAT水平較高。
[0044]在另一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定了PG[22:5/18:1 ]的水平，取自受試對(duì)象的樣品中的PG [22:5/18:1 ]水平相比參考樣品升高，指示EAT水平較高。
[0045] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括測(cè)定取自受試對(duì)象的樣品中的下列兩種、三種、 四種、五種、六種或全部脂質(zhì)生物標(biāo)志物的水平:PC[16 :l/16:l]、DAG[42:8]、PE-0[32:5]、 PC[18:0/22:5]、PI[18:0/16:1]、PG[20:3/20:3]、PG[22:5/18:1]。
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品包括取自受試對(duì)象的血清或血漿。
[0047] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，參考值以受試對(duì)象對(duì)照群體的生物標(biāo)志物平均水平為基 礎(chǔ)。
[0048] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，采用脂質(zhì)組學(xué)分析法測(cè)定生物標(biāo)志物的水平。
[0049] 目前使用的大多數(shù)脂質(zhì)組學(xué)分析平臺(tái)以電噴霧電離(ESI)結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS) 為基礎(chǔ)進(jìn)行分析?；贓SI-MS的方法可分為兩類，分類依據(jù)是在注入質(zhì)譜儀之前，是否進(jìn)行 液相色譜(LC)。
[0050] 液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)或者HPLC-MS是一項(xiàng)把液相色譜(或HPLC)的物理分離能力 與質(zhì)譜(MS)的質(zhì)量分析能力結(jié)合起來(lái)的分析化學(xué)技術(shù)。
[0051] 將樣品（如有機(jī)提取物)直接注入離子源的方法被統(tǒng)稱為鳥槍脂質(zhì)組學(xué)。
[0052]鳥槍脂質(zhì)組學(xué)采用直接注入的辦法，避免了因濃度變化、色譜異常和離子配對(duì)變 化帶來(lái)的分析困難。
[0053]在另一個(gè)實(shí)施方案中，采用非靶向鳥槍脂質(zhì)組學(xué)分析法測(cè)定生物標(biāo)志物的水平。 [0054]鳥槍分析法用于快速定量地提供給定生物基質(zhì)分子組成的快照。通常情況下，月旨 質(zhì)從細(xì)胞、體液或組織中提取后被直接注入質(zhì)譜儀，完全不必進(jìn)行色譜預(yù)分離。超過(guò)1〇〇， 〇〇〇的質(zhì)量分辨率與混合型Orbitrap儀器的亞ppm級(jí)質(zhì)量精度相結(jié)合，使得能夠從MS全譜圖 和脂質(zhì)種類各自的MS/MS譜圖中識(shí)別出各脂質(zhì)種類并加以量化。
[0055]這種方法與傳統(tǒng)的三重四極桿質(zhì)譜靶向分析相比，主要優(yōu)點(diǎn)是可在不對(duì)分子組成 施加任何限制的情況下從多個(gè)脂質(zhì)類別中非靶向、快速并可靠地識(shí)別出單獨(dú)脂質(zhì)種類并加 以量化。
[0056]在一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品中生物標(biāo)志物的水平與參考值相比，指示與EAT水平 升高相關(guān)聯(lián)的患病風(fēng)險(xiǎn)，所述疾病例如心血管障礙或代謝障礙。
[0057]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品中生物標(biāo)志物的水平與參考值相比，指示與EAT水 平升高相關(guān)聯(lián)的患病風(fēng)險(xiǎn)，所述疾病例如動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、代謝綜合征、空腹血糖受 損、胰島素抵抗、高血壓和糖尿病。
[0058]在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品中生物標(biāo)志物的水平與參考值相比，指示心血管 障礙或代謝障礙正在發(fā)展。
[0059] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品中生物標(biāo)志物的水平與參考值相比，指示動(dòng)脈粥 樣硬化、冠心病、代謝綜合征、空腹血糖受損、胰島素抵抗、高血壓和糖尿病正在發(fā)展。
[0060] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品中生物標(biāo)志物的水平與參考值相比，指示健康受 試對(duì)象中的EAT水平降低，有失去心肌保護(hù)作用的風(fēng)險(xiǎn);或指示含有過(guò)多EAT的不健康受試 對(duì)象有恢復(fù)心肌保護(hù)作用的可能。
[0061] 在本發(fā)明另一方面，提供了一種調(diào)節(jié)受試對(duì)象心外膜脂肪組織(EAT)水平的方法， 包括:如果此前使用上述方法已確定受試對(duì)象具有指示EAT水平不健康的生物標(biāo)志物水平， 則改變受試對(duì)象的生活方式，從而調(diào)節(jié)EAT水平。
[0062] 在又一方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)受試對(duì)象中EAT水平的方法，包括：
[0063] (a)采用上述方法測(cè)定生物標(biāo)志物的水平，
[0064] (b)如果受試對(duì)象具有指示EAT水平不健康的生物標(biāo)志物水平，則改變受試對(duì)象的 生活方式，從而調(diào)節(jié)EAT水平。
[0065] 在再一方面，本發(fā)明提供了一種選擇改變受試對(duì)象的生活方式，從而調(diào)節(jié)所述受 試對(duì)象的心外膜脂肪組織(EAT)水平的方法，該方法包括：
[0066] (a)采用上述方法測(cè)定生物標(biāo)志物的水平，
[0067] (b)根據(jù)步驟(a)測(cè)定的生物標(biāo)志物水平，選擇生活方式的適當(dāng)改變。
[0068] 優(yōu)選的是，"調(diào)節(jié)EAT水平"包括減少EAT或防止EAT增多。
[0069] 在一個(gè)實(shí)施方案中，改變受試對(duì)象的生活方式包括改變飲食。改變飲食優(yōu)選地包 括向所述受試對(duì)象施用至少一種營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品，構(gòu)成飲食的一部分，所述營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品用于調(diào)節(jié)EAT 水平，例如促使EAT減少或防止EAT增多。
[0070] 例如，改變飲食可包括減少脂肪攝入和/或增加低脂食物攝入。
[0071 ]僅舉例來(lái)說(shuō)，低脂食物可包括全麥面粉和面包、燕麥粥、高纖維早餐谷類食物、全 粒大米和全麥面食、蔬菜和水果、干制豆類和扁豆、烤馬鈴薯、干果、核桃、白魚、鯡魚、鯖魚、 沙丁魚、腌魚、皮爾徹德魚、鮭魚和瘦白肉。
