一種馬鈴薯資源耐寒性鑒定方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種馬鈴薯資源耐寒性鑒定方法與應(yīng)用，該方法其步驟包括：分別取待鑒定的馬鈴薯和作為對照的耐寒馬鈴薯的成熟葉片；2）將葉片放入低溫環(huán)境中，初始溫度設(shè)為0℃，保持20?40min,后，取樣作為樣品1；3）將溫度從0℃降至?1℃，保持50?70min后，取樣作為樣品2；4）再將溫度從?1℃降至?2℃，保持50?70min后，取樣作為樣品3；5）測量樣品1、2、3的可溶性糖含量；6）運用DPS分析軟件對數(shù)據(jù)進行聚類分析并作圖；8）根據(jù)作圖結(jié)果得出待鑒定馬鈴薯的耐寒性。該檢測方法材料處理快速，項目分析簡單，每批次處理材料量大，可在短時間內(nèi)對大批量材料進行初步抗寒性分級，檢測效率提高，檢測的成本低。
【專利說明】
一種馬鈴薯資源耐寒性鑒定方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)作物抗逆性鑒定分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種梯度低溫處理馬鈴薯離體 葉片，分析不同處理條件下葉片的可溶性糖含量，以耐寒性材料作為對照，系統(tǒng)聚類分析材 料與對照的歐式距離來分析馬鈴薯耐寒性的分析方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 我國南方水稻產(chǎn)區(qū)有3億多畝的冬閑田，在冬閑田種植馬鈴薯是提高我國糧食安 全水平的新的有效措施。我國冬作馬鈴薯的種植面積已經(jīng)達(dá)到3000萬畝以上。由于馬鈴薯 喜溫怕寒，而冬作馬鈴薯幼苗生長期多處于低溫陰雨天氣，且霜凍頻發(fā)，常常導(dǎo)致冬作馬鈴 薯生長期延遲和產(chǎn)量不穩(wěn)定，從而制約了冬作馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。所以，低溫脅迫是伴隨中 國冬作馬鈴薯迅速發(fā)展，不同于其他馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)所面臨的全新科學(xué)問題。研究馬鈴薯的 耐寒性和不同栽培方式下冬作馬鈴薯防寒(凍)技術(shù)，對冬作馬鈴薯高效栽培技術(shù)體系的建 立具有重要意義。
[0003] 資源的耐寒性鑒定是馬鈴薯冬作適應(yīng)型品種選育的必要前提。在自然霜凍條件下 評價作物耐霜凍性，固然具有快速、方便、經(jīng)濟等優(yōu)勢，但受氣溫影響較大，只能在特殊的季 節(jié)進行。因此不同農(nóng)作物的室內(nèi)耐寒性鑒定方法分別從植物形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生理生化屬性 分析，以及耐寒性分子標(biāo)記等不同層面展開。生長發(fā)育和形態(tài)差異研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件下的 種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽臨界溫度等出苗性狀可以對玉米苗期耐寒性作出可靠估 計 [1、2]。低溫下種子吸水速度、植株萎蔫狀況與玉米耐寒性也存在顯著相關(guān)性[3]。發(fā)育和形 態(tài)指標(biāo)鑒定法具有簡便易測、實用性強的特點，但是溫度壓力的確定和表型分析是難點。研 究表明，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與作物的耐寒性成正相關(guān)，耐寒性強的作物品種膜透性增大 程度較慢。因此，電解質(zhì)滲漏法測定質(zhì)膜的透性常用于對作物耐寒性的評估 [4_5]。另有研究 認(rèn)為以電解質(zhì)滲漏率為基礎(chǔ)的半致死溫度更能反映特定低溫下質(zhì)膜的透性 [6]。此外，膜脂 中不飽和脂肪酸的含量與質(zhì)膜相變溫度呈顯著正相關(guān)，膜脂中不飽和脂肪酸的含量也成為 衡量作物的耐寒性差異的指標(biāo)& 8]。同時研究者發(fā)現(xiàn)，低溫下不同耐寒玉米和馬鈴薯品種光 合速率變化的差異與其耐寒性相一致由于脂肪酸的含量，光合速率指標(biāo)測定難度大， 儀器設(shè)備操作復(fù)雜，費用昂貴，同時要求取樣和測定環(huán)境均非常嚴(yán)格，因此，不適合對大量 材料進行鑒定。