[0072] 在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法還包括在改變受試對(duì)象的生活方式之后，重復(fù)預(yù)測(cè)受 試對(duì)象中EAT水平的步驟。
[0073] 根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種預(yù)測(cè)受試對(duì)象發(fā)展心血管障礙或代謝障礙的 風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括：
[0074] (a)測(cè)定取自受試對(duì)象的樣品中的一種或多種脂質(zhì)生物標(biāo)志物的水平，其中所述 生物標(biāo)志物選自以下物質(zhì)：
[0075] (i)磷脂酰膽堿(PC) [ 16:1/16:1 ]
[0076] (ii)甘油二酯（DAG)[42:8]
[0077] (iii)磷脂酰乙醇胺-醚(PE-0)[32:5]
[0078] (iv)磷脂酰膽堿(PC) [ 18:0/22:5]
[0079] (v)磷脂酰肌醇(PI)[18:0/16:1]
[0080] (vi)磷脂酰甘油（PG) [20:3/20:3]
[0081] (vii)磷脂酰甘油(PG) [22:5/18:1]
[0082 ] (b)將樣品中的生物標(biāo)志物水平與參考值比較；
[0083] 其中樣品中的生物標(biāo)志物水平與參考值相比，指示發(fā)展代謝障礙或心血管障礙的 風(fēng)險(xiǎn)。
[0084] 在一個(gè)實(shí)施方案中，心血管障礙是動(dòng)脈粥樣硬化或冠心病。
[0085] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，代謝障礙是空腹血糖受損、胰島素抵抗或糖尿病。
【附圖說(shuō)明】
[0086] 圖1是用于預(yù)測(cè)心外膜脂肪、胰島素抵抗和內(nèi)臟脂肪含量的相關(guān)變量的匯總。圖 例:EF為心外膜脂肪;Η0ΜΑ為H0MA-IR; R2為內(nèi)臟脂肪含量。表中列出了代謝物在預(yù)測(cè)心外膜 脂肪、內(nèi)臟脂肪和H0MA-IR方面的重要性和穩(wěn)健性(采用隨機(jī)森林分析法評(píng)估）。11=10000之 后隨機(jī)森林分析法產(chǎn)生的合并平均值的精度降低。
【具體實(shí)施方式】
[0087] 預(yù)測(cè)受試對(duì)象中EAT水平
[0088] 本發(fā)明一方面涉及預(yù)測(cè)受試對(duì)象心外膜脂肪組織(EAT)水平的方法。在特定實(shí)施 方案中，該方法可用于診斷不健康的EAT水平、監(jiān)測(cè)一段時(shí)間內(nèi)EAT的水平，或識(shí)別有患上與 EAT相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)的受試對(duì)象。
[0089] 例如，該方法可用于預(yù)測(cè)受試對(duì)象患有或染上與EAT相關(guān)疾病的可能性，或評(píng)估受 試對(duì)象當(dāng)前的EAT水平。該方法也可用于評(píng)估干預(yù)方案促進(jìn)調(diào)節(jié)(特別是降低)EAT水平的功 效。例如，本發(fā)明可用于監(jiān)測(cè)改變生活方式或改變飲食的效果。
[0090] 與EAT水平升高相關(guān)聯(lián)的典型疾病是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括心血管障礙和 代謝障礙。
[0091] 與EAT相關(guān)聯(lián)的典型障礙包括動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、代謝綜合征、空腹血糖受損、 胰島素抵抗、高血壓和糖尿病。
[0092] 受試對(duì)象
[0093] 本發(fā)明的方法可應(yīng)用于任何受試對(duì)象，包括非人類或人類受試對(duì)象。在一個(gè)實(shí)施 方案中，受試對(duì)象是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人?；蛘撸茉噷?duì)象可以是非人類的哺乳動(dòng)物，包括例如 馬、牛、羊或豬。在一個(gè)實(shí)施方案中，受試對(duì)象是伴侶動(dòng)物如狗或貓。
[0094] 晝顯
[0095] 本發(fā)明的方法包括測(cè)定取自受試對(duì)象的樣品中的一種或多種脂質(zhì)生物標(biāo)志物的 水平這一步驟。因此，本發(fā)明的方法通常在人或動(dòng)物的身體外部實(shí)施，例如，使用先前從待 檢測(cè)受試對(duì)象取得的體液樣品實(shí)施。樣品優(yōu)選地來(lái)源于血液，也就是說(shuō)，樣品包括全血或血 液的成分。最優(yōu)選地，樣品包含血漿或血清。
[0096]收集血液樣品和分離血液成分的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，可使用針從患 者采集靜脈血液樣品并收集入塑料管。收集管可(例如)包含噴涂的硅膠和聚合物凝膠，用 于分離血清?？稍谑覝叵乱?300RCF離心分離血清10分鐘，然后存放在小塑料管內(nèi)，-80 °C保 存。 _7] 測(cè)定樣品中脂質(zhì)生物標(biāo)志物的水平
[0098] 樣品中單獨(dú)脂質(zhì)種類的水平可通過(guò)任何合適的方法測(cè)量或測(cè)定。例如，可使用質(zhì) 譜法(MS)?？稍谔娲鷮?shí)施方案中使用其他的光譜方法、色譜方法、標(biāo)記技術(shù)或定量化學(xué)方 法。最優(yōu)選的是，用質(zhì)譜法(特別是鳥槍質(zhì)譜法)測(cè)量樣品中的脂質(zhì)水平。通常使用同一種分 析方法測(cè)定樣品中的脂質(zhì)水平和參考值。
[0099] ||M
[0100] 本發(fā)明的方法包括測(cè)定脂質(zhì)生物標(biāo)志物的水平，所述脂質(zhì)生物標(biāo)志物選自磷脂酰 膽堿(PC)、甘油二酯(DAG)、磷脂酰乙醇胺-醚(ΡΕ-0)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酰甘油(PG)。 [0101 ]所述方法包括測(cè)量至少一種生物標(biāo)志物的水平。通過(guò)合并測(cè)量生物標(biāo)志物，可用 脂質(zhì)生物標(biāo)志物更好地表征EAT。
[0102] 磷脂酰膽堿
[0103] 在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定了結(jié)構(gòu)為PC[ 16:1/16:1 ]和/或PC[ 18:0/22: 5]的磷脂酰 膽堿(PC)的水平。在命名法(X:Y)中，X指分子中脂肪酸部分的碳原子總數(shù)，Y指分子中脂肪 酸部分的雙鍵總數(shù)。命名法(XI :Υ1/Χ2:Υ2)指的是PC種類的第一（1)脂肪酸鏈和第二(2)月旨 肪酸鏈中的碳原子數(shù)(X)和雙鍵數(shù)(Y)。因此，PC(18:0/22:5)的第一脂肪酸鏈包含18個(gè)碳原 子且不含雙鍵，第二脂肪酸鏈包含22個(gè)碳原子和5個(gè)雙鍵。
[0104] 甘油二酯
[0105] 在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定了結(jié)構(gòu)為[42:8](使用上文定義的(X:Y)命名法）的甘油 二酯(DAG)的水平。
[0106] 磷脂酰乙醇胺-醚
[0107] 在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定了結(jié)構(gòu)為[32:5](用上文定義的(Χ:Υ)命名法）的磷脂酰 乙醇胺-醚(PE-Ο)的水平。
[0108] 磷脂酰肌醇
[0109] 在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定了結(jié)構(gòu)為[18:0/16:1](用上文定義的(Χ:Υ)命名法)的磷 脂酰肌醇(ΡΙ)的水平。
[0110] 磷脂酰甘油 在一個(gè)實(shí)施方案中，測(cè)定了結(jié)構(gòu)為[20:3/20:3]和/或[22:5/18:1](用上文定義的 (Χ:Υ)命名法）的磷脂酰甘油(PG)的水平。
[0112] 生物標(biāo)志物的組合
[0113] 雖然各種脂質(zhì)生物標(biāo)志物在本發(fā)明的方法中可具有預(yù)測(cè)值，但可通過(guò)合并多個(gè)脂 質(zhì)生物標(biāo)志物的值來(lái)提高本發(fā)明方法的質(zhì)量和/或預(yù)測(cè)能力。
[0114] 因此，本發(fā)明的方法可包括測(cè)定至少兩種上文定義的脂質(zhì)生物標(biāo)志物的水平。例 如，本發(fā)明的方法可包括測(cè)定上述2、3、4、5、6或7種脂質(zhì)種類的水平。
[0115] 特別優(yōu)選的是檢測(cè)包括PC[16:l/16:l]、DAG[42 :8]和PE-0[32:5]的組合的方法。
[0116] 同對(duì)照比較
[0117] 本發(fā)明的方法還包括將試驗(yàn)樣品中單獨(dú)脂質(zhì)種類的水平與一個(gè)或多個(gè)參考值或 對(duì)照值比較這一步驟。通常對(duì)于本發(fā)明方法所測(cè)定的每個(gè)單獨(dú)的脂質(zhì)種類使用一個(gè)特定的 參考值。參考值可以是某脂質(zhì)種類的正常水平，例如，取自正常受試對(duì)象的同一類型樣品 (如血清或血漿)的脂質(zhì)水平。參考值可(例如)基于受試對(duì)象對(duì)照群體中某脂質(zhì)種類的平均 值或中值水平，所述受試對(duì)象對(duì)照群體包含(例如）5、10、100、1000個(gè)或更多個(gè)正常受試對(duì) 象(可與試驗(yàn)受試對(duì)象的年齡和/或性別匹配或不匹配）。
[0118] 受試對(duì)象的脂質(zhì)生物標(biāo)志物水平與相應(yīng)參考值的差異程度，也有助于確定哪類受 試對(duì)象將從特定干預(yù)方案受益最多。試驗(yàn)樣品中脂質(zhì)的水平與參考值相比，可增大或減小 (例如）至少1 %、至少5%、至少10%、至少20%、至少30%、至少50%或至少100%。
[0119] 在某些實(shí)施方案中，參考值是先前從同一受試對(duì)象獲得的值。這允許直接比較受 試對(duì)象當(dāng)前生活方式與之前生活方式對(duì)與EAT相關(guān)聯(lián)的脂質(zhì)生物標(biāo)志物水平的影響，所以 可直接評(píng)估多方面的改善。
[0120] 參考值可通過(guò)使用相應(yīng)的方法測(cè)定試驗(yàn)樣品（例如，一個(gè)或多個(gè)取自正常受試對(duì) 象的樣品）中的脂質(zhì)水平來(lái)測(cè)定。例如，在某些實(shí)施方案中，對(duì)照樣品中的脂質(zhì)水平可在與 試驗(yàn)樣品平行的測(cè)定法中確定?；蛘?，在某些實(shí)施方案中，特定類型樣品（如血清或血漿）中 單獨(dú)脂質(zhì)種類的水平的參考值可能是現(xiàn)成的，例如可從已公布的研究數(shù)據(jù)獲得。因此在某 些實(shí)施方案中，參考值可能已預(yù)先確定，或可計(jì)算得出或外推得到，不必通過(guò)對(duì)與每一個(gè)試 驗(yàn)樣品相關(guān)的對(duì)照樣品執(zhí)行對(duì)應(yīng)的測(cè)定來(lái)獲得。
[0121] 將脂質(zhì)水平與EAT關(guān)聯(lián)
[0122] 通常情況下，試驗(yàn)樣品中上述脂質(zhì)種類的水平相比參考值增大或減小，可指示EAT 水平較高或較低。EAT的總體水平和/或與EAT相關(guān)聯(lián)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)可通過(guò)測(cè)定上述不同脂 質(zhì)生物標(biāo)志物的水平來(lái)評(píng)估。例如，受試對(duì)象可依據(jù)單獨(dú)脂質(zhì)種類的數(shù)量，按EAT水平預(yù)測(cè) 值被劃分為低、中、高和/或非常高這些級(jí)別，其中單獨(dú)脂質(zhì)種類被相對(duì)于對(duì)照值和/或其升 高的程度進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0123] 或者，受試對(duì)象可依據(jù)單獨(dú)脂質(zhì)種類的數(shù)量，按患上與EAT相關(guān)聯(lián)疾病的風(fēng)險(xiǎn)被劃 分為低、中、高和/或非常高這些組，其中單獨(dú)脂質(zhì)種類被相對(duì)于對(duì)照值和/或其升高的程度 進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0124] 促進(jìn)EAT保持健康水平的方法
[0125] 在一方面，本發(fā)明提供了一種調(diào)節(jié)受試對(duì)象中EAT水平的方法。該方法尤其可用于 降低受試對(duì)象患上EAT相關(guān)病癥或疾病的風(fēng)險(xiǎn)，或延長(zhǎng)受試對(duì)象的壽命。
[0126] 該方法的第一步為通過(guò)上述方法確定受試對(duì)象中EAT水平不健康的可能性。確定 受試對(duì)象中EAT水平不健康的可能性之后，可基于評(píng)估的風(fēng)險(xiǎn)水平，為受試對(duì)象選擇適當(dāng)?shù)?干預(yù)策略(例如改變生活方式和/或飲食）。
[0127] 通常情況下，如果預(yù)測(cè)受試對(duì)象的EAT水平低，則可能不必要加以干預(yù)。例如，如果 受試對(duì)象的預(yù)測(cè)EAT水平等于或低于閾值水平，則可能不需要藥物或營(yíng)養(yǎng)治療。閾值水平可 對(duì)應(yīng)(例如)普通群體的正常或平均EAT水平。
[0128] 或者，如果預(yù)測(cè)受試對(duì)象的EAT水平高，該方法還可包括改變受試對(duì)象的生活方式 這一步驟。受試對(duì)象生活方式的改變可以是本文描述的任何變化，例如，飲食改變、運(yùn)動(dòng)量 增大、工作和/或生活環(huán)境改變，等等。
[0129] 優(yōu)選地，所述改變是使用至少一種營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)的，受試對(duì)象之前未攝入過(guò)該營(yíng) 養(yǎng)產(chǎn)品或之前攝入該營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的量與當(dāng)前不同，所述營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品例如有影響EAT水平的效果 并且/或者有避免EAT相關(guān)障礙的效果(包括食物產(chǎn)品、飲品、寵物食物產(chǎn)品、食物補(bǔ)充劑、保 健營(yíng)養(yǎng)品、食物添加劑或營(yíng)養(yǎng)配方產(chǎn)品）。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，飲食改變包括脂肪攝 入水平降低。