游離脯氨酸、可溶性蛋白作 [11_13]和可溶性糖作為細(xì)胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)也經(jīng) 常被用于作物耐寒性評價。但有關(guān)可溶性蛋白質(zhì)含量與作物耐寒性關(guān)系的研究結(jié)論不盡一 致，有研究認(rèn)為逆境下脯氨酸的積累是傷害的結(jié)果，只能作為輔助指標(biāo) [14]。植物體內(nèi)含有 許多參低溫響應(yīng)的酶，其中，抗氧化酶保護系統(tǒng)的超氧化物歧化酶（S0D)、過氧化物酶（ P0D)、過氧化氫酶（CAT)、葉綠體中半乳糖脂酶在適應(yīng)低溫的過程中表現(xiàn)活躍，但酶活性 對分析處理條件與材料狀況極其敏感，分析過程中的穩(wěn)定性、重復(fù)性差。一般認(rèn)為脫落酸（ ΑΒΑ)是抗寒基因的啟動子，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)引發(fā)酶活性變化或者基因表達(dá)的改變調(diào)控植物 的耐寒生理機能。研究認(rèn)為低溫下ΑΒΑ的含量變化或GA /ΑΒΑ值能夠清楚反映作物適應(yīng)低 溫的能力[15]，但植物體內(nèi)激素含量極微，測定困難，低溫條件下內(nèi)源激素作為抗寒性鑒定 指標(biāo)的研究甚少。近年來，迅速發(fā)展的分子遺傳學(xué)為進行耐寒性的遺傳研究提供了有利的 工具，尤其是已經(jīng)創(chuàng)立的數(shù)量性狀基因（QTL)作圖方法極大地促進作物耐寒性的遺傳研 究。但目前可實際運用的分子標(biāo)記很少。
[0004] 綜上所述，確定一個易于分離提取，對實驗室分析條件要求較低的鑒定指標(biāo)，建立 一套處理方便、操作簡單、重復(fù)性好，經(jīng)濟可靠的分析方法仍然是目前農(nóng)作物包括馬鈴薯在 內(nèi)的耐寒性室內(nèi)分析亟待解決的問題。
[0005] 參考文獻(xiàn)
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:提供一種馬鈴薯資源耐寒性鑒定方法，該方法處 理方便、操作簡單、重復(fù)性好，經(jīng)濟可靠，可在短時間內(nèi)對大批量材料進行初步抗寒性分級， 檢測效率提尚，檢測的成本低。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種馬鈴薯資源耐寒性鑒 定方法，其步驟包括： 1) 分別取待鑒定的馬鈴薯和作為對照的耐寒馬鈴薯的成熟葉片； 2) 將葉片放入低溫環(huán)境中，初始溫度設(shè)為0°C，保持20-40min，后，取樣作為樣品1; 3) 將溫度從0°C降至_1°C，保持50-70min后，取樣作為樣品2; 4) 再將溫度從-1°C降至_2°C，保持50-70min后，取樣作為樣品3; 5 )測量樣品1、2、3的可溶性糖含量； 6)運用DPS分析軟件對數(shù)據(jù)進行聚類分析并作圖； 8)根據(jù)作圖結(jié)果得出待鑒定馬鈴薯的耐寒性。
[0008]本發(fā)明選擇強耐寒性馬鈴薯材料作為對照:選用屬于commersonii種的強耐霜凍 馬鈴薯野生材料GS393，和1份強耐寒性馬鈴薯栽培種AV9，可根據(jù)待鑒定材料多少自行選擇 2-3個對照為。
[0009] 優(yōu)選地，第1)步是取待鑒定的馬鈴薯充分成熟的植株上部功能葉片，洗凈并吸干 葉片表面水分，將葉片放入容器中。
[0010] 所述的方法，優(yōu)選地，第2)步是將密封容器放入低溫循環(huán)水浴鍋中，水浴鍋初始溫 度設(shè)為〇°C，保持30min;向離心管中加入一小塊冰，保持30min后取樣。
[00?1 ]所述的方法，優(yōu)選地，第3)和4)步是中保持時間為60min。
[0012]所述的方法，其中第6)步的聚類分析操作如下： 1) 分別計算待鑒定材料和對照在0°c、-rc、-2°c低溫下處理后的葉片可溶性糖含量， 并求得三次重復(fù)的平均值； 2) DPS軟件分別對待鑒定材料和對照三種溫度下可溶性糖含量平均值進行系統(tǒng)聚類分 析，優(yōu)選采用歐式距離，或最短距離法； 3) 根據(jù)待鑒定材料與對照的歐式距離分析耐寒性，其中與強耐寒性馬鈴薯材料對照歐 式距離<10即待鑒定材料被視為耐寒性與對照相近或較耐寒;相反其中與弱耐寒性馬鈴薯 材料對照歐式距離<10即待鑒定材料被視為耐寒性與對照相近或不耐寒。