[0130] 改變受試對(duì)象的生活方式還包括向受試對(duì)象指明其需要改變生活方式，例如，囑 咐、督促和/或建議受試對(duì)象作出上述的生活方式改變。例如，該方法可包括向受試對(duì)象施 用或提供至少一種上述營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品的步驟。
[0131] 選擇的生活方式改變要能有效調(diào)節(jié)與EAT相關(guān)聯(lián)的特定脂質(zhì)種類的水平。一般情 況下，由于各種各樣的因素比如遺傳變異和環(huán)境因素，不同的生活方式改變(例如服用個(gè)人 營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品）可能對(duì)受試對(duì)象個(gè)體的單獨(dú)脂質(zhì)種類的分布產(chǎn)生不同影響。
[0132] 生活方式的改變可為受試對(duì)象量身定制，從而將監(jiān)測(cè)脂質(zhì)水平與有針對(duì)性地調(diào)節(jié) 受試對(duì)象中單獨(dú)脂質(zhì)種類的特定方案結(jié)合起來(lái)。例如，該方法可包括進(jìn)一步(重新)測(cè)定受 試對(duì)象中的脂質(zhì)水平(也就是在最初的生活方式或飲食調(diào)節(jié)干預(yù)之后），以評(píng)估治療方案的 效果。例如，如果受試對(duì)象在初步干預(yù)階段之后顯示EAT水平降低，則可繼續(xù)干預(yù)，以保持這 種降低的趨勢(shì)。
[0133] 然而，如果受試對(duì)象未能充分響應(yīng)初始干預(yù)(例如，特定的脂質(zhì)水平未出現(xiàn)明顯變 化），則可為該受試對(duì)象選擇替代方案，例如不同的生活方式改變、飲食或營(yíng)養(yǎng)制劑。例如， 如果受試對(duì)象對(duì)最初的營(yíng)養(yǎng)療法響應(yīng)不佳，則可向該受試對(duì)象施用替代的營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品?？芍?復(fù)該方法，包括選擇不同劑量的各種制劑，直到EAT水平發(fā)生期望的改變?yōu)橹?。通常情況下， 可用特定的療法(如上文定義的營(yíng)養(yǎng)制劑)持續(xù)治療受試對(duì)象至少一周、兩周、一個(gè)月或三 個(gè)月，再重復(fù)測(cè)定脂質(zhì)水平。該方法可用于監(jiān)測(cè)生活方式改變(例如飲食、運(yùn)動(dòng)量、吸煙、飲 酒等方面的改變)對(duì)與EAT相關(guān)聯(lián)的脂質(zhì)水平的影響，還可用于識(shí)別可有效調(diào)節(jié)EAT水平的 因素組合。
[0134] 在另一方面，本發(fā)明提供了一種如上文所定義的營(yíng)養(yǎng)制劑(例如，選自食物產(chǎn)品、 飲品、寵物食物產(chǎn)品、食物、保健營(yíng)養(yǎng)品、食物添加劑或營(yíng)養(yǎng)配方產(chǎn)品），該營(yíng)養(yǎng)制劑用于調(diào) 節(jié)受試對(duì)象中EAT水平(或預(yù)防或治療與EAT相關(guān)聯(lián)的疾?。渲惺茉噷?duì)象中不健康的EAT 水平已由上述方法預(yù)測(cè)。
[0135] 在另一方面，本發(fā)明涉及使用如上文所定義的營(yíng)養(yǎng)制劑，來(lái)制造用于調(diào)節(jié)受試對(duì) 象中EAT水平(或預(yù)防或治療與EAT相關(guān)聯(lián)的疾病）的藥物，其中受試對(duì)象中不健康的EAT水 平已由上述方法預(yù)測(cè)。
[0136] 試劑盒
[0137] 在另一方面，本發(fā)明提供了一種預(yù)測(cè)受試對(duì)象中EAT水平的試劑盒。該試劑盒可 (例如)包含一種或多種試劑、標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ諛悠?，以用于本文所述的方法。舉例來(lái)說(shuō)，在 一個(gè)實(shí)施方案中，該試劑盒包含一種或多種參考樣品和試劑盒使用說(shuō)明，所述參考樣品包 含預(yù)定水平的（i)PC[16:l/16:l]、（ii)DAG[42:8]、（iii)PE-0[32:5]、（iv)PPC[18:0/22: 5]、（￥汗1[18 :0/16:1]、（￥1汗6[20:3/20:3]和/或(￥^汗6[22 :5/18:1]，使用說(shuō)明指示了預(yù) 測(cè)受試對(duì)象中EAT的方法，即把參考樣品的預(yù)定水平與取自受試對(duì)象的樣品的脂質(zhì)水平比 較。
[0138] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，在不脫離本文所公開的本發(fā)明范圍的前提下，他們可以 自由地組合本文所述的本發(fā)明的所有特征?，F(xiàn)在結(jié)合下列具體實(shí)施方案，僅以舉例的方式 對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述。
[0139] 實(shí)施例
[0140] 實(shí)施例1-材料和方法
[0141] 參與者和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。
[0142] 在收到瑞士洛桑大學(xué)醫(yī)學(xué)院(CHUV)適當(dāng)倫理審查委員會(huì)的知情同意書之后，我們 觀察研究了CHUV肥胖門診的40名健康的肥胖白人婦女。參與者的BMI (身體質(zhì)量指數(shù))在28 至40之間，年齡在25歲至45歲之間，未表現(xiàn)代謝疾病特征。額外的排除標(biāo)準(zhǔn)是患有糖尿病、 懷孕、開始研究前一個(gè)月內(nèi)接受過(guò)抗生素治療、在訪視日前一周的磨合期內(nèi)接受過(guò)任何治 療(避孕除外），以及進(jìn)食障礙。在過(guò)去3個(gè)月內(nèi)減重超過(guò)3公斤的受試對(duì)象也被排除。受試對(duì) 象都未患有下列疾?。焊哐獕?、葡萄糖耐受不良、多囊卵巢綜合征、甲狀腺功能不全和腎上 腺障礙?；€（V0)時(shí)，受試對(duì)象接受標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)療訪視，此時(shí)收集隔夜空腹血漿樣品。一周后 (VI )，用CT(在CHUV)和iDXA(瑞士洛桑雀巢研究中心（Nestl^Research Center，Lausanne， Switzerland)代謝科室)檢測(cè)身體組成，通過(guò)間接測(cè)熱法測(cè)量了靜息時(shí)能量消耗，并進(jìn)行了 標(biāo)準(zhǔn)的口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(〇GTT，75g葡萄糖）。一周后(V2)，收集隔夜空腹血漿和24小時(shí) 的尿樣，對(duì)其進(jìn)行代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)分析。
[0143] 化學(xué)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)品
[0144] 乙醇、氯仿、異丙醇(HPLC級(jí)）購(gòu)自Biosolve公司（荷蘭范肯斯沃德(Valkenswaard, the Netherlands))。甲醇、水和醋酸銨購(gòu)自默克公司（Merck)(德國(guó)達(dá)姆施塔特 (Darmstadt,Germany))。合成的脂質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Avanti Polar Lipids公司，純度高于 99%。用甲醇制備單獨(dú)脂質(zhì)化合物的儲(chǔ)備溶液，制好后在-20°C下儲(chǔ)存。用異丙醇/甲醇/氯 仿的4:2:1 (體積比）溶液稀釋儲(chǔ)備溶液，制備所需濃度的工作溶液。
[0145] 臨床測(cè)量、人體測(cè)量與身體組成測(cè)量
[0146] 這些參數(shù)按之前報(bào)道的方式測(cè)量(Martin et al. (2013))。簡(jiǎn)言之，臨床測(cè)量和人 體測(cè)量(體重、身高、腰圍、臀圍）依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的臨床操作規(guī)范進(jìn)行。執(zhí)行全身掃描，來(lái)確定腹部 脂肪分布和整個(gè)身體的組成。全身掃描采用GE Lunar iDXA系統(tǒng)（軟件版本：enCORE 12.10.113版)執(zhí)行，由設(shè)備自動(dòng)確定掃描模式，使用之前報(bào)道過(guò)的程序(Martin et al. (2013))。
[0147] 使用64層螺旋CT掃描儀(VCT Lightspeed，美國(guó)密爾沃基通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)(GE Medical Systems，Milwaukee，USA))對(duì)腹部區(qū)域進(jìn)行CT掃描，用測(cè)量結(jié)果來(lái)量化腹膜內(nèi)脂 肪和皮下脂肪，如此前所述(Martin et al.(2013))。受試對(duì)象以仰臥位平躺，雙臂舉過(guò)頭 頂，用墊子墊高雙腿。在脊椎L4-L5位置單次掃描（10_)腹部，分析脂肪組織的橫截面積，用 平方厘米表示。使用下列采集參數(shù)：120Kv，100至200mA，帶Z軸劑量調(diào)制，視野500mm。使用標(biāo) 準(zhǔn)內(nèi)核重建5mm層面厚度的軸向斷層圖像。該量化過(guò)程以Advantage Window工作站(通用電 氣醫(yī)療系統(tǒng)(GE Medical Systems))為載體，采用市售的半交互式算法，分割皮下脂肪和腹 內(nèi)脂肪。使用Deltatrak II(Datex Instruments公司），通過(guò)開路間接測(cè)熱法測(cè)量靜息代謝 率。
[0148] 進(jìn)一步CT掃描心包內(nèi)脂肪、心包外脂肪和縱隔脂肪，由40名受試對(duì)象中的28名產(chǎn) 生了高分辨率心臟脂肪沉積圖像。
[0149] 鳥槍脂質(zhì)組學(xué)分析
[0150]我們自行開發(fā)了一種全自動(dòng)的高通量液/液萃取法，該方法利用漢密爾頓 Microlabstar機(jī)器人(瑞士博納杜茨漢密爾頓公司（Hamilton，Bonaduz，Switzerland))，用 于脂質(zhì)組學(xué)提取，是對(duì)之前的方法稍作修改得到的（之前的方法參見Matyash et al.， (2008)J Lipid Res 49:1137-1146(Matyash 等人，2008 年，《脂質(zhì)研究雜志》第 49 卷，第 1137-1146頁(yè)））。在3小時(shí)內(nèi)提取了96份樣品。簡(jiǎn)言之，用5yL血清來(lái)清理樣品。使用700yL MTBE/Me0H(10/3)來(lái)提取脂質(zhì)，該MTBE/MeOH溶液含有的內(nèi)標(biāo)為下列物質(zhì)的混合物:5μΜ TAG 44:1、0.5μΜ DAG 24:0、5μΜ PC 28:0、1μΜ LPC 14:0、1μΜ ΡΕ 28:0、0.5μΜ LPE 14:0、1μΜ PS 28:0、0·5μΜ LPS 17:1、1μΜ PI 32:0、0·5μΜ LPI 17:1、0·5μΜ PA 28:0、0·5μΜ LPA 14: 0、1μΜ PG 28:0、0·5μΜ LPG 14:0、2μΜ SM 35:1、1μΜ Cer 32:1。4。(：下渦旋混合樣品 1 小時(shí)， 然后添加150yL水，引起相分離。5，000g離心10分鐘后，取500yL上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到96孔深孔 板(德國(guó)漢堡艾本德公司（Eppendorf，Hamburg，Germany))內(nèi)，用錯(cuò)箱密封好，-20°C保存，分 析時(shí)取出。MS分析之前，取10yL總脂質(zhì)提取物，最后用90yL包含7.5mM醋酸銨的MS運(yùn)行緩沖 液(異丙醇/甲醇/氯仿，體積比4:2:1)稀釋。
[0151]基于之前發(fā)表的研究成果（Schuhmann et al ·，（2012)J Mass Spectrom 47:96-104(Schuhmann等人，2012年，《質(zhì)譜雜志》第47卷，第96-104頁(yè)）；Schuhmann et al · (2011) Anal Chem 83:5480-5487(Schuhmann等人，2011年，《分析化學(xué)》第83卷，第5480-5487頁(yè)））， 自行開發(fā)了鳥槍脂質(zhì)組學(xué)方法。采用連接到Nanomate納升注入(nanoinfusion)離子源（英 國(guó)艾塞克斯哈洛鎮(zhèn)Advion生物科學(xué)股份有限公司（Advion Bioscience Ltd,Harlow, Essex，UK))的LTQOrbitrapVelos質(zhì)譜系統(tǒng)（瑞士賴納赫賽默飛世爾科技公司（The;rmo Fisher Scientific，Reinach,Switzerland))進(jìn)行分析。對(duì)于每份樣品提取物，連續(xù)進(jìn)樣兩 次，分別采用負(fù)離子化模式和正離子化模式分析。在DDA模式下采集質(zhì)心高能碰撞解離 (HCD)負(fù)MS/MS。每個(gè)DDA周期包括一個(gè)MS全譜圖，該譜圖以100，000的目標(biāo)分辨率R m/Z4〇o采 集，然后以30，000的分辨率Rm/Z4QQ采集20個(gè)Η⑶FT MS/MS譜圖。一次DDA實(shí)驗(yàn)在25分鐘內(nèi)完 成。前體離子只有在其m/z與預(yù)先編制的包含列表的質(zhì)量相匹配(精度為5ppm)的情況下，才 能被MS/MS檢測(cè)到。在正離子化模式下，以100，000的目標(biāo)分辨率R m/Z4QQ采集MS譜圖，不再進(jìn) 行MS/MS實(shí)驗(yàn)。激活鎖定質(zhì)量選項(xiàng)，使用LPA 17:0(m/z 424.492;負(fù)離子模式)和(118:1/17: 0Cer(m/z 551.528;正尚子模式)作為參考峰。