[0013] 所選擇的對照馬鈴薯為由美國國家植物資源中心（The U.S. National Plant Germplasm System NPGS)提供湖南省馬鈴薯工程技術(shù)中心收集并保存，并可對外分發(fā)的強 耐寒性馬鈴薯野生種GS393、和馬鈴薯普通栽培種AV9。
[0014] 植物葉片可溶性糖分析方法有:蒽酮比色法，2-硫代巴比妥酸(TBA)法，高效氣相色譜 法等。
[0015] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明檢測方法以葉片可溶性總糖作為分析指標(biāo)，易于分離提取，對實驗室分析條件 要求較低;鑒定過程中材料處理簡單、設(shè)置對照，進行相對耐寒性分析，重復(fù)性好;一批次處 理材料量大，可在短時間內(nèi)對大批量材料進行初步抗寒性分級，檢測效率提高，檢測的成本 低。
【附圖說明】
[0016] 圖1為0°C低溫下各材料葉片可溶性糖系統(tǒng)聚類分析。
[0017] 圖2為-1°C低溫下各材料葉片可溶性糖系統(tǒng)聚類分析。
[0018] 圖3為_2°C低溫下各材料葉片可溶性糖系統(tǒng)聚類分析。
[0019]
【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步地解釋(試驗I)，同時采用目前運用較多 的電導(dǎo)率分析法(試驗π)和霜凍表型分析法(試驗m)做比較，以說明本發(fā)明的可靠性。但 具體實施例并不對本發(fā)明做任何限定。 實施例
[0021] 待鑒定材料：費烏瑞它、83226、83214、￥&112、13*10、41*8、中薯3號（被中國農(nóng)業(yè)科 學(xué)蔬菜花卉研究所驗證為耐寒性弱的馬鈴薯普通栽培種）、興佳二號。
[0022] 對照：GS393(美國國家植物資源中心（The U.S. National Plant Germplasm System NPGS)提供，湖南省馬鈴薯工程技術(shù)中心收集并保存，并可對外分發(fā)的強耐寒性馬 鈴薯野生種）、544 3〇4、4￥9;基質(zhì)盆栽，基質(zhì)采用商用蔬菜栽培土。
[0023] 試驗I:(梯度處理分析可溶性糖含量） 1)取待鑒定的馬鈴薯材料(含對照1-2份，處理材料數(shù)量根據(jù)實驗室低溫處理容量和后 續(xù)分析能力自行決定)充分成熟的植株上部功能葉片，用蒸餾水反復(fù)沖洗并吸干葉片表面 水分，將葉片放入50mL離心管中，封口。
[0024] 2)將離心管放入低溫循環(huán)水浴鍋中，水浴鍋初始溫度設(shè)為0°C，保持30 min，向離 心管中加入一小塊冰，繼續(xù)保持30 min后取樣1。
[0025] 3)溫度從0°C降至-1°C，保持lh后取樣2。
[0026] 4)溫度從-1°C降至-2°C，保持lh后取樣3。
[0027] 5 )測量樣品1、2、3采的可溶性糖含量。
[0028] 6)重復(fù)測定三次，收集整理數(shù)據(jù)。
[0029] 7)運用DPS分析軟件對數(shù)據(jù)進行聚類分析并作圖。
[0030] 8)材料耐寒性分析。
[0031]結(jié)果請參見圖1至圖3,圖1~3分別為0°C、-1°C、-2°C低溫下各材料葉片可溶性糖 系統(tǒng)聚類分析。〇°C和-l°c低溫處理下，供試材料Q304和S4與對照AV9，Yan2、興佳二號和 BS214與對照GS393的歐式距離<3,兩個組群的歐式距離<6。而與弱耐寒性對照中薯3號所 在組群的歐式距離多14(圖1、圖2)。當(dāng)溫度繼續(xù)下降到-2°C，類群特點并沒有改變，但類群 間的歐式距離有所增加，但兩個對照各自群類內(nèi)歐式距離仍保持在5以內(nèi)，群間歐式距離仍 保持在10以內(nèi)，與弱耐寒性對照中薯3號所在組群的歐式距離多12(圖3)。
[0032] 試驗Π :(電導(dǎo)率法求半致死率驗證試驗I的結(jié)果） 1)取待鑒定的馬鈴薯材料(含對照1-2份，處理材料數(shù)量根據(jù)實驗室低溫處理容量和后 續(xù)分析能力自行決定)充分成熟的植株上部功能葉片，用蒸餾水反復(fù)沖洗并吸干葉片表面 水分，將葉片放入50mL離心管中，封口。
[0033] 2)將離心管放入低溫循環(huán)水浴鍋中，水浴鍋初始溫度設(shè)為0°C，保持30 min，向離 心管中加入一小塊冰，保持30 min后取樣1。
[0034] 3)溫度從0°C降至-1°C，保持lh后取樣2。
[0035] 4)溫度從-1Γ降至-2Γ，保持lh后取樣3。
[0036] 5)依次類推至溫度到_7°C。共取樣八次。將取出的所有離心管放在冰上解凍過夜， 測量相對電導(dǎo)率。