[0152]采用LipidXplorer，遵循Herzog及其同事開發(fā)的方案（Herzog et al · (2011)， Genome Biol 12:R8(Herzog等人，2011年，《基因組生物學(xué)》第12卷，第R8頁(yè)））鑒定脂質(zhì)種 類。然后導(dǎo)出數(shù)據(jù)，采用自行開發(fā)的軟件工具進(jìn)一步處理。該程序合并了數(shù)據(jù)集，通過(guò)將被 分析物前體離子的豐度與提取前加標(biāo)的內(nèi)標(biāo)的豐度對(duì)比，生成了包含歸一化值（內(nèi)標(biāo)與被 分析物的比值)和絕對(duì)濃度的Exce 1輸出文件。
[0153]依據(jù)脂質(zhì)圖分類和命名系統(tǒng)(http://www. lipidmaps.org)，注釋了脂質(zhì):PC，磷脂 酰膽堿;PC-0，磷脂酰膽堿-醚;LPC，溶血磷脂酰膽堿;PE，磷脂酰乙醇胺;ΡΕ-0，磷脂酰乙醇 胺-醚;LPE，溶血磷脂酰乙醇胺;PS，磷脂酰絲氨酸;LPS，血磷脂酰絲氨酸;PI，磷脂酰肌醇； LPI，溶血磷脂酰肌醇;PG，磷脂酰甘油;Cer，神經(jīng)酰胺;SM，鞘磷脂;DAG，甘油二酯;TAG，甘油 三酯;PA，磷脂酸。通常，單獨(dú)脂質(zhì)種類注釋如下：[脂質(zhì)類別][碳原子總數(shù)]:[雙鍵總數(shù)]。
[0154] 化學(xué)計(jì)量
[0155] 化學(xué)計(jì)量分析使用軟件包SIMCA-P+(13.0版，瑞典烏默奧Umetrics AB公司 (Umetrics AB，U.melSweden))和自行開發(fā)的MATLAB程序(美國(guó)馬薩諸塞州納蒂克邁斯沃 克公司（1'116]\^11:11￥〇^8 111(3.，他1:;[01<:，]\^，1]3厶））進(jìn)行。使用主成分分析（？〇厶）（￥〇1(13， Esbensen K,Geladi P(1987)Principal Component Analysis.Chemom Intell Lab Syst 2:37-52(Wold S、Esbensen K、Geladi P，1987年，"主成分分析"，《化學(xué)計(jì)量學(xué)和智能實(shí)驗(yàn) 室系統(tǒng)》第2卷，第37-52頁(yè)））、潛結(jié)構(gòu)投影（PLS)(Wold S，Hellberg S，Lundstedt T， Sjostrom M(1987)PLS Modeling with Latent Variables in Two or More Dimensions.PLS Meeting,Frankfurt(ffold S、Hellberg S、Lundstedt T、Sjostrom M， 1987年，"用潛在變量進(jìn)行二維或更高維PLS建模"，法蘭克福PLS會(huì)議））和潛結(jié)構(gòu)正交投影 (〇-PLS)(Trygg J，Wold S(2003)J Chemom 17:53-64(Trygg J、Wold S，2003年，《化學(xué)計(jì)量 雜志》第17卷，第53-64頁(yè)）），來(lái)研究心外膜和內(nèi)臟脂肪與脂質(zhì)組學(xué)分布之間的關(guān)系。使用7 倍交叉驗(yàn)證來(lái)評(píng)估模型的有效性（Cloarec et al.(2005),Anal Chem 77:517-526 (Cloarec等人，2005年，《分析化學(xué)》第77卷，第517-526頁(yè)））。
[0156] 此外，通過(guò)隨機(jī)森林算法分析脂類組學(xué)數(shù)據(jù)，利用了"隨機(jī)森林(randomForest)" (RF?)軟件包（Liaw et al.，2002，R News 3:18-22(Liaw等人，2002年，R News第3卷，第 18-22頁(yè)））（設(shè)置500棵樹，以=5的樹分裂進(jìn)行隨機(jī)變量采樣），并利用在RF?中實(shí)施的變量重要 性特征(精度/結(jié)點(diǎn)不純度的平均降低量)來(lái)測(cè)定與內(nèi)臟脂肪和心外膜脂肪的狀態(tài)關(guān)聯(lián)得更 好（由絕對(duì)值或體脂肪率評(píng)估)的變量。
[0157] 使用統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算軟件環(huán)境R計(jì)算了Spearman自相關(guān)矩陣，并使用軟件包Rgraphviz v. 1.32.0生成了相應(yīng)的圖形。還在R內(nèi)執(zhí)行了單變量顯著性檢驗(yàn)，來(lái)驗(yàn)證計(jì)量結(jié)果。
[0158] 實(shí)施例2
[0159] 研究了特定內(nèi)臟脂肪庫(kù)中的血漿脂質(zhì)組，及其內(nèi)部容納的信息。具體地講，基于磁 共振(MRI)和CT的現(xiàn)代成像技術(shù)可生成內(nèi)臟脂肪庫(kù)的準(zhǔn)確區(qū)域特異性量化，包括EAT(Wang et al.(2009)J Clin Endocrinol Metab 94:662-669(Wang等人，2009年，《臨床內(nèi)分泌與 代謝雜志》第94卷，第662-669頁(yè)））。在對(duì)健康的肥胖女性進(jìn)行的同一同期群研究中，應(yīng)用鳥 槍脂質(zhì)組學(xué)方法來(lái)量化血漿脂質(zhì)的分布，并評(píng)估與特定體脂沉積相關(guān)的復(fù)合代謝特征，尤 其注重VA、EAT和胰島素抵抗。因此，本研究在內(nèi)臟肥胖的外形如何與健康肥胖女性的血漿 脂質(zhì)組建立不同關(guān)聯(lián)方面，提供了補(bǔ)充性和全新的見解。
[0160] 心外膜脂肪測(cè)量值、臨床參數(shù)與身體組成參數(shù)之間的關(guān)系
[0161]所述同期群的人體測(cè)量數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)記錄在表1和表2中。初始的PCA和 spearman相關(guān)分析表明，心包內(nèi)脂肪、縱隔脂肪和心外膜脂肪參數(shù)與下列諸項(xiàng)密切相關(guān):其 他內(nèi)臟脂肪估計(jì)值(例如，腹膜內(nèi)脂肪（IPVF)的Logio值(r = 0.56，p = 0.002;r = 0.65，p〈 0.001；r = 0.66,p<0.001),VAT/SAT(r = 0.49,p = 0.008；r = 0.50,p = 0.006；r = 0.40,p = 0 · 031)，VAT/腹部脂肪總量的比值(r = 0 · 49，p = 0.008 ;r = 0 · 49，p = 0 · 006 ;r = 0 · 39，p = 0.037)，BMI(r = 0.45，p = 0.016;r = 0.54，p = 0.003;r = 0.60，p〈0.001)，腹部脂肪（r = 0·39，p = 0.040;r = 0·51，p = 0.005;r = 0.56，p = 0.002)，皮下脂肪(r = 0·62，p〈0·001 ;r = 0.70印〈0.001# = 0.71印〈0.001)，以及脂肪總量（『=0.44印=0.019# = 0.52印=0.004; r = 0.55，p = 0.002)，但與男性型/女性型脂肪不相關(guān)（圖1)。此外，縱隔脂肪和心包內(nèi)脂肪 與幾個(gè)瘦體質(zhì)參數(shù)相關(guān)聯(lián)。類似于其他內(nèi)臟脂肪估計(jì)值，心包內(nèi)脂肪和縱隔脂肪與下列諸 項(xiàng)密切相關(guān):ALAT(r = 0 · 38，p = 0 · 045 ;r = 0 · 42，p = 0 · 025)，ALAT/ASAT比值(r = 0 · 49，p = 0.007# = 0.56，？ = 0.002)，血液甘油三酯（1 = 0.48，？ = 0.009# = 0.45，？ = 0.016)。心外 膜脂肪主要與ALAT/ASAT比值相關(guān)聯(lián)(r = 0.47，p = 0.011)，然而所有的心臟脂肪參數(shù)與GGT 密切相關(guān)(r = 0.54，ρ = 0· 039; r = 0.57，p = 0.001 ;r = 0.47，ρ = 0· 011)。有趣的是，相比其 他內(nèi)臟脂肪估計(jì)值，在空腹或OGTT期間測(cè)得的心臟脂肪參數(shù)與葡萄糖和胰島素參數(shù)并沒有 統(tǒng)計(jì)相關(guān)性。比值Α和Β不依賴于大多數(shù)其他參數(shù)，只與BMI(r = 0.41，p = 0.028;r = 0.41，p =0.028)和心外膜脂肪(r = 0.42, p = 0.025; r = 0.42，p = 0.025)正相關(guān)，并與區(qū)域特異性 的骨量分布負(fù)相關(guān)(例如相對(duì)女性型骨量，r = -0.46，p = 0.015)。
[0162] 心外膜脂肪、內(nèi)臟脂肪含量和H0MA-IR同特定的血漿脂質(zhì)組成重構(gòu)相關(guān)聯(lián)
[0163] 使用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的鳥槍脂質(zhì)組學(xué)方法表示40名受試對(duì)象的血漿脂質(zhì)組的特征，得到 14種不同類別脂質(zhì)中的252種脂質(zhì)種類的相對(duì)定量值。分析對(duì)象涵蓋甘油三酯TG(n = 50)、 甘油二酯DAG(n = 18)、鞘磷脂SM(n = 24)、神經(jīng)酰胺Cer(n = 17)、磷脂酰肌醇PI(n=12)、溶 血磷脂酰肌醇LPI(n = 2)、磷脂酰甘油PG(n = 6)、磷脂酰乙醇胺PE(n = 23)、磷脂酰乙醇胺-醚PE-0(n=15)、溶血磷脂酰乙醇胺 LPE(n = 4)、磷脂酰膽堿PC(n = 45)、磷脂酰膽堿-醚PC-0 (n = 29)、溶血磷脂酰膽堿LPC(n = 6)和磷脂酸PA(n = l)。
[0164] 通過(guò)0PLS分析法，使用1個(gè)預(yù)測(cè)分量和1個(gè)正交分量生成了三個(gè)模型，分別為內(nèi)臟 脂肪模型(VAT/腹部脂肪的l〇g 1Q比值，的=0.16，的=0.87,0吟=0.59)、心外膜脂肪模型 (1^( = 0.32，1?2￥ = 0.81，02￥ = 0.59，圖2)、!1〇嫩-1財(cái)莫型（1^( = 0.32，1?2￥ = 0.55,02￥ = 0.21)。
[0165] 使用Volcano繪圖法，基于VIP和相關(guān)系數(shù)值，研究了影響變量。與此同時(shí)，使用在 RF?中實(shí)施的變量重要性特征，可測(cè)定與內(nèi)臟脂肪、H0MA-IR和心外膜脂肪最佳關(guān)聯(lián)的代謝 讀出值。
[0166] EAT的代謝特征示于表3。此外，表3總結(jié)了以RF?指標(biāo)為基礎(chǔ)，就VA、EAT和H0A-IR而 言的各影響變量的相似性和差異性。
[0167] 最可判別的變量是PC[16:1/16:1]、DAG[42:8]、PE-0[32:5]。根據(jù)這些分析，我們 可以定義 PC[16:1/16:1]、DAG[42:8]、PE-0[32:5]、PC[18:0/22:5]、PI[18:0/16:1]、PG[20: 3/20:3]和PG[22:5/18:1]。
[0168] 表1:受試對(duì)象的描述性身體組成

[0170]^關(guān)鍵詞：SAT =皮下脂肪組織，VAT=內(nèi)臟脂肪組織。
[0171]表2:受試對(duì)象的描述性人體測(cè)量參數(shù)與臨床參數(shù)
[0173]關(guān)鍵詞：BMI =身體質(zhì)量指數(shù)，HDL-C =高密度脂蛋白膽固醇，H0MA-IR =胰島素抵 抗穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估法，LDL-C =低密度脂蛋白膽固醇，TG =甘油三酯，MAP =平均動(dòng)脈血壓， ALAT =丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶，ASAT =天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，GGT= γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，0GTT= 口服葡萄糖 耐量試驗(yàn)。
[0174] 表3代謝物在預(yù)測(cè)EAT、VAT和H0MA-IR方面的重要性和穩(wěn)健性(采用隨機(jī)森林分析 法評(píng)估）
[0177]圖例:報(bào)告的數(shù)值與n = 10000之后隨機(jī)森林分析法產(chǎn)生的合并平均值的精度降低 相對(duì)應(yīng)。變量的重要性越高，合并平均值精度下降的值越大。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于預(yù)測(cè)受試對(duì)象心外膜脂肪組織(EAT)水平的方法，包括： (a) 測(cè)定取自所述受試對(duì)象的樣品中的一種或多種脂質(zhì)生物標(biāo)志物的水平，其中所述 生物標(biāo)志物選自以下物質(zhì)： (i) 磷脂酰膽堿(PC)[16:1/16:1] (ii) 甘油二酯(DAG)[42:8] (i i i)磷脂酰乙醇胺-醚(PE-0) [ 32:5 ] (i v)磷脂酰膽堿(PC) [ 18:0/22:5 ] (v) 磷脂酰肌醇(PI)[18:0/16:1] (vi) 磷脂酰甘油（PG) [20:3/20:3] (vii) 磷脂酰甘油(PG) [22:5/18:1] (b) 將所述樣品中的所述生物標(biāo)志物的水平與參考值比較； 其中所述樣品中的所述生物標(biāo)志物的水平與所述參考值相比，指示了所述受試對(duì)象中 EAT的水平。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括測(cè)定取自所述受試對(duì)象的所述樣品中的一種或多 種脂質(zhì)生物標(biāo)志物的水平，所述生物標(biāo)志物選自以下物質(zhì)： (i) PC[16:l/16:l] (ii) DAG[42:8] (iii) PE-0[32:5]。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，包括測(cè)定取自所述受試對(duì)象的所述樣品中的兩種或更 多種脂質(zhì)生物標(biāo)志物的水平，所述生物標(biāo)志物選自以下物質(zhì)： (i) PC[16:l/16:l] (ii) DAG[42:8] (iii) PE-0[32:5]。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，包括測(cè)定取自所述受試對(duì)象的所述樣品中的下列每一 種的水平： (i) PC[16:l/16:l] (ii) DAG[42:8] (iii) PE-0[32:5]。5. 