[0037] 6)取處理后的離心管中的葉片，盡量保持葉片完整性，少含莖節(jié)。用蒸餾水沖洗干 凈，并用濾紙吸干葉片表面水分，剪成適宜長度的長條，迅速稱量三份，每份〇. 2g，分別置于 含20ml去離子水的試管中，封口，室溫下浸泡12h后用DDSJ-308A型電導(dǎo)率儀測定提取液電 導(dǎo)率(R1)，然后沸水浴20min殺死葉片，冷卻至室溫，充分搖勻后測量浸提液電導(dǎo)率(R2)。相 對電導(dǎo)率=R1/R2X100% 7)重復(fù)測定三次，收集整理數(shù)據(jù)。
[0038] 8)求半致死率。半致死溫度為相對電導(dǎo)率為50%時的數(shù)值。通過EXCEL做圖，從圖上 找出相應(yīng)的點。
[0039]試驗m:(霜凍表型分析驗證試驗I的結(jié)果） -1.5°C低溫下霜凍處理3小時。寒凍處理:運用人工霜凍箱，-1.5°C連續(xù)處理3小時，取 出室溫恢復(fù)1小時后進行凍害評估。
[0040]凍害分級標(biāo)準(zhǔn):其標(biāo)準(zhǔn)為:0級，無明顯冷害癥狀；1級，葉緣略失水，其他無明 顯冷害癥狀;2級，葉緣失水嚴(yán)重，心葉無明顯冷害癥狀;3級，葉緣嚴(yán)重失水，心葉略失 水;4級，葉片萎蔫，心葉嚴(yán)重失水，很難恢復(fù)生長;5級，全部葉片、莖萎蔫，幼苗在常溫 下不能恢復(fù)生長。最后用DPS多元統(tǒng)計分析軟件進行霜凍評價。
[0041 ]結(jié)果表明電導(dǎo)率法所得材料的半致死溫度越低，材料凍害指數(shù)越低，兩者呈正相 關(guān)(表1)。該結(jié)果與按本發(fā)明分析所得結(jié)果高度契合。
[0042]表1馬鈴薯耐低溫性半致死率分析
【主權(quán)項】
1. 一種馬鈴薯資源耐寒性鑒定方法，其步驟包括： 1) 分別取待鑒定的馬鈴薯和作為對照的耐寒馬鈴薯的成熟葉片； 2) 將葉片放入低溫環(huán)境中，初始溫度設(shè)為0°C，保持20-40min，后，取樣作為樣品1; 3) 將溫度從0°C降至_1°C，保持50-70min后，取樣作為樣品2; 4) 再將溫度從-1°C降至_2°C，保持50-70min后，取樣作為樣品3; 5 )測量樣品1、2、3的可溶性糖含量； 6)運用DPS分析軟件對數(shù)據(jù)進行聚類分析并作圖； 8)根據(jù)作圖結(jié)果得出待鑒定馬鈴薯的耐寒性。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:第1)步是取待鑒定的馬鈴薯充分成熟的植株 上部功能葉片，洗凈并吸干葉片表面水分，將葉片放入容器中。3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：第2)步是將密封容器放入低溫循環(huán)水浴鍋 中，水浴鍋初始溫度設(shè)為〇°C，保持30min;向離心管中加入一小塊冰，保持30min后取樣。4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:第3)和4)步是低溫保持時間為60min。5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:第6)步的聚類分析操作如下： 1) 分別計算待鑒定材料和對照在〇°C、-rC、-2°C低溫下處理后的葉片可溶性糖含量， 并求得三次重復(fù)的平均值； 2. DPS軟件分別對待鑒定材料和對照三種溫度下可溶性糖含量平均值進行系統(tǒng)聚類分 析，優(yōu)選采用歐式距離，或最短距離法； 3) 根據(jù)待鑒定材料與對照的歐式距離分析耐寒性，其中與強耐寒性馬鈴薯材料對照歐 式距離<10即待鑒定材料被視為耐寒性與對照相近或較耐寒;相反其中與弱耐寒性馬鈴薯 材料對照歐式距離<10即待鑒定材料被視為耐寒性與對照相近或不耐寒。6. 如權(quán)利要求1至5任一項所述的方法，其特征在于:所選擇的對照馬鈴薯為強耐寒性 馬鈴薯野生種GS393和馬鈴薯普通栽培種AV9。
【文檔編號】G01N27/06GK105866334SQ201610213779
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月8日
【發(fā)明人】秦玉芝, 熊興耀, 劉明月, 胡新喜, 宋勇, 何長征, 潘飛, 謝潔, 丁旭
【申請人】湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)