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中測(cè)定了 PC[16:1/16:1]的水平，并且取自 所述受試對(duì)象的所述樣品中的PC[ 16:1/16:1 ]的水平相比所述參考樣品降低，指示EAT水平 較高。6. 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中測(cè)定了 DAG[42:8]的水平，并且取自所述 受試對(duì)象的所述樣品中的DAG[42:8]的水平相比所述參考樣品升高，指示EAT水平較高。7. 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中測(cè)定了 PE-0[32:5]的水平，并且取自所 述受試對(duì)象的所述樣品中的PE-〇[ 32:5]的水平相比所述參考樣品升高，指示EAT水平較高。8. 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中： 測(cè)定了PC[ 18:0/22:5]的水平，并且取自所述受試對(duì)象的所述樣品中的PC[ 18:0/22:5] 的水平相比所述參考樣品升高，指示EAT水平較高，和/或 測(cè)定了PC[ 20:3/20:3 ]的水平，并且取自所述受試對(duì)象的所述樣品中的PC[ 20:3/20:3 ] 的水平相比所述參考樣品升高，指示EAT水平較高，和/或 測(cè)定了 PG[22:5/18:1 ]的水平，并且取自所述受試對(duì)象的所述樣品中的PG[22:5/18:1 ] 的水平相比所述參考樣品升高，指示EAT水平較高，和/或 測(cè)定了 PG[22:5/18:1 ]的水平，并且取自所述受試對(duì)象的所述樣品中的PG[22:5/18:1 ] 的水平相比所述參考樣品升高，指示EAT水平較高。9. 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述樣品包括取自所述受試對(duì)象的血清 或血漿。10. 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述參考值基于受試對(duì)象對(duì)照群體的 所述生物標(biāo)志物的平均水平。11. 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述生物標(biāo)志物的水平是通過(guò)質(zhì)譜法 測(cè)定的。12. 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述生物標(biāo)志物的水平是通過(guò)鳥槍脂 質(zhì)組學(xué)方法測(cè)定的。13. 根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法，其中所述樣品中的所述生物標(biāo)志物的水平 與所述參考值相比，指示發(fā)展心血管障礙或代謝障礙的風(fēng)險(xiǎn)。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述心血管障礙是冠狀動(dòng)脈疾病。15. 用于調(diào)節(jié)受試對(duì)象心外膜脂肪組織(EAT)水平的方法，包括： 如果此前使用前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法已確定所述受試對(duì)象具有指示EAT水平 不健康的所述生物標(biāo)志物的水平，則改變所述受試對(duì)象的生活方式，從而調(diào)節(jié)EAT水平。16. 用于調(diào)節(jié)受試對(duì)象心外膜脂肪組織(EAT)水平的方法，包括： (a) 執(zhí)行權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法；以及 (b) 如果所述受試對(duì)象具有指示EAT水平不健康的所述生物標(biāo)志物的水平，則改變所述 受試對(duì)象的生活方式，從而調(diào)節(jié)EAT水平。17. 用于選擇受試對(duì)象的生活方式的改變從而調(diào)節(jié)所述受試對(duì)象的心外膜脂肪組織 (EAT)水平的方法，所述方法包括： (a) 執(zhí)行權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法， (b) 根據(jù)步驟(a)測(cè)定的生物標(biāo)志物水平，選擇生活方式的適當(dāng)改變。18. 根據(jù)權(quán)利要求15至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中調(diào)節(jié)EAT水平包括降低EAT水平。19. 根據(jù)權(quán)利要求15至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試對(duì)象的所述生活方式的 改變包括飲食改變。20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述飲食改變包括向所述受試對(duì)象施用至少一 種營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品，所述營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品是防止EAT增多的飲食的一部分。21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述飲食改變包括向所述受試對(duì)象施用至少一 種營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品，所述營(yíng)養(yǎng)產(chǎn)品是促使EAT減少的飲食的一部分。22. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述飲食改變包括減少脂肪攝入。23. 根據(jù)權(quán)利要求16至22中任一項(xiàng)所述的方法，還包括在改變所述受試對(duì)象的所述生 活方式之后重復(fù)步驟(a)。24. 用于預(yù)測(cè)受試對(duì)象心外膜脂肪組織(EAT)水平的方法，包括： (a)使用檢測(cè)裝置測(cè)定取自所述受試對(duì)象的樣品中的一種或多種脂質(zhì)生物標(biāo)志物的水 平，其中所述生物標(biāo)志物選自以下物質(zhì)： (i) 磷脂酰膽堿(PC)[16:1/16:1] (ii) 甘油二酯(DAG)[42:8] (i i i)磷脂酰乙醇胺-醚(PE-0) [ 32:5 ] (i v)磷脂酰膽堿(PC) [ 18:0/22:5 ] (v) 磷脂酰肌醇(PI)[18:0/16:1] (vi) 磷脂酰甘油（PG) [20:3/20:3] (vii) 磷脂酰甘油(PG) [22:5/18:1] 以及根據(jù)所述樣品中的所述生物標(biāo)志物相對(duì)所述參考值的水平，預(yù)測(cè)所述受試對(duì)象中 EAT的水平。
【文檔編號(hào)】G01N33/92GK105874335SQ201480072250
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2014年12月9日
【發(fā)明人】F·C·貝格蘭, S·科里諾, F-P·馬丁, I·蒙托柳魯拉, M·舍雷爾
【申請(qǐng)人】雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司